Enzimas

A qualquer momento, todo o trabalho dentro de uma clula est sendo feito por enzimas. Se voc compreende as enzimas, entende as clulas. Uma bactria como a E. coli possui cerca de mil tipos diferentes de enzimas flutuando no seu citoplasma. Enzimas tm propriedades extremamente interessantes que fazem delas mquinas de produzir reaes qumicas. O propsito da enzima de uma clula permitir que essa faa reaes qumicas com bastante rapidez. E so essas reaes que permitem que as clulas construam ou separem coisas conforme a necessidade. assim que uma clula cresce e se reproduz. Simplificando bastante, uma clula nada mais do que um saco cheio de reaes qumicas possibilitadas pelas enzimas. As enzimas so feitas de aminocidos e so protenas. Quando uma enzima se forma, ela feita pelo encadeamento de cem a mil aminocidos em uma ordem muito especfica e nica. A cadeia de aminocidos, ento, se dobra para adquirir uma forma exclusiva. Essa forma permite que a enzima produza reaes qumicas especficas. Uma enzima age como um catalisador muito eficiente para uma determinada reao qumica. Ela aumenta muito a velocidade dessa reao. Por exemplo, o acar maltose feito de duas molculas de glicose ligadas. A enzima maltase tem um formato especfico que lhe permite quebrar a ligao e liberar dois pedaos de glicose. A nica coisa que a maltase pode fazer quebrar molculas de maltose, mas ela faz isso de maneira muito rpida e eficiente. Outros tipos de enzimas podem colocar tomos e molculas juntos. Separar e juntar molculas o trabalho das enzimas, e h uma enzima especfica para cada reao qumica necessria para que a clula funcione corretamente.

A estrutura qumica da glicose

A maltose composta por duas molculas de glicose ligadas (1). A enzima maltase uma protena que tem um formato perfeito para aceitar uma molcula de maltose e quebrar essa ligao (2).

As duas molculas de glicose so liberadas (3). Uma simples enzima maltase consegue quebrar mais de mil ligaes de maltose por segundo, mas somente ir funcionar com molculas de maltose.

No diagrama acima possvel ver a ao bsica de uma enzima. Uma molcula de maltose flutua nas proximidades e acaba sendo presa em um stio especfico da enzima maltase. O stio ativo da enzima quebra a ligao e as duas molculas de glicose se separam. Voc j pode ter ouvido que h pessoas que so intolerantes lactose, ou quem sabe voc mesmo tem o problema. Esse problema surge porque o acar do leite (a lactose) no pode ser quebrada em suas partes de glicose, e conseqentemente o seu corpo no pode digeri-la. As clulas do intestino das pessoas intolerantes lactose no produzem lactase, a enzima necessria para quebrar a lactose. Este problema mostra como a falta de apenas uma enzima no corpo humano pode criar problemas. Se uma pessoa intolerante lactose engolir uma gota de lactase antes de beber leite, o problema se resolve. Mas muitas deficincias enzimticas no so to fceis assim de se consertar. Dentro de uma bactria, h cerca de mil tipos de enzimas (a lactase uma delas). Todas as enzimas flutuam livremente no citoplasma espera de compostos qumicos especficos passarem por perto. H centenas ou milhes de cpias de cada tipo diferente de enzima, dependendo da importncia que uma reao tem para a clula e da freqncia em que a reao deve acontecer. Essas enzimas fazem tudo o que for preciso para quebrar a glicose e ter energia para construir as paredes celulares, novas enzimas e permitir que a clula se reproduza. So as enzimas que fazem todo o trabalho dentro das clulas

ENZIMAS A exposio dos alimentos temperaturas elevadas (cozimento, etc.), destri as enzimas neles contidos. Quando os alimentos no contm as enzimas necessrias, o organismo obrigado a usar as suas prprias, gastando no processo energia e recursos. Essa uma das vantagens da alimentao vegetariana Viva (crudvora ou crudicista) sobre os alimentos cozinhados da alimentao dita normal. Mas qual afinal a importncia das enzimas? Vejamos: Enzimas so, em termos biolgicos, compostos proticos complexos, caracterizados por longas cadeias de aminocidos, unidos por ligaes peptdicas. Enzimas so estruturas proticas ativas, bsicas, que so essenciais vida. Sem enzimas a vida, como a conhecemos, no seria possvel. As enzimas representam a fonte de energia orgnica e a vitalidade bioqumica central de toda a estrutura viva existente, incluindo-se os animais, plantas, algas e microorganismos. As enzimas so essenciais para a formao estrutural, crescimento, desintoxicao, defesa e mecanismos de cura do nosso organismo. So fundamentais na regulao das atividades bioqumicas do organismo, como a digesto e absoro de alimentos, equilbrio hormonal, atividade cerebral, humor, sexualidade, circulao sangunea, respirao, estmulos nervosos, reposio celular, sistema imunolgico, mecanismos dos sentidos (paladar, olfato, tato, viso e audio) e outras.

