Manual prctico de microbiologa y parasitologa

Universidad Jurez Autnoma de Tabasco. Divisin Acadmica Multidisciplinaria de Comalcalco

Directora M. en C. Teresa Ramn Fras Coordinacin de Docencia M T E. Mirelda Velzquez Gutirrez Coordinacin Administrativa M A P. Hugo Adrian Barjau Madrigal Coordinacin de Biblioteca L I A. Jos Alfredo de la Cruz Narvez Coordinacin de Informtica L I. Gustavo Antonio Morillo Lpez Coordinacin de Estudios Bsicos Lic. Heidi Guadalupe Hernndez Mndez Coordinacin de Difusin Lic. Nancy Cristel Hernndez Garca

Reglamento del laboratorio de microbiologa y parasitologa mdica 1. El alumno cuenta con 10 minutos de tolerancia para presentarse en el laboratorio. Superado este lapso de tiempo no tendr derecho a estar presente en la prctica. 2. El uso de bata es obligatorio para su acceso al laboratorio, y se negar la entrada a todo aquel alumno que no porte su bata debidamente. 3. Los objetos personales deben ser depositados sobre los anaqueles diseados para tal efecto. 4. Cada equipo o alumno deber contar antes del inicio de cada prctica con el material necesario, ya que de lo contrario no podr permanecer en el laboratorio. 5. Queda estrictamente prohibido comer, beber, fumar y en general, llevarse cosas a la boca dentro del laboratorio. 6. Se prohbe entablar conversaciones, as como comunicarse a voces con los compaeros de otras mesas. 7. Limpiar con etanol o hipoclorito de sodio al 7% las mesas de trabajo antes de empezar con las actividades que indica la prctica y despus de haber concluido. 8. En caso de derrame de material biolgico infectocontagioso, agregar etanol o hipoclorito de sodio al 7% y dejar por lo menos 15 minutos antes de limpiar. Notifique al encargado de la prctica (profesor). 9. Material que se rompa o extrave debe ser pagado en la seccin de laboratorio. 10. El material que no rena las caractersticas de trabajo (tiempo de incubacin, volumen, tipo de espcimen, etc.) de lo contrario este ser desechado. 11. No almacenar material de trabajo de prcticas anteriores en el refrigerador. 12. El material consumible como; algodn, papeles, cerillos, etc. sern colocados en la basura municipal. No se debe tirar basura en el suelo, ni guardarla en los cajones, ni tirarla en la tarja. 13. Etiquetar el material a usar durante el desarrollo de la prctica para evitar accidentes.

14. Al finalizar la prctica: Quitar las etiquetas del material reutilizable. El material sucio no contaminado colocarlo en un recipiente debidamente rotulado. El material contaminado que va a ser desechado colocarlo en un recipiente debidamente rotulado para su esterilizacin. 15. El alumno que haga caso omiso de los lineamientos de este reglamento se sancionar con la anulacin de la prctica.

Contenido
Introduccin ........................................................................................................................................ 2 Qu es la microbiologa? ............................................................................................................... 2 Qu es la parasitologa? ................................................................................................................ 2 La seguridad en el laboratorio de microbiologa y parasitologa. ................................................... 2 Prctica No. 1: Manejo y uso del microscopio .................................................................................... 3 Objetivo: .......................................................................................................................................... 3 Fundamento. ................................................................................................................................... 3 Material y equipo. ........................................................................................................................... 5 Conclusin ....................................................................................................................................... 8 Prctica No 2. Preparacin y esterilizacin de materiales y medios de cultivo. ................................. 9 Objetivo: .......................................................................................................................................... 9 Fundamento .................................................................................................................................... 9 Material y equipo .......................................................................................................................... 12 Conclusin ..................................................................................................................................... 14 Prctica No 3. Toma de muestras. .................................................................................................... 15 Objetivo: ........................................................................................................................................ 15 Fundamento .................................................................................................................................. 15 Material y equipo. ......................................................................................................................... 16 Conclusin ..................................................................................................................................... 17 Prctica No 4: Tincin de Gram. ........................................................................................................ 19 Objetivo: ........................................................................................................................................ 19 Fundamento .................................................................................................................................. 19 Material y equipo. ......................................................................................................................... 20 Conclusin ..................................................................................................................................... 21 Prctica No 5. Tincin de tinta china................................................................................................. 23 Objetivo: ........................................................................................................................................ 23 Fundamento .................................................................................................................................. 23 Material y equipo .......................................................................................................................... 23 Conclusin ..................................................................................................................................... 24 Prctica No 6. Examen coproparasitoscopico. .................................................................................. 25 Objetivo: ........................................................................................................................................ 25

Fundamento .................................................................................................................................. 25 Material y equipo .......................................................................................................................... 25 Conclusin ..................................................................................................................................... 27 Prctica No 7. Tincin de hifas .......................................................................................................... 28 Objetivo: ........................................................................................................................................ 28 Fundamento .................................................................................................................................. 28 Material y equipo .......................................................................................................................... 28 Conclusin ..................................................................................................................................... 29 Bibliografa. ....................................................................................................................................... 30 ANEXOS ............................................................................................................................................. 31

Introduccin
Qu es la microbiologa?
La microbiologa mdica es la rama de la disciplina mdica que estudia a los agentes biolgicos que viven a expensas del hombre y producen enfermedades en este. La palabra microbiologa deriva de las voces griegas mikros, pequeo; bios, vida y logos, estudio; por lo que etimolgicamente estudia los microorganismos que no son perceptibles a simple vista.

