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Ciencia y Tecnologa de Alimentos

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Determinacin de nitrgeno y protenas

Mtodos no extractivos Determinacin de Protenas totales: Determinacin del nitrgeno total por el Mtodo de Kjeldahl (Mtodo de Referencia) Aplicaciones: Alimentos en general Como consecuencia de su estructura a base de aminocidos individuales, el contenido en nitrgeno de las protenas vara slo entre unos lmites muy estrechos (15 a 18%; en promedio 16%). Para la determinacin analtica del contenido en protena total, se determina por lo general el contenido de nitrgeno (N) tras eliminar la materia orgnica con cido sulfrico (mtodo de Kjeldahl), calculndose finalmente el contenido de protena con ayuda de un factor (en general f = 6,25). Se asume que el SO3 que se forma durante el tratamiento a altas temperaturas se adiciona como cido de Lewis al grupo NH del enlace peptdico (base de Lewis) de la protena, formndose el correspondiente cido amidosulfnico, el que posteriormente se transforma en sulfato amnico por degradacin. El sulfato amnico se determina a continuacin, tras liberacin del NH3 y destilacin, por medio de una valoracin cido-base. Como en el tratamiento Kjeldahl de alimentos no se determinan slo protenas o aminocidos libres, sino tambin cidos nucleicos y sales de amonio y tambin nitrgeno ligado de compuestos orgnicos o vitaminas, el nitrgeno ligado orgnico se expresa como nitrgeno total calculado como protena o como protena total (N x f). No obstante, como por lo general los alimentos slo contienen cantidades traza de compuestos aromticos nitrogenados y de vitaminas, el error as cometido se considera despreciable. Fundamento: La sustancia a investigar se somete a un tratamiento oxidativo con cido sulfrico concentrado en presencia de una mezcla catalizadora (las sales/xidos metlicos sirven para el transporte de oxgeno con formacin intermedia de oxgeno naciente; el sulfato potsico sirve para elevar el punto de ebullicin, alcanzndose temperaturas de 300-400C durante la digestin). Del sulfato amnico formado se libera el amonaco por tratamiento alcalino y ste se transporta con ayuda de una destilacin en corriente de vapor a un recipiente con cido brico y se realiza una titulacin con una solucin valorada de cido sulfrico. El contenido en protena de la muestra se calcula teniendo en cuenta el contenido medio en nitrgeno de la protena en cuestin. Reactivos: H2SO4 conc. p.a. (98%) Catalizador: K2SO4 o Na2SO4 anhidro + CuSO4. 5 H2O p.a. (relacin 10:1) NaOH 40% Solucin H3BO3 4% Solucin H2SO4 0,2 N Indicador Mortimer: 0,016% rojo de metilo, 0,083% verde de bromocresol en etanol Determinacin: a) Digestin: Colocar la cantidad adecuada de muestra (de acuerdo al contenido estimado de nitrgeno) entre 0,1 y 4 g con una precisin de 1 mg, en un baln Kjeldahl de 500 ml. Agregar 1 cucharadita de catalizador, perlas de vidrio y 15-20 ml de H 2SO4 conc. Todo el material debe estar sumergido en el cido para que no haya prdidas de nitrgeno. Conectar el baln a la trampa de agua y calentar la mezcla suavemente hasta que cese el desprendimiento de espuma; luego calentar enrgicamente hasta completar la digestin de la materia orgnica (no se observan partculas carbonosas sin oxidar y el lquido queda translcido y de color dbilmente verdoso o azul-verdoso). La digestin demanda entre 1 y 2 hs. Enfriar y agregar cuidadosamente al menos 100 ml de agua. b) Destilacin: Presentar el baln con la muestra digerida a un refrigerante por medio de una trampa adecuada. Preparar un erlenmeyer con 25-50 ml de H 3BO3 4% (sobre el cual se va a recoger el

