UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CINCIAS NATURAIS E EXATAS CURSO DE CINCIAS BIOLGICAS

Biologia Celular

Caderno Didtico de
(BLG 138)

lgion Loreto
Departamento de Biologia -2005

Sumrio:
Pgina
Introduo 3

Primeira Parte
Uma breve reviso de Biologia Celular A lgica da composio molecular dos seres vivos Estruturas supra-moleculares e a emergncia de novas propriedades A organizao celular: o conceito de clula mnima Da clula procaritica para a clula eucaritica 4 4 12 16 24

Segunda Parte
Recomendaes de ordem geral a serem observadas no uso do Laboratrio. O uso do microscpio ptico (mo) Observando clulas de epitlio de escamas de cebola Propriedades fsico-qumicas dos componentes da membrana plasmtica. Comparando clulas procariotas e eucariotas. Um pouco de fsico-qumica: pH Estudando a passagem de solutos e solventes pela membrana plasmtica. Fracionamento celular : centrifugao. cromatografia eletroforese Observao de ciclose e cloroplastos em clulas de Elodea Observando clios e sistema de endomembranas Preparao de lminas permanentes Observao de complexo de Golgi em lminas permanentes de epiddimo Observao de clulas musculares estriadas Observao de mitose em ponta de raiz de cebola Atividades de prticas de biologia como componente de formao pedaggica. atividade 1 Biologia na cozinha. atividade 2 - O uso de modelos didticos e simulaes 65 65 49 51 53 54 57 59 60 61 62 27 29 40 41 42 44 47

INTRODUO
Biologia Celular (BLG 138) uma disciplina do primeiro semestre, e ministrada com duas horas/aula (h/a) tericas e duas h/a prticas semanais. Os principais objetivos da disciplina so o dar ao aluno: uma viso atual da organizao e funcionamento celular, assim como o domnio dos conceitos bsicos dessa rea do conhecimento; uma viso histrica sobre as principais descobertas que levaram aos paradigmas atuais dessas cincias; instrumentalizao para busca de informao e atualizao, de forma autnoma nessa rea do conhecimento; instrumentalizao para o desenvolvimento de atividades didticas de Biologia Celular, para todos os nveis de ensino, incluindo as atividades prticas. O presente Caderno Didtico foi escrito para auxiliar a atingir os objetivos descritos acima. Para tal, ele consta de duas parte: 1a) Uma breve reviso terica atualizada, porm escrita em nvel de ensino mdio. Este texto servir de base para as primeiras semanas de aula terica que consistir de uma reviso geral de Biologia Celular. 2a) Protocolos das aulas prticas. Estas atividades sero executadas durante as aulas prticas e cabe ao aluno fazer o registro solicitado nos protocolos. Pensamos ser este material uma posterior fonte de consulta para a execuo de atividades didticas. O aprofundamento terico, que se seguir reviso apresentada na primeira parte deste Caderno Didtico ser feito a partir da seguinte bibliografia: CARVALHO, H.F. e RECCO-PIMENTEL, S.M. A clula 2001. Barueri,SP, Ed. Manole, 2001. JUNQUEIRA , L.C. e CARNEIRO, J. Biologia Celular e Molecular. 7a Ed. Rio de Janeiro, Guanabara-Koogan, 2000. DeROBERTIS, E.D.P. e DeROBERTIS, E.M.F. Bases da Biologia Celular e Molecular. 14 ed, Rio de Janeiro, Guanabara-Koogan, 2003. COOPER, G.M. A clula, uma abordagem molecular. 2 ed P. Alegre, Artes Mdicas, 2001. ALBERTS, B. e colaboradores. Fundamentos da Biologia Celular. P. Alegre, Artes Mdicas, 1999. ALBERTS, B. e colaboradores. Biologia Molecular da Clula. 4 ed. P. Alegre, Artes Mdicas, 2004.

Uma breve reviso de Biologia Celular

Unidade I
A lgica da composio molecular dos seres vivos:
DE QUE SO FEITAS AS CLULAS?
Os conceitos primordiais para o entendimento dos seres vivos so aqueles relacionados aos tipos de molculas que os compem. Os seres vivos so formados por clulas e todas as clulas so constitudas pelos mesmos componentes qumicos, organizados em uma lgica muito simples: tomos se agrupam para formar molculas, estas, nos seres vivos so as vezes muito grandes, e por isto chamadas de macromolculas, que se associam para formar as organelas e demais partes da clula. (Figura 1).

1. A gua e suas propriedades especiais

A gua a molcula mais abundante nos sistemas vivos e perfaz 70%, ou mais, do peso da maioria das formas de vida. Sempre admitimos a gua como um lquido inerte, suave, conveniente para muitos propsitos prticos. Embora seja quimicamente estvel, ela uma substncia com propriedades incomuns. Na verdade, a gua e seus produtos de ionizao, os ons H+ e OH-, influenciam profundamente nas propriedades de muitos componentes importantes das clulas, como as enzimas, as protenas, os cidos nuclicos e os lipdios. A molcula da gua eletricamente neutra, mas o arranjo dos tomos de hidrognio e oxignio em forma de V torna essa molcula um dipolo eltrico. Pela presena dos dois plos (+ e -) a gua dita um solvente polar. A gua melhor solvente do que a maioria dos lquidos comuns. Quase todos os sais minerais, podem ser dissolvidos na gua sob forma de ons, como por exemplo, os ons de Na+, Cl -, K+, Mg++ . Estes ons, em especial, so de fundamental importncia no controle da quantidade de gua nas clulas (presso osmtica), e atuam tambm no funcionamento de muitas enzimas e na excitabilidade das clulas. As molculas orgnicas, que so as molculas mais importantes na constituio e

Figura 1. Organizao das estruturas celulares a partir dos tomos.

funcionamento

dos

seres

vivos,

podem

que as molculas biolgicas podem ser organizadas em apenas 4 classes. Alm disso, deve-se levar em conta que as molculas orgnicas so formadas por, aproximadamente, 30 componentes bsicos. Entender esta classificao fundamental para a compreenso da qumica da vida. As quatro classes de molculas orgnicas que esto presentes nas clulas so as seguintes: A) Glicdios (tambm chamados de acares ou carboidratos) B) cidos nuclicos C) Protenas D) Lipdios (gorduras) As trs primeiras classes formam MOLCULAS POLIMRICAS, isto , so molculas compostas por unidades que se repetem, denominadas MONMEROS.

apresentar trs diferentes comportamentos com relao a gua: a) so solveis (se solubilizam totalmente na gua, como a maioria dos glicdios); b) so insolveis (por exemplo, as gorduras neutras), ou c) so anfipticos, isto , possuem uma parte da molcula que se dissolve na gua e outra que insolvel. Temos,como exemplo desse ltimo tipo, os lipdios e protenas que compem as membranas. A forma e propriedades funcionais que as macromolculas vo apresentar so profundamente influenciadas pelo modo com que elas interagem com a gua. Sendo assim, esse lquido inodoro, incolor e sem gosto desempenha, no funcionamento celular, um papel muito importante.

2. As molculas orgnicas
Em quimicamente molculas uma primeira observao, Suas podemos constatar que os seres vivos so muito complexos. so orgnicas gigantescas

quando comparadas as molculas dos seres brutos e, alm disso, so extremamente variveis. Por exemplo, um organismo bem simples como uma bactria, pode ter mais de 2.000 protenas diferentes. Um ser humano deve ter em torno de 100.000 tipos de protenas. Como somente as poderemos protenas, temos estudar uma quimicamente estes seres, se, considerando diversidade to grande ? Esta tarefa, que aparentemente impossvel, torna-se facilitada pelo fato de
Figura 2. Formao de polmeros

Podemos resumir a composio das macromolculas orgnicas dos seres vivos na Figura 3, em que encontramos os tomos que compem cada classe de macromolcula, os monmeros de cada classe e o polmero formado.

Devemos lembrar que na Figura 3 as molculas polimricas aparecem formadas por poucos monmeros, mas na realidade, geralmente, elas so formadas por milhares deles.

No

grupo

dos

glicdios,

principal

monmero a glicose. Nas protenas, os monmeros so 20 diferentes aminocidos e, nos cidos nuclicos, so basicamente 8 nucleotdeos. Somando-se a estes alguns tipos predominantes de lipdeos, teremos ento, aproximadamente os 3040 componentes qumicos bsicos, e suas variaes, que so predominantes nos seres vivos.

2.1 PROTENAS
As protenas so as molculas responsveis pelo funcionamento da clula.
Praticamente todas as atividades da clula e, portanto, de um organismo so executadas por protenas. O transporte de substncias realizado por protenas, como por exemplo, a HEMOGLOBINA que transporta oxignio. O movimento das organelas no interior da clula, e mesmo o movimento proporcionado pelos msculos, como um todo, resultado da interao de protenas como a TUBULINA e DINEIRA; a ACTINA e a MIOSINA. A proteo
Figura 3. Classes de molculas presentes nas clulas

do

nosso

corpo

contra

os

microrganismos que causam doenas dada pela ao de ANTICORPOS, que so protenas. Todas as reaes qumicas que, constantemente, esto ocorrendo em nosso organismo, so realizadas por protenas especiais chamadas de ENZIMAS. Enfim, todo o funcionamento do nosso organismo se d graas atividade das PROTENAS. Cada uma dessas funes realizada por uma protena diferente. Existe,

Como podemos ver na Figura 3, seis principais tipos de tomos vo formar todas as molculas orgnicas dos seres vivos. Estes seis elementos se organizam em aproximadamente 30 40 tipos de molculas (os monmeros) que podem ser classificados por sua estrutura qumica em 4 grupos.

no corpo humano, cerca de 100.000 tipos diferentes de protenas, cada uma sendo especialista em uma funo. As protenas so construdas a partir de 20 tipos de aminocidos, que diferem entre si atravs de uma parte da molcula, chamada de radical.

estrutura primria . A substituio de um nico aminocido em uma cadeia protica, provoca uma alterao na estrutura primria dessa uma protena. nova A conseqncia que no da modificao pode ser grave, resultando em protena funcione corretamente dentro da clula. Chamamos de estrutura secundria a interao entre os aminocidos vizinhos um uma cadeia polipeptdica. A interao entre radicais + e ou hidrofbicos e hidroflicos fazem com que parte da cadeia se organize em hlice ou pregas (folhas) . Na Figura 5, est representada a estrutura primria da ribonuclease bovina, que uma enzima que degrada o RNA. Na estrutura primria, est explcito apenas qual a ordem dos aminocidos que compem uma protena, ou seja, qual o primeiro, o segundo, o terceiro... at o ltimo aminocido.

Figura 4 - Os 20 aminocidos que compe as protenas As protenas so formadas pela unio de 100 ou mais aminocidos. O que vai diferenciar uma protena de outra a seqncia dos aminocidos que a compem. Como existem 20 diferentes tipos desses aminocidos e as vrias protenas podem ter comprimentos diferentes, temos uma diversidade muito grande nessa classe de macromolculas (figura 4). Por exemplo, a enzima ribonuclease bovina formada por 124 aminocidos, j a albumina do soro humano formada por 528 aminocidos. A seqncia de aminocidos que compe uma protena, recebe o nome de
Figura 5. Estrutura primria da ribonuclease bovina

A protena, representa

estrutura por sua como

terciria vez, a

de

uma que forma

aquela sua

tridimensional. O formato da mioglobina, ou seja, sua estrutura terciria representada na da Figura 6. A estrutura terciria das

protenas

depende

da

seqncia

de

O modo como uma protena ir desempenhar a sua atividade depender de sua forma tridimensional, ou seja, depende de sua estrutura terciria, que em ltima anlise depende que da seqncia a de aminocidos compe protena

aminocidos (estrutura primria).

(estrutura primria). A troca, acrscimo ou retirada de um aminocido PODE ocasionar alteraes na estrutura dessa protena, alterando sua forma e, portanto, sua funo. A troca de um aminocido na protena ribonuclease, por exemplo, aminocido
Figura 6. Estrutura secundria terciria da mioglobina. e

substituio (treonina) por

do uma

terceiro glicina

resultar em uma protena com outra forma tridimensional e incapaz de executar sua funo. Somos formados por aproximadamente 100 trilhes de clulas. As clulas so estruturas muito organizadas cujo funcionamento , essencialmente, realizado por uma classe de molculas, as protenas. So as protenas que iro dar forma as estruturas celulares, transportar substncias, realizar as reaes qumicas necessrias a sobrevivncia e crescimento da clula, enfim so elas que iro pr as clulas a funcionar. Existem milhares de protenas diferentes em cada clula. Cada protena est envolvida em uma funo ou atividade especfica. Diferentes clulas apresentam protenas diferentes, o que explica as variaes nas formas e funes observadas em cada tipo celular Portanto, para entender o

Forma e Funo das Protenas

Para todo o lado que olhamos, podemos observar que a forma dos objetos que ditam a sua funo. Na Figura 7, temos a representao de uma tesoura e de uma colher. muito difcil cortar um pano com uma colher, ou comer sopa com uma tesoura. A forma desses objetos que permite sua funo.

funcionamento celular temos que olhar com

Figura 7- Relao entre forma e funo

ateno para as protenas. As protenas so cadeias de aminocidos. Imagine uma

protena como um colar de prolas, cada aminocido sendo uma prola. Existem 20 diferentes tipos de aminocidos, o que poderia ser representado em nosso colar por prolas de 20 cores diferentes. O nmero de prolas e a seqncia nas cores das prolas (aminocidos) Figura 8. variam de protena para protena, como nos dois "colares" vistos na

um deles est relacionada sua forma. a estrutura tridimensional que permitir a uma enzima (protena que ativa reaes qumicas) encaixar-se perfeitamente ao seu substrato e alterlo. Vamos a um exemplo: o fator VIII uma protena de 2.531 aminocidos e est envolvida na coagulao sangunea. A ausncia ou a reduo da atividade dessa protena no sangue causa a hemofilia clssica (hemofilia A), condio em que a pessoa pode morrer devido hemorragia intensa e de longa durao, desencadeada por qualquer pequeno ferimento. H casos em que os hemoflicos

Figura 8: Diferentes protenas podem possuir diferentes nmeros de aminocidos (como no exemplo aqui temos um "colar" com 11 e outro com 9 contas). As protenas diferem tambm com relao a seqncia de cores das contas do colar (seqncia de aminocidos).

tm o fator VIII no sangue, porm, essa protena apresenta alguns dos seus aminocidos trocados ou faltando, e isso causa uma alterao no formato tridimensional dessa protena, impedindo que ela se ligue com as outras protenas envolvidas na coagulao sangunea, ou dificultando essa ligao. Sabe-se tambm que algumas substituies de aminocidos na protena podem ter efeitos apenas menos drsticos, uma pequena provocando

O nmero de aminocidos varia de uma protena para outra, as menores tem em torno de 50 aminocidos e as maiores perto de 20.000. As protenas se dobram formando tpica, uma ou estrutura seja cada tridimensional

protena tem uma forma definida que depende da seqncia de aminocidos que possui. essa forma que vai ser responsvel pela funo da protena. Observe a sua volta diferentes objetos e veja como a funo de cada

alterao de forma do fator VIII, sem comprometer o funcionamento de modo muito intenso. Neste caso, a pessoa pode ter um tempo de coagulao um pouco maior do que a maioria dos

indivduos, sendo, no entanto, normal e no hemoflica.