Sem enzimas, nem mesmo se efetiva a funo de assimilao e distribuio de vitaminas e sais minerais. A vitalidade e longevidade esto relacionadas s enzimas. Toda a nossa sade depende da manuteno de nveis enzimticos adequados. Por exemplo, so detectadas carncias enzimticas em muitos casos de doenas crnicas, como cncer, reumatismo, artrite reumatide, alergias, doenas cardiovasculares, e muitas outras. As enzimas podem ser divididas em dois grupos, as endgenas e as exgenas. As endgenas ou internas, originam-se no prprio organismo e as exgenas ou externas, so originadas fora do corpo e so obtidas dos alimentos ingeridos. As endgenas, dividem-se em metablicas e digestivas. As metablicas esto presentes nas clulas, no sangue e nos tecidos em geral. As digestivas esto presentes no trato digestivo. Ao nascer, recebemos um potencial enzimtico metablico limitado. como se o organismo recebesse uma reserva limitada para metabolizar enzimas. At onde se sabe, quanto mais enzimas prprias o organismo precisa usar, ao longo do tempo, menos capacidade lhe resta para manter os nveis enzimticos necessrios. como se essa reserva se fosse esgotando na medida em que vai sendo usada. Quanto mais rapidamente usamos essa reserva, mais curta ser nossa vida e mais deficiente nossa sade. Os nveis enzimticos nos tecidos corporais so elevados na infncia e reduzidos na velhice. Um recm-nascido pode apresentar cerca de cem vezes mais enzimas na corrente sangunea do que um idoso (com alimentao cozinhada durante a sua vida). Por outro lado um idoso apresenta cerca de mil vezes mais radicais livres no seu organismo que o recm-nascido. O enfraquecimento dos nveis de enzimas est ligado ao aumento de radicais livres, associado carncia de micro-minerais. A reduo do potencial enzimtico do organismo causa de doenas degenerativas e envelhecimento precoce. Os alimentos crus trazem consigo as enzimas necessrias sua prpria digesto. As nossas enzimas digestivas, presentes na saliva (ptialina), no estmago (proteases), nos intestinos (lpases) e as produzidas pelo pncreas, atuam como reservas ou para complementar o processo digestivo. Normalmente o corpo conta com a presena das enzimas digestivas que j vm com os alimentos. A reduo do nosso potencial enzimtico provocada principalmente e em ordem de importncia, por: A) Ingesto de alimentos pobres em enzimas B) Estresse C) Consumo de lcool, acar e outros destruidores de vitaminas e minerais D) Uso excessivo de medicamentos E) Poluio ambiental Se exposta ao calor intenso, uma enzima completamente destruda, mas se mantida a uma temperatura corporal, durante o tempo necessrio, ser ativada e realizar adequadamente suas funes.

