Estructura y Funcin de Biomolculas Clase 7

Plegamiento in vitro de protenas

JJC

Por qu se pliega una protena? Cmo se pliega?

Plegamiento N U

Conjunto discreto de confrmeros muy parecidos entre s.

Protena nativa

Protena desnaturalizada
Coleccin heterognea de conformaciones con grado variable de compactacin. Rpida velocidad de interconversin

El dogma central de la biologa molecular

En un principio fueron la protenas. Luego vino ese advenedizo, el DNA
DNA No olvidemos que duplicar el DNA requiere protenas Protena

Y result que el seorito necesita emisarios el RNA

DNA RNA

Y el RNA puede usarse como molde para hacer DNA

DNA RNA

Pero todava nos falta algo fundamental: plegar las protenas:

DNA RNA FOLDING Protena desplegada

y como si sto fuera poco result ser que el ribosoma, es una ribozima!!!

Qu determina la estructura terciaria de una protena? Existe un cdigo de plegamiento?

C26-C84

C58-C110

C64-C72

Christian Anfinsen Premio Nobel de Qumica 1972

C40-C95

Ribonucleasa A (pdb: 1AFK)

Experimento de Anfinsen:
HO S S HO C H2 H2 Betamercaptoetanol C SH SH SH H2 C H2 C OH

C H2
HS

C H2

26 84 40 95 110

72 65

SH HS Dilisis O2 40 SH

HS HS SH

26 84 95 110

72 65

HS Urea 8 M 58 Betamercaptoetanol

58

Actividad enzimtica

NO hay actividad enzimtica

Actividad enzimtica

Conclusiones de Anfinsen:
La informacin necesaria para especificar la estructura est en la secuencia (las chaperonas complicaron un poco, pero se sigue manteniendo) Hiptesis termodinmica: el estado nativo es la conformacin de mnima energa libre (hay que considerar todo: solvente, ligandos, etc)

Confrmero

Confomacin nativa

En principio se podra calcular cual es la conformacin de mnima energa. Hay dos problemas: No conocemos la funcin potencial con suficiente precisin El nmero de conformaciones posibles es MUY grande Las predicciones con protenas chicas estn dando cada vez mejor

Desplegamiento de una protena

El estado nativo es estable en un rango muy reducido de condiciones (temperatura, pH, co-solventes) Como desnaturalizamos una protena? Aumento de temperatura (desnaturalizacin trmica) Cambios de pH O NH2 Agentes qumicos: + ClH2 N C

UREA

NH2

Cloruro de guanidinio

H2 N

NH2

Disminucin de temperatura (suena raro, pero pasa)

La estabilidad de una protena se mide con el G de unfolding: G U N

Coordenada de plegamiento

UREA

Coordenada de plegamiento

GN < GU GU = GU GN > 0

GN > GU GU = GU GN < 0

GU GN
[UREA]

La desnaturalizacin es un proceso cooperativo:

Ku = [D] [N] [D] [N] + [D]

Fraccin desnaturalizada: fu =

Fraccin nativa: fn = fu + fn = 1 Ku =

[N] [N] + [D] fu fn = fu 1 - fu

En [UREA]50:

fu

fu = fn = 0.5 [N] = [U] Ku = 1 [UREA]50 0 [UREA] 8

GU GN

GU = -RT ln(Ku) = 0

GU = 0

[UREA]50

 Qumicamente una protena es una entidad metaestable (hidrlisis) Igual se puede usar el formalismo de la termodinmica de sistemas en equilibrio

Qu significa que una mutacin desestabiliza un protena?