As Protenas na Nossa Dieta

As protenas, enquanto macromolculas, no so essenciais na dieta humana. Alguns monmeros que formam as

Enzimas
As enzimas formam uma classe especial de protenas que tem como funo catalisar (acelerar) as reaes qumicas. Cada enzima especializada em acelerar uma reao especfica. Por exemplo, a enzima amilase age sobre o amido e o degrada at glicose. O amido, que a substncia que vai ser alterada durante a reao qumica, recebe o nome de SUBSTRATO. Na enzima, existe uma regio que se liga especificamente ao substrato e a esta regio chamamos de STIO ATIVO. Assim, aps a interao do substrato com o stio ativo, ocorre a reao qumica, sendo liberado o PRODUTO da reao, que no caso da amilase, a glicose. As enzimas no se alteram com a reao qumica que promovem, saindo intactas do processo, podendo ir localizar mais substrato para catalisar nova reao (Ver Figura 9).

protenas que so considerados essenciais para nutrio humana. Os aminocidos chamados de essenciais so aqueles que nossas clulas no conseguem produzir. As protenas presentes nos alimentos so degradadas no aparelho digestivo. Essa degradao corresponde separao da cadeia polipeptdica em monmeros. Os aminocidos liberados so, ento, levados atravs do sangue para todas as clulas do nosso corpo. Uma vez no interior de nossas clulas, esses aminocidos sero utilizados para compor as nossas protenas e fazer funcionar o nosso organismo. As importantes protenas no de um bife eram da vaca. As msculo

protenas do ovo seriam importantes para o pintinho que iria se desenvolver naquele ovo. Se essas protenas entrassem intactas em nossa circulao, de nada adiantaria, pois no estariam aptas a desempenhar as funes que as nossas clulas devem executar. Alm do mais, como sabemos, toda protena estranha serve como antgeno, e provavelmente, a absoro de uma protena de vaca ou de galinha provocaria uma reao alrgica. Nosso sistema imune reconheceria essas protenas como estranhas ao organismo e criaria anticorpos contra elas. As protenas so molculas muito grandes. composto Por por exemplo, o colgeno aproximadamente 3.000

Figura 9 Esquema de uma reao enzimtica

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aminocidos. Essa protena fibrosa o principal componente da matriz extracelular e do tecido conjuntivo. Se considerarmos que a molcula da gua (que bem menor que a de um aminocido) tem dificuldade de atravessar absorvida a pele, como poderia de ser 3.000 uma molcula

Resumindo o que foi apresentado sobre protenas, podemos dizer que:

O funcionamento de um organismo depende de suas protenas. O funcionamento de cada protena depende de sua forma.
A forma de uma protena depende da seqncia dos aminocidos que a compem.
A questo agora explicar: Como o organismo estabelece seqncia de aminocidos que deve estar presente em cada protena? A seqncia de aminocidos das protenas est escrita (codificada) nos genes. Os genes so compostos de outro tipo de molcula orgnica, os cidos nuclicos.

aminocidos? Mas muitos cremes vendem a idia de que podemos repor o colgeno que est faltando em nossa derme, usando colgeno de galinha. Na verdade essa protena no consegue atravessar a pele e chegar na derme, onde normalmente est depositada. antgeno). Os aminocidos so divididos em essenciais, isto , aqueles que precisam fazer parte de nossa dieta, pois no temos a capacidade de sintetiz-los e no essenciais (aqueles que podemos sintetizar). A quantidade de protenas necessrias na dieta varia conforme a idade e o estado fisiolgico. Crianas, gestantes e lactantes necessitam mais protenas do que adultos. Um adulto jovem, com intensa atividade fsica, deve consumir em torno de 56g diria de protenas. Os alimentos de origem animal, como carne, leite e ovos so ricos em protenas. Os vegetais tambm tm protenas porm em quantidades menores. Por exemplo, uma fatia de po de trigo integral possui 2 gramas de protena, mas como essa uma protena de baixa de qualidade, um adulto jovem precisaria comer 72 fatias dirias protenas. para obter as 56 g Caso isso acontecesse, provocaria uma reao alrgica (seria um

2.2.CIDOS NUCLICOS
Os cidos nuclicos tambm so macromolculas polimricas, formadas por monmeros chamados de nucleotdeos. Cada nucleotdeo formado por uma base nitrogenada, um acar (ribose ou desoxirribose) e fosfato (Figura 10):

Figura 10. Nucleotdeo

11

Estes monmeros se unem para formar dois tipos de polmeros, o DNA (cido desoxirribonuclico) ribuclico). Os cidos nuclicos so formados pela unio de nucleotdeos (Figura 11). e o RNA (cido

1) Capacidade de replicao. Com o auxlio de enzimas, a dupla hlice de DNA se abre, formando fita simples e pode ser duplicada, originando cpias exatamente iguais a molcula original. 2) Capacidade de conter a informao da seqncia de aminocidos que compe as protenas. As seqncias de nucleotdeos do DNA determinam a estrutura primria das protenas.

Figura 11- Molcula de cido nuclico

Na molcula de DNA encontramos as seguintes bases: adenina (A); citosina (C); guanina (G) e timina (T) e so chamados de desoxiribonucleotdeos, porque o aucar a desoxiribose. A molcula de DNA formada por uma cadeia dupla, tendo algumas caractersticas importantes. Sempre que Figura 13- Replicao da molcula de DNA O RNA uma molcula formada por uma nica cadeia, ou seja, fita simples. Os nucleotdeos do RNA so chamados de Ribonucleotdeos porque o acar a ribose. No RNA a base uracila (U) substitui a Timina do DNA. Os diferentes tipos de RNAs so extremamente importantes para fazer com que a informao gentica contida no DNA seja
Figura 12. Estrutura da molcula de DNA mostrando a complementariedade das bases A=T; C=G.

existir uma adenina em um lado da cadeia, teremos uma timina no outro e sempre que ocorrer uma citosina em um lado da cadeia, teremos uma guanina no outro. Chamamos isto de complementariedade das bases, ou seja, as timinas sempre fazem par com as adeninas e as citosinas sempre pareiam com as guaninas.

traduzida

em

uma

seqncia

de

aminocidos, originando as protenas (ser visto adiante).

2.3. GLICDIOS
Duas propriedades importantes Os glicdios, tambm chamados de carboidratos ou acares so poliis de aldedos ou cetonas, divididos em: resultam da estrutura do DNA:

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a) Monossacardeos - como por exemplo a glicose e a frutose. Os monossacardeos podem unir-se formando dissacardeos. Por exemplo, a sacarose (acar de cana) a unio de uma frutose e uma glicose. A maltose formada pela unio de duas molculas de glicose e a lactose (acar do leite) formada pela unio de galactose e glicose.

As

principais

funes

desempenhadas pelos glicdios so: -ENERGTICA: so fonte de energia para a clula (ou reserva de energia) - ESTRUTURAL: formam as paredes das clulas vegetais -RECONHECIMENTO: clula-clula esto envolvidos no processo de reconhecimento nos tecidos dos animais pluricelulares, atravs do glicocalix.

2.4. LIPDIOS
Os lipdios ou gorduras desempenham importante papel na estrutura e funo celular. especficas. Os cidos graxos so a unidade fundamental da maioria dos lipdios e junto com os triglicerdios constituem as principais gorduras neutras que funcionam como reservas energticas. H vrias classes de lipdios e cada uma possui funes biolgicas

Figura

14

-Exemplo

de

alguns

monossacardeos b) Polissacardeos - so formados pela unio de vrios DE monossacardeos GLICOSE) Os (so trs Fig 15 - Exemplos de cidos graxos. J triglicerdios. os fosfolipdios lipdios, e uma os das POLMEROS

polissacardeos mais importantes so o AMIDO (reserva de energia dos vegetais), o GLICOGNIO (reserva de energia dos animais) e a CELULOSE (constituinte da parede das clulas vegetais). A diferena entre esses polissacardeos est na ligao qumica que une as glicoses. esfingolipdios so lipdios derivados dos Nesses cadeias de cido graxo substituda por uma estrutura qumica POLAR. Desta forma,

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estas molculas tero uma parte polar (hidroflica) e uma parte apolar (hidrofbica) Os fosfolipdios e esfingolipdios so componentes fundamentais das membranas biolgicas (ser visto adiante). Outra classe de lipdio a dos esterides que podem ter funo estrutural, como o colesterol que um componente da membrana como por plasmtica. exemplo a Outra funo desempenhada pelos esteris a hormonal, testosterona, progesterona.

muito especfica, a amilase desdobra o amido em glicose. Se ao invs de acrescentar saliva na mistura, acrescentssemos os aminocidos que compem a amilase, iria ocorrer a reao de degradao do amido? claro que no. Uma pilha de tijolos no o mesmo que uma casa. Uma mistura de aminocidos isolados, no possui as propriedades da protena que poderia ser formada pela unio desses aminocidos. Para que uma protena desempenhe uma funo definida, necessrio que ela tenha uma forma especfica. A estrutura tridimensional de uma protena resultado da unio de aminocidos em uma seqncia tambm especfica. Portanto, a ligao sucessiva de um aminocido ao outro que ir determinar a forma final de uma protena e sua capacidade funcional. As macromolculas apresentam propriedades novas que no esto presentes nos seus componentes isolados. A amilase, por exemplo, tem a capacidade de degradar o amido, porm esta propriedade no est presente em nenhum dos aminocidos que compem a amilase. Quando, pela unio de aminocidos em uma seqncia especfica, a macromolcula amilase se forma, EMERGE uma nova propriedade (capacidade de degradar a amido) que no est presente nos seus componentes. As propriedades emergentes so um atributo da forma esterioqumica da macromolcula. Do mesmo modo que a forma da tesoura confere a esse instrumento uma propriedade nova (capacidade de

ESTRUTURAS SUPRA-MOLECULARES E A EMERGNCIA DE NOVAS PROPRIEDADES

Um conceito importante para o

entendimento dos seres vivos o de propriedades emergentes. Vejamos um exemplo bem simples: um professor demonstra a ao enzimtica da amilase salivar, atravs de um experimento muito comum, que pode (e deve) ser realizado em sala de aula. Nesse experimento, uma soluo de Maizena fervida e distribuda em dois frascos. Em apenas um dos frascos adiciona-se um pouco de saliva e ,depois, uma gota de lugol (ou soluo de iodo) acrescentada em ambos os frascos. Neste caso, a alterao de cor que se observa no frasco explicada pelo fato da enzima presente na saliva ter a PROPRIEDADE de degradar o amido da Maizena. Essa uma propriedade cataltica

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cortar), a forma da protena amilase lhe permite catalisar a reao amidoglicose. Muito do funcionamento celular depende das propriedade emergentes de suas macromolculas. Mas as clulas no so formadas apenas de macromolculas, elas possuem Estruturas estruturas tambm ESTRUTURAS so vrias SUPRAMOLECULARES. supramoleculares por formadas

Os

ribossomos

so

estruturas

capazes de auto-montagem, isto , basta colocarmos todos os componentes juntos e, em condies fsico-qumicas apropriadas, automaticamente as sub-unidades do ribossomo montam-se. possvel, portanto, desmontar e remontar os ribossomos em tubos de ensaio. E sempre, aps a automontagem, uma PROPRIEDADE nova EMERGE : os ribossomos so capazes de fazer sntese de protenas. Todas as organelas intracelulares so estruturas supramoleculares. A mitocndria, por exemplo, formada por um grande nmero de protenas, lipdios, DNA, RNA... que formam suas membranas, os seus ribossomos, corpsculos elementares, etc... Estas macromolculas, formam a ao se que associarem, mitocndria

macromolculas. Um exemplo de estrutura supramolecular o ribossomo (Figura 16). Cada sub-unidade do ribossomo formada por vrias macromolculas. A sub-unidade maior formada por 3 diferentes RNAs ribossmicos: um com 120 nucleotdeos (nts), outro com 160 nts e o terceiro com 4700 nts. Alm dos RNAs a sub-unidade maior apresenta 49 diferentes protenas (denominadas L1, L2, L3, ... at L49). Na sub-unidade menor temos apenas um rRNA de 1900 nts associado a 33 protenas (denominadas S1, S2, ..at S33).

possui propriedades novas que no esto presentes nos componentes isolados. Por exemplo, a sntese quimiosmtica do ATP s possvel graas estrutura da mitocndria que dada pela totalidade por um de ou seus outro componentes associados, e no pode ser realizada apenas componente da mitocndria. Este outro exemplo de uma propriedade emergente, que s se manifesta a partir do surgimento de uma estrutura com organizao supramolecular.

Figura 16 .Ribossomo dos eucariontes

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UNIDADE II
A ORGANIZAO CELULAR
O tema de estudo da Biologia, a VIDA uma propriedade emergente de uma supraestrutura: a clula. A Vida originou-se na Terra a +/- 3.5 bilhes de anos atrs quando montaram-se as primeiras clulas. O CONCEITO DE CLULA MNIMA A definio mais comum para clula : unidade morfo-fisiolgica dos seres vivos. Mas o que caracteriza uma clula? Quais so os componentes MNIMOS para que uma estrutura possa ser considerada uma clula? De uma forma geral, quando perguntamos como constituda e como funciona uma clula, a resposta mais comum : ...formada por membrana, citoplasma e ncleo. A membrana reveste a clula, fazendo as trocas contm pelo o ncleo com as o meio, o citoplasma responsveis clula e organelas da este

dependia exclusivamente do microscpio ptico e de alguns corantes. Neste perodo, o que mais chamava a ateno, quando se observava uma clula, era a presena do ncleo. Posteriormente, verificou-se que, no ncleo, estavam os cromossomos e inferiuse que estes eram depositrios dos genes. Assim, a idia de que, no ncleo, estava o controle do funcionamento celular relativamente antiga, porm por muito tempo no foi possvel saber exatamente como esse controle era exercido.