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NH3 destilado) y gotas de indicador Mortimer (color rojo), y colocarlo a la salida del refrigerante cuidando que el extremo del mismo quede sumergido en la solucin cida. Antes de conectar completamente el baln se va agregando con cuidado la cantidad necesaria de solucin de NaOH 40% como para neutralizar el cido sulfrico, primero sin agitar para que se ubique en el fondo, y una vez agregado todo, conectar bien el baln, agitar para lograr la mezcla (el medio se hace fuertemente alcalino que se detecta por formacin de un precipitado pardo oscuro, dispersado por efecto de la ebullicin) y simultneamente se comienza el calentamiento a ebullicin del contenido del baln. El indicador vira a azul cuando empieza a destilarse el NH3 por arrastre en corriente de vapor. Se sigue destilando hasta llegar a aproximadamente 200 ml en el erlenmeyer colector (los primeros 150 ml de destilado contienen generalmente la totalidad del NH3). Una vez alcanzado dicho volumen, se retira el erlenmeyer enjuagando dentro del mismo el extremo del refrigerante con AD, para no perder nitrgeno y luego se apaga el calentamiento. c) Valoracin: El destilado se valora con solucin de H2SO4 0.2 N, hasta lograr el viraje del indicador Mortimer al color inicial rojo. d) Blanco: Se debe realizar un blanco de reactivos, siguiendo las mismas indicaciones pero sin colocar muestra en el baln. Clculos: Protena total % = (VMyestra - VBlanco) x NAcido x 0.014 x F x 100/gMuestra Siendo VMuestra ml de cido gastados en la valoracin de la muestra VBlanco ml de cido gastados en la valoracin del blanco NAciodo normalidad del cido sulfrico 0.014 peso del meq de nitrgeno, en g F factor de conversin de nitrgeno a protena gmuestra peso en g de la muestra En los clculos para convertir nitrgeno a protenas, usar el factor 6,25 para carnes, 5,7 para cereales y soja y 6,38 para leche y derivados. Determinacin de Nitrgeno bsico voltil- ndice de putrefaccin Aplicacin: carne vacuna, pescado Fundamento: El pH de msculo de pescado fresco est entre 6,6 y 6,8 (lo conserva en el momento de la muerte). Despus de muerto se acumula cido lctico, provocando cada de pH, pero como en el msculo hay compuestos con carcter buffer, no permiten que se vea ese descenso. Por descomposicin del msculo se acumulan amonaco, dimetilamina y trimetilamina. Si en ese momento se produce contaminacin bacteriana, entonces comenzar a subir el pH (primero lentamente y rpido al final), en condiciones extremas de deterioro puede llegar a 7,5-8,0. Ocurre un proceso de autolisis que lleva al aminocido: R-CH-NH2-COOH
Decarboxilasas Aminooxidasas

CO2 + R-CH2-CH2-NH2

NH3

R-CH2-COOH
(algunos son voltiles y arrastrables por agua)

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Hay accin sobre el xido de trimetilamina que existe en algunos peces de agua salada. El lctico en el msculo es reductor y acta sobre el O=N(CH3)3 (precursor). CH3 I H-C-OH I COOH CH3 I COOH + CO2 + H2O
voltil