Qu es la parasitologa?
El termino parasitologa mdica proviene de las voces griegas para, junto a; sito, comida y logos que trata a los seres vivos que viven en relacin parasitaria con otros organismos (hospedero) del cual obtienen sus nutrientes para su desarrollo. Y la palabra mdica viene del latn medicus, cuya significado tiene relacin con la medicina y esta, a su vez, del latn medicina, que es el arte y ciencia de conocer las enfermedades y tratarlas. La microbiologa mdica se enfoca principalmente en los procesos patolgicos tales como los mecanismos de colonizacin, mecanismos de diseminacin y transmisin, significacin clnica y epidemiolgica. Su principal objetivo es la deteccin, aislamiento, identificacin y el desarrollo de procedimientos para su control sanitario o teraputico y la respuesta biolgica del ser humano ante bacterias, parsitos, hongos y virus.

La seguridad en el laboratorio de microbiologa y parasitologa.

La estancia en el laboratorio de microbiologa y la realizacin de las prcticas microbiolgicas, implica el conocimiento de los lineamientos de bioseguridad en el laboratorio. Estos lineamientos estn diseados con base a las caractersticas fundamentales de cada tipo de laboratorio. Los laboratorios se clasifican de la siguiente manera: Laboratorio bsico (nivel de bioseguridad 1), Laboratorio bsico (nivel de bioseguridad 2), Laboratorio de contencin (nivel de bioseguridad 3), y laboratorio de contencin mxima (nivel de bioseguridad 4). La concesin de los lineamientos a cada nivel de bioseguridad va a estar estrechamente relacionado con el tipo de muestra o microorganismo que se analiza, la metodologa que se desarrolla en el anlisis de cada muestra biolgica, etc. La bioseguridad durante el desarrollo de las prcticas microbiolgicas va a depender de la evaluacin del riesgo que implica la realizacin de un procedimiento o experimento determinado. Esta evaluacin recae sobre el profesional, l cual conoce las caractersticas
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de los microorganismos con los que se va a trabajar, el equipo, los procedimientos a desarrollar y los medios de contencin disponibles. Una vez establecidos los lineamientos de bioseguridad, deben ser consultados peridicamente y actualizados con base a la literatura cientfica que compete a la bioseguridad en el laboratorio. Ocasionalmente los laboratorios de nivel 1 o 2, analizan o pueden estar expuestos a muestras biolgicas de grupos de riesgo ms altos. Esta posibilidad debe tenerse en cuenta durante la elaboracin de planes y polticas de seguridad. Estos planes o polticas van encaminados a reconocer los riesgos potenciales que este tipo de muestras biolgicas representan, con el fin de reducir al mnimo o eliminar esos riesgos. Para que se efecten las tcnicas microbiolgicas apropiadas con la debida seguridad, el laboratorio debe contar con la infraestructura y normas adecuadas, estas se describen a continuacin: este smbolo regula la entrada y salida a las reas donde se manipulan microorganismos del grupo de riesgo 2 o superior. De esta forma se indica que el personal debe portar batas, guantes y gafas de seguridad durante la manipulacin de las muestras biolgicas con el fin de reducir al mnimo la exposicin a estas. Es de vital importancia seguir el protocolo de procedimientos establecidos en cada laboratorio ya que esto minimizar el riesgo de accidentes, tales como la formacin de aerosoles, derrames de reactivos, accidentes y exposiciones reales o potenciales a materiales infecciosos. En cuanto a la zona de trabajo en el laboratorio, est se debe mantener ordenada, limpia y libre de materiales no relacionado con el trabajo. Si por algn motivo se derramara material potencialmente peligroso durante la manipulacin, se debe descontaminar la superficie de trabajo as como materiales, muestras y cultivos antes de eliminarlos o de limpiarlos para volverlos a utilizar. El laboratorio debe estar diseado con el espacio suficiente para realizar las prcticas en condiciones de seguridad y limpieza. Con las caractersticas necesarias para el mantenimiento de limpieza y seguridad, tales como: paredes, techos y suelos lisos fciles de limpiar, impermeables a lquidos y resistentes a productos qumicos y desinfectantes normalmente usados en laboratorio. El suministro elctrico del laboratorio es de vital importancia puesto que este brinda la iluminacin adecuada a cada rea especfica de trabajo para la realizacin de las tcnicas microbiolgicas, adems permite el funcionamiento de equipos electrnicos como: estufa de incubacin, parrilla elctrica, congeladores y equipos automatizados como el Vitek (antibiograma), nefelmetro o turbidimetro de Mcfarland, etc. El funcionamiento ptimo de los equipos de laboratorio va a depender del adecuado suministro elctrico pero principalmente del mantenimiento diario, semanal, mensual, bimestral o trimestral segn el equipo, el cul puede incluir cambiar alguna pieza del equipo. El mantenimiento diario normalmente es limpieza general del equipo, purgar cnulas y verificar que todo est en orden. El semanal incluye limpieza interna. El mensual, bimestral o trimestral, dependiendo del equipo puede incluir el cambio de algn consumible o parte del equipo que sea necesario cambiar en ese periodo. No hay que dejar de mencionar el adecuado suministro de gas e instalaciones que provean agua potable de buena calidad. El conocimiento adecuado de los lineamientos en bioseguridad brinda al personal o al estudiante la capacidad de realizar las prcticas microbiolgicas de forma rpida y eficiente sobre todo a la hora de manipular muestras biolgicas potencialmente infectocontagiosas.