Figura 17. Aspecto geral da organizao celular de um procarionte. CARACTERSTICAS BSICAS DE UMA CLULA (uma concepo atual) Se a descrio de uma clula como um conjunto de membrana, citoplasma e ncleo uma viso originria do fim do sculo passado, quais seriam as caractersticas da organizao celular em uma viso contempornea? Para responder essa questo temos que pensar em caractersticas que sejam comuns a todas as clulas, sejam elas e procariticas e eucariticas. So quatro as partes essenciais que podemos encontrar em toda clula:

funcionamento controla

funcionamento. Devemos considerar, entretanto, dois aspectos importantes: 1) As bactrias e demais procariontes so organismos celulares e no possuem ncleo; 2) Quando dizemos que o ncleo controla o funcionamento Esta celular, viso da no fornecemos nenhuma idia de como isto ocorre. constituio funcionamento celular originria do fim do sculo passado e, nessa poca, o estudo da estrutura e do funcionamento celular

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 Membrana - delimita a clula, separando os demais elementos celulares do meio ambiente e regulando as trocas da clula com o meio; Maquinaria metablica conjunto de enzimas e protenas capazes de utilizar a matria e energia do meio ambiente para realizar as funes celulares; Informao gentica como, quando e informao de montar as onde

ambiente. Estas trocas so controladas pela membrana plasmtica. Por isto a principal caracterstica da membrana a PERMEABILIDADE SELETIVA. Assim, a membrana permevel porque deixa passar substncias atravs dela, porm, faz isso seletivamente, ou seja, escolhendo o que deve entrar e sair da clula. Para se entender como a membrana realiza seletiva, esta funo que de permeabilidade como a temos estudar

protenas da mquina metablica e demais protenas estruturais da clula Maquinaria de sntese protica constituda por ribossomos, mRNAs e tRNAs capazes de transformar em a informao metablica. Estes componentes celulares podem ser facilmente reconhecidos nos Mycoplasma, um tipo de bactria, que so os seres celulares estruturalmente mais simples que conhecemos (Ver Figura 17). Vamos, a seguir, tratar de cada uma dessas partes que compem o que podemos chamar de uma clula mnima. gentica maquinaria

membrana constituda quimicamente e como estes componentes atuam. Os reserva de lipdios energia da membrana graxos so e diferentes dos lipdios que so usados como (cidos os triglicerdios). Enquanto lipdios

energticos so insolveis em gua, os lipdios que compe a membrana (chamados de fosfolipdios, esfingolipdios e outros) so ANFIPTICOS, ou seja, tm uma parte da molcula que eletricamente carregada e hidroflica (solvel em gua), e outra parte que hidrofbica (insolvel em gua) Figura 18.

MEMBRANA CELULAR
O que delimita a clula do resto do universo uma fina membrana LIPOPROTICA chamada membrana plasmtica ou membrana celular. A clula no pode se isolar do meio em que se encontra, precisando manter uma constante troca de matria e energia com o Tendo esta caracterstica anfiptica, os fosfolipdios, quando colocados em gua, vo ter uma organizao tpica, formando Figura 18- .Estrutura de um Fosfolipdio

17

finas membranas em BICAMADAS, conforme representado na Figura 19.

protenas da membrana tambm tero uma parte hidroflica e uma parte hidrofbica.

Figura 19 Formao de bicamadas lipdicas quando os fosfolipdios so colocados em gua.

Desta forma, sempre que colocarmos lipdios anfipticos em gua, formar-se-o bolhas e a gua estar tanto do lado de dentro da bolha, quanto do lado de fora (Figura 19). A gua e todas as substncias hidrossolveis, como os acares, Por terem tanto regies hidrofbicas como regies hidroflicas, as protenas anfipticas vo se intercalar entre os fosfolipdios. (figura 20 e 21) O Como, ento, a membrana realiza a sua funo de permeabilidade seletiva? S existe permeabilidade seletiva graas ao do outro componente das membranas: as PROTENAS. Como sempre, as atividades de funcionamento dos organismos esto relacionadas s protenas. As protenas das membranas tambm so ANFIPTICAS, ou seja, elas tm uma parte formada por aminocidos polares (com carga eltrica) e outra parte constituda aminocidos preponderantemente apolares. Desta forma, com as Modelo do MOSAICO FLUDO das membranas biolgicas explica como se organizam e funcionam essas membranas. Segundo este modelo, temos uma bicamada de lipdios com protenas intercaladas nesta bicamada. As partes hidroflicas dos fosfolipdios e das protenas ficam voltadas para as superfcies interna e externa da membrana em contato com a gua. As partes hidrofbicas protenas dos na fosfolipdios regio e das da ficam interior aminocidos, nucleotdeos, por no serem solveis em lipdios, no podem passar pela camada hidrofbica da membrana. Figura 20. Estrutura das protenas da membrana

membrana (figura 21)

18

TRANSPORTE DE SUBSTNCIAS PELA MEMBRANA As substncias passam pela membrana de trs formas diferentes: 1) Difuso simples: Algumas substncias como o O2, CO2, lcool e ter, por serem solveis tanto em gua como em gorduras, podem Figura 21Modelo do MOSAICO passar Para diretamente estas pelos a fosfolipdios. FLUIDO da membrana biolgica Este modelo chamado de substncias,

membrana no constitui uma barreira, e suas molculas vo difundir de onde elas esto mais concentradas para aonde esto menos concentradas (1 na Figura 22).

MOSAICO, porque os componentes da membrana se organizam como um mosaico (associao de pequenas peas que se encaixam ou sobrepe para formar uma estrutura). A denominao de Mosaico FLUDO justificada pelo fato de seus componentes (fosfolipdios e protenas) no serem fixos na membrana, podendo apresentar movimentos laterais. Podemos resumir a atuao dos componentes da membrana da seguinte forma: a) OS FOSFOLIPDIOS atuam como uma barreira, impedindo que as substncias que esto dentro da clula saiam e evitando que as substncias que esto fora da clula entrem. b) AS PROTENAS (tecnicamente funcionam chamados como de portes A maioria das substncias no pode atravessar livremente pela membrana e precisam 2) passar pelas protenas. ou est Essa passagem pode ocorrer de duas maneiras: Transporte uma passivo substncia difuso mais facilitada. O transporte passivo ocorre, quando concentrada de um lado da membrana do que do outro, e h interesse da clula que esta substncia passe pela membrana. Protenas especficas, chamadas que de essas CARREADORES, permitem Figura 22 Passagem de substncias atravs da membrana

CARREADORES ou POROS), por onde passam as molculas; entrar ou sair da clula. so as elas que reconhecem as substncias que devem

19

substncias atravessem (geralmente atravs de aberturas ou canais nas prprias a NA INTERNET: Entenda melhor a membrana celular comparandocom bolhas de sabo: www.sbbq.org.br/revista/artigo.php?artigoid=41 protenas). No caso do transporte passivo, no h gasto de energia, porque a favor do gradiente de concentrao ( 2 na Figura 22). 3) Transporte Ativo: Quando do interesse da clula transportar substncias contra um gradiente de concentrao, (ou seja, de onde tem pouco de uma substncia para aonde j existe bastante dessas mesmas molculas) a clula precisa gastar energia para fazer esse transporte (3 na Figura 22). Como podemos ver, somente molculas no muito grandes podem entrar e sair da clula pelos carreadores. Molculas grandes como as protenas, cidos nuclicos ou polissacardeos, somente em condies muito especiais Molculas podem passar pela membrana. grandes (macromolculas), assim como estruturas ainda maiores como vrus ou clulas no passam diretamente pela membrana celular, e s entram na clula atravs (fagocitose de e mecanismos de TRANSPORTE DE MASSA, chamado endocitose pinocitose). Mas vale ressaltar que atravs da fagocitose e pinocitose as substncias ou estruturas passam entram a na clula, mas no MEMBRANA SEGUNDO O MODELO MOSAICO-FLUIDO membrana pois entram BRINCAR COM BOLHAS DE SABO PODE AJUDAR A ENTEDER A

envolvidas em membrana.

20

MAQUINARIA METABLICA
O que permite que uma lactobactria (bactria do iogurte) se desenvolva to bem no leite, transformando-o em iogurte e uma aceto-bactria se procrie maravilhosamente no vinho, transformando-o em vinagre? Se colocarmos a bactria do vinho no leite, ela no vai se desenvolver, o mesmo acontecendo com a bactria do iogurte, quando colocada no vinho. Por que isto acontece? Cada clula, mesmo simples como uma bactria, possui enzimas e outras protenas que a capacita a desempenhar as funes para as quais est adaptada. A lacto-bactria possui enzimas para quebrar a lactose e as protenas do leite. J a acetobactria possui enzimas para transformar o lcool em cido actico e usar outros nutrientes encontrados no vinho. Estas duas bactrias possuem diferentes maquinarias metablicas que as tornam adaptadas para explorar recursos diversos. As diferenas que ocorrem no funcionamento entre clulas so explicadas pela variao nas protenas existentes nelas. Chamamos metablica o de de maquinaria enzimas e conjunto

os em energia ou em outras molculas estruturais da clula; as protenas motoras que produzem movimento dos componentes celulares, etc... No caso especfico do exemplo que estamos trabalhando, a aceto-bactria ter as protenas de membrana para retirar do vinho os nutrientes apropriados. No interior da clula, enzimas transformaro estes nutrientes em mais macromolculas de aceto-bactria. Enfim, possibilitam o sonho primordial de toda aceto-bactria: tornar-se duas aceto-bactrias...

INFORMAO GENTICA
Porque uma aceto-bactria colocada no leite no produz as enzimas necessrias para usar o acar e as protenas do leite como nutrientes? Ou, colocando a mesma questo em um outro exemplo: sabemos que a celulose um polissacardeo formado de molculas de glicose. No entanto, se por um motivo qualquer para s tivssemos papel (celulose) comer, acabaramos

morrendo de inanio por falta de energia, embora estivssemos ingerindo um polmero construdo com glicose. Outros organismos, como cavalos, vacas ou baratas so capazes de aproveitar a glicose presente na celulose do papel. Nos dois exemplos, o que falta a informao gentica de como fazer as enzimas necessrias para aproveitar uma determinada nutriente. A informao gentica est armazenada nas clulas sob forma de cidos molcula como fonte de

protenas que vo ser responsveis pelo funcionamento da clula (ou seja, pelo metabolismo protenas celular). Por exemplo, que as da membrana captam

nutrientes do meio externo e os transportam para o interior da clula; as enzimas que vo transformar estes nutrientes, atravs de complexas rotas bioqumicas, transformando-

21

nuclicos. (procariticas

Para ou

todas

as o

clulas a DNA.

seqncia de DNA que essencial para uma funo especfica. Trs tipos de genes so reconhecidos: 1) protenas. genes So que codificam para para RNA

eucariticas),

macromolcula

informacional

Somente alguns vrus apresentam suas informaes armazenadas sob forma de RNA. A informao gentica total, carregada por um organismo ou clula, denominada de GENOMA. Por exemplo, na nossa espcie, o genoma das clulas somticas constitudo por 46 molculas de DNA. Cada uma dessas molculas se organiza sob forma de um cromossomo, ou seja, cada cromossomo contm uma nica molcula comeando cromossomo de DNA em e uma que contnua, do sem 3) genes no transcritos. So seqncias de DNA que, embora no sejam transcritas, desempenham alguma funo. Por exemplo, os genes de replicao, envolvidos na duplicao do DNA; genes de recombinao, seqncias proteo que so seqncias na dos envolvidas no processo de crossing-over; telomricas, das envolvidas
6

transcritos

mensageiro (mRNA) e subseqentemente traduzidos, nos ribossomos, para protenas.

2) genes que especificam RNAs funcionais, RNAs miRNA. que como os RNAs ribossmicos desempenham funes (rRNA); RNAs transportadores (tRNA) e regulatrias na clula como os snoRNA e

extremidade

prolongando-se

interrupo at a outra extremidade. Temos tambm uma 47a molcula de DNA que o cromossomo mitocondrial. O genoma de clulas mais simples, como as bactrias, est organizado em um nico cromossomo circular. Em torno de 2000 genes esto presentes no genoma de uma bactria, como a Escherichia coli. O cromossomo bacteriano como de E. coli nmero DNA, na possui aproximadamente 4,2x 10 de diferentes este de nmero bases nos pares de bases. Ou seja, se contssemos o nucleotdeos seria desta genes de, Assim, o genoma contm um grande nmero de genes que, quando necessrios, so ativados, ou seja, so copiados em RNA (ver Figura 23). ATCCGGTAACC... em uma das fitas do aproximadamente, 4.200.000 nucleotdeos. seqncia imensa dessa molcula de DNA que est escrito a informao bactria. Estudos moleculares recentes tem ampliado o conceito de gene: uma 22 gentica,

extremidades

cromossomos...

Figura 23) Exemplo hipottico do genoma de um procarionte O genoma contm muitos genes. Alguns so genes para tRNA, outros para rRNA e outros ainda codificam para polipeptdios (mRNA). A transcrio de um gene depende da regio regulatria desse gene. Um dos principais elementos da regio regulatria do gene o stio ou regio promotora que corresponde ao local de entrada da RNA polimerase. Essa enzima, responsvel pela transcrio de DNA em RNA, reconhece a regio promotora do gene, se associa a esse conjunto de bases e passa a se deslocar pela fita molde de DNA, fazendo a ligao entre os ribonucleotdios complementares fita de DNA. No fim do processo de transcrio temos uma fita de RNA que,aps passar por algumas modificaes (processamento do RNA), torna-se funcional e poder executar as diferentes funes necessrias sntese de protenas. Figura 25 Fluxo da informao gentica dentro da clula. O DNA se duplica pelo processo chamado de transcrio. A informao nele contida copia em molculas de RNA em um processo chamado de transcrio. Os RNAs participam do processo de sntese de protenas (traduo)
Figura 24) Processo de transcrio dos genes ribossmicos (rRNA); dos RNAs transportadores tRNA e dos RNAs mensageiros mRNAs. mostrado tambm, a unio de todos estes componentes no processo de TRADUO, que a sntese de protenas.

23

MAQUINARIA DA SNTESE PROTICA

No citoplasma existem todos os elementos polipeptdios, necessrios que sntese de de chamamos

tenha

uma

trinca

de

bases

que

seja

complementar as trs bases do mRNA que esto naquele momento no stio A. A regio do tRNA que entra em contado com as bases do mRNA dentro do ribossomo denominada de anticdon. De um modo

MAQUINARIA DE SNTESE PROTICA:

> ribossomos >RNAs transportadores > RNA mensageiro

A seqncia de eventos que resulta na sntese de uma protena pode ser resumida da seguinte forma : Transcrio do DNA em RNA (nos 1, 2 e 3 na Figura 21). Processamento do RNA para que se torne funcional (ocorre em eucariontes). Montagem do ribossomo - a subunidade menor do ribossomo reconhece o incio da fita de mRNA e se liga ao mRNA . Essa ligao permite que a subunidade maior se associe subunidade menor, formando-se assim um ribossomo capaz de realizar a sntese de protenas. Primeira ligao Peptdica - o ribossomo se desloca sobre a fita de mRNA e quando encontra nessa fita a seqncia de base AUG, cria no seu interior, dois stios, um destinado a receber os tRNAs que trazem os aminocidos para serem ligados cadeia polipeptdica (stio A) e outro que ser ocupado pelo transportador que mantm a cadeia polipeptdica nascente (stio P). Qualquer tRNA pode entrar no ribossomo e ocupar o stio A, porm para que o tRNA permanea nesse stio necessrio que ele

simplificado, as molculas de tRNAs so representadas como tendo em uma extremidade a regio do cdon e na outra a regio de ligao com o aminocido. Os tRNAs que possuem o mesmo anticdon transportam estar o mesmo aminocido. para dentro Por do exemplo, se o anticdon for AAA, esse tRNA transportando ribossomo o aminocido fenilalanina. Alguns aminocidos so transportados por mais de um tipo de tRNAs. Por exemplo, os tRNAs que possuem anticdons GCA, GCG, GCU ou GCC transportam (ver tabela do cdigo gentico) para o ribossomo arginina. Desse modo, as trs bases do mRNA (cdon) que ocupam o stio A, ao selecionar qual o tRNA que permanecer dentro do ribossomo, determinam qual o aminocido que ser adicionado cadeia polipeptdica. O primeiro tRNA a ocupar o stio A, deve ter anticdon complementar trinca AUG. Esses tRNAs sempre transportam uma metionina, portanto esse o primeiro aminocido de toda a sntese de protenas. A metionina inicial pode ser removida depois, o que significa que nem todas as protenas funcionais tero esse aminocido presente no incio da cadeia. Crescimento da cadeia

polipeptdica - quando os stios A e P esto ocupados por tRNAs, que tenham anticodons complementares ao mRNA, na parte superior

24

da subunidade maior do ribossomo, ocorre a ligao entre os aminocidos que esses tRNAs transportam. Quando essa ligao ocorre, o ribossomo se desloca sobre a fita de mRNA e esse deslocamento corresponde exatamente a trs nucleotdios. Assim, a cada ligao entre dois aminocidos, um novo cdon ocupa o stio A e determina a entrada de um novo tRNA que trar o prximo aminocido a ser ligado. Com o deslocamento do ribossomo, o tRNA que trouxe o ltimo aminocido adicionado passa a ocupar o stio P e o tRNA, que antes estava nesse stio, liberado pelo ribossomo, podendo voltar a participar da sntese de protenas quando estiver de novo ligado a um aminocido especfico. Por exemplo, na Figura 26, no incio da traduo, o stio P est ocupado pelo cdon AUG e pelo tRNA da metionina, e o stio A est ocupado com o cdon UUU e o tRNA da fenilalanina. Aps a ligao entre os dois primeiros aminocidos (metionina e fenilalanina), com o

polipeptdica.

comum

encontrar,

no

citoplasma, vrios ribossomos realizando traduo a partir da mesma fita de mRNA. Desse modo, a clula pode originar vrias molculas da mesma protena com um nico RNA mensageiro. Final da sntese - os ribossomos seguem se deslocando na fita de mRNA e quando o stio A ocupado por uma trinca UAA, ou UAG ou UGA o crescimento da cadeia polipeptdica interrompido. Nenhum tRNA possui anticodons complementares a essas trincas e por isso esses codon so chamados sem sentido e sinalizam o fim da traduo. Depois que o ribossomo atinge um desses codon, as subunidades se separam. A um subunidade mRNA, menor iniciando pode, ento, se um associar novamente com a parte inicial de novamente processo de traduo.