O cozimento, ao destruir as enzimas de qualquer alimento, perturba a programao biolgica do organismo, aperfeioada durante milhes de anos, e cria uma sobrecarga orgnica, j que provoca a necessidade de produo de enzimas digestivas. A produo dessas enzimas digestivas desvia substncias presentes nas enzimas metablicas. Desta forma provocado um enfraquecimento das funes gerais que dependem dessas enzimas, debilitando o organismo e expondo-o a variadas molstias. Quando comemos a comida cozinhada, para a sua digesto e assimilao, o corpo precisa usar suas prprias enzimas. Essas enzimas a que o corpo precisa recorrer, poderiam estar servindo para atividades mais importantes, tais como limpar o fgado, proteo contra tumores, eliminao de radicais livres e toxinas em geral. Tudo isso, porque o cozimento destruiu as toxinas que j estavam contidas nos alimentos quando crus. Sob estresse, ocorrem importantes perdas minerais, o que enfraquece os nveis de enzimas metablicas e reduz a capacidade das digestivas. O acar refinado, um produto desmineralizante, que rouba clcio, magnsio e vitaminas do complexo B, e um agente enfraquecedor do organismo. O abuso de bebidas alcolicas, reduz as reservas corporais de tiamina (vitamina B1), e de outras vitaminas envolvidas com a estruturao enzimtica. O uso constante de medicamentos, principalmente os antibiticos, enfraquece os mecanismos de defesa do organismo, interfere nos processos de autoregulao e homeostase, afetando as funes das enzimas. A poluio ambiental origina a ingesto de compostos qumicos, molculas agressoras e metais pesados, que intoxicam e alteram as funes celulares, prejudicando tambm a funo das enzimas. Esses fatores associados causam um aumento de radicais livres, devido incapacidade das enzimas metablicas de inibir a sua formao (radicais livres). Em quantidades elevadas, esses radicais livres, interferem nas atividades celulares, provocando mutaes, erros genticos, inibio de secrees celulares e uma poro de outros problemas. Outra conseqncia, menos evidente, mas relevante, da diminuio dos nveis enzimticos do organismo, que nos tornamos menos sensveis aos outros e ns prprios, prejudicando nossa espiritualidade. Gastamos energia demasiada na desintoxicao e deixamos de usa-la para outras finalidades importantes.

Prof. Dr. Luiz Antonio Gallo Colaboradores: Giuliana Castro Magalhes Paulo F. Mendes Filho

ENZIMAS

I- CONCEITO As enzimas so protenas especializadas em catalisar reaes biolgicas, ou seja aumentam a velocidade de uma reao qumica sem interferir no processo. Elas esto associadas a biomolculas, devido as suas extraordinria especificidade e poder cataltico. I- a. Histria O nome enzima provm de "in yeasts", no qual suspeitava-se que as catlises biolgicas estavam envolvidas com a fermentao do acar em lcool. A primeira descoberta foi feita por Payen e Persoz em 1833, quando encontraram uma substncia termolbil no precipitado do lcool, extrato de malte, que convertia amido em acar, mais tarde denominada amilase. A primeira teoria foi publicada em 1835 por Berzelius. Pasteur em 1860 postulou que as enzimas esto associadas estrutura e a vida da clula. Em 1877 Buchener obteve sucesso na extrao de enzimas de clulas de leveduras que catalisavam a fermentao alcolica. Isto demonstrou que estas enzimas catalisavam a maioria das vias metablicas energticas e podem funcionar independentemente da sua estrutura. A enzima foi primeiramente isolada na forma cristalina, mas isto foi compreendido melhor quando Summer em 1926 isolou urease de feijo e evidenciou que estes cristais consistem em protenas. Hoje 2000 diferentes enzimas so conhecidas, nas quais muitas so isoladas na forma pura homogenizada e 200 na forma cristalizada. II- NATUREZA E ESTRUTURA ENZIMTICA Todas as enzimas so protenas, mas nem todas as protenas so enzimas. As protenas, como um todo, ocupam um papel de destaque na dinmica e estruturao dos organismos vivos. As enzimas, parte deste grupo de protenas, funcionam como catalisadores, permitindo que uma reao qumica venha a ocorrer dentro dos limites das temperaturas biolgicas. Para um perfeito entendimento sobre a estrutura de uma enzima e como esta funciona, devemos considera-la tanto como uma protena quanto um catalisador biolgico. Como uma protena a enzima apresenta blocos de construo denominados aminocidos. Algumas protenas, tais como ribonucleases, quimiotripsina e tripsina, so constitudas apenas de aminocidos. Outras

