05 Validacion de Metodos Analiticos

Universidad Nacional de Ingeniera
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA
FACULTAD DE CIENCIAS
Escuela Profesional de Qumica
VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS
1. INTRODUCCIN
1. INTRODUCCIN
Establece mediante estudios sistemticos de laboratorio, demostracin que las caractersticas de dicho procedimiento cumplen las especificaciones relativas al uso previsto de los resultados.
1. INTRODUCCIN
La NTP-ISO/IEC 17025:2006 5.4.5 Validacin de los mtodos
5.4.5.1 La validacin es la confirmacin, a travs del examen y el aporte de evidencias objetivas, de que se cumplen los requisitos particulares para un uso especfico previsto.
5.4.5.2 El laboratorio debe registrar los resultados obtenidos, el procedimiento utilizado para la validacin y una declaracin sobre la aptitud del mtodo para el uso previsto.
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1. INTRODUCCIN
CUNDO VALIDAR?
Mtodos No normalizados Mtodos Desarrollados por el propio laboratorio Mtodos Normalizados usados fuera de su alcance Mtodos Normalizados modificados
1. INTRODUCCIN
SECUENCIA DE ACTIVIDADES EN LA VALIDACIN DE MTODOS DE ENSAYO
Transformar la necesidad del cliente en requisitos analticos especficos
Seleccin de la metodologa
Revalidacin
Evaluacin de los parmetros de validacin
Seleccin de los parmetros de validacin
Caracterizar la metodologa
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2. OBJETIVOS DE LA VALIDACIN Evaluar las caractersticas de desempeo del mtodo. Demostrar que el mtodo desarrollado por un laboratorio es til para la aplicacin propuesta. Demostrar que las modificaciones realizadas a un mtodo no afectan su desempeo, de tal manera que se obtenga resultados confiables. Demostrar que un mtodo es equivalente a otro.
3. TIPOS DE VALIDACIN
3.1. PROSPECTIVA
Proceso de validacin para metodologas nuevas.

3.2. RETROSPECTIVA
Proceso de validacin para mtodos utilizados a diario no validados anteriormente y de los cuales se dispone de suficiente documentacin para probar los atributos del mtodo.
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3. TIPOS DE VALIDACIN
3.3. REVALIDACIN
Repeticin total o parcial de una validacin, por la introduccin de algn cambio que se espera afecte a un mtodo ya validado.
10
4. REQUISITOS PARA LA VALIDACIN

Calificacin del personal en el uso de los mtodos a validar. Verificacin, calibracin y control de los instrumentos de medicin y material de vidrio utilizado.
11

Utilizacin de reactivos apropiados y disoluciones de trabajo valoradas. Procedimiento normalizado de operacin del mtodo de ensayo.
ESTNDARES
12

Observacin de las medidas de seguridad y BPL.
13
5. PROTOCOLO DE LA VALIDACIN Describe las etapas de validacin de un mtodo y establece la elaboracin de un plan de validacin.
14
6. DOCUMENTACIN DE LA VALIDACIN La documentacin de un mtodo tiene efecto directo sobre la consistencia de su aplicacin, en consecuencia, tiene tambin influencia en su reproducibilidad y en la estimacin de la incertidumbre asociada. Se debe generar un informe de la validacin del mtodo con informacin clara y sin ambigedades, estar suficientemente soportada para ser utilizada por los analistas y producir resultados consistentes.
15
7. PARMETROS DE DESEMPEO
16
7.1. VERACIDAD
Es la proximidad de concordancia entre el

valor promedio obtenido de una serie de resultados de prueba y un valor de referencia aceptado. La medida de la veracidad se expresa por lo general en trminos de sesgo.
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7.1. VERACIDAD
Se define dos componentes del sesgo:
Sesgo del mtodo: Errores sistemticos