Atravs

dos

mecanismos

de

deslocamento do ribossomo, o tRNA da metionina perde sua ligao com esse aminocido e sai do ribossomo. O tRNA da fenilalanina passa, ento, a ocupar o stio P e se mantm ligado fenilalanina, que por sua vez est ligada metiona. medida que o ribossomo se desloca, a cadeia polipeptdica vai crescendo, sempre ligada ao tRNA que acabou de fornecer o ltimo aminocido. Deve-se ressaltar que, logo aps o primeiro deslocamento do ribossomo, o cdon de iniciao AUG fica liberado e outro ribossomo pode se associar ao mRNA e iniciar a sntese de uma segunda cadeia

transcrio e traduo, a informao gentica se transforma em maquinaria metablica. Assim, em uma clula simples como uma lacto-bactria, a informao contida no genoma traduzida, isto , esta informao capaz de conduzir a sntese de um bom nmero de protena que estaro aptas a utilizar os nutrientes presentes no leite, para manter a estrutura celular e ainda criar mais macromolculas e permitir o crescimento desta bactria e posterior reproduo.

25

Unidade III
DA CLULA PROCARITICA PARA A CLULA EUCARITICA.
Podemos dizer que uma bactria um bom exemplo de uma clula mnima. Vimos anteriormente a como atuam a a membrana, maquinaria metablica,

informao gentica e a maquinaria da sntese protica, para fazer uma bactria funcionar. Mas se as bactrias so ditas Figura 26) Processo de traduo de uma protena. A) montagem do ribossomo B) iniciao do processo de traduo C e D) elongao da cadeia de aminocidos. Cada tRNA que se liga ao ribossomo, deixa um aminocido. A TABELA DO CDIGO GENTICO clula, clulas mnimas, porque existem clulas muito mais complexas, as eucariticas. O que elas possuem que no est presente nas clulas bacterianas? Um sistema de membranas que compartimentaliza as diversas funes da chamado Uma para a de rede SISTEMA de DE ENDOMEMBRANAS; protenas de filamentosas que do forma e mobilidade clula, chamada CITOESQUELETO.

A INFORMAO GENTICA NOS EUCARIONTES A eucariontes DNA est informao gentica dos apresenta sempre algumas com

peculiaridades. Nas clulas eucariontes o complexado protenas. As protenas que se associam ao DNA so de dois tipos: as histonas ou Diga que protena resulta do seguinte mRNA: UUAUGGUUAGUCGUAGAUAUUGA protenas bsicas e as protenas cidas. Quando a clula no est em diviso (durante a interfase), a molcula de DNA

26

apresenta seu grau mnimo de enrolamento, constituindo a Cromatina. Conforme podemos ver na Figura 27, a cromatina apresenta vrios graus de compactao: em (A) temos a molcula de DNA com seu dimetro de 2 nammetros (nm = 10
9

Em (C) a fibra de nucleossomos se enrola sobre si mesma, originando a fibra em solenide, em um formato de fio de telefone; nesse formato de solenide que a cromatina se encontra no ncleo na interfase. Algumas protenas cidas unem as fibras da cromatina formando s alas de cromatina (letra D na figura). As alas vo sendo unidas em grupos cada vez mais condensados, no centro da cromtide. No fim desse processo, o cromossomo atinge seu grau mximo de dobramento, que corresponde ao cromossomo metafsico, ou seja, ele observvel na fase de metfase da diviso celular. (letras E e F na figura abaixo). Para dar uma idia de como longo os fios de cromatina, apresentamos, na Figura 28, a cromtide de um cromossomo mittico que teve as protenas cidas removidas. Esse tratamento permitiu que as alas constitudas pela fibra de cromatina se desprendessem do centro da cromtide. A informao gentica est escrita na seqncia de bases que o DNA apresenta. O genoma nuclear de uma clula humana contm, aproximadamente, 6.000.000.000 pares de bases, compondo as 46 molculas de DNA dos cromossomos. O menor cromossomo humano, o de nmero 21, possui 50.000.000 pares de bases. Voc pode imaginar isso?

m)

no associado a nenhum tipo de protena. A dupla hlice sem protenas associadas no encontrada no ncleo das clulas, pois em seu estado funcional o DNA eucaritico sempre est ligado a protenas. Em (B) a molcula de DNA apresenta-se enrolada nas histonas, formando as fibras dos nucleossomos com 11 nm. Quando a clula inicia o processo de diviso, pode-se notar uma mudana no aspecto do ncleo. A medida que a clula avana na fase de prfase, possvel visualizar, no ncleo, uma condensao progressiva da cromatina.

Figura 27- ver texto

27

Ter

genomas dos

grandes eucariotes.

uma Esses grandes

As

principais

vantagens

da

caracterstica organismos

compartimentalizao celular so: Permitir a separao e a associao dos sistemas enzimticos; Aumentar a superfcie interna da clula, aumentando o campo de ao enzimtica e facilitando Permitir intracelular. Componentes endomembranas Retculo endoplasmtico: O tbulos retculo (pequenos endoplasmtico tubos) e constitudo por endomembranas que limitam cisternas (cavidades em forma de sacos achatados). O retculo endoplasmtico dividido em: Reticulo endoplasmtico lisoforma de tbulos, est tem a em do sistema de as reaes valores qumicas, do pH principalmente as que ocorrem em cadeia; diferentes

apresentam

quantidades de DNA em suas clulas, mas boa parte desse DNA no considerado gene, pois no transcrito, e no apresenta funo para a clula.

Figura 28 visualizao de uma cromtide em um cromossomo

envolvido

SISTEMA DE ENDOMEMBRANAS
As citoplasma clulas todo eucariticas em so

transporte e armazenamento de substncias, sntese de lipdios e desintoxicao celular; Retculo endoplasmtico rugoso-

compartimentalizadas, isto , possuem o dividido estruturas membranosas. Cada compartimento tem a sua funo especfica. As membranas que delimitam estas organelas so do tipo mosaico fludo. Assim, os lipdios destas membranas isolam os contedos destes compartimentos e as protenas controlam o que deve entrar ou sair de cada compartimento. especificas qumicas Alm disso, as do enzimas reaes proporcionam caractersticas

possui ribossomos aderidos a sua superfcie citoplasmtica; como os ribossomos fazem a sntese protica, o retculo endoplasmtico rugoso est envolvido na sntese protica, alm de transporte e armazenamento de substncias (principalmente protenas). Complexo de Golgi: formado por vrias vesculas ou cisternas achatadas em forma de discos. Nestas vesculas ocorre a maturao (modificaes qumicas) de substncias (principalmente protenas ribossomos rugoso). que do foram sintetizadas pelos retculo endoplasmtico

funcionamento de cada organela.

Aps esta maturao, essas

28

protenas tero dois destinos:

podem ser

temos as clulas glandulares. As clulas do pncreas produzem insulina, que uma protena importante para todas as clulas do organismo. A esta exportao de substncia chamamos SECREO CELULAR. A secreo celular tem vrias FASES. Vamos ver o exemplo da secreo da insulina para entendermos estas fases. A insulina uma protena, portanto, tem uma seqncia especfica de aminocidos. Esta seqncia est codificada no gene da insulina que est no ncleo da clula. A

enviadas para fora da clula (secreo); podem ser enviadas para outra organela (lisossomo) intracelular. para participar da digesto

primeira fase da secreo celular ocorre ento, no ncleo da clula, onde o gene transcrito em RNA mensageiro (mRNA). Este mRNA ento processado e sai do no retculo endoplasmtico A ncleo. No citoplasma, ele ir se ligar aos ribossomos rugoso (RER) e, l, ocorre a sntese da protena (insulina) que entra no RER. Figura 29- -Sistema endomembranas da clula eucaritica A Figura 29 apresenta o esquema de uma clula eucaritica: mp=memb. plasmtica; ri= ribossomos; mi= mitocndrias; REG= retculo endoplasmtico granular (rugoso); REA= ret. end. agranular (liso); c= centrolo; G= golgi; Li= lisossomos; Pe= peroxissomos; vs= vescula secretora; ve= vescula endoctica; mv= Lisossomos: So vesculas que contm hidrolases cidas (enzimas digestivas que atuam em pH Secreo celular: Muitas clulas produzem substncias de exportao, isto , so substncias que vo atuar fora da clula. Como exemplo, cido) e esto envolvidas no processo de digesto intracelular. microvilosidade.

insulina transportada do RER at o Complexo de Golgi, onde sofrer algumas modificaes (amadurecimento) e ser empacotada em vesculas. produzidas chamadas pelo Complexo vesculas As vesculas de Golgi, sero

secretoras,

levedas para fora da clula. Neste caso, a insulina cair na corrente sangunea e ser levada para todas as clulas do organismo.

29

Digesto intracelular: Chamamos de digesto intracelular a quebra de macromolculas como protenas, cidos nuclicos respectivos e polissacardeos monmeros, em seus no ocorrendo

vezes

lisossomo

primrio

envolve partes da prpria clula, que por algum motivo no esto mais funcionais, formando o AUTOFAGOSSOMO, que um lisossomo que digere uma parte da clula (AUTOFAGIA - auto= por si prprio / fagos= comer ).

interior da clula. Para fazer estas quebras, so necessrias enzimas (PROTEASES, DNAses, etc...). Estas enzimas no podem ficar soltas no interior da clula, pois quebrariam as protenas, DNA.... da prpria clula. Por isso elas so isoladas no interior de um compartimento, os lisossomos aonde ocorre a digesto intracelular. A digesto intracelular tambm ocorre em FASES: as trs primeiras

Como podemos notar, tanto na digesto celular como na secreo celular, nenhuma parte do sistema de endomembranas atua sozinha, ao contrrio, so processos em que vrias partes do sistema de endomembranas atuam em conjunto.

fases da digesto so idnticas a secreo celular, uma vez que para fazer digesto, precisamos enzimas que quebrem macromolculas, e enzimas so protenas, e a mensagem de como fazer as protenas esto nos genes; da vescula ou o na quarta fase, ocorre a ou a dentro seja, clula de por vai uma

Peroxissomas: Os peroxissomas ou microssomas de forma so pequenas vesculas esfrica,

semelhantes aos lisossomos, porm as enzimas que carregam so muito diferentes. Os peroxissomas carregam e OXIDASES superoxido (RADICAIS (peroxidases, formas ativas catalases do

internalizao do que vai ser digerido atravs endoctica, pinocitose, alimento fagocitose internalizar

dismutase) que so enzimas que quebram as oxignio LIVRES). Como exemplo de radicais livres podemos citar a gua oxigenada (H2O2). A gua oxigenada, chamada tambm de perxido de hidrognio uma molcula muito reativa, podendo reagir com as protenas e outras macromolculas quebrando-as. Por isso muitas pessoas usam gua oxigenada para branquear os cabelos, pois a molcula de H2O2 quebra a melanina que uma protena que d a cor ao cabelo. No milhares interior de de nossas qumicas clulas, esto reaes

vescula (vescula endoctica) e

ocorre a

unio da vesicula endoctica com o lisossoma primrio (produzido no complexo de golgi, contendo as enzimas j prontas para atuar na digesto). Da unio da vescula endoctica com o lisossomo primrio formar-se- o lisossoma secundrio, onde ocorrer a digesto. Aps a digesto, os monmeros sero lanados para o hialoplasma (lquido que envolve todos os compartimento do sistema de endomembrana), onde serviro para a clula montar novos polmeros.

continuamente sendo realizadas, a estas

30

reaes chamamos METABOLISMO. Muitas reaes metablicas produzem, normalmente, muitas formas reativas de oxignio do tipo da gua oxigenada, ou mesmo alguns (O2-). e mais reativos, como o superoxido protenas degradam enzimas Para impedir que estes as nossas livres. clulas Estas nos um

radicais livres degradem as nossas prpria DNAs, produzem algumas enzimas (oxidases) que estes so radicais armazenadas que nascem com Figura 30- Esquema trimensional do sistema de endomembranas. Podemos ver o REG na forma de cisternas (sacos achatados) e o REL na forma de tbulos. O golgi tambm apresenta a forma de cisternas, porm so menores e no possui ribossomos aderidos.

PEROXISSOMAS. Crianas defeito gentico em que estas enzimas no so produzidas, morrem nos primeiros dois anos de vida (Sndrome de Zellsweger).

CITOESQUELETO
Mitocndria: Um citoplasmtico mitocndria, compartimento muito uma vez (organela) a este que A habilidade da clula eucaritica em adotar variedades de formas, assim como promover uma movimentos rede coordenados de dos componentes de seu interior, depende de complexa protenas de filamentosas chamadas importante

compartimento est envolvido no processo de transduo de energia (transferncia de energia provinda dos alimentos, principalmente de molculas de glicdios e lipdios para a molcula de ATP - Adenosina Tri-Fosfato. Ncleo: Este que o maior compartimento do sistema de endomembranas contm a

CITOESQUELETO (Figura 31).