Enzimas

+ 2 O=N(CH3)3
microbianas

2 N(CH3)3 +
bsico voltil

Se sabe que se produce la HN(CH3)2 pero no se conoce el precursor. Reactivos: MgO puro Agente antiespumante (puede ser alcohol octlico o un antiespumante siliconado) Acido brico 2% Indicador Mortimer: 0,016% rojo de metilo, 0,083% verde de bromocresol en etanol H2SO4 0,02N "standarizado" (preparado por dilucin de H2SO4 0,1 N) Determinacin: Colocar en un baln Kjeldahl 10 a 15 g de muestra preparada exactamente pesada y agregar 2 g de MgO, 300 ml de agua destilada, unas gotas de antiespumante y unos trozos de porcelana porosa o piedra pmez. Instalar el baln en el aparato de destilacin. Poner en un erlenmeyer de 500 ml, 50 ml de solucin de cido brico al 2% y 4 gotas de indicador. Conectar el aparato y colocar el erlenmeyer de manera que el extremo del refrigerante quede sumergido en la solucin de cido brico. Calentar el baln Kjeldahl de modo tal que el lquido contenido entre en ebullicin en exactamente 10 min. Destilar durante 25 min exactos, manteniendo la misma intensidad de calentamiento. Enjuagar el refrigerante con agua destilada recogiendo tambin en el erlenmeyer. Titular el destilado con H2SO4 0,02 N. Expresar el resultado como mg de nitrgeno bsico voltil por 100 g de muestra. Determinacin de Nitrgeno no proteico Pesar con exactitud 0,5-1 gr de muestra y dispersarla en 10 ml de agua destilada. Agregar 10 ml de cido tricloroactico 24%, homogeneizar y centrifugar. Tomar una alcuota de sobrenadante lmpido y determinar N por el mtodo de Kjeldahl.

Determinacin de Nitrgeno lcali lbil: Mtodo de Kofranyi (1950. Milchwissenschafts, 5154 Vol. 2). Determinacin de protenas en leche por destilacin directa.

