http://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/16743/SSR.pdf.pdf?sequence=1 http://es.scribd.

com/doc/7082257/Clase-2Marcadores-Moleculares

UNIVERSIDAD AUTONOMA INDIGENA DE MEXICO CULTIVO DE TEJIDOS

Morfognesis in vitro de leguminosas forestales Nativas de la Repblica Argentina

FACILITADORA EDUCATIVA: DRA ROSA MARTINEZ RUIZ

RESUMEN
El objetivo de este trabajo fue inducir la morfognesis in vitro en cotiledones inmaduros de leguminosas forestales nativas de la Repblica Argentina: Erythrina crista-galli L. (seibo), Acacia caven (Mol.) Mol. (espinillo), Parkinsonia aculeata L. (cina-cina), Gleditsia amorphoides (Griseb.) Taub. (espina de corona) y Sesbania punicea (Cav.) Benth. (acacia mansa). Las legumbres verdes fueron recolectadas de rboles que crecen naturalmente en los alrededores de la ciudad de La Plata y Provincia de Buenos Aires. Los frutos fueron desinfectados en superficie, se extrajeron las semillas inmaduras y se separaron los cotiledones del eje embrionario. Los cotiledones fueron cultivados en el medio basal Murashige-Skoog (MS), con sus macro y micronutrientes a la mitad de su concentracin, suplementado con 3% de sacarosa, 0,65% de agar, 0,165 g/l de NO3NH4, 1 ppm de 2,4D (cido 2,4- diclorofenoxi actico) y 0,1 ppm de Kin (cinetina). Los cultivos fueronincubados a 25 +/- 2 C y 16 horas de luz con una irradiancia de 60 mmol m-2 s-1. Se obtuvieron embriones somticos en Acacia caven, regeneracin de brotes y races adventicias en Parkinsonia aculeata, callos y races en Gleditsia amorphoides y callos en Erythrina crista-galli y Sesbania punicea. Los resultados sugieren que algunas leguminosas nativas de la Repblica Argentina pueden ser propagadas mediante tcnicas de cultivo de tejidos.

INTRODUCCION
El cultivo in vitro de tejidos vegetales es una tcnica permite la propagacin de rboles y proporciona una ventaja econmica importante a la industria forestal. Adems, permite reducir los largos perodos de maduracin, la baja viabilidad de las semillas y la dificultad que presentan algunos individuos de propagarse por mtodos tradicionales. Los tejidos juveniles presentan frecuentemente una mayor aptitud para la organognesis adventicia que los tejidos que provienen de rganos adultos o senescentes. Esta aptitud est ampliamente aprovechada en la multiplicacin vegetativa in vitro, sobre todo en los casos de especies difciles de propagar, especialmente, las leosas. En muchas especies los cotiledones expandidos de plntulas producen ms brotes adventicios que todo el embrin, hipoctilo, o cualquier otro tejido de la plntula, conviertindolos en el mejor explanto. En Acacia koa se obtuvieron brotes y races, a partir de callo (Skoleman & Mapes, 1976). A partir de explantos juveniles se obtuvieron plantas completas de Acacia caven, Parkinsonia aculeata y Erhythrina crista-galli (Abedini et al., 2000). La embriognesis somtica en especies de leguminosas leosas est restringida al uso de explantos de semillas inmaduras o partes de plntulas. El perodo ptimo para la iniciacin del cultivo in vitro est definido por la cantidad de das de la post-antesis, por

la morfologa del desarrollo del embrin cigtico y por el peso fresco del embrin El perodo de post-antesis es el momento ms adecuado para la formacin de embriones somticos, aunque el proceso est muy influenciado por un gran nmero de factores, tales como la localizacin geogrfica y la calidad de sitio.El rea de distribucin en la provincia de Buenos Aires de las especies bajo estudio Acacia caven (Mol.) Mol, Erythrina crista-galli (L.), Parkinsonia aculeata (L.), Sesbania punicea (Cav.) Benth. y Gleditsia amorphoides (Gris.) Taubert, ha sufrido diversas modificaciones como reemplazo de comunidades naturales por agroecosistemas, modificaciones del suelo, incorporacin de agroqumicos, cambios del balance hdrico regional e introduccin masiva de especies exticas, esto puede conducir a la prdida irreversible de estas especies, incluso antes de que se hayan realizado estudios sobre su variacin y caractersticas. Frente a esta problemtica, es necesario ampliar los conocimientos de cada especie en particular, contribuyendo de esta manera con la conservacin de los recursos fitogenticos nativos. El objetivo de este trabajo fue inducir la morfognesis in vitro en cotiledones inmaduros de Acacia caven, Erythrina crista-galli, Parkinsonia aculeata, Sesbania punicea. y Gleditsia amorphoides, especies nativas de la provincia de Buenos Aires, para determinar si existen diferencias en el potencial morfogentico de cada especie, frente a las mismas condiciones de cultivo in vitro.