Citoesqueleto:

rede

de

protenas filamentosas que do forma e movimento clula Diferente de um esqueleto feito de ossos, a rede de protenas do citoesqueleto muito poderia dinmica, bem ser reorganizando-se chamado de continuamente. De fato, o citoesqueleto citomusculatura, j que responsvel

informao gentica, conforme j descrito anteriormente.

pelas mudanas de forma das clulas, pelos

31

movimentos das clulas sobre um substrato (movimento amebide), atua na contrao muscular, assim movimentos como em todos os tais como intracelulares,

transporte de organelas, segregao dos cromossomos, etc...

Figura 32- Microtbulos

Os microtbulos se distribuem pelo interior da clula, a partir de uma regio central chamado centro celular, aonde nas clulas animais encontra-se o centrolo. Estes microtbulos citoplasmticos so importantes em estabelecer a forma da clula, pois, ao se irradiarem a partir do
Figura 31. Clula vista ao microscpio, evidenciando a rede de protenas do citoesqueleto

centro da clula, atuam como se fossem estacas ou colunas. Os microtbulos citoplasmticos tambm esto envolvidos em movimento dos componentes internos das clulas. Existem protenas enzimticas, como a dinena e a cinesina que quebram ATP e usam a energia liberada para promover movimento. Estas protenas ligam-se s organelas que precisam ser transportadas no interior da clula, e usam os microtbulos como se fossem trilhos, transportando as organelas at seu destino. Alm citoplasmtica, formar de os constituir uma rede podem os os

DIVISES DO CITOESQUELETO: O citoesqueleto pode ser dividido em trs classes os de componentes: e Essas microtbulos, filamentos microfilamentos

intermedirios.

classes

diferem em relao ao tipo de protena que as compe, ao padro de distribuio no interior da clula e quanto s funes desempenhadas na clula. MICROTBULOS So tubos ocos, de 25 nm, formados por uma protena globular, a TUBULINA. Milhares destas protenas iro se unir (polimerizar) formando os microtbulos.

microtbulos

ORGANELAS MICROTUBULARES.

Neste caso, muitos microtbulos e protenas motoras se unem para formar uma estrutura com uma finalidade especfica. Por exemplo,

32

durante a diviso celular, um feixe de microtbulos se estende de um plo da clula at o outro, estes microtbulos serviro como trilhos por onde as protenas motoras levaro os cromossomos para os plos da clula. Clios e flagelos (ex.: flagelo da cauda do espermatozide), so formados por muitos microtbulos e protenas motoras. As protenas motoras fazem com que os microtbulos apresentem movimentos rtmicos, dando capacidade de deslocamento para a clula. Clios e flagelos tm uma organizao um par central. MICROFILAMENTOS Os microfilamentos so formados, principalmente por uma protena chamada ACTINA. Esta, uma protena globular, mas ao polimerizar-se formar longos filamentos de 5 a 9 nm. Estes filamentos formam uma rede logo abaixo da membrana plasmtica, servindo de sustentao para essa estrutura que muito fina e frgil. peculiar: nove pares de microtbulos formaro um feixe em volta de

so

responsveis Essa

por funo

movimentos executada

intracelulares (ex.: ciclose e movimentos amebides). principalmente por uma protena motora, a MIOSINA, que tambm usa o ATP como fonte de energia e produz movimentos ao se ligar e puxar as fibras de actina.

FILAMENTOS INTERMEDIRIOS Os filamentos intermedirios so filamentos com um dimetro em torno de 10 nm, formado por vrios tipos de protenas, sendo a Os filamentos mais importante delas a QUERATINA. filamentos associam-se a intermedirios protenas da

membrana plasmtica e formam ligaes entre clulas vizinhas, mantendo-as unidas. Nas clulas epiteliais, por exemplo, os filamentos intermedirios so mais abundantes pois a unio entre as clulas deve ser mais forte.

DO UNICELULAR AO PLURICELULAR
Durante o processo evolutivo, alguns organismos tomaram o caminho de formar colnias de muitas clulas. Posteriormente, cada clula foi se especializando em uma determinada funo. Este caminho levou ao surgimento de seres pluricelulares. A rigor, todas contm metablica de as a uma clulas dos pluricelulares MESMA clula

Figura 33 Microfilamentos

INFORMAO GENTICA. Como ento a Alm de serem importantes para dar forma clula, os microfilamentos tambm maquinaria

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muscular to diferente daquele de um neurnio? A medida que dos diferentes processo ocorre genes chamado o desenvolvimento pluricelulares, sofrer um organismos sero de

ativados. ( VER FIGURA 34) As clulas vo diferenciao, tomando as suas vrias

funes. Embora todos os genes estejam presentes em todas as clulas, nas clulas musculares apenas alguns genes so ativos (so transcritos) e ento s as protenas codificadas pelos genes transcritos esto presente nessas clulas. J em uma clula nervosa, embora possua os mesmos genes da clula muscular, outros genes esto ativos, resultando a traduo de outras protenas.

FIGURA 34 Diferenciao celular que corre no desenvolvimento de organismos pluricelulares.

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PRTICAS DE BIOLOGIA CELULAR*

Recomendaes de ordem geral a serem observadas no uso do Laboratrio**
1

A manuteno do material colocado a sua disposio depende de sua boa vontade e do seu senso de responsabilidade pessoal. O microscpio que voc usa custou elevado preo, cuida dele como se fosse seu. Dedique 3 minutos finais de cada aula para limpar as objetivas com leno de papel (se foi usado leo de imerso), assim como a sua bancada. Freqentemente voc dever fazer desenhos ilustrativos das preparaes observadas. Para tal, traga folhas de papel ofcio, ou um caderno de desenho. Exatido nos detalhes, limpeza e capricho sero levados em conta mais do que habilidade para a arte de desenhar. Nunca desenhe algo incgnito que veja sob o microscpio. Compare aquilo que visto sob o microscpio com ilustraes de livros, quadros ou outras fontes. No se limite apenas a copiar figuras, examine o material colocado a sua disposio. Os roteiros de aulas prticas que esto includos neste caderno devem ser lidos CUIDADOSAMENTE antes que qualquer trabalho seja iniciado. Discuta suas dvidas com o professor. Procure estar sempre em dia com os trabalhos das aulas prticas. PONTOS A SEREM OBSERVADOS AO DESENHAR: Porque se exige um bom desenho: 1) para obrigar a observar. 2) para que a observao possa ser corrigida por outra pessoa.

3) para que fique um registro da observao efetuada que possa ser consultada posteriormente. **Copia parcial da introduo de MANARA, N.T.F.(mimeografado, sem data). FORMA CORRETA DE REALIZAR OS DESENHOS EXIGIDOS NAS AULAS PRTICAS. 1) Todos os desenhos e as anotaes devero ser feitos com lpis HB, ou similar, com a ponta fina. Tenha a mo uma borracha macia. 2) No esquea a data e o aumento usado. 3) Guarde as folhas arquivadas, junto ao caderno didtico. 4) Escreva sempre com letras de imprensa. 5) No encha o campo de desenhos. Os espaos em branco facilitam a compreenso e posterior estudo do tema. 6) Os desenhos devem ser proporcionais ao observado. No faa desenhos muito pequenos. 7) As setas indicadoras dos elementos desenhados devero ser linhas suaves, feitas com rgua e paralelas ao borde inferior da folha. 8) A utilizao de formas geomtricas (Figura 2.1) artifcio para facilitar a representao do objeto. Sobre esta base se Mais detalhes de algumas das prticas aqui descritas podem ser encontradas no livro: LORETO, E.L.S. & SEPEL, L. M.N. Atividades experimentais e didticas de Biologia Molecular e Celular. Ribeiro Preto, SBG. 2003. 2a ed.
1

www.sbg.org.br

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trabalhar, at obter a maior semelhana possvel com o observado. 9) Na Figura 2.2, encontrar um exemplo de proporo, formas, espaos, distncias e grossuras dos traos. 10) Antes de comear a desenhar o contorno dos objetos: a) observe bem o preparado. Estude-o e interprete-o;

b) determine exatamente o espao que vai ocupar o desenho, marcando com linha suave; c) observe a relao que guardam entre si os elemento a desenhar, isto , sua proporo, tamanho e forma, fixe-os com linhas auxiliares dentro do contorno geral (Figura 2.2).

Figura 2.1 Observao da linha e forma na hora de desenhar

Figura 2.2 Cuidados no fazer o desenho quanto proporo, forma, e espao.

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1a Aula

O USO DO MICROSCPIO PTICO (MO)

O mundo microscpico fascinante. O microscpio foi um aparelho que muito contribuiu para o desenvolvimento da Biologia Celular. Por esse motivo iniciamos as atividades prticas dessa disciplina descrevendo um microscpio ptico e dando algumas dicas para o seu uso adequado. Uma clula animal tpica tem 10 a 20 m de dimetro, ou ao redor de 5 vezes menos do que a menor partcula visvel ao olho nu. Portanto, a descoberta de que os animais e vegetais eram compostos por agregados de clulas individuais, ou a existncia de pequenos seres unicelulares, no foi possvel at que bons microscpios fossem fabricados, no incio do sculo XIX. As clulas animais no so apenas pequenas, mas so descoloridas e translcidas; conseqentemente, a descoberta de sua organizao interna dependeu, tambm, do desenvolvimento, na ltima metade do sculo XIX, de uma variedade de corantes que tornaram vrias partes da clula visveis. O microscpio tem por objetivo produzir imagens aumentadas de objetos to pequenos que, ao exame da vista desarmada, no poderiam ser vistos. Tem ainda como escopo, revelar detalhes texturais imperceptveis a olho nu. Devemos lembrar que os objetos so vistos por duas razes fundamentais: 1) porque absorvem a luz; 2) por causa da diferena entre o seu ndice de refrao e o do meio que os envolve. Quanto maior a diferena, mais facilmente o objeto ser visto. Assim, as clulas e seus componentes, para serem observados ao microscpio devem ser tratados por reagentes especiais, do que resulta sua colorao, isto , os componentes celulares passam a absorver luz diferentemente, tornando-se bem visveis. Chamamos de limite de resoluo (LR) a capacidade mxima de ver dois objetos como distintos. O LR depende do comprimento de luz usado e da abertura numrica do sistema de lentes. Dentro da faixa de luz visvel o LR de 0,4 m para o violeta e 0,7 m para o vermelho. Em termos prticos, bactrias e mitocndrias (+/- 0,5 m) so geralmente os menores objetos vistos ao M.O. Na Figura 2.3 temos um microscpio, em que so indicadas as suas principais partes. Um microscpio compe-se de um sistema ptico (condensador, objetivas e oculares), corpo do microscpio (mesa, tubo, platina...) e fonte de iluminao (que nos microscpios mais antigos no fazem parte do microscpio). O condensador tem por objetivo prover uma iluminao uniforme. Geralmente dotado de um diafragma que permite controlar a quantidade de luz que incidir sobre a preparao a ser

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observada. Em muitos aparelhos, a intensidade e qualidade da luz tambm pode ser controlada atravs de um parafuso que permite subir ou baixar o condensador. Duas lentes ou conjuntos de lentes permitem o aumento da imagem da preparao, so as lentes oculares e as objetivas. As oculares, como o prprio nome diz, ficam prximas ao olho do observador. J as objetivas ficam prximas ao objeto a ser observado. As objetivas so afixadas em um sistema rotativo, o revlver, que permite que sejam trocadas com facilidade. Quanto maior o tamanho da objetiva, maior o aumento que ele proporciona. As objetivas e oculares, trazem escrito no seu corpo, vrias informaes e entre elas o seu valor de aumento. O aumento final dado por um conjunto de lentes obtido multiplicando o aumento da objetiva pelo aumento da ocular. Assim, se o aumento da objetiva de 10X e a ocular tambm de 10X o aumento final de 100 vezes.

Como proceder para focalizar no microscpio:

1) Mova o revolver de modo a deixar a objetiva panormica (menor aumento) na posio de observao, e abaixe totalmente a mesa. 2) Coloque a lmina na mesa (platina), fixando-as com as garras do charriot (obs: a lamnula deve estar voltada para cima). 3) Ligue o sistema de iluminao e ajuste o charriot de modo a centrar o material a ser observado na regio iluminada do orifcio da platina. 4) Olhe pela ocular ao mesmo tempo em que a mesa lentamente elevada, girando o parafuso macromtrico, at que a preparao esteja focalizada. Use o micromtrico para fazer o ajuste fino do foco. 5) Mova a lmina usando o charriot de forma a encontrar campos interessantes a serem observados. Interprete o que estas vendo, registre e se necessrio desenhe. 6) Quando mais detalhes de uma regio da lmina so necessrios, utilize as objetivas de maior aumento (10X; 40X). Para tal, basta girar o revlver e fazer um ajuste fino do foco com o micromtrico. PARA USAR A OBJETIVA DE 100X, se faz necessrio colocar uma gota de leo de imerso entre a lamnula e a lente. Focalize mexendo somente o micromtrico. Aps o uso da lente de imerso no esquea de retirar o leo da objetiva e tambm da preparao. Outros lembretes importantes: Cada pessoa tem uma distncia entre os seus olhos. Para que possamos olhar em microscpios binoculares (com duas oculares), estes possuem um sistema de regulagem da distncia interorbital, ou seja, um mecanismo que permite movimentar os dois canhes para a medida exata da distncia entre os olhos de cada usurio. Alm disso, ao menos uma das oculares tem uma regulagem de foco independente. Assim, ao comear a observao em um microscpio binocular, primeiro focalize olhando somente a ocular que no tem regulagem, posteriormente, focalize com a outra ocular, girando o controle de foco da ocular. A iluminao, de fundamental importncia na visualizao ao microscpio ptico. Aps a focalizao, movimente o condensador e o diafragma deste, at encontrar a iluminao ideal.

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Ao encerrar as observaes ao microscpio no esquea de deixa-lo com a platina abaixada, com a objetiva panormica, e desligado.

Procedimento: 1) Corte um pedao de jornal que contenha algumas letras, coloque sobre uma lmina e leve ao microscpio. 2) Focalize algumas letras. O que acontece? Desenhe. 3) Mude as objetivas. O que acontece? Desenhe. 4) Pegue um fio de cabelo, coloque entre lmina e lamnula. Leve ao microscpio, observe e desenhe. Questes a serem respondidas:
1) Como se calcula a aumento final que estamos vendo em um microscpio? 2) Porque a imagem vista em um microscpio invertida? 3) O que microscopia de fluorescncia? Para que serve? 4) O que microscopia de contraste-de-fase? Para que serve? 5) Descreva o processo de focalizao de Khler 6) O que um estereomicroscpio? 7) O que microscopia eletrnica? Descreva o funcionamento de um microscpio eletrnico e compare o seu funcionamento com o do microscpio ptico.

Figura 2.3 Partes do microscpio

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2a aula

observando clulas de epitlio de escamas de cebola

Um dos materiais mais apropriados para um primeiro contato com as clulas uma preparao a fresco de epitlio de escamas de cebola. uma prtica extremamente simples e as clulas desse material so grandes de tal forma que com qualquer microscpio mesmo rudimentar permite a visualizao dessas clulas. Com um microscpio de uma boa ptica possvel observar o ncleo, nuclolo, plasmlise, parede celular, e plasmodesmos.

