UNIDAD V: TCNICAS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR BIOTECNOLGICO

5.1. Tcnicas basadas en PCR y/o electroforesis

la hibridacin de acidos nucleicos Es un proceso de unin de dos hebras complementarias de cidos nucleicos pero cuyo origen es distinto. Una de ellas ser el cido nucleico diana y la otra ser la sonda empleada para localizar ese cido nucleico diana. Qu es una sonda? Una sonda es un fragmento monocatenario de DNA o RNA marcado con una molcula reporter, y que se emplea para el reconocimiento especfico de una molcula determinada de cido nucleico diana de cadena sencilla, en un proceso de hibridacin. Existen tres tipos de sonda de cidos nucleicos: 1. Fragmentos de DNA , 2. Fragmentos de RNA y 3. Oligonucletidos sintticos u oligosondas. Qu son las molculas reporter? Son molculas qumicas unidas a la sonda y que van a permitir la deteccin de esta tras un proceso de hibridacin. Existen molculas reporter de muchos tipos: radiactivas (32P, 35S), de afinidad (Biotina, Digoxigenina...), enzimticas (Fosfatasa, Peroxidasa ...) y quimioluminiscentes (steres de acridina). Qu factores afectan a la sensibilidad y especificidad de la reaccin de hibridacin? Concentracin del cido nucleico diana Complementariedad sonda-cido nucleico diana Concentracin de la sonda.

Longitud de la sonda Actividad especfica de la molcula reporter. Condiciones de hibridacin (pH, fuerza inica, temperatura de hibridacin, ...) Tm Acceso al cido nucleico diana.

5.1.1. Southern

Hibridacin Southernblot (SB). Necesita de la extraccin del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la eliminacin de ARN y proteinas de la misma por digestin enzimtica. Con la aplicacin de endonucleasas de restriccin-la enzima Pst I es la mas utilizada, pues corta los genomas en fragmentos de diferentes tamaos ofreciendo un patrn caracterstico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizndose una separacin electrofortica de los fragmentos en gel de agarosa los cuales pueden ser visualizados con bromuro de etidio. El ADN se desnaturaliza y se transfiere a una membrana realizndose una hibridacin. El SB es el mtodo de referencia actual de. La especificidad de esta tcnica es superior a cualquier otra debido a la purificacin extra del ADN por electroforesis. Adems es el nico mtodo que permite conocer si el genoma viral est en situacin episomal o integrado en el ADN celular. Las desventajas fundamentales del SB son su gran complejidad tcnica, duracin de la misma y la necesidad de utilizar tejidos no fijados, puesto que existen protocolos para material fijado, su sensibilidad se reduce muy notablemente.

5.1.2. Northern

Lahibridacin Northern se utiliza para la detccin de RNA. El ARN celular se extrae y se separa por medio de un gel desnaturalizante que contiene formaldehido. Seguidamente se hibridan con sondas ARN antisense o ADN. En todos los sistemas de hibridacin el cido nuclico diana est localizado en un soporte slido, bien una membrana o una biopsia o extendido citolgico, en los procedimientos que seguidamente describiremos el cido nucleico se encuentra disuelto en un lquido.

5.1.3. marcadores moleculares

Desde la prehistoria, el hombre ha mejorado especies vegetales, animales y microbianas basndose en la seleccin de los mejores. El mejoramiento tradicional de las especies, fue posible gracias a varios factores tales como, la variabilidad gentica existente entre los organismos, la eficacia e intensidad de la seleccin aplicada, el tiempo necesario para realizar un ciclo de seleccin y la heredabilidad del carcter que se quera aislar, es decir qu porcentaje de las diferencias encontradas en un cierto carcter, entre los individuos de una determinada poblacin, se debe a diferencias en sus genes. Sin embargo, an quedan muchas preguntas por responder: cuntos genes estn implicados en la expresin de un carcter?, cul es el efecto de estos genes?, cul es su localizacin y su funcin fisiolgica?. Histricamente, la taxonoma (o clasificacin de organismos) ha estudiado caractersticas fenotpicas, los cuales se evalan mediante marcadores morfolgicos. Estos marcadores tienen la desventaja de que son limitados en nmero (las caractersticas a medir no son infinitas), se deben medir en cierta etapa del crecimiento y pueden estar influenciados por el ambiente. As, los criterios utilizados podran carecer, en algunos casos, de definicin y objetividad. Con el advenimiento de la biologa molecular, el desarrollo de los marcadores moleculares est ayudando a eliminar tanto los inconvenientes de una seleccin basada en el anlisis exclusivo del fenotipo, como la identificacin de especies y variedades de una forma ms rigurosa y repetitiva.