Silvestre

N*
K* folding

Mutante

U*

K folding

= Kf = [N] / [U]

= Kf* = [N*] / [U*]

K unfolding = Ku = [U] / [N]

K* unfolding = Ku* = [U*] / [N*]

Gu = -RTln(Ku) G

Gu* = -RTln(Ku*) G

Gu U N
Coordenada de plegamiento

N* Gu

Gu* U*

Coordenada de plegamiento

DESNATURALIZACION POR AGENTES QUIMICOS

UREA o GUANIDINIO: ALTERAN LA ESTRUCTURA DEL AGUA INTERACCIONAN CON GRUPOS DE LA PROTEINA ( aromticos, amidas) G DE TRANSFERENCIA DE UN AMINOACIDO DESDE AGUA A UNA SOLUCION DE DESNATURALIZANTE ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACION DE DESNATURALIZANTE COMO EL ESTADO D ES MAS EXPUESTO QUE EL N, ENTONCES D ES ESTABILIZADO POR EL DESNATURALIZANTE

GD-N = GD-N(H2O) - mD-N [desnaturalizante]

1 0.8 fu 0.6 0.4 0.2 0 0 2 4 [UREA] 6 8

O H2N C UREA NH2 H2N

NH2+ C NH2

GUANIDINIO

DIFERENCIAS DE ESTABILIDAD

> estabilidad

Transiciones de dos estados

La transicin medida por diversas tcnicas debe ser idntica (UV, fluorescencia, CD, etc) Idealmente debera haber puntos isosbsticos e isodicroicos (PORQUE?)

G = 0

TRP seal

nearUV CD

D N

farUV CD

[desnaturalizante]
nearUV CD

[desnaturalizante]
seal
D N N

TRP

Qu ocurri ac?
farUV CD

[desnaturalizante]

Cmo seguimos el desplegado de una protena?

Gel con gradiente de urea:
N U

Migracin

> tamao

0 M

UREA

8 M

Cmo medimos Gu? GN-U = -RT ln (KN-U) = -RT ln ([U]/[N]) Debemos cuantificar [U] y [N] Usamos algn mtodo que los diferencie: 1) Absorbancia 2) Fluorescencia 3) Dicroismo circular

Por qu nos interesa medir la estabilidad de una protena?

Actividad enzimtica residual (%)

I56T WT

D67H

Temperatura (C)

El GU en condiciones fisiolgicas tipicamente es 15-50 kJ/mol

Ku =

[D] [N]

Para calcular GU debemos medir K = [U] / [N], y aplicar GU = -RT ln K A 298 K, un GU = 30 kJ/mol da K = EXP(-GU/RT) = 5.5 10-6 O sea que [N] = 181000.[U] Tpicamente [N] + [U] ~ M

La concentracin de U es imposible de medir!!!

Cmo hacemos?

Perturbamos el equilibrio para desplazarlo y extrapolamos el resultado de G a las condiciones fisiolgicas:

U GH2O

K << 1

Extrapolo: Gurea = GH2O - m. [Urea]

[Urea]

K ~ 1 Calculo GUrea

GH2O

K >> 1 GUrea

[Urea]

COMO CALCULAMOS GD-N?

F
> [UREA]

Partimos de una seal espectroscpica a distintas [UREA]. Mezcla de las seales de N y D, pesadas por su concentracin: S =SN fN + SU fu = SN (1-fU) + SU fU Con esto podemos calcular fU:
Long. Onda (nm)

fD = (S SN) / (SD-SN) El cual se relaciona con KU-N = [D]/[N] = fU / (1-fU)

Podemos calcular KU-N para cada [UREA]

1 0.8 fu 0.6 0.4 0.2 0 0 2 4 [UREA] 6 8

Por qu KU-N depende de urea? Cmo calculamos KD-N en ausencia de urea?

Con KU-N podemos calcular GU-N para cada [UREA] y podemos extrapolar los valores en ausencia de urea:

GU-N = GH2O - m [UREA]

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En la practica se hace un ajuste global de la seal,

IF 350 nm

SU = SOU + bU [D] SN = SON + bN [D]

[D]50 [D]

El tratamiento es independiente de la tcnica espectroscpica que usen para seguir el equilibrio

S =SN fN + SU fu = SN (1-fU) + SU fU K = fu / (1- fu) = EXP(-G/RT) y G = GH2O-m[D] fu = EXP(-(GH2O - m[D]) / RT) / (1 + EXP(-(GH2O - m[D]) /RT))

S = {(SOU+bU[D]) (SON+ bN[D])} EXP(-(GH2O - m[D]) / RT) + (SON + bN[D])

(1 + EXP(-(GH2O - m[D]) /RT))

X = [D] Y = S (seal) Parmetros del ajuste: GH2O, m, SON, bN, S0U, bU

G = GH2O - m [D] Correlacin experimental: m: proporcional a ASA del desplegado

ASA

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Para el caso de oligmeros fU depende de la concentracin total de protena

GD-N G1 G2

Porqu?