inherentes al mtodo Sesgo de laboratorio: Errores sistemticos caractersticos del laboratorio y de la interpretacin del mtodo.
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7.1. VERACIDAD
Sesgo del mtodo
Sesgo del laboratorio
medida
+ B
Variabilidad aleatoria
m
Valor de referencia
19
7.1. VERACIDAD
Se estima el sesgo combinado (sesgo del mtodo y sesgo de laboratorio) y debe ser comparado con cualquier sesgo proveniente del mtodo de referencia.
Debe ser medido contra los materiales o mtodos de referencia apropiados tomando en cuenta la precisin del mtodo, la incertidumbre en la medicin y la exactitud requerida.
20
7.1. VERACIDAD
Determinacin de la veracidad.
Revisin empleando el mtodo analtico

con respecto a valores de referencia de un material certificado (MRC), trazable a estndares internacionales. Revisin empleando un mtodo alternativo caracterizado.
21
7.1. VERACIDAD
Determinacin de la veracidad.
Analizando
muestras fortificadas (Ensayos de Adicin y Recuperacin).
Comparando los resultados obtenidos en

un Ensayo de Aptitud.
22
7.1. 1. DETERMINACION DE LA VERACIDAD
Utilizando
Material Certificado (MRC).
de
referencia
MRC
Repeticin 1 Repeticin 2 Repeticin 3 Repeticin n
Se determina por: Prueba t-Student de una muestra Prueba de Wilconson de una muestra
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Criterio de decisin
P valor ( =0.05)
P valor >
Conclusin
El mtodo es veraz al 95% de confianza
P valor
El mtodo no es veraz al 95% de confianza
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Ejemplo: Determinar la veracidad en los siguientes resultados de ensayo de un MRC que contiene 4.629 mg/mL
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 4.620 4.621 4.624 4.626 4.634 4.628 4.622 4.627 4.631 4.627 4.623 4.608 4.621 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 4.608 4.627 4.617 4.639 4.635 4.634 4.640 4.622 4.631 4.631 4.623 4.621 4.625
25
Comparando con un Mtodo de Referencia.

Procedimiento Analtico Muestra Repeticin 1 Repeticin 1 Repeticin 2 Mtodo de Referencia
Repeticin 2
Repeticin n
Repeticin n
Se determina por: Prueba t-Student de dos muestras Prueba de Mann Whitney
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Comparando con un Mtodo de Referencia.

Ejemplo: La veracidad de un mtodo para la vigilancia de la concentracin de SO2 en el aire, fue determinada por comparacin de los resultados obtenidos del mtodo a validar con los resultados de un mtodo de referencia.
Mtodo de referencia 21.62 22.20 24.27 23.54 24.25 23.09 21.02 Mtodo nuevo 21.54 20.51 22.31 21.30 24.62 25.72 21.54
27
7.2. PRECISIN
Grado de concordancia entre los resultados obtenidos al aplicar el procedimiento experimental repetidas veces bajo las condiciones establecidas
Nivel de variabilidad
Repetibilidad
Precisin intermedia
Reproducibilidad
28
7.2. PRECISIN
La precisin depende slo de la distribucin de los errores aleatorios y no se relaciona con el valor verdadero. La medida de la precisin generalmente se expresa en trminos de imprecisin y se evala en base a la desviacin estndar de los resultados de la prueba.
29
7.2. PRECISIN
Repetibilidad Precisin en condiciones de repetibilidad, es decir, condiciones segn las cuales los resultados independientes de una prueba se obtienen con el mismo mtodo, sobre objetos de prueba idnticos, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, usando el mismo equipo y dentro de intervalos de tiempos cortos.
30
7.2. PRECISIN
Reproducibilidad Precisin en condiciones de reproducibilidad, es decir, condiciones segn las cuales los resultados de prueba se obtienen con el mismo mtodo, sobre objetos de prueba idnticos, en diferentes laboratorios, por diferentes operadores, usando diferentes equipos.
31
7.2.1. DETERMINACIN DE LA PRECISIN
Repeticiones
Muestra.
independientes
Repeticin 1 Repeticin 2 Repeticin 3
en
Muestra
Repeticin n
Se determina por: Comparacin con RSD de Horwitz

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RSD experimental:
RSD Horwitz:
Criterio de decisin
s RSDexperimental 100 x
in RSDHorwitz 2(10.5log(Concentrac ))
Conclusin
RSDexperimental < RSDHorwitz