Prctica No. 1: Manejo y uso del microscopio

Objetivo: Conocer en forma conjunta las partes que integran un microscopio, as como
tambin su manejo adecuado y la importancia de ste en el laboratorio de microbiologa y parasitologa.

Fundamento.
La microscopa estudia el uso y aplicaciones interpretativas de los microscopios los cuales permiten observar partculas invisibles al ojo humano. El microscopio es un instrumento indispensable para el rea de microbiologa y parasitologa, ya que permite la observacin de organismos que no pueden ser apreciados a simple vista, en estas reas el ms utilizado es el microscopio ptico. El microscopio ptico se basa en la refraccin de la luz (), que genera una imagen del objeto mucho ms grande a travs de un sistema de lentes que ayudan a disminuir el lmite de resolucin. El lmite de resolucin es la distancia que debe separar a dos fuentes luminosas puntiformes, cuando estos puntos se aprecian como separados. Cuanto menor es el lmite de resolucin, ms grandes se ven los objetos. El lmite de resolucin (d) depende de la apertura numrica del objetivo (AN) y de la longitud de onda de la luz usada ():

Como resultado de la frmula matemtica podemos obtener que la mejor resolucin (dmin ms pequea) se obtenga usando la menor longitud de onda y el lente objetivo de la mayor apertura numrica. El lmite de resolucin es inversamente proporcional al ndice de refraccin del medio, por lo que interesa que el medio entre el objetivo y la muestra tenga el mximo valor posible. Por esta razn se usan objetivos que utilizan como medio aceite de inmersin. La luz utilizada puede ser: blanca, ultravioleta y polarizada. Con el microscopio ptico se pueden observar, bacterias, hongos, esporas, huevos y larvas de parsitos.

Podemos encontrar microscopios simples (lente de aumento ordinaria) o compuestos (anexo 1) cuyos sistemas son los siguientes: Sistema ptico el cual est formado por los oculares, objetivos y condensador. Sistema mecnico que cuenta con un soporte, tubo, brazo, platina revolver, tornillo macromtrico y micromtrico y el tornillo del condensador. Sistema de iluminacin que est constituido de un espejo (plano por un lado y cncavo por el otro) y una fuente luminosa. De la misma forma podemos encontrar variedades de microscopios cuya caracterstica inherente a cada tipo es una modificacin del microscopio simple y esta va a depender del tipo de muestra a analizar. El microscopio ptico con iluminacin en campo claro cuenta con un sistema ptico que dispone de dos o ms lentes de aumento. A otros microscopios (contraste de fases) se les ha aadido una modificacin que permite aumentar el contraste sin necesidad de teir las muestras. Este se fundamenta en el hecho de que las ondas luminosas que pasan a travs de objetos transparentes, como las clulas, emergen en fases diferentes dependiendo de las propiedades de los materiales que atraviesan. En el microscopio de campo oscuro se emplea un condensador cuya apertura numrica es mayor que la del objetivo bloqueando as la emisin de fotones dando como resultado el desvo de la luz de un espejo al lado del condensador en ngulo oblicuo, esto provoca la formacin de un campo oscuro que produce contraste con los bordes del microorganismo. El microscopio de fluorescencia funciona a travs de la excitacin de fluorocromos que absorben luz ultravioleta o ultra azul de longitud de onda ms corta y emite energa a una mayor longitud de onda visible.

Material y equipo.
Mtodo apropiado para observar al microscopio: Para poder realizar una correcta observacin se deben seguir los siguientes pasos: Colocar la preparacin a observar sobre la platina, puede ser una extensin de sangre teida con Wright o bien utilizar agua estancada sobre un portaobjetos. Seleccionar el objetivo de 10X. Para enfocar correctamente un campo de observacin en el microscopio de campo claro realizar la iluminacin de Kohler. Observar el preparado por campos en forma de zig-zag. Hacer las observaciones correspondientes para el desarrollo del reporte de prctica. Concluidas las observaciones apagar el sistema de iluminacin. Retirar la preparacin y limpiar el objetivo si por algn motivo este se manch con material de la laminilla observada.

Recomendaciones generales para la conservacin del microscopio. Por ser un instrumento valioso y delicado en el laboratorio y si no se le utiliza de manera apropiada puede dar un rendimiento limitado. Por lo tanto, algunas cosas que no se deben hacer son: No limpie las lentes de los objetivos o los oculares con etanol. No sumerja los objetivos en xilol o etanol. No emplee algodn para limpiar las lentes. Limpiar con papel especial para limpieza de lentes (papel arroz) Nunca limpie los soportes o platina con xilol. No mover los lentes de su lugar porque se desajustan. Al utilizar aceite de inmersin en el objetivo 100X, asegrese de limpiar el aceite de inmersin para no dejar residuos que puedan daar su funcionamiento. Para mover el microscopio utilice siempre ambas manos para sujetarlo del brazo y de la base del microscopio, nunca lo arrastre porque esto puede daar los filamentos de tungsteno de la lmpara.

Desarrollo de la actividad 1. Traer un esquema representativo de un microscopio ptico con nombre de las partes que integran dicho microscopio. 2. Realizar una lista de los cuidados requeridos en el manejo del microscopio ptico. 3. A continuacin describe brevemente la funcin de cada una de las piezas accesorias que integran el microscopio ptico.