Fundamento: Es un mtodo rpido basado en la liberacin de amonaco cuando la leche es calentada a ebullicin en solucin alcalina. La mayor parte del amonaco liberado proviene de la rpida hidrlisis de glutamina y asparagina. Determinacin: colocar en un baln Kjeldahl 10 ml de leche, 20 ml de BaCl 2 10 % (usar propipeta) y 70 ml de NaOH 32%. Destilar durante 6 min (exactamente medidos a partir del inicio de la ebullicin), recogiendo sobre 100 ml de BO3H3 2 %. Titular el destilado con SO4H2 0.1N, usando como indicador 6 a 8 gotas de una solucin 0.016 % de rojo de metilo y 0.083 % de verde de bromocresol en alcohol. Calcular el porcentaje de protena (p/p) utilizando una curva de calibracin que relaciona el % protenas con los ml de SO4H2 0.1N gastados. Curva de calibracin: se obtiene siguiendo el procedimiento anterior pero con muestras de leche con contenidos de protena conocidos. Para obtener las distintas muestras de leche se parte de una leche entera a la que se le midi el % de protenas por el mtodo de Kjeldhal; con esta leche se hacen diluciones o se agrega casena para obtener las concentraciones proteicas deseadas. El contenido de protenas que cubra el rango de la curva de calibracin, debe ser de 1 a 4 % (p/v).
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NOTA: Actualmente los anlisis en leche se realizan siguiendo la metodologa especificada en las normas IDF, de la Federacin Internacional de Lechera (FIL). Para la determinacin del contenido de protenas se utiliza el mtodo de Kjeldhal, utilizando cido brico para recoger el destilado. Mtodos extractivos colorimtricos a) Mtodo de Biuret Fundamento: Los polipptidos (la mnima unidad de reaccin es el tripptido) reaccionan con una solucin diluida de sulfato cprico (Cu2+) en medio fuertemente alcalino, mostrando una coloracin azul caracterstica. Reactivos: Solucin A: tartrato de sodio y potasio.4 H2O -----18,06 g CuSO4.5H2O -------------------------------- 6,00 g KI ---------------------------------------- 2,00 g NaOH 2 N --------------------------------- 40 ml Llevar a 200 ml con agua destilada Solucin B: 10 g de KI en 160 ml de NaOH 2 N. Solucin C: (prepararla en el momento) 10 ml de Solucin A + 8 ml de Solucin B + agua destilada para completar 100 ml. Determinacin: En tubos de ensayo apropiados colocar 1 ml de solucin de protena (0,07mg1,5mg), 1ml de NaOH 2N, 2 ml de reactivo C y 1 ml de agua destilada. Agitar y dejar 30 min a temperatura ambiente. Leer la absorbancia a 545 nm. Se debe hacer cada vez un blanco y una curva de calibracin. b) Mtodo de Bradford Rango: 0,2 a 20g/20l (0.01-1g/l) Reactivos: Solucin colorante: Disolver 100 mg de Serva Blue G (Serva, Westbury, NY) o Coomassie Brilliant Blue G-250 en una mezcla de 100 ml de cido fosfrico 85% y 50 ml de etanol 95%. Una vez que el colorante se disolvi completamente, llevar a 1 litro con agua destilada fra. NaOH 1M Procedimiento: Prender el espectrofotmetro 15 min antes de usarlo. Poner 40l de muestra en un tubo de hemlisis. Agregar 50l de NaOH 2M (alternativamente, el NaOH puede agregarse al reactivo de color en la relacin 50l/ml). Agregar 1 ml de reactivo de color e incubar 5 min. Medir la absorbancia a 590 nm en cubetas de vidrio o poliestireno. c) Mtodo de Lowry Se basa en la reaccin del reactivo de Folin-Ciocalteu con las protenas. Si bien el mecanismo de reaccin no est bien dilucidado, se sabe que la tirosina, y en menor extensin la cistena, la cistina, la histidina y las uniones peptdicas, reaccionan reduciendo al molibdato a azul de molibdeno. La reaccin tambin puede producirse en presencia de tungstato, para generar azul de molibdeno y tungsteno. El complejo da un color azul caracterstico que se mide a 745-750 nm. Los iones Cu 2+ en medio alcalino facilitan la reaccin de reduccin del reactivo de Folin formando un complejo con la unin peptdica a travs del nitrgeno involucrado en el enlace y reducindose a Cu 1+. El Cu1+ y los residuos involucrados reducen entonces al reactivo de Folin generando el color caracterstico. Interferencias - Fenoles excepto nitrofenoles y otras sustancias reductoras (mercaptoetanol, ditiotreitol, etc) por reduccin del reactivo de Folin. - Glicina: por disminuir la intensidad del color desarrollado. - Sustancias o buffers que acidifiquen el medio. - Agentes quelantes del cobre.
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Rango: 0.05-0.4 mg/ml Reactivos: Na2CO3 2% en NaOH 0.1N: Solucin A CuSO4.5H2O 1.0% Tartrato de Na y K 2% Solucin de Folin: Reactivo de Folin Ciocalteau diluido con agua destilada 1:1 Determinacin: Se mezclan en el momento de la determinacin volmenes iguales de la solucin de CuSO4 y de la del tartrato. A esta mezcla la llamaremos solucin B. Aadir 1ml de la solucin B a 50 ml de la solucin A, para obtener la solucin A+B. Se prepara la dilucin de la muestra que corresponda (200 l) a la que se le adiciona 1ml de solucin A+B. Agitar bien y dejar reposar 10 min. Pasado este tiempo agregar 100 l del reactivo de Folin diluido. Agitar bien y dejar reposar 30 min. Leer absorbancia a 750nm Determinacin de Nitrgeno amnico: Mtodo de Sorensen Aplicacin: Sirve para determinar N amnico en muestras lquidas o extractos. La finalidad es poder determinar la concentracin de amonaco o grupos amino libres de aminocidos, pptidos y protenas. Es til para dosar aminocidos libres en jugos de fruta, el grado de hidrlisis de una protena, o amonio despus de la destruccin de materia orgnica en el mtodo de Kjeldahl, etc. Determinacin: Neutralizar 10 ml de muestra con NaOH 0,1 N usando fenolftalena como indicador. Es importante no excederse en el agregado de NaOH, detenerse en el punto en que aparece una dbil coloracin rosada que persiste por 30 seg. Otra posibilidad es utilizar un pHmetro y llegar a pH 8. Agregar 10 ml de formol neutralizado recientemente con fenolftalena y titular de inmediato la acidez liberada con NaOH 0,1 N hasta ver el punto final. Tomar este ltimo valor para el clculo de N amnico y el primero para el clculo de la acidez. Clculo: g %N = VNaOH NNaOH 0,014 x 100/peso de muestra Determinacin de aminocidos aromticos: mtodo de Hull Reactivos: todos los reactivos deben estar a una T > 30C - Rvo Folin-Cicoltou: 1 vol FC (cido fosfomolbdico-cido fosfotngstico) + 2 vol AD - CO3Na2 15% + Hexametafosfato sdico 2% Determinacin: Mezclar 0.5 ml de muestra con 1 ml de CO3Na2-Hexametafosfato y esperar 5 min. Luego agregar 0.3 ml de Rvo FC. Esperar 5 min y leer la absorbancia a 650 nm. Curva de calibracin: Con tirosina como patrn preparar soluciones de diferente concentracin y agregar el volumen necesario de TCA 12% como para tener una concentracin final de 8%. Centrifugar y sobre los sobrenadantes aplicar la tcnica descripta anteriormente.