protenas, alm dos aminocidos, contm componentes orgnicos e inorgnicos e so denominadas de protenas conjugadas. A peroxidase e a catalase so exemplos de enzimas com estrutura conjugada e que apresentam porfirina frrica como cofator. As ligaes peptdicas que ligam cadeias lineares de aminocidos caracterizam a estrutura primria das protenas. Considerando-se apenas a estrutura primria de uma protena, a molcula deveria ser muito extensa e muito fina. Porm, muitas enzimas apresentam uma forma globosa em vez da fina fita linear, evidenciando estruturaes de ordem superior, conhecidas como estrutura secundria, terciria e quaternria, que ocorrem em funo de interaes intrnsecas entre os blocos constituintes da molcula. A estrutura secundria de uma protena caracterizada pela formao de alfa hlices e folhas beta, conformaes resultantes das interaes acima mencionadas. Somente esta estrutura adicional explica como uma molcula de protena possa ser to compacta. Quando as quatro pontes de dissulfeto que estabilizam a estrutura de uma ribonuclease so reduzidas em uma soluo de uria, a cadeia polipeptdica assume uma conformao espiralada randmica e perde toda a sua atividade enzimtica. Removendo-se a uria e o agente redutor e deixando-se as pontes de dissulfeto restabelecerem-se, mais de 90% da atividade enzimtica volta a ocorrer e as propriedades da molcula retornam quelas do estado original. Na estrutura terciria, a protena est enrolada de uma maneira complexa e irregular, formando um prisma compacto, triangular e s vezes achatado. Nesta conformao os grupos heme e quase todos os resduos de aminocidos polares esto na superfcie enquanto que quase todos os resduos de aminocidos no polares esto orientados para o interior da molcula. Consequentemente, os resduos hidroflicos esto expostos ao solvente, gua, enquanto os resduos hidrofbicos so removidos da gua o quanto possvel. Um nmero grande de diferentes ligaes est envolvido na estabilizao desta conformao terciria. Estas incluem ligaes eletrostticas, pontes de hidrognio, pontes hidrofbicas, pontes dipolares e pontes de dissulfeto. Muitas enzimas so compostas de uma cadeia polipeptdica simples. Este caso de enzimas como a ribonuclease, lisosima, tripsina,pepsina e algumas alfa amilases. Ao contrrio, existe um grande nmero de enzimas que so compostas por mais de uma cadeia peptdica. A enzima lactatodesidrogenase composta por quatro cadeias polipeptdicas. A repetio das cadeias polipeptdicas na construo de uma macromolcula de protena caracteriza a estruturao quaternria que esta pode assumir. III- NOMENCLATURA E CLASSIFICAO DAS ENZIMAS:

A nomenclatura das enzimas tem sido utilizada de vrias maneiras. A mais utilizada feita pela adio do sufixo ase ao nome do substrato (chamada de Nome Recomendado), ou seja, a molcula na qual a enzima exerce sua ao cataltica. Neste caso, a enzima urease catalisa a hidrlise da uria em amnia e CO2, a arginase catalisa a hidrlise da arginina em ornitina e uria, e a fosfatase catalisa a hidrlise de steres de fosfato. Entretanto, esta nomenclatura simples no tem se mostrado prtica uma vez que muitas enzimas recebem denominaes que, do ponto de vista qumico, so muito pouco informativos. Por esta razo, e tambm devido descoberta de novas enzimas, foi proposta uma classificao sistemtica recomendada por uma comisso internacional de especialistas no estudo de tais macromolculas. O novo sistema de classificao divide as enzimas em seis Classes principais, nas quais esto inclusas subclasses de acordo com o tipo de reao catalisada. De acordo com esta sistemtica, cada enzima designada por um Nome Recomendado, usualmente pequeno e apropriado para o uso dirio, um Nome Sistemtico, o qual identifica a reao catalisada, e um Nmero de Classificao, o qual usado quando uma identificao precisa necessria. Como exemplo do novo sistema de classificao, considere a reao abaixo catalisada por uma enzima: ATP + creatina ADP + fosfocreatina O Nome Recomendado para esta enzima, que o normalmente usado, creatininaquinase e o Nome Sistemtico, baseado na reao catalisada, ATP:creatina fosfotransferase. Seu nmero de classificao EC 2.7.3.2, onde EC representa Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology - IUBMB, o primeiro dgito, 2, a Classe (transferase), o segundo dgito, 7, a Subclasse (fosfotransferase), o terceiro dgito, 3, a Sub-subclasse em que a fosfotransferase apresenta um grupo nitrogenado como aceptor, e o quarto dgito, 2, designa uma creatina quinase. O quadro abaixo relaciona os cdigos utilizados para a aplicao do nmero de identificao das enzimas. Classificao das Enzimas Segundo a Comisso de Enzimas
1. Oxido-redutases (reaes de oxidao-reduo ou transferncia de eltrons Desidrogenases e Oxidases) 1.1.atuando em CH-OH 1.2.atuando em C=O 1.3.atuando em C=O1.4.atuando em CH-NH2 1.5.atuando em CH-NH1.6.atuando em NADH, NADPH 2.Transferases (transferem grupos funcionais como amina, fosfato, acil, carboxil Quinases e Transaminases)