Interpretacin de resultados. Actividades complementarias. 1. Describe brevemente las partes y funcin de un microscopio ptico Parte mecnica: Pie____________________________________________________________________ Brazo del microscopio____________________________________________________ Platina_________________________________________________________________ Tornillos de desplazamiento________________________________________________ Tornillos de enfoque (macro mtrico y micro mtrico) ____________________________

Parte ptica Ocular_________________________________________________________________ Objetivos_______________________________________________________________ Tubo ptico_____________________________________________________________ Parte de iluminacin Espejo__________________________________________________________________ Lmpara________________________________________________________________ 2. Anote las caractersticas de los diferentes tipos de microscopios que a continuacin se escriben as como tambin en donde se emplean. pticos: De campo claro: De campo oscuro: De contraste de fases: De interferencia: De fluorescencia:

Conclusin
El uso del microscopio es de vital importancia ya que es una herramienta que nos permite visualizar a los microorganismos estudiados dentro de los mtodos o procedimientos aplicados en la microbiologa y parasitologa. Siendo estos microorganismos en extremo pequeos es necesario amplificar su tamao y esto solo se consigue con el aumento en el tamao a travs del sistema de lentes con el que est equipado el microscopio. Es esta herramienta imprescindible en las prcticas microbiolgicas.

Prctica No 2. Preparacin y esterilizacin de materiales y medios de cultivo.

Objetivo: Conocer el procedimiento de preparacin de los medios de cultivo de uso
frecuente (Gelosa sangre, Biggy, Sabouraud, Sal y Manitol y McConky), as como el proceso de esterilizacin de material de laboratorio y medios de cultivo.

Fundamento
La disponibilidad de nutriente es un factor determinante del crecimiento de los microorganismos. En microbiologa se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo, el cual consiste en proporcionarles las condiciones fsicas, qumicas y nutritivas adecuadas para estimular el desarrollo y aislamiento de los microorganismos. Estos pueden ser divididos en los siguientes tipos: Lquidos: se emplean principalmente para cultivar microorganismos y obtener grandes cantidades de estos o para la produccin de metabolitos especficos, as como estimular y promover la seleccin de algn o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen. Semislidos: se utilizan para identificaciones bioqumicas y averiguar si el germen estudiado es mvil. Estos medios tienen la caracterstica de poseer una consistencia blanda. Solidos: el empleo de estos permite la obtencin de colonias aisladas de microorganismos adems de que constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se emplean en microbiologa. Los medios pueden ser clasificados en varios grupos dependiendo de caractersticas especficas.

Clasificacin de los medios de cultivo Medios enriquecidos Medios no inhibidores Por su uso se clasifican en Medios selectivos de enriquecimiento Medios diferenciales Medios selectivos

De igual forma estos medios van a permitir conocer de acuerdo a sus caractersticas inherentes un conjunto de aspectos propios de los microorganismos.

Utilidad de los medios de cultivo en el anlisis de los microorganismos Conocer la microbiota patgena Con que objetivo se desarrollan los medios Conocer que medio sirve para cada de cultivo? microorganismo Conocer la morfologa colonial Conocer la microbiota normal

En los diferentes medios de cultivo se encuentran los nutrientes necesarios para el crecimiento de microorganismos por lo que es de vital importancia prepararlos en condiciones aspticas, para as evitar que se contaminen con microorganismos oportunistas. Estas condiciones solo pueden ser logradas mediante el uso de mtodos de esterilizacin, los cuales se dividen en: Esterilizantes fsicos, como el calor hmedo y el calor seco (121 o 132 C), producen la muerte bacteriana por desnaturalizacin de sus protenas. Mtodos ms usuales en los hospitales y aplica para casi todo tipo de material, a excepcin de termosensibles. Dentro de los mtodos fsicos tambin se incluyen los rayos ultravioletas (254 nm de longitud de onda) que induce entrecruzamiento entre pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos hebras de polinucletidos formando dmeros pirimidnicos y radiacin ionizante cuyo
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principal blanco es el ADN (cido desoxirribonucleico), produciendo en este roturas en las tiras sencillas y en las doble. Los esterilizantes gaseosos igual tienen alta capacidad de eliminar microorganismos como el xido de etileno a 450-1.200 mg/l a 29-65 C durante 25 hrs (inflamable, explosivo y cancergeno) es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgeno lbiles como los que tienen grupos carboxilos, aminos, sulfhidrilos e hidroxilos. De igual forma el formaldehido gaseoso de 2-5 % a 60-80 C es eficiente puesto que este es un potente carcinognico. No hay que dejar de mencionar los vapores de perxido de hidrogeno 30 % a 55-60 C debido a su caracterstica oxidante.

Esterilizantes qumicos, como el cido paractico al 0.2 % cuya actividad es oxidante sin generar productos secundarios txicos. Sin embargo, el uso de glutaraldehdo 2 % conlleva efectos adversos por lo que se deben tomar las medidas adecuadas. As cmo los mtodos de esterilizacin se pueden clasificar en fsicos y qumicos; estos a su vez se subclasifican como podemos apreciar en la figura 1.

Figura 1. Clasificacin de los mtodos de esterilizacin.

El uso de cada mtodo de esterilizacin va a estar estrechamente relacionado con el tipo de material que se pretenda mantener en condiciones aspticas.

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Material y equipo
Matraz Erlen Meyer. Vaso de precipitado. Parrilla elctrica. Esptula. Balanza granataria. Contenedor de plstico. Cajas de Petri. Filtro de algodn. Autoclave. Papel estraza. Cinta testigo. 15 ml de eritrocitos. Agar base sangre. Agar Biggy. Agar Macconkey. Agar sal-manitol. Agar Saubouraud.