OBSERVANDO OSMOSE EM CLULAS VEGETAIS

1) Retire a epiderme de uma escama de cebola e coloque sobre uma lmina com uma gota de azul de metileno (0,3%). Preste ateno para retirar o epitlio exterior da escama, pois este tem uma nica camada de clulas enquanto o da camada inferior tem vrias camadas o que dificultar a observao. Espere 1 minuto para corar e depois retire o excesso de corante com uma gota de gua. 2) Cubra com uma lamnula. Cuide para no ficar bolhas de ar e que fique lquido entre a lmina e a lamnula. Seque a lmina principalmente a face de baixo (sem a lamnula) pois se esta ficar mida, vai grudar na mesa do microscpio dificultando o movimento do charriot. 2) Observe e desenhe as clulas de epiderme de cebola, indicando a parede celular, o ncleo e o nuclolo. 3) Coloque em um dos lados da lamnula uma gota de uma soluo saturada de NaCl ou sacarose (ou glicerina). Observe, descreva e desenhe o que aconteceu. 4) Identifique os plasmodesmos, e a parede celular.

Responda as seguintes questes:

1) Faa um desenho com todas as partes observadas.No esquea as legendas, aumentos e a data. 2) Qual o formato das clulas observadas? 3) Para que serve o azul de metileno? 4) O que aconteceu quando colocamos as clulas em uma soluo hipertnica? Por que? 5) O que plasmlise? 6) O que so plasmodesmos? 7) O que a parede celular? No que ela difere da membrana plasmtica?

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PARA FAZER EM CASA (As questes e desenhos dessa atividade deve ser entregue junto com as
questes e desenhos da segunda aula)

PROPRIEDADES FSICO-QUMICAS DOS COMPONENTES DA MEMBRANA PLASMTICA.

Material necessrio: 3 recipientes (copo, vidro de remdio...); 1 colher; azeite; gua; detergente colorido (azul, verde ou vermelho); solvente orgnico (acetona, gasolina, ter ou guaraz); acar e sal. As macromolculas que compe os seres vivos podem ser classificadas em 2 tipos: polares, sendo solveis em gua (hidrossolveis) e as apolares que so insolveis em gua, mas solveis em solventes orgnicos como ter, clorofrmio, cetonas... (lipossolveis).

Procedimento:
1) Em um recipiente com um pouco de azeite de cozinha (que um lipdio- portanto apolar), coloque uma pitada de acar (que um glicdio). Mexa bem. O que aconteceu? Por que? - Repita com sal de cozinha, o que aconteceu? Por que? 2) Em um recipiente, coloque um pouco de acetona ou ter ou gua-raz ou gasolina (todos estes so solventes apolares). Coloque uma colher de acar. Agite. O que aconteceu? Por que? - Repita com uma gota de azeite. O que aconteceu? Por que? 3) Em 3 recipientes, coloque: no 1o: 1/2 de gua, 1/2 de azeite no 2o: 1/2 de azeite, metade de detergente colorido (azul ou vermelho) no 3o: 1/3 de gua, 1/3 de azeite e 1/3 de detergente colorido. Agite os lquidos com uma colher e observe por 5 minutos ou mais. Descreva o que aconteceu? As membranas biolgicas so formadas, principalmente, por lipdios e protenas anfipticas, ou seja, molculas com uma parte apolar (lipossolveis) e uma parte polar (hidrossolvel) como os detergentes. Portanto so, hidrossolveis e lipossolveis ao mesmo tempo.

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Responda: a) Faa um desenho de como so organizadas as molculas anfipticas de detergentes em uma bolha de sabo. b) Faa um desenho de como so organizadas as molculas de lipdios e protenas nas membranas plasmticas (Consulte os modelos nos livros de Biologia Celular). c) Que propriedades podemos esperar da Membrana Biolgica segundo o modelo do Mosaico Fludo ? d) Qual a funo dos lipdios (fosfolipdios) nas membranas biolgicas segundo o modelo do M-F ? e) Qual a funo das protenas nas membranas biolgicas segundo o modelo M-F?

3a Aula:

COMPARANDO CLULAS PROCARIOTAS E EUCARIOTAS.

Os seres vivos podem ser classificados em dois grandes grupos: os procariontes e os eucariontes, conforme a organizao da clula que os compe. O objetivo desta prtica de comparar clulas procariotas e eucariotas, suas semelhanas e diferenas. Ao microscpio ptico, o que mais chama a ateno, a grande diferena de tamanho que existe entre as clulas procariontes e eucariotes tpicas. claro que podemos encontrar clulas procariontes, como algumas algas cianofcias, que possuem tamanho prximo ou mesmo maior que algumas clulas eucariontes. Entretanto, a regra que os procariontes geralmente tm clulas bem menores que os eucariontes. Outra diferena bem marcante a presena do ncleo nos eucariontes e a sua ausncia nos procariontes. Internamente, no s a presena do ncleo difere os procariontes dos eucariontes, mas sim uma intensa compartimentalizao das diversas funes celulares em organelas envoltas por membranas, o sistema de endomembranas que caracteriza as clulas eucariontes. Porm, via de regra, o sistema de endomembranas de difcil visualizao ao microscpio ptico, sendo mais bem observado ao microscpio eletrnico. Nesta atividade, vamos colocar lado-a-lado clulas bacterianas (uma tpica clula procarionte) e clulas da mucosa da bochecha (representando uma tpica clula eucarionte).

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Material necessrio: Lmina, lamnula, palito de fsforo, placa com bactrias, ala de platina, lamparina, lcool 70%, corante azul de metileno 0,05%, papel filtro, copo Becker 250 ml (ou vidro de Nescaf), microscpio.

Procedimento:
1) Com uma ala de platina, encoste levemente em uma colnia de bactrias na placa de Petri. 2) Esfregue a ala na lmina at espalhar bem as bactrias. 3) Fixe as bactrias pelo calor, passando a lmina na chama de uma lamparina, com as bactrias voltadas para cima, tomando o cuidado para a lmina no aquecer demais (controle nas costas da mo). 4) Com um palito de fsforo, raspe a bochecha, posteriormente,esfregue o palito em cima da regio da lmina em que previamente foram colocadas as bactrias. 5) Fixe as clulas em lcool 70% por 1 minuto. 6) Coloque uma gota de corante (azul de metileno 0,3%) e espere 1 minutos. 7) Tire o corante, deixando passar um pequeno fluxo de gua, sob a torneira. 9) Cubra com lamnula, seque os lados da lmina e observe ao microscpio. Questes a serem respondidas: 1) Compare as clulas procariotas e eucariotas (observe e desenhe): a) Quanto ao tamanho - Faa um desenho com as relaes de tamanho, no esquecendo de anotar o aumento usado. b) Quanto forma. c) Quanto presena de ncleo. d) Porque fixamos as bactrias na chama ? e) Qual a funo da fixao em lcool ? f) Qual a funo de cada um dos componentes do corante? 2) Quais seres vivos chamamos de procariontes? Quais os que representam os eucariontes? 3) Que outras diferenas existem entre as clulas procariotas e as eucariotas, mas que no puderam ser vistas ao microscpio ptico? O que precisamos fazer para poder detectar estas diferenas?

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Para fazer na cozinha (2)

UM POUCO DE FSICO-QUMICA:
(as questes dessa atividade devem ser respondidas e entregues junto com as da 3a aula)

O que pH ? INFORMAES TERICAS: Muitas molculas esto continuamente formando ons. A gua, por exemplo, forma os ons H+ e OH-, que permanecem por algum tempo nesta forma inica e voltam a se associar para formar nova molcula de gua. A molcula de gua ao se dissociar, forma quantidades iguais de ons H+ e OH- . Algumas molculas formam quantidades desiguais de ons H+ ou OH-. Por exemplo: a) HCl (cido clordrico) forma os ons H+ e Cl - . Sempre que a dissociao de uma molcula em seus ons forma prtons H+, ela um CIDO. b) NaOH (hidrxido de sdio) forma os ons Na+ e OH-. Sempre que a dissociao de uma molcula em seus ons forma hidroxilas OH-, ela uma BASE. O pH (potencial de Hidrognio) uma medida da quantidade de prtons H+ presentes em uma soluo. Quanto mais prtons H+, mais cida a soluo. Quanto mais hidroxilas (OH-) mais bsica, ou alcalina a soluo. A gua, como tem igual quantidade de H+ e OH- dita NEUTRA. Chamamos de ESCALA DE pH as variaes na quantidades de prtons H+, que varia de 1 a 14. As solues com pH abaixo de 7 so ditas cidas e as acima de 7 so as bsicas (alcalinas). A gua tem pH 7,0. cido pH 1 2 3 4 5 6 Neutro 7 Base 8 9 10 11 12 13 14

Quando, em uma soluo cida, vamos gradativamente acrescentando uma base, forma-se Sal e gua e o pH da soluo vai subindo at ficar neutro e posteriormente continua subindo tornando-se bsica.

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Agora, se comearmos a adicionar um cido em uma soluo bsica, o pH vai diminuindo, torna-se neutro e passa a cido.

EXPERIMENTOS PARA DEMONSTRAR ALTERAO DE pH Algumas substncias podem mudar de colorao dependendo do Podemos usar esta propriedade para demonstrar alteraes de pH. pH da soluo.

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I . Preparando a atividade: Material Necessrio para Execuo do Experimento: - Folhas de Repolho Roxo, - cido actico (3%) ou vinagre - Hidrxido de sdio (0,1 M), ou uma soluo feita com umas escamas de soda custica (2 ou 3) em 10 ml de gua (+/- 3 colheres); em ltimo caso pode se usar leite de magnsia. - Frascos incolores / transparentes para a visualizar as alteraes de colorao - Conta-gotas ou pipetas (no mnimo um para cada soluo) Preparo das SoluesA) Infuso de repolho roxo: Picar bem 2 a 3 folhas de repolho roxo (correspondente a uma xcara), colocar em gua fervente e esperar alguns minutos, para que a gua torne-se colorida.

PROCEDIMENTO: 1. Colocar, em quatro frascos transparentes um pouco da soluo de repolho roxo 2. Acrescentar algumas gotas de vinagre. Observe o que acontece. 3. Acrescente agora algumas gotas de soluo de NaOH (ou soluo de soda custica). Acrescente tanta gotas at que no mude mais de cor. 4. Volte a adicionar gotas de vinagre. 5. Volte a adicionar NaOH. 6. Comparar e registrar as coloraes obtidas. OBS.: O fenmeno de alterao de cores reversvel portanto, ocorrendo toda vez que o pH ultrapassa o ponto de viragem do indicador. Responda as questes: 1) Quais so os pHs que encontramos no sangue, na urina e no estomago humano? 2) O pH do sangue sofre variaes? Existe algum mecanismo de controle do pH no sangue? 3) E dentro da clula, as diferentes organelas tm o mesmo pH? D exemplos. 4) O que acontece com as protenas quando temos pequenas alteraes de pH ? E quanto as protenas so submetidas a grandes alteraes de pHs, como quando colocadas em um meio com pH muito cido ou muito alcalino? 5) Localize 5 propriedades biolgicas associadas com pH? 46

4 a Aula

ESTUDANDO A PASSAGEM DE SOLUTOS E SOLVENTES PELA MEMBRANA PLASMTICA.

As clulas de qualquer organismo esto cobertas pela membrana celular. A constituio dessa membrana promove a passagem controlada de substncias e o conseqente equilbrio dinmico dentro do organismo. A gua e outros ons pequenos podem passar sem gasto de energia (transporte passivo) pelas membranas biolgicas (M.B). Uma das formas de transporte passivo a osmose, que vem a ser a passagem do solvente de uma soluo menos concentrada para a soluo mais concentrada, atravs de uma membrana semi-permevel. Observao importante: O uso de sangue em aulas prticas, deve ser feito com muita cautela, principalmente depois do aparecimento da AIDS. Mas pensamos que isto, ao invs de ser um obstculo, deve ser um componente a mais para a formao dos alunos. Devemos fazer uso de agulhas estreis, o chamar a ateno para que todos evitem, de toda maneira, usar a lmina dos colegas, ficando restrito a manipulao do seu prprio sangue. O professor, e todos os que vo manipular sangue, devem, sem exceo, usar luvas descartveis. Aps a atividade, todo o material deve ser desinfectado com lcool.

Material necessrio: Lmina, lamnula, agulha hipodrmica descartvel, lmina de barbear, conta gotas, gua destilada, soro fisiolgico (NaCl 0,9%), soluo hipertnica (soluo saturada de NaCl e/ou acar); papel filtro, MO, luvas descartveis, gua sanitria, algodo, glicerina. Procedimento: 1) Coloque uma gota de soro fisiolgico em duas lminas limpas (o uso de soro fisiolgico e opcional, se a gota de sangue for de um volume razovel -uma gota grande- no se faz necessrio o uso de soro fisiolgico). 2) Fazer um pequeno furo na ponta de um dedo, com uma agulha descartvel estril e colocar uma gota de sangue sobre cada lmina (todas as agulhas devem ser dispensadas em um frasco com uma soluo 20% de gua sanitria). 3) Cubra com lamnula e observe ao MO. Descreva e desenhe as hemcias.

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4) Em uma das lminas, com um conta-gotas coloque uma gota de uma soluo hipertnica em um dos lados da lamnula e encoste um papel filtro do outro lado para substituir o soro da lmina. Dessa forma, o papel filtro puxar um pouco do sangue da lmina e no outro lado, um pouco da soluo hipertnica entrar em contato com as clulas sanguneas. 5) Observe ao MO, principalmente na regio da lmina onde as hemcias mais entraram em contato com a soluo hipertnica que as hemcias murcharam, ficando crenadas. 6) Na outra lmina, repita o mesmo procedimento anterior, s que em vez de soluo saturada, use gua destilada. Observe na regio da lmina onde as hemcias mais entraram em contato com a soluo hipotnica que as clulas esto trgidas, quase estourando (e as vezes realmente estouram). Terminada esta parte da prtica, as lminas devem ser mergulhadas em uma soluo de gua sanitria 20% (ou lcool 96 GL) por no mnimo 1/2 hora, para depois ser limpo e reaproveitadas. Cada aluno deve passar um algodo com lcool, na mesa e demais partes manuseadas do microscpio. 1) O que osmose? quando ocorre? 2) Porque ocorre hemlise (as hemcias estouram) quando as colocamos em gua destilada? 3) Porque as hemcias ficam crenadas na presena de uma soluo hipertnica?

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5a aula

FRACIONAMENTO CELULAR
O emprego do microscpio, seja o microscpio ptico ou eletrnico, geralmente fica restrito descrio das estruturas celulares. Para o estudo da composio qumica dos componentes celulares e interpretao das interaes entre estes componentes para explicar o funcionamento celular, se faz necessrio o emprego de outras metodologias que no o uso do microscpio. O estudo bioqumico dos componentes celulares requer a separao e o isolamento cuidadoso das vrias organelas e macromolculas celulares. As 3 principais tcnicas usadas para isto so a centrifugao, cromatografia e eletroforese.

1) ORGANELAS E MACROMOLECULAS PODEM SEM SEPARADAS POR CENTRIFUGAO.