GD-N = G1 + G2
Para: Nn n U G = -RT ln ( fU n N0(n-1)/(1-fU))
N0= cc total de protena = 1 heterodmero = 4 homodmero = 27 homotrmero

En las curvas de desnaturalizacin pueden observarse dos tipos de comportamiento:

fD
> [PROT]

fD

> [PROT] [Desnaturalizante]

[Desnaturalizante]

Cmo estn acopladas las estructuras terciaria y cuaternaria en cada caso?

La presencia de un ligando aumenta la estabilidad:

Ejemplo: calreticulina Ca2+ Glc1Man9GlcNAc2
> Glc1Man9GlcNAc2

> [Calcio] > Glc1Man9GlcNAc2

Estabilidad trmica seguida por far-UV CD:

Glc1Man9GlcNAc2

calcio

12

Fluorescencia de TRP:

> [Calcio]

+ Glc1Man9GlcNAc2

+ Glc1Man9GlcNAc2

+ Glc1Man9GlcNAc2

GD-N

G1

G2

GD-N = G1 + G2

Binding Unfolding

Denaturalizacin de protenas oligomricas:

SOYBEAN AGGLUTININ (SBA)

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Tratamiento de SBA con urea TRP TRP ANS

ANS

SEC SEC

CD UV lejano

CD UV cercano

2 TRANSICIONES

ANS

14

La desnaturalizacin de una protena oligomrica puede ser ms de 1 estado:

Terciaria

La deteccin del monmero va a depender del grado de cooperacin entre estructura terciaria y cuaternaria fu fu

Urea

Urea

El Gu de una protena oligomrica depende de la concentracin total de protena: fu fu

> concentracin

> concentracin

Urea

Urea

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En el estado nativo de una protena se forman cientos interacciones

Cuan estable es el plegamiento de una protenas? Los Gu tpicamente caen en el rango de 20-60 kJ/mol Esto es muy bajo !!! Del orden de 3 a 10 puentes hidrgeno El estado nativo es marginalmente estable

Como puede ser?

Durante el plegamiento hay que tomar en cuenta TODAS las interacciones: Protena protena (p-p) Protena solvente (p-s) Solvente solvente (s-s) Y debemos tener en cuenta las contribuciones entlpicas y entrpicas al G

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Se forman: intracatenarias (Hp-p < 0) entre molculas de solvente (Hs-s < 0)

ENTALPIA: H
Se rompen: protena-solvente (Hp-s > 0) Valores enormes (varios miles de kJ/mol), pero similares en magnitud y de signo opuesto. Los grupos que forman puentes hidrgeno intracatenarios en el estado N se encontraban formando puentes hidrgeno con el solvente en el estado U. El balance entlpico es ligeramente favorable.

Disminucin de la movilidad de la cadena (Sp < 0)

ENTROPIA: S
Liberacin de molculas de solvente (Ss > 0)

Por qu una protena se pliega?

Por el mismo motivo que se forma una micela o una bicapa lipdica

Porque est rodeada de agua

Si sumergimos una protena en solvente orgnico lo ms probable es que se desnaturalice

Polar No lineal

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Al plegarse un protena se forman una gran cantidad de puentes hidrgeno intracatenarios, sin embargo el balance entlpico es casi neutro. Esto se debe a que esos mismos grupos expuestos en el estado desplegado se encuentran formando puentes hidrgeno con el agua
C O H H

folding
H

O
H

H
O O

H N

N
H

Por qu los compuestos no polares son hidrofbicos?