Desarrollo de la prctica. 1- Desinfectar el rea de trabajo con fenol al 5% o alcohol antes de iniciar el desarrollo de la prctica. Preparacin de medios de cultivo 1.- Leer las instrucciones del fabricante para cada medio de cultivo y pesar en la balanza granataria la cantidad indicada de acuerdo al volumen deseado. 2.- Colocar el medio en un matraz al que posteriormente se le agregar el agua destilada en el volumen requerido. Sellar el matraz con un filtro de algodn y proceder a agitar y
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calentar a ebullicin para disolver el agar. Evitar la formacin de burbujas que pueden alcanzar el filtro de gasa-algodn y expulsar la solucin. 3.- Al alcanzar el medio el punto de ebullicin este adquiere consistencia cristalina, indicador de que est completamente disuelto. Esterilizar los medios en autoclave a 121C durante 15 minutos. Concluido el proceso de esterilizacin dejar enfriar a temperatura ambiente el medio hasta alcanzar una temperatura que pueda ser soportada con las manos sin necesidad de usar guantes trmicos. 4.- Si se trata del medio agar sangre adicionar en condiciones de esterilidad sangre desfibrinada en concentracin final de 15%. Evitar adicionar la sangre a temperaturas superiores a 40C, ya que puede lisar a los eritrocitos y dar origen a otro tipo de medio. 5.- Es conveniente mantener el mechero encendido para formar un campo de esterilidad al momento del vaciado en las cajas de petri, aproximadamente deben vaciarse entre 15 a 20 ml de agar por caja procurando que no se formen burbujas. Interpretacin de resultados. Actividades. 1.- Que es un medio de cultivo? 2.- Que es un cultivo de microorganismos? 3.- Qu finalidad tiene utilizar medios de cultivo slidos? 4.- Escribe el nombre de 5 medios de cultivo que pueden ser empleados en el laboratorio de microbiologa. 5.- De dnde es obtenido el extracto Agar para la preparacin de medios de cultivos. 6.- Por qu es necesario esterilizar la mesa antes de realizar el vaciado del medio de cultivo en las cajas de petri? 7.- Escribe la composicin qumica para cada medio de cultivo que utilizaste.
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Agar Biggy

Agar Sabouraud

Agar base sangre

Agar Macconkey

Agar Sal-Manitol

9. Elabora un esquema del procedimiento efectuado en la preparacin de los medios de cultivo.

Conclusin
Los medios de cultivo son una herramienta til que permite el anlisis de microorganismos tanto de la flora normal como patgenos causantes de agresivas enfermedades en los huspedes humanos. A travs de los medios de cultivo podemos identificar a los microorganismos y determinar la sensibilidad a los antimicrobianos que van a contrarrestar o erradicar a estos devolviendo as el estado normal al husped afectado por dicho patgeno.

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Prctica No 3. Toma de muestras.

Objetivo: Adquirir habilidad en la toma de muestras (exudado faringeo) y conocer la
metodologa requerida para tomar estas muestras sin que se contamine de algn microorganismo que pueda dar falsos positivos.

Fundamento
Es muy importante tomar las muestras tan pronto como sea posible, de preferencia durante el inicio del cuadro clnico del paciente. Para limitar el posible contagio del tomador de muestras todas estas debern tomarse aspticamente y es indispensable el uso de bata, guantes y cubre boca. Las muestras deben mantenerse en hielo, refrigeracin o medios de transporte diseados para tal efecto (medio Stuart). La relevancia de los cultivos de exudado farngeo por ejemplo, radica en que este es un mtodo que permite el diagnstico de infecciones de amigdalitis o faringitis producidas por Streptococcus y Stafilococcus. En otras palabras este determina el estado de portador de estos microorganismos. El exudado tambin puede obtenerse de la nasofaringe principalmente recomendado para bebes y nios muy pequeos. En el caso de las infecciones vaginales (vaginosis), alteracin en el equilibrio bacteriano en la vagina con prdida del predominio de Lactobacillus e incremento en el nmero de Gardnerella vaginalis est indicado el exudado vaginal el cul debe tomarse usando un espculo vaginal y obtener el exudado con un escobilln. La toma del exudado vaginal del fondo del saco o crvix posterior es ms sensible y exacta para realizar el diagnostico. El procesamiento de resultados altamente confiables depende de la buena toma del

exudado practicada al paciente. Previo a la toma con respecto al exudado farngeo se le deben indicar al paciente los criterios para la toma de muestra del exudado las cuales son las siguientes: No tomar antibiticos de 3 a 5 das. Hora de toma: a cualquier hora del da cuando se cumplan con los criterios para la toma. Sin aseo bucal, sin haber hecho gargarismo con enjuagues bucales. Sin haber consumido alimentos (no menos de 3 horas).
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El aseo dental de preferencia que no se lo haga, porque afecta de manera baja en el cultivo pero no impacta al informe a comparacin del gargarismo con sln.