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Extraccin de Protenas A continuacin se presentan algunos protocolos comunmente utilizados para la extraccin de protenas de distintos productos alimenticios. Productos crneos. - Homogeneizar 1 g de msculo picado con 10,0 ml de buffer Tris-HCl 0,03 M, pH = 7,0. - Centrifugar a 7000 g (15 min, 4 C). Separar el sobrenadante. - Repetir el tratamiento anterior sobre el pellet. - Mezclar los dos sobrenadantes obtenidos. La solucin resultante constituye la fraccin de protenas extrables en agua (PEA) (protenas sarcoplsmicas fundamentalmente). - Tratar el pellet remanente luego de los dos pasos de extraccin previos con 10,0 ml de buffer Tris-HCl 0.03 M conteniendo KCl 0,6 M, pH = 7. - Centrifugar (7000 g, 15 min, 4 C) y separar el sobrenadante. - Repetir el tratamiento anterior sobre el pellet. - Mezclar los dos sobrenadantes: se obtiene la fraccin de protenas extrables con sal (PES) (protenas miofibrilares fundamentalmente). Harina de soja. - Tratar 1 g de harina de soja desgrasada con 10,0 ml de agua alcalinizada con NaOH 1 N a pH = 8. - Agitar durante 1 h en agitador magntico a temperatura ambiente. - Centrifugar a 10000 g (15 min, 4 C). Separar el sobrenadante: fraccin de protenas solubles. Harina de trigo (u otros cereales). - Tratar 625 mg de harina con 10,0 ml de buffer Tris-HCl 40 mM con 2% SDS, pH 6.8. - Incubar durante una hora a temperatura ambiente en agitador magntico. - Centrifugar a 15000 g (10 min, 4 C). Separar el sobrenadante.