Los marcadores moleculares y los marcadores genticos Una serie de tcnicas moleculares de gran desarrollo en los ltimos treinta aos permite conocer la informacin gentica que poseen los organismos. Se las conoce con el nombre de marcadores moleculares y funcionan como sealadores de diferentes regiones del genoma. Los marcadores se usan para el mapeo gentico, como el primer paso para encontrar la posicin e identidad de un gen. Son ampliamente utilizados en estudios de gentica humana, vegetal, animal y microbiana. Los marcadores moleculares permiten evidenciar variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos individuos, modifiquen estas o no su fenotipo. Esto se debe a que los marcadores moleculares sealan tanto regiones codificantes como no-codificantes del genoma.

1.- Marcadores moleculares son segmentos o fragmentos de cromosoma que no codifican necesariamente alguna caracterstica, que no estn afectados por el ambiente. pero que son heredados de una manera Mendeliana 2.- Un marcador gentico es un segmento de ADN con una ubicacin fsica identificable en un cromosoma y cuya herencia se puede rastrear. Para que una porcin de ADN ligada al carcter de inters sea considerado un marcador gentico debe mostrar una variacin experimentalmente detectable entre los individuos de la poblacin, y un modo de herencia predecible segn las leyes de Mendel. Esta variacin puede ser considerada a diferentes niveles biolgicos, desde cambios fenotpicos heredables significativos, hasta la variacin de un solo nucletido en la secuencia de ADN. Un marcador ideal debe ser: altamente polimrfico o variable dentro y entre especies, de herencia mendeliana no episttica (sin interaccin entre genes), insensible a los efectos ambientales, de rpida identificacin y simple anlisis de posible deteccin en los estadios tempranos del desarrollo.

Tipos de marcadores genticos En los anlisis genmicos, se han utilizado varios tipos de marcadores: morfolgicos, isoenzimas, protenas y marcadores basados en ADN.

Marcadores morfolgicos Son caractersticas fenotpicas de fcil identificacin visual tales como forma, color, tamao o altura. Muchos de ellos se convierten en importantes descriptores, a la hora de inscribir nuevas variedades. Por ejemplo, alrededor de 50 caracteres de plntula, tallo, hoja, espiga, espiguilla y cariopse se utilizan para inscribir e identificar variedades de trigo en la Secretara de Agricultura Ganadera Pesca y Alimentacin (SAGPyA). Como se describi anteriormente, los marcadores morfolgicos presentan algunas limitaciones, no obstante permanecen como caracteres tiles en la identificacin de materiales dado que representan un conjunto de caracteres que pueden ser evaluados con mtodos sencillos y a bajo costo.

Isoenzimas

Se definen como diferentes formas moleculares de un tipo de enzima, que poseen una actividad cataltica comn, es decir actan sobre el mismo sustrato. Ciertos cambios en la secuencia de ADN (mutaciones) que codifica para estas enzimas pueden resultar en cambios en la composicin de aminocidos. Si estos cambios se producen, las protenas podran tener la misma actividad biolgica, pero como su composicin de aminocidos vara, podran tener diferente carga neta y por tanto diferentes velocidades de migracin en un campo elctrico. Estas diferencias determinan patrones caractersticos de migracin electrofortica de las formas isoenzimticas. Las enzimas que se utilizan en estos estudios se clasifican de acuerdo a su funcin y se representan con una sigla de tres letras. Por ejemplo: dehidrogenasas (alcohol dehidrogenasa ADH, glutamato dehidrogenasa GDH), oxidasas (peroxidasas PRX), hidrolasas (fosfatasas cidas ACP, esterasas EST), isomerasas (fosfoglucoisomerasa PGI) transferasas (fosfoglucomutasas PGM).

Las isoenzimas han tenido un rol prominente en estudios de poblaciones vegetales para determinar variabilidad y estructura gentica, sistemtica y biologa evolutiva as como en descripcin de germoplasma e identificacin de variedades.

Protenas de reserva El endosperma de los cereales es el principal componente de la semilla ya que representa aproximadamente el 80-90% de su peso seco. Almidn y protenas son las dos macromolculas ms importantes. El contenido de protena vara segn la especie, por ejemplo, los valores ms altos se dan en trigo y avena (10-17%) y los ms bajos en maz y arroz (6%). La concentracin de protenas en los cereales es apreciablemente menor que en las leguminosas ya que en stas los rganos de reserva o cotiledones son capaces de almacenar hasta un 40% de su peso seco en protenas. Las protenas del endosperma fueron estudiadas ya a comienzos del siglo pasado por el qumico Osborne (Metodologa de Osborne& Mendel), quien dio las bases para las clasificaciones actuales. La misma se basa en la solubilidad relativa en diferentes solventes: albminas solubles en agua, globulinas en solucin salina, prolaminas en alcohol y glutelinas en cidos o lcalis. El uso de protenas de almacenamiento en estudios de diversidad gentica sistemtica, se basa en el

hecho que las protenas de diferentes individuos, poblaciones y especies son homlogas, y que al separarse en un gel producirn bandas similares o diferentes. Debido a que las protenas de reserva carecen de actividad enzimtica, ellas son detectadas en el gel por medio de tcnicas generales de teido.