RSDexperimental RSDHorwitz
Metodologa Precisa
Metodologa No Precisa
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Ecuacin de Horwitz
Valores aceptables de precisin en funcin de la concentracin para reproducibilidad (aceptados por AOAC)
%RSD 210.5logC
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Ejemplo: Para determinar la precisin en un mtodo se evalu la dispersin de los resultados en una muestra.
Repeticin
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
mg/kg
0.20 0.22 0.19 0.21 0.19 0.20 0.18 0.17 0.18 0.16
Repeticin
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
mg/kg
0.18 0.22 0.19 0.21 0.19 0.20 0.23 0.17 0.20 0.21
Repeticin
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
mg/kg
0.19 0.21 0.21 0.18 0.16 0.21 0.19 0.17 0.17 0.19
35
Resultados
Concentracin Desviacin promedio (mg/kg) estndar (S)
0.20 0.0183
%RSD Experimental
9.15
%RSD Horwitz
20.39
Conclusin: La metodologa es Precisa
36
7.3. SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD
Selectividad Caracterizacin cuantitativa de la presencia de interferencias en la determinacin de un analito mediante un procedimiento determinado (IUPAC Compendium of Chemical Terminology, 1987).
37
Selectividad cualitativa: Indicacin de la

presencia de sustancias interferentes.
Selectividad cuantitativa: Caracterizacin

cuantitativa de interferentes.
38
Especificidad Capacidad de un mtodo para determinar el contenido de un analito inequvocamente en presencia de otros componentes (impurezas, matriz, etc).
39
Si las Interferencias estn presentes y no pueden ser separadas del analito o no son conocidas pueden tener varios efectos en el anlisis: o Distorsionar la seal. o Contribuir a la seal del analito produciendo un aparente incremento en su concentracin. o Suprimir la seal del analito.
40
7.3.1. DETERMINACIN DE LA SELECTIVIDAD
La prueba consiste en verificar que las interferencias no afecten significativamente la seal. Se realiza muy frecuentemente en tcnicas instrumentales como: espectrofotometra de UV o cromatografa liquida, gaseosa.
41
Ejemplo: Para tcnicas cromatogrficas, se debe de comparar visualmente los cromatogramas en los diferentes parmetros importantes como: resolucin, tiempo de retencin, etc. Se analizan: Blancos reactivos Blanco de matriz Analito puro Patrn del Analito Matriz adicionada con concentracin conocida de analito puro
42
Ejemplo: Se debe comparar los resultados obtenidos en los distintos registros, y debe observarse: La seal correspondiente a la matriz sea despreciable frente a la del analito. La seal del analito en la matriz fortificada debe seguir el mismo patrn que la seal del analito puro. En el mejor de los casos, que no se detecte seal en el blanco de matriz.
43
7.4. LMITE DE DETECCIN Y DE CUANTIFICACIN
Lmite de Deteccin (LoD) La menor concentracin del analito en una muestra que puede detectarse pero no necesariamente cuantificarse bajo las condiciones establecidas. El lmite de deteccin, expresado como concentracin cL, se deriva de la medicin mas pequea xL que puede ser detectada con certeza razonable para un procedimiento analtico dado.
44
XL =
Xbl
k Sbl
Es la medida de las mediciones del blanco (10), valor positivo o cero.
Es un factor numrico elegido de acuerdo al nivel de confianza deseado.
Es la desviacin estndar de las mediciones del blanco.
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Lmite de Cuantificacin (LoQ) Menor concentracin de analito que puede determinarse con precisin y exactitud razonables en las condiciones establecidas.
Se obtiene multiplicando por el factor el valor obtenido en el calculo del lmite de deteccin correspondiente.
46
47
7.4.1. DETERMINACIN DEL LMITE DE DETECCIN Y DE CUANTIFICACIN
Ejemplo Los datos obtenidos en la calibracin para determinar plomo a partir de su espectro de emisin de llama se analizaron por mnimos cuadrados y la ecuacin obtenida fue: S = 1.12 cPb + 0.312 Siendo cPb la concentracin de plomo en ppm y S la seal de la intensidad relativa de la lnea de emisin de plomo.
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7.4.1. DETERMINACIN DEL LMITE DE DETECCIN Y DE CUANTIFICACIN
Ejemplo Se obtuvieron los siguientes resultados en los replicados:
Determine el lmite de Deteccin y el lmite de Cuantificacin.