Material y equipo.
Medio de transporte Stuart. Placas de agar gelosa sangre. Placas con agar sal y manitol. Asa bacteriolgica de platino. Portaobjetos. Reactivos para tincin de Gram. Microscopio ptico. Desarrollo de la prctica. Sentar al paciente y colocar su cabeza hacia atrs, iluminar bien la cavidad oro farngea y con un abatelenguas, bajar la lengua para facilitar el acceso a la parte posterior de la faringe, figura 2. Con un hisopo de dacrn o de rayn con mango de plstico, hacer un raspado firme, haciendo girar el hisopo, en las reas daadas que deben verse hipermicas, purulentas o necrticas y tambin en las membranas formadas sobre las lesiones o de las manchas de Koplic. Hay que evitar tocar la lengua, la vula o los carrillos. Introducir el hisopo con la muestra en un tubo con tapn de rosca que contenga el medio de transporte adecuado.

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Figura 2. Cavidad oro farngea

Interpretacin de resultados Actividades 1.- Con que fin se realiza el exudado y describa cules son los tipos de exudados?

2.- El Streptococcus causa tres tipos de hemolisis, describa detalladamente cada una.

3.- Haga un cuadro comparativo de la morfologa colonial de Streptococcus y Staphylococcus.

4.- En qu le va a beneficiar el conocimiento de la toma de muestras durante el ejercicio de su carrera medica?

Conclusin
La realizacin del exudado farngeo es un mtodo que permite diagnosticar la infeccin causada por bacterias del gnero Streptococcus cuya manifestacin clnica es la inflamacin de las amgdalas dando como consecuencia una intensa odinofagia. Este
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mtodo permite el diagnstico oportuno lo que permite como consecuencia que se aplique la terapia antimicrobiana con el fin de contrarrestar en tiempo y forma a este agente causal de esta patologa en las amgdalas.

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Prctica No 4: Tincin de Gram.

Objetivo: Realizar la metodologa de la tincin de Gram (tincin diferencial) para la
identificacin y clasificacin de bacterias en Gram positivas y Gram negativas.

Fundamento
El mtodo de la tincin de Gram se basa en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias. La coloracin clsica incluye la fijacin con calor los frotis bacterianos calentando suavemente a la llama una pelcula de bacterias secada previamente al aire. Esto permite conservar adecuadamente la morfologa bacteriana general pero no las estructuras internas de la bacteria; esta caracterstica en este mtodo de fijacin y sobre todo cuando se tiene especial inters en las estructuras internas de la clula bacteriana conduce a usar mtodos de fijacin qumicos que permiten conservar la subestructura fina y morfologa bacteriana. Luego de la fijacin, el primer paso de la coloracin de Gram es la aplicacin de una solucin de cristal violeta (cloruro de hexametil-p-rosanalina) que tie todas las clulas de color azul-violeta, colorante bsico que tiene grupo cargados positivamente los cuales van a interactuar con la pared celular de las bacterias que estn cargadas negativamente. A continuacin se agrega una solucin de lugol (yodo-yoduro de potasio) que acta como mordiente fijando qumicamente el colorante alcalino a la pared bacteriana. En otras palabras el yoduro reemplaza al cloruro en la molcula de cristal violeta y el complejo formado se vuelve insoluble en agua. La etapa de decoloracin la cual ocupa alcohol-acetona remueve solamente el colorante de las Gram negativas (apareciendo incoloras) mientras que las Gram positivas si lo retienen (apareciendo de color azul/violeta). Esta reaccin diferencial es debida a que en las Gram positivas la presencia de un mayor nmero de residuos de cido teicoco con uniones cruzadas en las bacterias Gram positivas es posible que aumente la fijacin del cristal violeta. La safranina es el colorante de contraste ms comn y tie las bacterias Gram negativas de rosa o rojo, dejando a las Gram positivas de color violeta (anexo 2). La safranina tie de rosa o rojo a las Gram negativas debido a la ausencia de cido teicoco pero presencia de lipopolisacrido.
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Material y equipo.
Asa de platino. Microscopio. Porta objetos. Aceite de inmersin. Sustancias colorantes Colorante cristal violeta (cloruro de hexametil-p-rosanalina). Yodo lugol (yodo-yoduro de potasio). Solucin decolorante alcohol acetona. Safranina.

Desarrollo de la prctica. 1. Colocar una pequea gota de solucin salina al 0.9 % en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de solucin salina, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima gota de agua, que resulta suficiente. 2. esterilizar el asa de siembra, tomar una colonia del cultivo bacteriano a emplear y transferirlo a la gota de solucin salina. Mezclar con el asa de siembra la muestra hasta formar una pelcula homognea, asegurndose de extender la mezcla para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensin bacteriana directamente sobre el portaobjetos. 3. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el portaobjeto a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaucin de no calentar demasiado el portaobjeto ya que se corre el riesgo que las clulas se deformen o rompan.

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Tincin. 1. Realizar la preparacin del frotis bacteriano como se explic en el paso anterior. 2. Incubar con cristal violeta 1min. 3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. 4. Cubrir con Lugol 1min. 5. Lavar con agua el exceso de Lugol. 6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparacin deje de perder color (30seg) 7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente. 8. Teir con safranina 1minuto. 9. Lavar con agua hasta eliminar el colorante de contraste. 10. Dejar secar la preparacin. 11. Examinar al microscopio con aceite de inmersin y fijndose sobre todo en el color de cada preparacin y las formas de estas. Interpretacin de resultados. Actividades. 1. Describe detalladamente, lo observado en cada preparacin. 2. Elabora un cuadro de bacterias Gram positivas y negativas de importancia clnica, as como las enfermedades que ocasionan. 3. Describe fisiolgicamente y bioqumicamente la composicin de las clulas procariotas. 4. Que molculas son las responsables de la coloracin obtenida a una clula bacteriana.