2.1.grupos com um carbono 2.2.grupos aldedo ou cetona 2.3.grupos acil 2.4.grupos glicosil 2.7.grupos fosfatos 2.8.grupos contendo enxfre 3.Hidrolases (reaes de hidrlise de ligao covalente - Peptidases) 3.1.steres 3.2.ligaes glicosdicas 3.4.ligaes peptdicas 3.5.outras ligaes C-N 3.6.anidridos cidos 4.Liases (catalisam a quebra de ligaes covalentes e a remoo de molculas de gua, amnia e gs carbnico Dehidratases e Descarboxilases) 4.1. =C=C= 4.2. =C=O 4.3. =C=N5.Isomerases (reaes de interconverso entre ismeros ticos ou geomtricos - Epimerases) 5.1.racemases 6.Ligases (catalisam reaes de formao de novas molculas a partir da ligao entre duas pr-existentes, sempre s custas de energia - Sintetases) 6.1. C-O 6.2. C-S 6.3. C-N 6.4. C-C

IV- CINTICA DA CATLISE ENZIMTICA A cintica enzimtica a parte da Enzimologia que estuda a velocidade das reaes enzimticas bem como os fatores que a influenciam. Os princpios gerais da cintica das reaes qumicas aplicam-se s reaes catalisadas enzimaticamente, embora estas tambm mostrem um padro distinto que no usualmente encontrado nas reaes no enzimticas: saturao com o substrato.

No grfico ao lado podemos observar o efeito da concentrao do substrato na taxa de uma reao catalisada por uma enzima, A P. Em concentraes de substrato muito baixas, a velocidade inicial de reao v0 quase proporcional concentrao da concentrao do substrato e a reao de primeira ordem em relao ao substrato. Entretanto, a proporo que a concentrao do substrato aumenta, a taxa inicial passa a crescer menos, significando que no mais proporcional

concentrao do substrato. Nessa zona, as ordens das reaes esto misturadas. Com o posterior aumento na concentrao do substrato, a taxa de reao torna-se essencialmente independente da concentrao do substrato e aproxima-se assintoticamente a uma taxa constante. Nesses valores de concentraes de substrato a reao de ordem zero em relao ao substrato e a enzima tida como estando saturada com o substrato. Todas as enzimas apresentam o efeito da saturao, porm variando consideravelmente no que diz respeito concentrao requerida para produzi-lo. Esse efeito de saturao levou alguns pesquisadores a estabelecerem a hiptese de que enzima e substrato reagem reversvelmente para formar um complexo, passo essencial na catlise de uma reao. Em 1913 a teoria da ao e cintica enzimtica foi desenvolvida por dois cientistas chamados L. Michaelis e M. L. Menten, na qual uma reao enzimtica pode ser expressa pela seguinte equao, considerando-se apenas um substrato: Enzima + Substrato [EnzimaSsubstrato] Enzima + Produto As molculas do substrato passam por uma srie de formas geomtrica e eletricamente alteradas antes de formarem produtos da reao e a energia livre destes intermedirios, especialmente aquelas que se encontram em estados de transio mais instveis, so os mais determinantes da taxa de reao. As enzimas tm muito maior afinidade por estes estados de transio do substrato do que tm por formas mais estveis. Como esta interao abaixa a energia destes estados de transio crticos, as enzimas podem acelerar uma determinada reao. A partir do modelo de reao proposto por estes pesquisadores, desenvolveu-se uma equao que nos permite demonstrar como a velocidade de uma reao varia em funo da concentrao do substrato, a qual est a seguir descrita:
V max[S ] V0 = Km + [ S ]

Esta equao relaciona a velocidade (V0), a velocidade mxima (Vmax) e a concentrao inicial de substrato com a constante de MichaelisMenten (Km). O Km de um substrato a concentrao do substrato na qual a velocidade inicial de reao equivale metade da velocidade mxima. Para reaes que envolvem um substrato expressa em moles por litro e independente da concentrao da enzima. O quadro abaixo relaciona algumas enzimas e seus respectivos Km.