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EFECTO HIDROFOBICO La interpretacin ha generado fuertes controversias. Veamos la interpretacin clsica: La presencia de una superficie no polar impide que las molculas de agua formen todos los puentes hidrgenos El solvente se orientan formando clatratos ordenados (icebergs) Costo entrpico muy alto Al plegarse una protena disminuye el rea hidrofbica expuesta, se liberan molculas de agua. El aumento de entropa del solvente compensa por la prdida de entropa al disminuir la movilidad la cadena
Acido graso en agua

Cluster de agua fluctuantes en el seno del solvente Molculas de agua altamente ordenadas formando una jaula que rodea la cadena alqulica

Formacin de bicapas y micelas

Disminuye el rea hidrofbica expuesta. El nmero de agua forzadas a ordenarse disminuye. Aumenta la entropa

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Una protena en su estado nativo es como una micela muy venida a ms. Al formarse el core hidrofbico disminuye la superficie accesible al solvente (ASA), liberndo molculas de agua
+
OH HO

Folding: ASA < 0

OH

+
HO

+ +
OH

- +

OH

+ -

OH +

OH

El cambio de ASA (ASA) en el plegamiento explica porqu la capacidad calorfica del estado desplegado es mayor que la del estado nativo (CpU > CpN). En unfolding: Cp = (CpU CpN) es positivo Por esto las protenas se pueden desnaturalizar a bajas temperaturas (cold denaturation)

(pero antes un poco de termodinmica bsica) Todos usamos Gsistema = Hsistema - TSsistema

como criterio de espontaneidad a P y T constantes. G < 0 para procesos espontneo, sto significa: reacciones exotrmicas (H < 0) y/o que generen desorden (S > 0) Pero.No era que el criterio de espontaneidad estaba dado por la segunda ley de la termodinmica? Suniverso = Ssistema + Sentorno > 0 Cmo se relaciona Gsistema con Suniverso ?

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Un poco de termodinmica semiavanzada.

K = [U] / [N] = pU / pN
pN: probabilidad de encontrar a la protena en N pU: probabilidad de encontrar a la protena en U

Una visin alternativa de K:

pN = wN EXP(-EN / RT) pU = wU EXP(-EU / RT) A P cte: pN = wN EXP(-HN / RT) pU = wU EXP(-HU / RT) (distribucin de probabilidad de Boltzman) (distribucin de probabilidad de Boltzman)

K = pU / pN = (wU / wN) . EXP(-(HU HN)/RT)

-RT ln(K) = H RT ln(wU / wN) = H0 T. S0 = G0

En donde S = R ln(wU / wN)

En otras palabras (lo que viene es Man): El cambio de energa libre estandar G0 es una forma de expresar la probabilidad relativa (pU/pN) de encontrar el sistema en dos estados. Si G0 es positivo, pU/pN <1, el estado U es relativamente poco probable Si G0 es negativo, pU/pN >1, el estado U es ms probable Cuando G0 = 0, pU = pB, (promediando a tiempos largo) la molcula pasa la misma cantidad de tiempo en ambos estados S0 es una forma de expresar el cambio en el nmero de formas que tiene el sistema para contener una determinada cantidad de energa Dadas P y T, el equilibrio del sistema est determinado por G0, el cual tiene un componente energtico (H) y uno entrpico (S). Un proceso espontneo no necesariamente involucra una disminucin de la energa (entalpa). De hecho los procesos endotrmicos son posibles (y comunes) siempre y cuando impliquen un aumento lo suficientemente grande de entropa.

21

(sigue el Man) Distribucin de probabilidad de Boltzman: pA = wA EXP(-EA/kT) EXP(-EA/kT): implicara que los sistemas van hacia las configuraciones de menor energa, como lo hacen en un sistema mecnico El trmino w da vuelta la situacin. A mayor energa hay mas formas (w) de distriburla en el sistema para llegar a la misma energa total (rotaciones, vibraciones, traslaciones, interacciones, etc). Esto da que el estado ms probable de un sistema termodinmico no sea el de menor energa En este sentido, un sistema termodinmico difiere de un sistema mecnico (disipativo).

Exp(-E/kT)

w X

w.exp(-E/kT)

Energa

Dicho popular: una medida del desorden del sistema

Qu es la entropa?