MATERIALES Y MTODOS Se utilizaron como explanto los cotiledones de semillas inmaduras obtenidas de legumbres verdes (90 das posteriores a la floracin) de Erythrina crista-galli, Acacia caven, Parkinsonia aculeata, Gleditsia amorphoides y Sesbania punicea, recolectadas durante el verano de 1999 de rboles que crecen en los alrededores de la ciudad de La Plata, Provincia de Buenos Aires, Argentina. Para su desinfeccin, las legumbres verdes fueron tratadas en superficie con hipoclorito de sodio comercial (55 g de Cl activo porlitro) al 50% de su concentracin, durante 1h y luego, se lavaron tres veces con agua bidestilada estril. Las legumbres desinfectadas se cortaron con escalpelo a lo largo de la sutura carpelar para extraer las semillas inmaduras. Las mismas fueron desprovistas del tegumento, separndose los cotiledones, que fueron utilizados como explanto, descartndose el eje embrionario. Se utiliz el medio basal de MS, con los macro y micronutrientes a la mitad de su concentracin y suplementado con 3% de sacarosa, 0,65% de agar, 1 ppm de 2,4D (cido 2,4 diclorofenoxiactico) y 0,1 ppm de cinetina. Adems, se agreg 0,165 g/l de NO3NH4, al medio basal de MS, aumentando as, en un 10% el contenido original de nitrgeno. El pH se ajust a 6 con hidrxido de sodio 1N y cido clorhdrico 1N, y los medios de cultivo fueron esterilizados en autoclave a 1,05kg.cm-2 a 120C durante 20 min. Las condiciones de cultivo fueron 25 +/- 2 C y 16 horas de luz, con una irradiancia de 60 mmol. m-2 s-1. Los envases utilizados fueron recipientes de vidrio de 45mm x 95mm con 37 ml de medio de cultivo. El tamao de muestra elegido fue de 60 cotiledones (2 por recipiente) por especie, y los explantos fueron colocados con la cara abaxial en contacto con el medio de cultivo. A los 45 das de iniciado el cultivo, los explantos se subcultivaron al medio basal de MS sin reguladores de crecimiento (PGR) y en las mismas condiciones ambientales de la etapa anterior.

Los embriones somticos obtenidos fueron aislados y sembrados en un medio basal de MS, suplementado con 3% de sacarosa, 0,65% de agar y 0,5 ppm de AG3 (cido giberlico), en las mismas condiciones ambientales de la primera etapa. Aspectos histolgicos de la morfognesis Se aplicaron las tcnicas histolgicas, para corte en fresco y cortes semifinos. Con una cuchilla o navaja de afeitar se realizaron cortes longitudinales y transversales a mano alzada, del material fresco de explanto original, callo, primordio radical, brote y embrin. Para analizar los procesos morfofisiolgicos y caracterizar citolgicamente los cambios producidos en el material, los cortes fueron depositados en portaobjetos y observados en lupa binocular y en microscopio ptico. Se utilizaron diversas tcnicas para la preparacin de los cortes (tincin, montaje y fijacin). La tincin se realiz con safranina al 1%, el montaje con aguaglicerina y se fijaron en FAA (formol-alcohol etlico-cido actico y agua). Cada 15 das, se determin el porcentaje de supervivencia de los explantos y las diferentes respuestas morfogenticas (formacin de callo, races, brotes y embriones somticos). A los 30 das de cultivo se evalu el peso fresco de los callos, el porcentaje de explantos con raz, con brotes adventicios y la formacin de embriones somticos por gramo de callo.

RESULTADOS
El establecimiento de los explantos se logr satisfactoriamente en el medio de cultivo utilizado, presentando un 3% de contaminacin con bacterias, que no alter los resultados ya que este material fue descartado. Se observ la formacin de callo, de tamao y aspecto variable en las diferentes especies estudiadas. En este trabajo se logr inducir la morfognesis en cinco especies forestales nativas de la provincia de Buenos Aires, pertenecientes a la familia Leguminosae, y se observaron marcadas diferencias en el potencial morfogentico de cada especie. De las especies estudiadas, slo se obtuvieron embriones somticos en Acacia caven. En Parkinsonia aculeata se observ la formacin de brotes y races y en Erythrina crista-galli, Sesbania punicea y Gleditsia amorphoides hubo escasa diferenciacin de rganos. Erythrina crista-galli: A los 15 das de iniciado el cultivo, se observ la formacin de callo de aspecto compacto y de color marrn oscuro ubicado en los bordes del cotiledn. Se observaron clulas alargadas y desorganizadas, sin diferenciacin alguna. A los 30 das de incubacin, los explantos se oxidaron, posteriormente se necrosaron y murieron. Acacia caven: A los 15 das de cultivo, se observ la formacin de callo color verde y aspecto friable en los bordes del cotiledn y a los 30 das este callo prolifer en la totalidad de la superficie del explanto. El anlisis histolgico revel la existencia de masas de clulas proembriognicas y embriones somticos, en diferentes estados: globular, corazn y torpedo. Adems, se observaron embriones somticos originados en forma directa, sobre la cara abaxial del cotiledn. A los 60 das de cultivo se observ la formacin de 57 embriones