Enzima Catalase Hoxoquinase Quimiotripsina

Substrato H2O2 Glicose Frutose N-benzoltirosinamida N-formiltirosinamida N-acetiltirosianamida Gliciltirosinamida HCO3Glutamato -cetoglutarato NH4+ NADox NADred Aspartato -cetoglutarato Oxalacetato Glutamato

Km (mM) 25 0,15 1,5 2,5 12,0 32 122 9,0 0,12 2,0 57 0,025 0,018 0,9 0,1 0,04 4,0

Anidrase carbnica Glutamato desidrogenase

Aspartato amininotransferase

Pode-se observar pelo quadro apresentado que os valores de Km no so fixos e podem variar com a estrutura do substrato, com o pH e com a temperatura. Para enzimas que atuam em mais de um substrato, cada substrato tem um Km caracterstico. A constante de Michaelis-Menten de uma enzima , portanto, uma caracterstica muito importante e fundamental, no apenas matematicamente na determinao da velocidade da reao catalisada como tambm na avaliao da atividade e na purificao das enzimas nos tecidos. V- MECANISMO DA AO ENZIMTICA V- a. Enzima como catalisador O princpio de catalisador diminuir a energia de ativao. A enzima se liga a uma molcula de substrato em uma regio especfica denominada stio de ligao. Esta regio um encaixe que apresenta um lado envolvido por cadeias de aminocidos que ajudam a ligar o substrato, e o outro lado desta cadeia age na catlise. Em 1894 Emil Fischer props o modelo chave fechadura para explicar a ao enzimtica. A enzima se encaixa com o substrato especfico no stio ativo, como uma chave e fechadura.

Tanto a enzima quanto o substrato sofrem conformao para o encaixe. A enzima no aceita simplesmente o substrato, o substrato distorcido para conformao exata do estado de transio, denominado encaixe por induo, proposto por Koshland (1958).

A enzima tambm encontra o lado especfico da cadeia posicionando no lugar exato da ligao no processo cataltico, muitas vezes o lado da cadeia pode ser bsico ou cido promovendo a adio ou remoo de prtons. Em outras circunstncias a enzima se agrupa a um on metlico na posio correta para a ocorrncia da catlise. Ao completar a reao cataltica a enzima libera o produto e retorna a forma original. O processo ocorre em duas etapas: (1) S + E (2) ES ES* E+P (etapa reversvel) (etapa irreversvel)

* complexo enzima-substrato V- b. Inibio Enzimtica

Muitos tipos de molculas inibem as enzimas e podem agir de vrias

formas. A principal distino entre inibio reversvel e inibio irreversvel. A forma que envolve ligaes no-covalentes reversvel, atravs da remoo do inibidor. Em alguns casos as ligaes no-covalentes podem ser irreversveis sob diferentes condies fisiolgicas. J a inibio irreversvel, a ligao molecular covalente. So geralmente encontrados em reaes que apresentam toxinas especficas. V- b.1. Inibio Reversvel Existem vrios modos que esto envolvidos com ligao no covalente, eles diferenciam quanto ao mecanismo pelo qual diminuem a atividade enzimtica e como eles afetam na cintica da reao. V- b.1.1. Inibio Reversvel Competitiva Uma molcula apresenta estrutura semelhante ao substrato da enzima que se liga para realizar a catlise, ela poder aceitar esta molcula no seu local de ligao, mas no pode levar ao processo cataltico, pois ocupando o stio ativo do substrato correto. Portanto o inibidor compete pelo mesmo local do substrato. O efeito da reao modifica o Km, mas no altera a velocidade.

V- b.1.2. Inibidor Reversvel no Competitivo Ocorre quando um molcula ou on pode se ligar em um segundo local na superfcie enzimtica (no no stio ativo). Isto pode distorcer a enzima tornando o processo cataltico ineficiente.

O inibidor no competitivo pode ser uma molcula que no se assemelha com o substrato, mas apresenta uma grande afinidade com a enzima. o mecanismo inverso do inibidor competitivo, porque inibe a ligao do complexo ES e no da enzima livre.

O efeito da reao modifica a velocidade e o Km permanece constante.