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Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) La composicin polipeptdica de un extracto proteico puede ser evaluada mediante una electroforesis, basada en la capacidad de migracin de una partcula cargada bajo la accin de un campo elctrico. A pHs diferentes al pI, las protenas se encuentran cargadas y se mueven frente a la fuerza impulsora generada por un campo elctrico. Segn la ley de Stokes las partculas se movilizarn a una velocidad definida segn su tamao, carga y viscosidad del medio. En las electroforesis proteicas se utilizan soportes estructurados los cuales adems actan como tamiz, limitando as la movilidad de las protenas de acuerdo a su tamao. El gel de poliacrilamida es el soporte mas comnmente utilizado por su alta reproducibilidad, estabilidad (pH, temperatura, fuerza inica), inercia qumica y porosidad controlable. La polimerizacin de la acrilamida sigue un mecanismo de radicales libres cuyo iniciador es el persulfato de amonio con el N, N, N, N tetrametiletilenodiamina (TEMED) actuando como catalizador. La porosidad del gel se controla mediante la relacin entre la acrilamida y la N, Nmetileno-bis-acrilamida, la cual acta como entrecruzador, y la concentracin de ambos compuestos. En el caso de las electroforesis desnaturalizantes, la protena tratada con SDS, detergente aninico, pierde su estructura cuaternaria y terciaria, y los polipptidos que forman las subunidades de protenas multimricas, y las protenas monomricas se cargan negativamente de manera uniforme separndose de acuerdo a su tamao. Reactivos y equipo Buffer de electrodo: Tris(hidroximetil)aminometano-HCl (Tris-HCl) 25 mM, glicina 192 mM (pH 8,3), con dodecil sulfato de sodio (SDS) 0,1 % p/v. Buffer de gel stacking (4x): Tris-HCl 500 mM (pH 6,8) con SDS 0,4 % p/v; N,N,N,N, tetrametiletilenodiamina (TEMED) 0,4 % v/v. Buffer de gel separador (4x): Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) con SDS 0,4 % p/v; N,N,N,N, tetrametiletilenodiamina (TEMED) 0,4 % v/v. Buffer de muestra para electroforesis desnaturalizante: Tris-HCl 62,5 mM (pH 6,8), sacarosa 15 % v/v, SDS 2% p/v, EDTA 25 mM y azul de bromofenol 0,05 % p/v con o sin 2-mercaptoetanol (2-ME) 5% v/v, para obtener condiciones reductoras o no reductoras, respectivamente. El 2-ME reduce enlaces disulfuro y desarma estructuras multimricas estabilizadas por uniones covalente de grupos tioles de cistenas. Solucin de acrilamida-bisacrilamida: 30 g de archilamida y 0,8 g de bisacrilamida se llevan a un volumen final de 100 mL con agua destilada. Luego se filtra y se almacena en frasco color caramelo. Equipo de electroforesis: Mini Protean II (BIO-RAD Life Sciences, EE. UU.) con separadores entre placas de 1 mm de espesor. Preparacin de las muestras y siembra En el caso de extractos proteicos, los mismos sern mezclados con buffer muestra. Si se trata de muestras slidas las mismas sern directamente solubilizadas en buffer muestra 1x. En el caso de muestras tratadas con 2-ME, sern calentadas a 100 C durante 3 minutos. Las mezclas se centrifugarn a 12.000 g durante 10 min a 20 C. En los distintos geles de poliacrilamida se sembraron entre 5 L y 25 L de muestra por calle o 3 L de solucin patrn para tener una concentracin detectable y buena resolucin con la tincin con Coomasie Brilliant Blue R-250. Preparacin del gel, siembra y corrida Se prepararn geles de separacin con una concentracin de arcrilamida del 12 % p/v y un gel de concentracin o stacking de 4 % p/v, de acuerdo con Para 1 gel de 1mm: -Gel separador (7 ml en total): Acril. Stock 2.73 ml 12% Buffer gel (4x) 1.75 ml
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Agua Persulfato 10% TEMED 2.52 ml 25 l 7 l

-Gel de stacking (2 ml en total): Acril. Stock 0.26 ml 4% Buffer stacking (4x) 0.5 ml Agua 1.24 ml Persulfato 10% 22 l TEMED 2.5 l Se sembrar un volumen de muestra en buffer muestra tal que contenga entre 20 y 30 g de protena. La corrida se realizar a voltaje constante de 30 mV, controlando que la temperatura de la cuba no supere los 35 C. Tincin Los geles sern fijados y coloreados en una misma etapa en solucin de Coomasie Brilliant Blue R 0,192 % p/v en agua-metanol-acido actico (10:10:4) durante un tiempo mayor a 1,5 h y sern decolorados en solucin agua-etanol-cido actico (65:25:10) con sucesivos cambios a temperatura ambiente hasta obtener la resolucin deseada.