As clulas podem ser rompidas de vrias maneiras, como por choque osmtico, vibraes ultrasnicas, foradas a passar por um pequeno orifcio ou homogeneizadas por fora mecnica. Quando cuidadosamente aplicadas, estes procedimentos deixam as organelas como ncleo, mitocndrias, complexo de Golgi, peroxissomos... intactos. Assim como muitas vesculas derivadas do retculo endoplasmtico, chamadas microssomos, mantm muito de suas propriedades bioqumicas originais. Como todos estes componentes tem grandes diferenas de tamanho, eles podem ser separadas por centrifugao. Postos em um tubo a girar em altas rotaes, os vrios componentes vo sofrer a ao da fora centrfuga. Os componentes maiores como clulas intactas e ncleos vo sedimentar primeiro no fundo do tubo (p/ ex: 1000 rpm por 5'); rotaes medianas em maior tempo faro sedimentar componentes um pouco menores como mitocndrias, lisossomas e peroxissomas (20.000 rpm por 10'). Altas rotaes em tempos ainda maiores (80.000 rpm por 3 horas) sedimentam ribossomos e grandes macromolculas. Ver esquema de fracionamento por centrifugao em Junqueira e Carneiro (2000). Material Necessrio: Folhas de Tradescantia; gral e pistilo; tubos de centrfuga; pipetas Pasteur; centrfuga; soro fisiolgico; SDS 10% (sdio-duodecil-sulfato) ou detergente, gua destilada. lmina, lamnula e microscpio.

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Procedimento:
Primeira parte: Observao de um corte transversal de folha de Tradescantia 1) com uma gilete afiada, corte transversalmente uma folha de Tradescantia, o mais fino possvel. 2) Coloque o corte em uma lmina com uma gota de gua, cubra com lamnula e leve ao microscpio. 3) Observe: a) que clulas tem pigmento roxo. Desenhe b) Que clulas tem cloroplastos. Identifique os cloroplastos e desenhe. Segunda Parte: Fracionamento por centrifugao. 1) Coloque 3 ml de soro fisiolgico em um gral; 2) Esmague nesta soluo 3 a 4 folhas de Tradescantia com um pistilo; 3) Coloque o lquido em um tubo de centrfuga e centrifugue rapidamente (15 seg) para retirar fibras de celulose e restos de tecidos; 4) Transfira o sobrenadante para um novo tubo, e centrifugue por 5 minutos a 7.000 rpm. 6) Desenhe e descreva o que encontramos no tubo aps a centrifugao. 7) Passe o sobrenadante para um novo tubo. 8) Ressuspenda o precipitado com dois ml de soro fisiolgico. 9) Faa uma lmina com o sobrenadante e com o precipitado, observe ao microscpio e desenhe. 10) Acrescente uma gota de SDS 1% ou detergente no tubo com lquido verde, agite por um minuto. 11) Centrifigue os tubos, sobrenadante e o precipitado (agora ressuspenso) por 5 mim a 7.000. 12) Observe e desenhe o que encontramos nos tubos 13) Faa uma lmina com o precipitado do tubo verde.

Responda as questes: 1) Que mtodo usamos para romper as clulas, nesta prtica? 2) Porque usamos soro fisiolgico e no gua? 3) O que encontramos no sobrenadante aps a primeira centrifugao? E no precipitado? 4) Por que usamos o SDS? 5) Por que o sobrenadante agora verde e o precipitado incolor? 6) o que uma ultracentrfuga? 7) Faa um esquema de fracionamento celular, que voc poderia fazer se tivesse uma ultracentrfuga, e desejasse fracionar hepatcitos nos seus vrios componentes. 6a aula

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FRACIONAMENTO MOLECULAR POR CROMATOGRAFIA

Como podemos isolar uma protena ou uma outra molcula da clula? Para o desenvolvimento da Biologia Celular, foi crucial obter as molculas que compe a clula, como as protenas, em seu estado puro, isto , isolado das outras molculas da clula. Mas mesmo uma bactria bem simples possui mais de 2000 tipos de protenas, como podemos isolar s uma enzima que nos interesse? Um dos mtodos mais utilizados para este fim a cromatografia de coluna, na qual uma mistura de molculas em soluo aplicada na parte superior de uma coluna, que contm uma matriz slida, porosa. Posteriormente, um grande volume do solvente passa pela coluna e coletado em tubos separados, medida que emerge na parte inferior da coluna. As diferentes molculas so retardadas diferencialmente, pela sua interao com a matriz, molculas diversas atravessam a coluna com velocidades diferentes e so ento fracionados em uma srie de tubos.

Depois de passar em algumas dessas colunas, a enzima de nosso interesse estar isolada de todas as outras molculas, em um dos diferentes tubos que foram coletados.

Atividade experimental: 1- Coloque um pequeno pedao de esponja na ponta de uma pipeta Pasteur.

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2- Faa uma soluo de Slica gel em um copo volumtrico ou becker, usando gua de torneira levemente acidulada com 1 gota de vinagre para cada 10 ml. Com um conta-gotas, coloque a resina (slica gel) na coluna. A este procedimento chamamos empacotamento da coluna. 3- Em um gral, coloque uma folha de manto-de-viuva (Tradescantia), com umas gotas de guaacidulada e esmague com o pistilo. 4- Colocar aproximadamente um ml desse lquido na coluna 5- Com uma pipeta de Pasteur coloque gua na ponta superior da coluna e observe que um lquido roxo comea a descer, enquanto uma camada verde se deposita na ponta superior da coluna. Aps algum tempo comea a pingar uma soluo roxa (antocianina). Colete amostra desta fase. 6- Substitua o lquido que passa pela coluna, coloque etanol na parte superior da coluna e observe que o pigmento verde comea a descer 7- Quando comear a pingar o pigmento verde, colete uma amostra deste.

Responda: 1) Faa um desenho esquemtico representando o experimento e explique-o. 2) Porque o pigmento roxo diludo primeiro na coluna? 3) Por que o pigmento verde fica retido no coluna enquanto estava passando gua pela coluna? 4) Por que ele desceu na presena de lcool? 5) Qual a localizao intracelular das antocianinas? 6) Qual a localizao intracelular das clorofilas? 7) Qual a solubilidade desses pigmentos?

ISOLAMENTO DE DNA NA COZINHA

Em um laboratrio de Biologia Molecular, o primeiro passo para se estudar um gene o isolamento do DNA. Voc tambm pode fazer isto na sala de aula ou em sua cozinha.

Procedimento:
1) Pique uma cebola grande (250g) em pequenos pedaos (ou rale com um ralador). Faa uma soluo misturando 10 ml de detergente de loua, 1/2 colher de sopa de sal e complete com gua at 100 ml. Aquea a soluo at +/- 60oC e adicione esta mistura ao picadinho de cebola, deixando 10 minutos em banho-maria a 60oC.

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2) Resfrie rapidamente a mistura colocando o recipiente em uma bacia contendo gua e gelo. Coe a mistura em um filtro de papel para caf, aparando o filtrado em um vidro. 3) Adicione delicadamente lcool (gelado) no filtrado de cebola, deixando o etanol escorrer pela parede do vidro. Observe a formao de fios esbranquiados que sobem para onde est o lcool. Estes fios correspondem aos cidos nuclicos - DNA e RNA. 4) Voc pode retirar o DNA da soluo enrolando em um basto. 5) Deixe o basto secar ao ar e coloque o basto em um tubo com gua para re-dissolver o DNA. Aplique este DNA no processo de eletroforese explicado a seguir.

Atividades Propostas e Perguntas

1) Faa um desenho esquemtico com todas as fases do experimento. - Em detalhe, mostre o que vai acontecendo com as clulas e com as macromolculas. 2) Porque usamos detergente? 3) Qual a funo do sal e da gua quente? 4) Por que baixamos a temperatura, aplicando gelo? 5) Por que coamos em um filtro de caf? 6) Qual a finalidade de acrescentarmos o lcool? 7a aula

ELETROFORESE
Molculas que possuem carga eltrica, como as protenas e os cidos nuclicos, podem ser separadas por eletroforese. Eletroforese o movimento de molculas eletricamente carregadas em um campo eltrico. Geralmente, em um processo eletrofortico, as protenas ou cidos nuclicos so colocadas a migrar sob um campo eltrico, no interior de um suporte gelatinoso (um gel) de poliacrilamida, agarose ou amido. A seguir ser apresentado o processo de eletroforese vertical para separao de protenas. O que voc vir em aula ser eletroforese horizontal de cidos nuclicos, preste ateno na aula e faa as devidas observaes das diferenas entre a tcnica descrita para protenas e a feita em aula para DNA.

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As amostras contendo uma mistura de protenas so aplicadas em um gel. Posteriormente uma corrente eltrica aplicada neste gel por algumas horas, as protenas mais negativas e menores migraro mais rapidamente que as positivas e maiores.

Posterior a migrao, o gel colocado em uma soluo contendo corantes especficos para protenas (A). Aps a colorao, podemos visualizar diferentes bandas que correspondem a protenas que possuem cargas ou tamanhos diferentes (B). Alguns processos de eletroforese podem revelar mais de 1000 diferentes protenas em um nico gel. Esta grande sensibilidade torna esta tcnica muito til para identificar quais as protenas so responsveis por diferenas genticas ou fisiolgicas em qualquer organismo.

Atividade experimental:
1) Montar um gel de agarose 0,8% da seguinte forma: Ferver em microondas 0,8 gramas de agarose, em 100 ml de uma soluo tampo (TAE) e aps fundir a agarose, acrescentar 25 microlitros de Brometo de etdio. (usar luvas sempre que usar esta droga, pois ela cancergena). Colocar a agarose ainda quente em uma placa com um pente

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Esperar esfriar e colocar o gel na cuba eletrofortica de gel horizontal 2) Misturar 5l de uma soluo de DNA com 5l de uma soluo de tampo de amostra (Glicerina e azul de bromofenol) . Aplicar com uma micropipeta em um dos pocinhos do gel. 3) Ligar a fonte de eletroforese a 100 volts e deixar o azul de bromofenol migrar aproximadamente 3 cm 4) Observar o gel no transluminador ultravioleta (UV). RESPONDA e Faa os desenhos do que foi visto em aula. 1) Quantas diferentes bandas foi possvel ver em cada aplicao? 2) Quem migrou mais rpido o DNA ou o RNA? Porqu? 3) Por que os cidos nuclicos migram em direo ao plo positivo? 4) Qual a funo do azul de bromofenol? 5) O que uma soluo tampo? 6) Por que colocamos brometo de etdio no gel? 7) Quais as semelhanas e diferenas dos processos de eletroforese horizontal de cidos nuclicos e o sistema de eletroforese vertical de protenas descrito?

8a Aula

OBSERVAO DE CICLOSE E CLOROPLASTOS EM CLULAS DE Elodea

Elodea uma planta usada como ornamental em aqurios, facilmente adquirida em lojas que vendem produtos para aquariofilia. uma monocotilednea pertencente famlia Hydrocharitaceae. As folhas dessa planta so timas para observao de ciclose que o movimento contnuo do citoplasma no interior da clula, assim como de cloroplastos. Geralmente, os componentes das clulas so incolores. Por isso, ao se observar direto ao microscpio, pouco se pode observar de seus constituintes. Para se superar este problema, geralmente fazemos uso de corantes que vo evidenciar alguma parte da clula. Os cloroplastos, organela presente somente nas clulas vegetais e responsveis pela fotossntese, so naturalmente corados. Em virtude disto, e tambm por serem organelas bastante grandes, os cloroplastos podem ser facilmente visualizados ao microscpio. As folhas de Elodea apresentam apenas duas camadas de clulas, em que se pode observar com facilidade os cloroplastos. As clulas eucariontes possuem um citoesqueleto que promove o movimento dos componentes no interior da clula. s vezes estes movimentos so correntes citoplasmticas que chamamos CICLOSE. Se todos os componentes do interior da clula so incolores, muito difcil se observar os movimentos citoplasmticos. A presena dos cloroplastos que so naturalmente

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corados torna possvel a visualizao da ciclose. Devemos lembrar que a ciclose o movimento do citoplasma causado pela ao do citoesqueleto. Os cloroplastos so levados por essa corrente do citoplasma. Procedimento 1) Com o auxlio de uma pina ou gilete, retire uma folha de Elodea. 2) Em uma lmina para microscopia com uma gota de gua, coloque a folha de Elodea, por sobre a gota. 3) Cubra com lamnula, e leve ao microscpio para observao. 4) Observe o tamanho e forma dos cloroplastos. Geralmente aps alguns minutos de observao, podemos ver a ciclose. Descreva como a ciclose.

Observao de ciclose em clulas do plo estaminal de Tradescantia (mantode-viuva).

As clulas do plo estaminal de manto-de-viva (trapoeraba) tambm apresentam ciclose bastante ativa. Vale salientar que nessas clulas existe a presena de um grande vacolo. O citoplasma da clula fica restrito a alguns canais internos da clula, o restante ocupado pelo vacolo. Procedimento: 1) Com uma pina, retire um plo do estame de uma flor de manto-de-viva. 2) Coloque sobre a lmina com uma gota de gua e cubra com uma lamnula. 3) Observe ao microscpio, desenhe e descreva a ciclose.

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Responda as questes: 1) Por que podemos ver facilmente os cloroplastos, mas no outros componentes do sistema de endomembranas como o complexo de Golgi, retculo endoplasmtico ou mitocndrias? 2) 3) Que parte do citoesqueleto est envolvida na ciclose? De que forma? Por que a ciclose nas clulas da Elodea ocorrem no interior de toda a clula enquanto na clula da Tradeschantia ocorre apenas dentro de estruturas que lembram canais?

9a Aula

OBSERVANDO CLIOS E SISTEMA DE ENDOMEMBRANAS

Podemos observar com facilidade a atuao do citoesqueleto, atravs dos clios e dos pseudpodes em protozorios de vida livre. Nos Paramecium podemos ver os clios e em Amoeba os pseudpodes. Alm disso, vrios componentes do sistema de endomembranas, como vacolos digestivos (e pulstil em Paramecium) so tambm facilmente observveis. Paramecium o nome genrico de um protozorio ciliado muito comum em mananciais de gua como os audes e riachos. Estes protozorios so de fcil cultivo, se alimentando principalmente de bactrias, pequenas algas e outros protozorios menores. Podem ser mantidos em recipientes com um pouco de gua e uma pequena pitada de leite em p (+/- 60mg para cada 100 ml de gua). Como a qualidade da gua importante para este protozorio, devemos trocar um pouco da cultura velha (mais ou menos a metade) por gua nova com leite, a cada semana. Assim, podemos manter infinitamente o Paramecium. Outro meio de cultivar este ciliado colocar um pouco de grmen de trigo na gua a cada semana, e sempre trocando a metade do volume da cultura por gua nova a cada semana. Por ser de fcil cultivo e apresentar clios e o sistema de endomembranas facilmente observvel, alm de ter uma taxa de reproduo assexual bem alta, este protozorio um excelente recurso para atividades prticas de Biologia Celular. Antes, porm, de descrever estas

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prticas, vamos mencionar alguns aspectos importantes sobre a biologia e estrutura dos Paramecium. As espcies mais comuns de Paramecium possuem em torno de 0,5 mm de comprimento. Os ciliados so excepcionais entre os eucariontes, uma vez que possuem no mnimo dois ncleos com funes distintas. O macroncleo participa das atividades do dia a dia como crescimento, metabolismo e reproduo. O microncleo permanece relativamente dormente at que a clula entre em reproduo sexuada. Os Paramecium possuem dois tipos de reproduo; a) diviso binria: em condies favorveis a clula se divide em duas. As duas novas clulas, geneticamente idnticas, crescem rapidamente e voltam a se dividir. Mantendo as condies favorveis estes organismos podem se dividir duas a trs vezes em um dia; b) conjugao: em condies ambientais desfavorveis, dois indivduos de sexos diferentes entram em contato e formam uma ponte citoplasmtica temporria, por meio da qual trocam microncleos.