49
7.5. RANGO DE TRABAJO
Es el intervalo entre las mas baja y alta concentracin del analito de la muestra, para la cual se ha demostrado que el mtodo de ensayo tiene un nivel apropiado de precisin y exactitud. (Text on validation of analytical procedures. ICH Harmonized Tripartite Guideline)
50
7.5. RANGO DE TRABAJO
El rango se expresa en las mismas unidades que los resultados obtenidos por ese mtodo. Los rangos son establecidos por las normativas. Dentro de rango de trabajo puede existir un rango de respuesta lineal.
51
7.5.1. OBTENCIN DEL RANGO DE TRABAJO
Dicho intervalo esta definido por: La menor concentracin del intervalo, que estara dada por los valores del lmite de deteccin o lmite de cuantificacin. La mayor concentracin estara establecida por efectos que dependern de la tcnica analtica y del sistema de respuesta del instrumento.
52
7.5.1. OBTENCIN DEL RANGO DE TRABAJO
53
7.6. LINEALIDAD
Es la relacin entre la concentracin del analito y la respuesta del mtodo. Esta relacin denominada generalmente como Curva de Calibracin no siempre es lineal, en estos casos se debe determinar la ecuacin adecuada. La linealidad define la capacidad del mtodo para obtener resultados de la prueba proporcionales a la concentracin del analito.
54
7.6. LINEALIDAD
Verificacin Mediante inspeccin visual, adems de su confirmacin mediante revisiones de linealidad empleando al menos 10 diferentes concentraciones. Mediante evaluacin del intervalo de trabajo realizando clculos segn la teora regresin lineal por mnimos cuadrados.
55
7.6.1. OBTENCIN DE LA LINEALIDAD
Obtencin La menor concentracin del intervalo, que estara dado por el valor del lmite de cuantificacin. La mayor concentracin estara establecida por efectos que dependern de la tcnica analtica y del sistema de respuesta del instrumento.
56
7.6.1. OBTENCIN DE LA LINEALIDAD
Ejemplo Analice el intervalo de calibracin lineal del siguiente experimento de fluorescencia.
Concentracin (ug/mL) 0 2
Intensidad de fluorescencia 0.1 8.0
4 6
8 10
15.7 24.2
31.5 33.0
57
7.7. SENSIBILIDAD
Cambio de la respuesta del sistema de medicin en funcin del cambio de la concentracin del analito. O es la capacidad para discriminar entre pequeas diferencias de concentracin del analito. Nota: Aunque esta definicin se aplica claramente a un instrumento de medicin, tambin puede aplicarse al mtodo analtico como un todo.
58
7.7.1. DETERMINACIN DE LA SENSIBILIDAD
Obtencin Se evala mediante la sensibilidad de calibracin, que es la pendiente concentracin/ unidades de intensidad de los datos de la curva de calibracin a la concentracin de inters, es decir, el gradiente de la respuesta de la curva, si la respuesta es lineal con respecto a la concentracin.
59
7.7.1. DETERMINACIN DE LA SENSIBILIDAD
60
7.8. ROBUSTEZ
La robustez es una medida de la resistencia de un mtodo al cambio de respuestas cuando se introducen pequeas variaciones en el procedimiento. (EURACHEM Guide The fitness for purpose of analytical methods)
61
7.9. INCERTIDUMBRE
La incertidumbre es un parmetro asociado con el resultado de una medida que caracteriza la dispersin de los valores, que podran ser razonablemente atribuidos al mensurando el cual comprende varios componentes.
62

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Se define dos componentes del sesgo:

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Se determina por: Comparacin con RSD de Horwitz

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RSDexperimental < RSDHorwitz

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