ADN y marcadores moleculares Un marcador de ADN es simplemente un punto de referencia en un cromosoma, que puede o no corresponder a un gen. Existen diversas tcnicas de biologa molecular disponibles para detectar variabilidad en la secuencia de ADN. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), las enzimas de restriccin, la separacin electrofortica de los fragmentos de ADN, las sondas marcadas y las hibridizaciones son algunas de las tcnicas que permiten obtener un nmero virtualmente ilimitado de marcadores moleculares. y cubrir la totalidad del genoma de un organismo. Los marcadores moleculares pueden ser clasificados en tres grupos: Grupo 1: Marcadores basados en la hibrididacin del ADN Estos tipos de marcadores involucran la deteccin de un segmento especfico (marcador) en el ADN de estudio por hibridacin con un fragmento marcado radiactivamente de secuencia complementaria al marcador (sonda). Esto implica que el investigador que busca estudiar un gen de inters, debe conocer al menos una parte de su secuencia, para poder construir una porcin complementaria (sonda) que permita pescar a ese gen de inters. Dentro de este grupo de marcadores se encuentran los RFLP y los VNTR o minisatlites. Las secuencias de ADN de minisatlites (VNTR) son secuencias repetidas que se presentan en eucariontes. Ellas se encuentran repetidas en tandem (una detrs de la otra) y dispersas a travs del genoma. Cada VNTR tiene distinto nmero de repeticiones variable, asocindose de esta manera un tamao distinto a cada alelo. Existen dos formas de detectar los VNTR ya sea por hibridacin o por tcnicas de PCR.

Grupo 2: Marcadores basados en la amplificacin del ADN

En este grupo se incluyen aquellos marcadores moleculares en los que se utiliza la reaccin de PCR (polymerasechainreaction) o reaccin en cadena de la polimerasa de ADN. Esta tcnica se basa en la sntesis enzimtica de millones de copias de un segmento especfico de ADN . Son muchos los marcadores moleculares que estn incluidos en este grupo, entre los que se encuentran los microsatlites o SSR, los RAPDs y CAPs.

Grupo 3: Marcadores mixtos Son aquellos que resultan de la combinacin de otros tipos de marcadores moleculares. Entre ellos se encuentran los AFLP, unos de los ms utilizados en estos tipos de estudios.

De la descripcin realizada, se desprende que los marcadores varan ampliamente en el grado de complejidad del mtodo, el nivel de polimorfismo y en los factores costo y tiempo, de gran importancia cuando los objetivos del estudio incluyen el anlisis de un nmero elevado de individuos. Estos son algunos de los aspectos importantes a tener en cuenta a la hora de elegir el tipo de marcador a utilizar en una determinada investigacin cientfica.

Aplicaciones de los marcadores moleculares Son mltiples las aplicaciones de los marcadores moleculares en el estudio de especies vegetales, animales, microbianas e incluso en el rea de los alimentos.

Utilizacin de los marcadores moleculares: Las herramientas descriptas anteriormente se utilizan en numerosas reas relacionadas con el mejoramiento vegetal y el anlisis de la biodiversidad. A continuacin se describen algunas de estas aplicaciones:

Identificacin de genotipos Pureza varietal El control de la pureza varietal y la discriminacin de variedades protegidas (es decir, registradas) requieren de una adecuada identificacin de los materiales. Esta identificacin se basa tradicionalmente en el uso de descriptores morfolgicos y fisiolgicos. Sin embargo, varios de los caracteres usados como

descriptores presentan limitaciones en cuanto al nmero restringido de variantes, influencia ambiental y dependencia del estadio de desarrollo de planta. Como alternativa para resolver estos problemas, los polimorfismos moleculares de protenas y ADNresultan de utilidad en la determinacin de los criterios DUS (distincin, uniformidad y estabilidad). Se utilizan localmente como datos complementarios de los descriptores morfolgicos y fisiolgicos para el registro de los cultivares.

Uso en bancos de germoplasma Los marcadores moleculares permiten caracterizar las accesioneso muestras a ser incluidas en las colecciones, estudiar el proceso de domesticacin, establecer relaciones filogenticas y colaborar en la eleccin de las estrategias de conservacin en los Bancos de germoplasma.