somticos en estado globular por gramo de callo. Estos fueron aislados y cultivados en un medio adecuado para su germinacin, logrndose a las 48 hs el 10 % de germinacin (aparicin de la radcula). Parkinsonia aculeata: A los 15 das de cultivo, los cotiledones comenzaron a elongarse y se curvaron como consecuencia de la formacin de callo en los bordes. Se originaron brotes adventicios, en forma directa sobre la cara abaxial del explanto. A los 30 das, el callo cubri toda la superficie del cotiledn y se observ la formacin de brotes adventicios y races, en forma indirecta. Los callos, de aspecto compacto y color marrn, estaban constituidos por capas superficiales de clulas poco diferenciadas, en el centro de los mismos se observ la presencia de traqueidas y haces vasculares agrupados en zonas pro-meristemticas, que dieron origen a brotes y races. Gleditsia amorphoides: a los 15 das de cultivo se observ la formacin de callo en los bordes del cotiledn, estos callos estaban constituidos por clulas alargadas y desorganizadas, que luego diferenciaron races en el 19 % de los explantos. A los 60 das de cultivo, estos callos se oxidaron, necrosaron y murieron. Sesbania punicea: A los 15 das de cultivo, los cotiledones comenzaron a desdiferenciarse, originando un callo de apariencia muy heterognea con zonas de color marrn y friable, otras de color verde y compacto y una tercera zona de color blanco y aspecto nveo. Luego de 30 das de cultivo, estos callos cubran toda la superficie del explanto, siendo su peso promedio de 0,943 g. A los 90 das el peso promedio de los callos fue de 1,128 g. Si bien se pudo observar un crecimiento en el tamao de los callos, no se observ la formacin de rganos a partir de los mismos. Al microscopio, los callos de color marrn y blanco estn constituidos por clulas alargadas y desorganizadas. Los callos verdes presentaron escasa diferenciacin celular, en el centro se observan grupos de traqueidas alargadas y hacia la superficie hay clulas de menor tamao, isodiamtricas y con alto contenido de almidn.

Conclusin
Segn los resultados obtenidos en este trabajo, Parkinsonia aculeata presenta la capacidad de formar rganos en forma directa a partir de cotiledones inmaduros y en forma indirecta, segn lo sealado por Skoleman & Mapes (1976).No se logr la organognesis directa ni indirecta en Sesbania punicea, utilizando el mismo explanto. En Acacia caven los embriones somticos se formaron a partir de los cotiledones inmaduros en forma directa e indirecta, observndose todos los estados caractersticos como globular, corazn y torpedo, mientras que otros explantos procedentes de plntulas, como cotiledones no mostraron ninguna diferenciacin. La formacin de embriones somticos depende de la edad del explanto.

Una variedad de factores modifican las respuestas morfogenticas observadas en los explantos cultivados in vitro. Todos estos factores pueden resumirse en el trmino control fisiolgico, haciendo referencia a los factores fsicos y qumicos que se encuentran dentro de las clulas o en el ambiente que rodea a las clulas, modificando las respuestas morfogenticas, dentro de los lmites genticos o restricciones epigenticas (Halperin, 1986). En general, la respuesta de un tejido al cultivo in vitro depende, en mayor medida, de la interaccin entre el nivel hormonal endgeno y el tipo y concentracin de los reguladores de crecimiento suplementados al medio de cultivo. De acuerdo a esto, cada explanto o un mismo explanto pero de diferente especie, pueden responder de manera distinta a una misma concentracin de reguladores de crecimiento, a causa de diferencias en el contenido hormonal endgeno (Prez Molphe Balch et al., 1999). En este trabajo, utilizando cotiledones de semillas inmaduras de cinco leguminosas forestales como explantos, se observ la formacin de callo en los bordes de los cotiledones, los que, con el transcurso del tiempo, cambiaron de aspecto, dando una respuesta diferencial de la capacidad morfogentica de las especies bajo estudio. Es as, que en Parkinsonia aculeata se obtuvo la formacin, a partir del callo originado in vitro, de brotes adventicios que posteriormente enraizaron. En la cara abaxial del cotiledn, estos brotes se formaron directamente. En Acacia caven se observ la formacin de embriones somticos, en los callos originados in vitro y en forma directa, en la cara abaxial de los cotiledones. De esta manera, queda demostrada la capacidad embriognica de Acacia caven y la capacidad organognica de Parkinsonia aculeata, mientras que las restantes especies, slo formaron callo. Por lo tanto, sera oportuno profundizar los estudios de cada especie en particular, modificando distintas variables relacionadas con el medio de cultivo, especialmente los reguladores de crecimiento, ya que cada tejido tiene una determinada sensibilidad ante los reguladores de crecimiento, lo que los hace ms o menos capaces de responder ante ellos (Prez Molphe Balch et al., 1999).