V- c. Inibio Irreversvel Algumas substncias se ligam covalentemente s enzimas deixando-as inativas. Na maioria dos casos a substncia reage com o grupo funcional no stio ativo bloqueando o local do substrato, deixando a enzima catalticamente inativa. Inibidores irreversveis podem ser extremamente seletivos pois so semelhantes ao substrato. So muito utilizados como resduos, os quais apresentam grupos de tomos que se configuram semelhantemente ao estado de transio que se ligam ao substrato. V- d. Cofatores Para alguns tipos de processos biolgicos, apenas a cadeia protica no suficiente, por isso a protena requer uma molcula denominada cofator a qual pode ser uma pequena molcula orgnica, denominada coenzima ou um on metlico. Os cofatores so geralmente estveis em temperatura alta. A catlise ativa enzima-cofator denominada holoenzima, quando o cofator removido, se mantm a protena, a qual catabolicamente inativa e denominada apoenzima. Coenzimas A molcula orgnica que se liga s enzimas para ativar uma reao, denominada coenzima, cada tipo apresenta uma funo qumica particular, algumas so agentes oxi-redutoras, outras transferidoras etc. Como exemplo explanatrio, consideramos a coenzima dinucleotdeo nicotinamida de adenina (NAD+). Esta molcula contm duas principais partes: a poro difostato adenosina, ligando uma ribose a uma nicotinamida. A outra poro a parte final da molcula do NAD onde o anel de nicotinamida ser imediatamente reduzido e ainda servir como agente oxidante. Uma reao tpica que o NAD participa na converso do lcool em aldedos e cetonas, o qual age como agente oxidante. Algumas vezes difcil distinguir uma verdadeira coenzima de um segundo substrato. Durante uma catlise, uma coenzima tem a capacidade de, atravs de oxi-redues, ser reutilizada por outra enzima, voltando novamente a ciclo metablico. Por exemplo o NAD aps a oxidao do substrato, passa a NADH, ativa a reao, deixa a enzima e novamente ser oxidada por um sistema de aceptor de eltrons, voltando a ser NAD e assim podendo se ligar a outra enzima. J um segundo substrato nunca deixa a enzima, ele reduzido e oxidado no ciclo metablico.

Muitas coenzimas so fortemente relacionadas com vitaminas. As vitaminas so molculas orgnicas essenciais para o processo biolgico em organismos superiores e no podem ser sintetizados por eles mesmos. Portanto estas coenzimas so essenciais aos processos metablicos vitais dos organismos superiores. Outra estrutura que apresenta a mesma funo de coenzima, so as metaloenzimas. So enzimas que tm ons metlicos ligados covalentemente nas cadeias de aminocidos ou em grupos prostticos como o grupo heme. Os metais que se ligam as enzimas agem como metais catalticos em reaes hidrolticas e outros com agentes redutores. VI- TCNICAS EMPREGADAS NO ESTUDO DAS ENZIMAS VI1) Anlise de Velocidade de reao cataltica

Existem duas formas essenciais para o estudo da cintica de uma enzima. Primeiramente deve ser feito medies sob condies na qual mantenha o estado de equilbrio, depois observar a aplicabilidade da equao de Michaelis-Menten, e determinar a velocidade de reao pela concentrao do substrato e da enzima. 2 ) Anlise do Equilbrio de Reao O equilbrio de uma reao enzimtica estabelecido em segundos ou poucos minutos . Vejamos algumas tcnicas de avaliao: Espectrofotometria um mtodo simples e apurado. medido pela absoro de luz na regio espectral do substrato ou produto formado na reao. Fluorescncia similar a metodologia de espectrofotometria. O substrato ou o produto deve emitir fluorescncia neste espectro. A tcnica vantajosa por ser altamente sensvel, a soluo a ser empregada deve estar extremamente diluda. Titulao automtica

 utilizada quando a reao produz ou consome cido ou base. Titula-se na soluo cido ou base para que o pH continue constante. A quantidade de cido ou base consumido o valor da reao cataltica enzimtica. Anlise Radioativa avaliado quando o substrato marcado com istopo radioativo, o qual ser perdido ou transferido durante a reao a ser estudada. um mtodo extremamente sensvel para anlise cintica enzimtica. 3) Anlises de reaes com alta velocidade a) "Stopped Flow"