En una Facultad de Ciencias: S = k ln (w) EntoncesQu es w?

W: nmero de configuraciones (microestados) posibles de un sistema que son compatibles con su energa total
Veamos un caso simple:

Sistema: 4 molculas con dos estados posibles, A y B A: estado de baja energa. EA = 1 B: estado de alta energa. EB = 2 Energa total: Et = 4 Cuntas configuraciones son compatibles para Et = 4? Si Et = 5 B A A A A B A A A A B A A A w = 1 S = 0 A B

A A

B A

A A

w = 4 S = 1.39 k

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B Si Et = 6 B A

B A B

A A B

A B A

B A A

A B A

B A B

A B B w = 6 S = 1.79 k

(hay algo interesante con este ejemplo, la entropa del sistema con Et = 8 vuelve a cero ! (B-B-B-B). Esto no sucede en un sistema a P cte, al aumentar T aumenta el volumen y aparecen nuevos microestados posibles)

Vayamos al casino: Olvidndose de la diferencia de energa, el microestado A-A-A-A es menos probable que por ejemplo el microestado A-A-B-A? NO! El sistema est igual de ordenado en ambos casos. Entonces, Qu significa que el estado U tiene mayor entropa que el estado N? El nmero de configuraciones posibles del estado U es mucho mayor que las del estado N, pero un microestado particular de U es igual de probable que un microestado N

Estabilidad trmica de protenas

G = H T. S = -RT ln(K)

Debemos ver como vara G con T: dH = Cp.dT H = Cp dT + H(0) Cp = es una medida de la diversidad de formas que tiene un sistema para distribuir un monto de energa agregado. Cp SE RELACIONA CON LA ENTROPA: dS = dH / T = (Cp / T) . dT S = (Cp/T) . dT Nosotros estamos interesados en los cambios de H y S: H = HU HN = Cp . dT + H(0) S = SU SN = (Cp/T) . dT Cp = CpU CpN H(0) en la diferencia energtica entre U y N a 0 K

23

Usualmente se relaciona estas cantidades a una temperatura de referencia Tref (en general 298 K): H (T) = H (Tref) + Cp . dT + H(0) S (T) = S (Tref) + (Cp/T) . dT Si hay una diferencia de Cp entre U y N, entonces H y S varan con T (y por ende K) Si Cp es constante (independiente de T), algo razonable en un rango limitado de T, podemos integrar: H (T) = H (Tref) + Cp (T Tref) S (T) = S (Tref) + Cp.ln(T/Tref) Y con esto calculamos

G (T) = HTref + Cp (T Tref) T [STref + Cp.ln(T/Tref)]

En la desnaturalizacin de protenas Cp es positiva. Es una de las evidencias ms fuertes del efecto hidrofbico (la solubilidad en agua de los compuestos orgnicos aumenta al bajar T)

1500

DH (T)
1000

DG (T) T.DS (T)

500

Tm
250 300 350 400 450

0 100 -500 150 200

-1000

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Cp > 0 trae consecuencias inesperadas: las protenas tambin se desnaturalizan a T muy bajas !!!!

1500

DH (T)
1000

DG (T) T.DS (T)

500

0 0 -500 100 200 300 400

-1000

TCD

Tm

PARA PODER RACIONALIZAR EL EFECTO DE UNA MUTACION HAY QUE VER COMO CAMBIA LA ESTABILIDAD RELATIVA DE N Y D
EJEMPLOS: 1) GLICINA: EN GENERAL DISMINUYE LA ESTABILIDAD PORQUE? AUMENTA LA ENTROPIA DEL ESTADO D (ver Ramachandran)

2) PUENTES S-S: EN GENERAL AUMENTAN LA ESTABILIDAD PORQUE? DISMINUYE LA ENTROPIA DEL ESTADO D CADA PUENTE PUEDEN CONTRIBUIR HASTA 4 kcal/mol

25

Se puede jugar mucho ms con los loops y residuos expuestos que con el core hidrofbico. En el caso de mutar residuos del core, se tolera la generacion de cavidades (ej ILE -> ALA), pero muy difcilmente lo inverso (ALA -> ILE)

PORQUE?
El grado de empaquetamiento del core es muy alto, similar a un cristal orgnico. Muy probablemente se generen choques. COMO PODRIAN EVITAR ESTO?