Conclusin
La coloracin de Gram es una metodologa que clasifica a las bacterias en dos grandes grupos, estos son positivos y negativos. No hay que dejar de mencionar que algunas bacterias se tien como Gram variables debido a la composicin estructural de la pared celular diferente de la mayora de las dems bacterias las cuales poseen peptidoglucano, molcula responsable de retener los colorantes de la tincin de Gram. Esta caracterstica
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tpica de las bacterias muchas veces es ocupada como un elemento de identificacin rpido muy importante en patgenos. Es por ello que es de suma importancia conocer el fundamento de esta y su uso en la prctica clnica.

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Prctica No 5. Tincin de tinta china

Objetivo: Realizar la tincin negativa en microorganismos capsulados como mtodo de
diagnstico rpido.

Fundamento
Los mtodos ms usados para poner de manifiesto las cpsulas bacterianas son las coloraciones negativas ya que los colorantes no son capaces de fijarse ni penetrar en las clulas. No obstante, las bacterias pueden ser observadas en negativo; esto quiere decir que estas estn sin teir sobre una superficie que si lo est. Esto descarta la tincin de Gram como mtodo para el anlisis de bacterias encapsuladas ya que la naturaleza bsica de sus colorantes no permite la tincin de las cpsulas. En cambio s se tratan las bacterias encapsuladas con tinta china cuya sustancia est formada de partculas de carbn muy grandes incapaces de penetrar la matriz de la cpsula va a generar un patrn en el que el medio circundante se teir de color negro pero las bacterias aparecern transparentes sobre este fondo negro (anexo 3).

Material y equipo
Medio de cultivo con Cryptococcus neoformans. Colorante de tinta china. Portaobjeto y cubreobjetos limpio. Microscopio. Aceite de inmersin.

Desarrollo de la prctica 1. Tomar una gota del medio de cultivo y depositarla sobre el portaobjetos. 2. Agregar una gota de tinta china procurando que sea aproximadamente el mismo volumen de la muestra que contiene al microorganismo a analizar. La solucin de ambas gotas debe extenderse y mezclarse de manera uniforme. 3. Colocar un cubreobjetos en la porcin central del portaobjetos evitando la formacin de burbujas. 4. Dejar secar a temperatura ambiente. 5. Observar al microscopio.
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Interpretacin de resultados 1. Describe detalladamente, lo observado en la preparacin. 2. Cul es la importancia clnica de la tincin con tinta china y que la diferencia de la tincin de Gram. 3. Por qu las molculas de carbn son incapaces de teir al hongo utilizado en esta prctica.

Conclusin
Este mtodo es efectivo en la deteccin de microorganismos capsulados como por ejemplo la levadura Cryptococcus neoformans ya que este forma con la tincin negativa un patrn en el cul la superficie del portaobjeto se encuentra oscuro como causa de la tinta en contraste con las clulas que se encuentran en halos transparentes. Esto constituye un mtodo rpido para la deteccin e identificacin de este hongo.

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Prctica No 6. Examen coproparasitoscopico.

Objetivo: Realizar la metodologa requerida que nos ayudar a determinar la presencia de
protozoarios, as como quistes y trofozoitos en muestras de heces.

Fundamento
El examen coproparasitoscpico es uno de los estudios de laboratorio en el que se analiza la materia fecal. En particular este estudio se utiliza para detectar la presencia de parsitos intestinales, lo que sirve para establecer un diagnstico definitivo de parasitosis. Las infecciones por helmintos (gusanos) se diagnostican mediante la identificacin de los huevos en las heces, las infecciones por protozoos (p. ej., amebas) se diagnostican mediante la presencia de trofozoito (estado activo), quistes u ooquistes (estadios acorazados) en las heces. Se requiere una muestra de heces reciente, la cantidad de muestra es importante y sta preferentemente no debe exceder el tamao de una nuez aproximadamente. Este mtodo se realiza principalmente en muestras frescas, para encontrar presencia de formas de parsitos de tamao microscpico (trofozoitos, quistes de protozoos: Entamoeba histolytica,Giardia lamblia (duodenalis) ,Balantidium coli etc., as como larvas o huevos de helmintos: Strongyloides stercolaris, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Paragonimus, Fasciola etc, anexo 4).

Material y equipo
Laminas portaobjetos. Lamina cubreobjetos. Aplicador de vidrio o madera. Microscopio ptico. Solucin salina. Solucin de lugol.

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Desarrollo de la prctica Colocar aproximadamente 1 g de materia fecal en un tubo eppendorf 1.5 ml con solucin salina. Procesar cada muestra a analizar por duplicado. Mezclar hasta que la materia fecal se diluya completamente en la solucin salina sin que queden grumos en la solucin. Uno de los tubos se incuba a 37 C por 5 minutos. Como consecuencia de la incubacin la amoeba experimenta movimientos unidireccionales. Colocar sobre uno de los extremos de la lmina portaobjeto una gota del preparado. De preferencia el que se incubo a 37 C, sobre esta gota colocar una gota de lugol con el fin de teir los depsitos de glucgeno de los trofozoitos y se puedan apreciar con un mayor contraste. En el extremo contrario de la lmina portaobjetos colocar una gota del preparado sin incubacin. Con la solucin salina los trofozoitos y quistes de los protozoarios se observan en forma natural y con lugol las estructuras internas, ncleos y vacuolas. Observar al microscopio al 10 o 40 X. No es aconsejable usar objetivos de inmersin (100 X) pues se puede ensuciar el objetivo del microscopio. Recorrer la lmina en forma de zig-zag para observar campos diferentes. La observacin se considera positiva cuando se identifican trofozoitos, presencia de pseudpodos y movimiento unidireccional de la amoeba.