Observando os clios e o sistema de endomembranas:

Nos Paramecium podemos observar com facilidade a atuao do citoesqueleto, atravs dos clios, assim como o movimento intracelular dos vacolos digestivos e contrtil. Alm disso, vrios componentes do sistema de endomembranas, como vacolos digestivos e pulstil so tambm facilmente observveis. Material necessrio: Cultura de Paramecium; microscpio, lmina lamnula; infuso de cigarro. Procedimento: 1) Encher um tubo de centrfuga com uma cultura de Paramecium. Centrifugar por 60 segundos. 2) Retirar o sobrenadante, deixando apenas uma pequena gota de meio lquido. 3) Acrescentar, na gota que restou no tubo em que os Paramecium foram centrifugados, uma gota de uma soluo de narctico feito da seguinte maneira: ( deixar um cigarro em infuso em 30 ml de gua por 12 horas). A finalidade desta infuso de cigarro e diminuir a atividade dos Paramecium , uma vez que estes protozorios so muito rpidos e sem este narctico muito difcil segui-los ao microscpio. Outra opo colocar alguns fios de algodo entre a lmina e a lamnula. Os Paramecium no podem nadar to livremente entre os fios de algodo, facilitando a sua observao. 4) Faa um desenho com as principais partes de um Paramecium. 5) Observe o batimento dos clios e desenhe (observe e descreva os tricocistos) 6) Identifique e observe a contrao dos vacolos contrteis. 7) Identifique os vacolo digestivo.

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8) Identifique e desenhe o citostoma e a citofaringe. (O que so fagossomas e onde estes se formam nos Paramecium ? 9) Faa um desenho comparando a ultra-estrutura de um clio e de um centrolo.

10a Aula

PREPARAO DE LMINAS PERMANENTES

(aula demonstrativa).

Estruturas biolgicas grandes no podem ser vistas diretamente ao microscpio, por que a luz no pode atravess-las. Precisamos, ento, fazer cortes o mais fino possvel, para que a luz possa passar pelas estruturas, e assim ser visto ao microscpio. Para sofrer tais cortes, o material deve ser fixado, emblocado em parafina ou outra resina e, imerso neste suporte, cortado em pequenas "fatias", atravs de um aparelho chamado micrtomo. Posteriormente este material corado e a lmina montada. Nesta prtica, vamos visitar os laboratrios de anatomia vegetal do Dep. de Biologia, em que lminas permanentes de vegetais so preparadas. Preste ateno as explicaes (e faa as perguntas que achar necessrio) e posteriormente responda as seguintes questes: 1) O que a fixao do material? Qual a funo da fixao? 2) lcool etlico, clorofrmio, formol, cido actico, cido pcrico, e cido smico so as principais substncias usadas como fixadores. Quais so as principais caractersticas de cada um destas quanto a sua capacidade de fixao?

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3) As substncias citadas na pergunta anterior, geralmente no so usadas em conjunto, constituindo fludos fixadores. Alguns destes fludos so muito usados, como o Fluido de Carnoy; o F.A.A; o Bouin. Diga qual a composio destes fixadores e suas caractersticas. 4) Porque desidratamos o material em uma srie alcolica antes de emblocar em parafina? 5) Para que emblocar em parafina? 6) Que outros suportes ou estratgias podem sem usadas no lugar do emblocamento em parafina? 7) O que orientao do corte? 8) Para que re-hidratar o material antes de cora-lo? 9) Qual a importncia do uso de corantes na preparao de lminas? 10) O que significam: colorao vital; corante acidfilo; corante basfilo? 11) Entre os principais corantes podemos citar: Carmim; hematoxilina; azul de metileno; Cristal violeta (violeta genciana); Eosina; Fast Green; Fucsina cida, safranina; Sudan black; diga quais as caractersticas principais destes corantes (que estruturas eles coram, solubilidade, concentraes usadas...)

11a Aula

OBSERVAO DE COMPLEXO DE GOLGI EM LMINAS PERMANENTES DE EPIDDIMO.

Material fornecido: lminas permanentes de epiddimo de rato.

Procedimento:
1) Localize e desenhe as clulas nos tbulos de epiddimo. 2) Observe e desenhe a posio do ncleo. 3) Observe e desenhe a posio e a forma do complexo de Golgi. Responda as questes: 1) Por que foi escolhido o epiddimo para observar o complexo de Golgi? Que outro tipo de clula poderia ser usada? 2) Que mtodo de colorao foi usada e por que? 3) Como se forma o Complexo de Golgi?

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Observao de neurnios em cerebelo de camundongo.

Material fornecido: lminas permanentes de cerebelo de camundongo.

Procedimento:
Observe ao microscpio a regio entre as substncias branca e cinzenta, nela existem alguns neurnios gigantes em que podemos ver perfeitamente o corpo celular (com ncleo), o axnio e dendritos. Responda: 1)Observe e desenhe estas clulas, suas partes, e descubra como so chamadas estas clulas. 2)Qual a relao existente entre forma e funo nestas clulas?

12a Aula

OBSERVAO DE CLULAS MUSCULARES ESTRIADAS

O desenho esquemticos de clulas presente nos livros so muito comuns e teis. Porm, muitas vezes os alunos tem dificuldade de reconhecer que em um ser pluricelular, a diferenciao celular a regra. Muitas clulas acabam com formatos muito diferentes. As clulas musculares estriadas esquelticas so um exemplo. Clulas musculares estriadas so clulas muito longas, polinucleadas apresentando os ncleos na periferia da clula. O citoesqueleto hipertrofiado, sendo que os microfilamentos de actina e miosina, vo ocupar a maior parte da fibra muscular, constituindo estruturas especficas das clulas musculares estriadas, que so os sarcmeros. Essas estruturas que do uma aparncia estriada a essas clulas quando vistas ao microscpio. Material necessrio: Lmina, lamnula, agulha histolgica e lmina de barbear, abelhas (ou outro inseto grande), soluo de verde Janus (0,7% em etanol 70%).

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Procedimento:
1) Com uma gilete, abra o trax de uma abelha, vespa ou outro inseto voador grande (previamente morta em vapores de ter). 2) Com uma agulha histolgica retire algumas fibras musculares e transfira para uma lmina com uma gota de corante. 3) Cubra com lamnula, deixe corar por 3 minutos, e observe ao microscpio. Alguns questionamentos : a) Como esto organizados os sarcmeros e como estes funcionam? (faa um desenho). b) Quais as fases da contrao muscular? c) Como est organizado o citoesqueleto em uma clula muscular lisa? d) Relacione as regies estriadas que podemos ver nas fibras musculares com o sarcmero. e) Qual a funo do Verde Janus?

13 a aula

OBSERVAO DE MITOSE EM PONTA DE RAIZ DE CEBOLA,

Allium cepa (2n = 16).

COLETA E FIXAO DAS PONTAS DE RAZES DE CEBOLA O procedimento mais fcil encher um frasco com gua colocar a cebola com a parte das razes imersa na gua (figura abaixo) e esperar at que as razes comecem a crescer. Dependendo da poca isso pode ocorrer em 24 horas ou em alguns dias.

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Quando as razes tiverem atingido pelo menos cinco milmetros podero ser facilmente destacadas do bulbo, com auxlio de uma lmina de barbear, estilete ou mesmo agulha. No necessrio deixar as razes crescerem mais do que os cinco milmetros, pois o material que nos interessa est na ponta.

As pontas de raiz devem ser imediatamente fixadas em soluo de lcool e cido actico (3:1). Essa soluo no dever ser estocada, recomenda-se que seja preparada no momento em que vai ser usada. O tempo mnimo que as pontas de raiz devem ficar no fixador duas horas, as vezes, se o material fica muito tempo no fixador ocorre um amolecimento excessivo do tecido dificultando a preparao da lmina. Aps o tempo de imerso no fixador as pontas de raiz podem ser estocadas em lcool 70% (de preferncia em refrigerador) ou ento preparadas para a observao das mitoses.

2. HIDRLISE DO MATERIAL FIXADO Transferir as pontas de raiz de cebola para uma soluo de cido clordrico 1N e deixar em imerso por 15 minutos. Depois disso lavar em gua (imerso por um ou dois minutos); remover o excesso de gua com um papel absorvente e transferir para uma lmina de microscopia. 3. COLORAO Antes de adicionar o corante sobre a ponta de raiz, pode-se remover (ou simplesmente romper com uma agulha) a parte mais extrema do material (correspondente regio da coifa), pois isso facilitar a colorao e a observao ao microscpio. Para colorao um dos corantes mais usados a orcena actica 2% (outros corantes produzem o mesmo efeito e podem substituir a orcena). Uma gota desse corante suficiente para

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uma boa colorao, desde que se espere no mnimo vinte minutos, antes de bater ou esmagar o tecido. Ao colocar a lamnula deve-se cuidar para deixar o menor nmero possvel de bolhas de ar para que a observao do material no seja prejudicada. Depois que o corante atuou sobre o tecido pode-se envolver a lmina com um papel filtro e pressionar com o dedo polegar a regio onde est a lamnula. Esse movimento far com que o tecido se espalhe pela lmina e seja possvel observar camadas de clulas isoladas. Nesses grupos de clulas que ser possvel observa as mitoses. No se deve colocar uma quantidade muito grande de tecido na lmina pois isso ira dificultar o espalhamento. Dois milmetros de ponta de raiz produz material suficiente para observao. Outra forma de realizar o espalhamento segurar a regio da lamnula com um papel absorvente e bater com um lpis borracha ou com a ponta da tampa de uma caneta. Aps o esmagamento do material, a lmina deve ser observada inicialmente em menor aumento (x10), para que se localize rapidamente onde esto as clulas em diviso. 5. LAMINAS SEMI-PERMANENTES As lminas que estiverem boas podem ser temporariamente conservadas (uma semana) se forem vedadas com esmalte para unhas ou cola para cmera de pneu de bicicleta. 6. LMINAS PERMANENTES As lminas semi permanentes podem ser transformadas em permanentes, para isso basta remover o vedante (esmalte ou cola) e colocar as lminas no freezer at que seja possvel soltar a lamnula. Aps a remoo da lamnula, mergulhar rapidamente as lminas em alcool absoluto e deixar secar. Colocar uma gota de Resina para microscopia (Permonte; Entelan ou Balsamo do Canad) na regio onde est o material. Fechar com uma lamnula e deixar secar.

Procedimento:
1) Pegue uma raiz j fixada 2) Hidrlise: coloque as pontas de raiz em uma soluo 1N de HCl por 5 min. 3) Lavagem: deixe as razes em gua por 5 min. 4)Corte com uma gilete +/- 3mm da ponta da raiz, logo aps os 2 primeiros mm (coifa). 5) Coloque este material em uma lmina com uma gota de orceina actica, deixe corar por 5 minutos. 6) Cubra com uma lamnula, colocando a lmina entre papel higinico e aperte fortemente para espalhar o material ( com o polegar). 7) Vede as bordas da lamnula com luto (ou esmalte de unha). 8) Observe ao microscpio.

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Questes:
a) Descreva e desenhe o que ocorre na: interfase; prfase; metfase; anfase; telfase. b) O que uma clula 2n=16? c) O que centrmero e qual sua funo? d) O que so cromtides? o que representam?

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Atividades de Prticas de Biologia como componente de formao pedaggica. Atividade 1

Biologia na cozinha.
A cozinha de nossa casa pode ser um excelente laboratrio. As experincias feitas nas 2a e 3a aula so exemplos disso. Em grupos, a turma elaborar um experimento relacionado ao programa de biologia celular e apresentar em aula em data a ser marcada. Atividade 2:

O USO DE MODELOS DIDTICOS E SIMULAES.

(com marcao da data para apresentao dos modelos) Simulaes e modelos didticos so excelentes recursos didticos, principalmente se conseguimos colocar os alunos a construir os modelos ou montar as simulaes. Os modelos didticos, por representarem bidimensionalmente ou tridimensionalmente de modo macroscpico estruturas e/ou funes, permitem um entendimento mais fcil de fenmenos microscpicos que de outra forma so apresentados e entendidos apenas de forma abstrata. Os modelos permitem uma visualizao das estruturas, tornando o assunto mais concreto. Desta forma os modelos facilitam o aprendizado e a discusso sobre o tema em estudo. As simulaes correspondem representao dinmica de processos, com ajuda de materiais e dos alunos. Nas simulaes, podemos, por exemplo imprimir uma longa seqncia de DNA em

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papel e com a participao dos alunos pedir que eles encontrem uma seqncia correspondente ao stio de clivagem de uma enzima de restrio. Podemos pedir que os alunos cortem com tesoura este stio e posteriormente o mesmo stio de um plasmdeo. Posteriormente podemos simular como seria uma reao de ligao de todos esses fragmentos, e uma transformao bacteriana com os plasmdeos gerados. Por fim podemos discutir conceitos como clonagem de genes e bancos genmicos. Apresentamos exemplos de alguns dos modelos que podem ser construdo na pgina www.ufsm.br/auladebio

BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTAR PARA A PARTE PRTICA:

LORETO, E.L.S. & SEPEL, L. M.N. Atividades experimentais e didticas de Biologia Molecular e Celular. Ribeiro Preto, ed. Da Sociedade Brasileira de Gentica. 2003. 2a ed.

www.sbg.org.br
DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA, UFPR. Bioqumica: aulas prticas. 5 ed.Curitiba, Ed. da UFPR, 1997. JORDO, B.Q e colaboradores. Prticas de Biologia Celular. Londrina, Editora UEL, 1998. JUNQUEIRA, L.C.U e JUNQUEIRA, L.M.M.S. Tcnicas Bsicas de Citologia e Histologia. So Paulo, Ed. Santos, 1983. MANARA, N.T.F. Roteiro de aulas prticas de citologia vegetal. Santa Maria, Faculdade de Agronomia-UFSM, (mimeografado-sem data). MELLO, M.L.S. e VIDAL, B.C.; Prticas de Biologia Celular. So Paulo, Edgar Blcher, 1980. POLIZELI, M.L.T.M., Manual Prtico de Biologia Celular. Ribeiro Preto, Holos editora, 1999. QUESADO, H.L.C. e colaboradores. Biologia: Prticas. Fortaleza, Edies UFC, 1996. SLATER, J. Experiments in molecular biology. Clifton, N.J., The Humana Press, 1986. VALLE, F.C., Prticas de citologia e gentica. Rio de Janeiro, MEDSI, 2001.

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