Realizando dos cambios que se compensen

EL ESTADO D: PARA UNA DADA PROTEINA, D DEPENDE DEL TIPO DE DESNATURALIZANTE POSEE UN ALTO GRADO DE ENTROPIA CONFORMACIONAL PERO NO ES UNA CADENA AL AZAR (RANDOM COIL) EL GRADO DE COMPACTICIDAD DE D VARIA CON CADA PROTEINA EL SOLVENTE (H2O) DURANTE EL PLEGAMIENTO HAY UN FACTOR ENTROPICO NEGATIVO DEBIDO A LA PERDIDA DE LIBERTAD CONFORMACIONAL DE LA PROTEINA, PERO ESTE SE COMPENSA POR LA LIBERACION DE AGUA AL ENTORNO (EFECTO HIDROFOBICO)

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Hagamos un poco de biologa terica por el absurdo

Caminos de plegamiento y paisajes de energa

Sintetizamos una protena de 100 aminocidos con una secuencia al azar. Cuan probable es que adopte una estructura nativa? Apliquemos el mtodo inductivo: La mayor parte de las protenas que conocemos adoptan una conformacin nativa, entonces nuestra protena debera plegarse correctamente. Vale este razonamiento? Las protenas que hay en la naturaleza Son una muestra representativa? Cuntas posibles protenas de 100 residuos se podran hacer ?

20100 = 1.3 x 10130

(nmero de protones y neutrones del universo 1076) Cuntas protenas hay en la naturaleza? Supongamos 10.000 x 106 especies y que cada genoma codifica para 30.000 genes (exageracin supina). Entonces tendramos 3 x 1020 protenas (muchas estn repetidas).

27

Secuencias posibles= 1.3 x10130 Secuencias en la naturaleza: como mucho 3 x 1020 Por cada secuencia seleccionada por la evolucin hay 4.3 x 10109 secuencias que no aparecieron Volvamos a nuestra pregunta inicial: Sintetizamos una protena de 100 aminocidos con una secuencia al azar. Cuan probable es que adopte una estructura nativa? En principio no podemos decir nada. Seguro que luego de miles de millones de aos de evolucin nos lleg un muestreo nfimo de todas las protenas posibles.

Cules fueron las protenas que nos llegaron?

Casualmente aquellas que se plegaron correctamente!!!

Las protenas que SI nos llegaron, siguen un camino al azar al plegarse? Azar: la cadena va probando todas las conformaciones hasta llegar a N

Cunto tiempo demandara este proceso?

Imaginemos que cada aminocido puede adoptar tres conformaciones posibles (, y L) Cada conformacin se puede interconvertir en 1 ps (10-12 seg) Una cadena de 100 residuos puede adoptar 3100 = 5.2 x 1047 conformaciones EXPLORAR TODAS LAS CONFORMACIONES REQUERIRIA: 10-12 seg * 5.2 1047 = 5.2 1035 seg (1.7 1028 AOS !)
(si supemos que en cada paso de busqueda los 100 residuos cambian, tardara 1.7 1026 aos)

PERO, LA MAYOR PARTE SE PLIEGA EN 0.1 - 1000 seg !!! PARADOJA DE LEVINTHAL (1968)

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Entonces Es el plegamiento un proceso al azar?

NO
COMO PUEDE SER?
No hace una busqueda al azar de la conformacin de mnima G. Necesariamente deben existir caminos favorecidos que restrigen la bsqueda. La evolucin cumpli un papel fundamental. Se seleccionaron aquellas secuencias cuya velocidad de plegamiento es compatible con la vida.

Caminos de plegamiento
Imaginemos que tenemos dos proteinas con los estos espacios conformacionales:

G U
N coordenada

N coordenada

Cul creen que se pliega con ms eficiencia? En el primer caso el plegamiento se ver fustrado mucho ms veces (trampas cinticas) La evolucin seleccion aquellas secuencias que presentan espacios conformacionales lisos, con pocos mnimos locales.