A enzima e o substrato so inicialmente separados em seringas, que rapidamente libera seu contedo at uma cmara misturadora e em seguida passa para a seringa que pra a reao. Neste instante um detector mede a absorbncia de luz ou fluorimetria. b) "Temperature Jump" O processo ocorre quando a mistura de reao, que est em equilbrio numa Temperatura 1, rapidamente passada uma temperatura 2 . O ponto de equilbrio mudar e a reao deve ocorrer para que a reao alcance um novo equilbrio. A mudana rpida de temperatura obtida por uma exploso de corrente eltrica nos eletrodos imergidos na mistura de

reao. O tempo de relaxamento entre a mudana de temperatura medido por absorbncia ou fluorescncia.

4) Anlise quantitativa da atividade enzimtica Para obteno de uma anlise quantitativa necessrio saber: - Toda estequiometria de uma reao cataltica - Se a enzima requer adio de cofatores como um on ou coenzima - A dependncia da enzima sob a concentrao do cofator ou substrato. - O pH timo - A temperatura pela qual a enzima est estvel e apresenta alta atividade. - O procedimento para determinao do aparecimento e desaparecimento do substrato de um produto de reao. A anlise quantitativa confirmada quando o substrato ou o produto colorido ou absorvido em luz ultravioleta. O valor de aparecimento ou desaparecimento do produto ou substrato absorvido por luz pode ser analisado pelo espectrofotmetro. Alm do produto ou substrato pode - se analisar o intermedirio (aquele que serve como ponte para o desencadeamento de outra reao).

a) Purificao enzimtica As enzimas so encontradas na natureza em misturas complexas, geralmente as clulas apresentam centenas ou mais diferentes enzimas, para um estudo aprofundado deve-se purificar a enzima a ser estudada. Em alguns casos possvel atravs da aplicao de mtodos especficos utilizar enzimas nos estado impuro, mas na maioria dos casos, a presena de outras enzimas interfere nos substratos desviando as reaes especficas. b) Mtodos de purificao 1) Teste primeiramente faz-se uma anlise quantitativa da atividade da enzima a ser estudada. A enzima deve ser isolada utilizando - se o teste de atividade em diferentes fraes, sendo mais importante que a exatido do mtodo. 2) Procedimento Geral definio da unidade enzimtica, concentrao e atividade especfica. 3) Origem enzimtica determinao do local (tecido) de maior quantidade, geralmente a rpida centrifugao adquire enzimas mitocondrial. 4) Extrao necessrio ter a enzima em soluo e, portanto, a ruptura de membranas. Deve se utilizar um tampo, pois ao romper o tecido pode ocorrer liberao de substncias cidas que degradam a enzima. Os mtodos utilizados so o mecnico com partculas de areia, nitrognio lquido, "shaker" em alta velocidade , ondas de ultrassom e solventes como acetona. c) Unidade de atividade enzimtica definida pela quantidade que causa transformao de 1 mol de substrato por minuto a 25C sob condies timas. A atividade especfica o nmero de unidade de enzimas por miligrama de protena, mede a pureza da enzima. A atividade molar ou molecular ou nmero de "turnover", o nmero de molculas do substrato transformado por uma nica molcula de enzima ou nico stio de ligao em um minuto, quando a enzima est no valor de limite. A atividade molar pode ser calculada pela velocidade mxima. A nova unidade internacional da atividade enzimtica determinada pela "Comisso da Enzima" o "katal", o qual definido como a transformao do substrato em 1 mol por segundo.

Mtodos de Fracionamento O extrato de enzimas apresenta inmeras substncias com diferentes pesos moleculares e de acordo com seu interesse de estudo utilizam-se diferentes mtodos: 1) 2) 3) 4) 5) 6) Precipitao por diferena de pH Desnaturao por aquecimento Precipitao com solventes orgnicos (etanol, acetona) Precipitao por sais (sulfato de amnia) Adsoro Cromatografia - o mecanismo de separao depende da adsoro, troca inica, afinidade especfica para imobilizar ligantes especficos ou efeitos de peneiramento molecular. 7) Eletroforese - a mobilidade das protenas causada por campo eltrico 8) Cristalizao 9) Concentrao reduo de volume atravs de evaporao do solvente ou congelamento.