Mapeo gentico Un mapa genticode una especie muestra la distribucin linear de un grupo de genes y marcadores en cada uno de los cromosomas que constituyen el genoma de un organismo. El objetivo es encontrar aquellos marcadores moleculares que estn ligados a un gen de inters (es decir, que estn lo suficientemente cerca como para que segreguen juntos en la meiosis). As, si un marcador resulta estar genticamente ligado a un gen que controla un carcter de inters agronmico, la seleccin de este marcador resulta en la seleccin indirecta del gen de inters. Este hecho constituye el fundamento del proceso denominado seleccin asistida por marcadores moleculares (MAS), aplicado en el mejoramiento gentico vegetal y animal. Cuanto ms prximos estn el marcador y el gen en cuestin, ms eficiente ser la seleccin.

Mapeo comparativo La comparacin de mapas de ligamiento entre diferentes especies se denomina mapeo comparativo. Si un grupo de marcadores moleculares mantiene el orden y sus relaciones de ligamiento entre dos especies se dice que muestran sintenia. Diversos estudios en diferentes grupos taxonmicos mostraron una estrecha relacin entre los genomas de las especies comprendidas dentro de cada grupo. Esto se ha observado, por ejemplo, entre especies pertenecientes a las Solanceas (tomate, papa, pimiento), entre Arabidopsisy cultivos del gnero Brassica, y dentro de las gramneas entre especies pertenecientes a la tribu

Triticeas(trigo, cebada, centeno) as como entre especies pertenecientes a distintas subfamilias taxonmicas, tal el caso de arroz, maz y sorgo.

Distribucin de la variabilidad gentica en poblaciones naturales Las especies estn constituidas por unidades ms o menos aisladas denominadas poblaciones. Una especie vegetal raramente se extiende en forma continua e ininterrumpida. En general adopta una distribucin en parches. El nmero de individuos en cada poblacin, el modo reproductivo (autogamia-alogamia), las distancias entre poblaciones, el tipo de polinizacin (gravedad-anemfilaentomfila), la accin del hombre en la fragmentacin del hbitat y el origen histrico (especies nativas-especies introducidas) determinan en conjunto una distribucin de la variacin gentica propia de cada especie. Los proyectos destinados a la conservacin de especies naturales, tienen como objetivo seleccionar poblaciones que formarn parte de las reas protegidas, las cuales debern contener la mayor diversidad gentica posible de modo de asegurar el mayor potencial evolutivo. Los marcadores moleculares permiten establecer la diversidad gentica existente en estas poblaciones.

Estimacin del flujo gnico El flujo gnico entre poblaciones vegetales ocurre mediante el movimiento de polen o de semillas. La morfologa de semilla y polen, los mecanismos de dispersin, el tipo de polinizacin, etc., hacen que la contribucin de estas dos vas al flujo total vare de acuerdo a la especie. Los marcadores moleculares permiten cuantificar cada uno de estos procesos.

En resumen, en los ltimos treinta aos se produjeron grandes avances en biologa molecular que permitieron el desarrollo de tcnicas moleculares que admiten analizar en forma rpida y precisa el genoma de los seres vivos. A travs de estas tcnicas se obtuvieron gran cantidad de marcadores moleculares dispersos a lo largo de todo el genoma, se construyeron mapas genticos de diversas especies, y se ubicaron genes de resistencia a enfermedades, plagas, etc. Los marcadores ligados a genes de inters agronmico se pueden utilizar para realizar seleccin genotpica temprana, en plntulas, y de esta manera se evita manejar cientos o miles de plantas en la seleccin fenotpica en invernculo o a campo. La seleccin asistida por marcadores moleculares es una herramienta

muy interesante para los planes de mejoramiento, ya que permite acelerar la seleccin y disminuir los costos en el manejo de grandes poblaciones de plantas.

5.1.3.1. AFLP

Dentro de los marcadores moleculares mixtos se encuentran los AFLP, unos de los ms utilizados en estos tipos de estudios. El AFLP consiste en amplificar en forma selectiva fragmentos de ADN cortados con enzimas de restriccin. El ADN de las individuos a analizar se corta con dos enzimas de restriccin distintas y luego se le ligan adaptadores a los extremos de los fragmentos de ADN resultantes de dicha digestin, que permite que se amplifiquen en forma selectiva algunos de esos fragmentos que tienen las bases suplementadas a los cebadores o primers utilizados. La separacin de estos fragmentos por electroforesis en geles de poliacrilamida genera entre 50 y 100 fragmentos. La ventaja de este mtodo radica en que se puede analizar, en un solo ensayo, un gran nmero de regiones del genoma.

5.1.3.2. RAPD

Usa cebadores cortos (normalmente 10 bases). Amplifica regiones annimas de ADN. Los pasos involucrados en el laboratorio son: 1.- extraccin del ADN 2.- reaccin de PCR con un cebador al azar 3.- Separacion de los fragmentos de DNA

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