29

Tres modelos de plegamiento proteico

Difusin-condensacin

1) Estructura 2ria 2) Chocan entre si para formar la 3ria Ejemplo: barnasa

N
Nucleacin-condensacin

1) Aglutinacin del core hidrofbico 2) La 3ria se propaga desde all

Colapso-hidrofbico

1) Un elemento de estructura 2ria 2) La 3ria se propaga desde all Ejemplo: CI2

Cmo podemos conocer la estructura de un intermediario de plegamiento?

N -TS

TS

H G H
TS N

G
D

Folding: D TS : costo entrpico Unfolding: N TS: costo entlpico

-TS

30

Estructura del TS: valores

Protena wt TS Mutacion Xxx Ala TS

GTS-D
D N

GTS-D

GN-D
N

GN-D

GTS-D - GTS-D GN-D - GN-D

GTS-D GN-D

Caso 1: el residuo forma contacto en N y no en TS

U
WT

TS

Mutante

TS = TS

GTS-D = GTTS-D
D N N

GN-D GN-D

GTS-D - GTS-D GN-D - GN-D

=0

31

Caso 2: el residuo forma contacto en N y TS

TS

WT

Mutante

TS TS

GTS-D
D N N

GTS-D GN-D

GTS-D - GTS-D GN-D - GN-D

=1

GN-D

1: el residuo forma contactos en el TS

0: el residuo no forma contactos en el TS

Puede haber fuera de estos valores (< 0 > 1). La interpretacin es ms complicada.

32

Cmo se miden los valores ?

Medidas de unfolding en equilibrio: fU mutante wt

(G)N-D = GN-D - GN-D

Medidas cinticas de refolding:

[Urea]

(G)TS-D = GTS-D - GTS-D

Dilucin
Urea 8 M

Ajuste a monoexponencial: fU = exp(-kD-N.t) mutante kD-N = A.Exp(- GTS-D /RT) kD-N = A.Exp(- GTS-D /RT)

fU

wt
Tiempo

GTS-D - GTS-D = RT ln (kD-N / kD-N)

Ejemplo: TS del inhibidor de quimiotripsina 2 (CI2) Mecanismo de nucleacin-condensacin L49

Nucleacin-condensacin

I57

1) Un elemento de estructura 2ria 2) La 3ria se propaga desde all Ejemplo: CI2

A16

33

El embudo de plegamiento (folding funnel)

El mecanismo de plegamiento no es anlogo a una reaccin de molculas chicas (pocos enlaces de alta energa). Es una bsqueda sesgada en una superficie de energa chata (muchas conformaciones con energa similar). Superficie caracterstica de un nmero muy grande de interacciones de baja energa.

34

Anlisis de la superficie de energa libre

Lenta

Chiche bombn

No tan mala

Lenta y peligrosa

Funcional ?

El sesgo proviene porque en promedio aquellas conformaciones que presentan ms contactos nativos entre residuos son ms estables. Como sabe la protena que un contacto es correcto? No lo sabe. Aquellas estructuras que no presentaban este comportamiento no fueron seleccionadas. Que ocurrira si sintetizamos una protena con una secuencia cualquiera? Que no fue filtrada por millones de aos de evolucin. Se plegara con una estructura nica? Lo ms probable es que no se pliegue.

35

Un mono secretario

Cintica de plegamiento
Aquellas protenas que s se pliegan lo hacen con cinticas muy diversas (milisengundos a minutos)

Hay alguna forma de racionalizar sto?

SI, orden de contacto (contact order, CO): protena de L residuos, donde N residuos se contactan: CO = (1/L.N) . Sij donde Sij es la separacin en # de residuos entre los residuos j e i que estn en contacto.

36

Si
j

Aquellas estructuras terciarias que contactan residuos alejados en la secuencia se pliegan ms lento. Costo entrpico.