Interpretacin de resultados Actividades. Con el apoyo de la informacin proporcionada en el laboratorio conteste las siguientes preguntas: 1. Qu entiende por examen coproparasitoscpico cualitativo? 2. Anote el nombre de la especie del parsito y su estado evolutivo que haya observado, indicando la densidad (nmero de formas parasitarias por campo microscpico) expresado en cruces.

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Conclusin
El mtodo de amiba en fresco es una herramienta que permite la deteccin rpida de la presencia de trofozoitos en pacientes con enfermedad diarreica para afirmar el diagnstico clnico de amebiasis intestinal.

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Prctica No 7. Tincin de hifas

Objetivo: Llevar a cabo la bsqueda de la presencia de hifas en exmenes directos mediante el
uso de hidrxido de potasio como aclarante de la queratina para analizar la morfologa de estas en el mtodo diagnstico rpido.

Fundamento
Las infecciones invasoras por hongos son cuadros difciles de reconocer debido a que tanto los sntomas como los signos clnicos son con frecuencia inespecficos. El cultivo de hongos es una tcnica tardada que en el mejor de los casos se obtienen resultados hasta en un periodo de 15 das. Por lo tanto el examen directo recibe un valor decisivo ante la necesidad de corroborar la sospecha por infecciones de agentes fngicos. Este procedimiento no sustituye al cultivo pero si permite obtener resultados preliminares al ser una tcnica rpida que puede ser til al clnico y en algunos casos llegar a ser diagnstico.

Material y equipo
Portaobjetos Cubreobjetos Hidroxido de potasio (KOH) Muestra Microscopio

Desarrollo de la prctica La manera ms rpida y sencilla de verificar la presencia de hongos es la microscopa directa de una preparacin de hidrxido de potasio (KOH). El excelente resultado se obtiene cuando la muestra es recolectada en las condiciones adecuadas y estas pueden ser variadas dependiendo de la colonizacin (heridas, expectoracin, secrecin vaginal, lavado bronco alveolar, raspado de piel o forneos, lquidos de cavidades esteriles, etc). Realizar una preparacin en fresco de la muestra micolgica agregndola sobre un portaobjetos y sobre la muestra agregar una gota de hidrxido de potasio (KOH) al 10 %. El KOH clarifica el material orgnico y deja intactas las estructuras fngicas. Observar al microscopio con el objetivo de 10 o 40 X las hifas filamentosas cuya estructura es la unidad funcional del hongo. Esta puede ser macrosifonado 1 o microsifonado < 1 de dimetro. Tambin se pueden observar al microscopio levaduras, yemaciones, hifas septadas o aseptadas, pseudohifas, etc.

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Interpretacin de resultados Actividades 1.- En qu le va a beneficiar el conocimiento de la tincin de hifas durante el ejercicio de

su carrera medica?

2.- Cul es la importancia clnica de la preparacin en fresco de muestras micolgicas?

3.- Realice un esquema de las estructuras micolgicas observadas durante la realizacin de la prctica.

Conclusin
Las micosis invasoras son cada vez ms frecuentes en la prctica clnica por lo que la preparacin en fresco es un mtodo de diagnstico rpido y muy til, lo que permite el desarrollo de las infeccines invasoras causadas por hongos.

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Bibliografa.
Gamazo C, Lpez I, Daz R. Manual prctico de Microbiologa. 3ra Ed.. Elsevier Masson. 2005. Gmez, R, N; Molina, M, AF; Garca, Z, MG; Castillo, A, JD; Castillo, R, J; Garca, H, RJ; Fonseca, C, I; Valenzuela, A, O. Identificacin de la Entamoeba histolytica/E. dispar por la tcnica de amiba en fresco vs su tincin con hematoxilina-eosina en la diarrea aguda. Revista mexicana de pediatra 2005; 72: 109-112.

Guzmn, D, AM. Importancia del laboratorio en el diagnstico de las micosis invasoras. Rev Chil Infect 2004; 21: 39-47.

Hernndez, LA; Vivanco, VM; Silva, ZJ. Microbiologa y parasitologa mdica.

Perez, A, R; Weiss, E; Villanueva, E. Mtodo rpido y sencillo para visualizacin de hifas en el diagnstico de las dermatomicosis. Dermatologa Venezolana: 27-34. Prescott, LM; Harley, JP; Klein, DA. Microbiologa. 5ta Ed. Editorial McGraw-HillInteramericana de Espaa, S. A. U. 2004. Murray, RP; Rosenthal, KS; Pfaller, MA. Microbiologa mdica. 6ta ELSEVIER Mosby Espaa 2009.

Ed. Editorial

Norma oficial mexicana NOM-065-SSA1-1993, que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo. Snchez, H, JA; Coyotecatl, G, LL; Valentin, G, E; Vera, G, L; Rivera, T, JA. Diagnstico clnico, de laboratorio y tratamiento de la vaginosis por Gardnerrella vaginalis. Universitas mdica 2007; 48: 382-395.

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ANEXOS
ANEXO 1

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ANEXO 2

32

33

34

35

ANEXO 3

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ANEXO 4 Entamoeba coli

Iodamoeba btschlii

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Blastocystis Hominis

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