Y a veces las cosas son lgicas

Todo Log (kfolding)

Todo

Orden de contacto %

37

EFECTO DEL UNFOLDING EN LA CAPACIDAD CALORIFICA (Cp)

Cp = dH / dT Es una medida de la variedad de formas para almacenar energa Cp del estado D es mayor que el de N Fusin de los clatratos de solvente Si D tiene estructura residual, tambin puede haber una contribucin a Cp Cp desnaturalizacin ~ 12 cal/C mol Evidencia del efecto hidrofbico

OH

- +

OH

+ -

OH

+
OH

Fusin de clatratos

OH

- +

OH

+ -

OH

+
OH

38

Dicrosmo circular (CD)

CD en estado estacionario o resuelto en el tiempo:

Plegamiento del citocromo c

39

Espectroscopa de fluorescencia

Desplegada EX 292 nm Desplegada EX 275 nm Nativa EX 292 nm

Casi siempre el espectro de U aparece corrido hacia el rojo La intensidad puede aumentar o disminuir

Fluorescencia en estado estacionario o resuelto en el tiempo: en equilibrio resueltas en el tiempo

nucleasa de estafilococo

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Atrapado de intermediarios de plegamiento ligados por puentes disulfuro: La protena completamente desplegada y reducida se vuelve a plegar si se elimina el desnaturalizante y los puentes disulfuro se forman por oxidacin con O2. Se pueden atrapar los intermediarios con diferentes puentes disulfuro ya formados, de dos maneras principales: bajando el pH o por modificacin covalente (Iodoacetato):
SH SH SH SCH2COOSCH2COO-

SH SH

O2

ICH2COO-

HS

S-S

S-S

Una de las pocas tcnicas para ver folding in vivo

Inhibidor de tripsina de pncreas bovino (BPTI)

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Intercambio de protn/deuterio: Se utilizan D2O para medir la tendencia de los H a intercambiarse con el solvente (H unidos a N, O o S). (H amdicos) Depende del pH y de su accesibilidad. Por RMN se puede identificar cada protn intercambiado y su velocidad. Los protones que intercambian ms lentamente en las protenas plegadas son los involucrados en estructuras y las hlices. El experimento puede hacerse desnaturalizando en D2O, para pasar los NH a ND; luego diluyendo en D2O para iniciar el plegamiento, y, a diferentes tiempos, agregar alcuotas de H2O a pH alto. Se frena el intercambio a pH 4, para obtener entonces el patrn de marcacin por NMR.

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Lisozima

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Existe una vinculacin estrecha entre cintica y termodinmica

fU

[Urea]

[Urea]

U
Log (k)

Refolding

Unfolding

8M X M

0 M X M [Urea]

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Ejemplo: mutacin que desestabiliza estado N

fU

[Urea]

D N N Log (k)

Refolding

Unfolding

[Urea]

(Cierra muy bien, no?)

QUE OCURRE CUANDO UNA PROTEINA POSEE UN CONTENIDO DEMASIADO BAJO DE RESIDUOS HIDROFOBICOS? No se puede formar un core hidrofbico estable. Como resultado se genera una especie poco estructurada. Existe en la naturaleza algo as? SI. Protenas nativamente deplegadas. Protenas o dominios de protenas (regiones de > 30-40 residuos). No presentan estructura terciaria, se componen de un conjunto de conformaciones. Poseen un alto contenido de residuos cargados y polares Ricas en: E, K, R, G, Q, S, P Niveles bajos de: I, L, V, W, F, Y, C, N

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SON COMUNES?
SI. 33 % de la protenas eucarioticas tienen al menos un dominio parcialmente desordenado. En procariotas la proporcin es mucho menor: 2% en arquea 4.2 % en eubacterias La proporcin del genoma que codifica protenas desordenadas se incrementa con la complejidad del organismo. PARA QUE SIRVEN? PRESENTAN ALGUNA VENTAJA? Por lo comn cumplen funciones regulatorias: control del ciclo celular, regulacin transcripcional y traduccional. Al ser flexibles pueden unirse a una gran variedad de ligandos. Al unirse a sus ligandos adoptan una estructura definida.

Nativamente desplegada

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47