Manual de Laboratorio de Bioquímica

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Manual de laboratorio de Bioqumica, Cdigo 24726, Profesora Martha Cecilia Daza Espinosa

MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUMICA

Segundo semestre del 2012

Martha Cecilia Daza Espinosa
Profesora Asociada
Escuela de Qumica


CALENDARIO DE LAS PRCTICAS DEL LABORATORIO

PRCTICA

FECHA
Introduccin al laboratorio de bioqumica Noviembre 19
Determinacin de punto isoelctrico de aminocidos Noviembre 26
Determinacin de la concentracin de protenas Diciembre 3
Extraccin y precipitacin fraccionada de protenas Diciembre 10
Evaluacin dela actividad enzimtica de peroxidasa. Ensayo enzimtico. Ver
http://es.wikipedia.org/wiki/Ensayo_enzim%C3%A1tico Diciembre 17
Determinacin de concentracin de azcares reductores y totales Enero 21
Aspectos generales de las enzimas: Efecto de la concentracin de enzima, de la
temperatura y del ph sobre la hidrlisis de almidn Enero 28
Extraccin e identificacin cualitativa de lpidos Febrero 4
Extraccin de DNA y determinacin del efecto de parmetros ambientales sobre su
estabilidad. part e I Febrero 11
Extraccin de DNA y determinacin del efecto de parmetros ambientales sobre su
estabilidad. part e II Febrero 18
Trabajo de Investigacin Personal - Asesora Febrero 25
Trabajo de Investigacin Personal Elaboracin presentacin Marzo 4
Trabajo de Investigacin Personal Presentacin oral Marzo 11


Lineamientos generales del laboratorio de bioqumica:
Pre-informes e informes
Antes de cada prctica el estudiante debe realizar una consulta de los temas relacionados en la gua y a
partir de ella responder las preguntas correspondientes. En algunas prcticas de laboratorio incluyen un
taller que el estudiante debe resolver previamente. Al inicio de cada prctica se realizar un quiz para
evaluar la preparacin de la prctica de laboratorio. El quiz tendr un valor del 20% de la nota del
laboratorio. Estar relacionado con el tema, las preguntas de consulta y la metodologa de la prctica. El
pre-informe y el informe tendrn un valor del 80%.
Cada estudiante deber elaborar un pre-informe que incluye el ttulo, los objetivos y el procedimiento, el
que deber presentar en un cuaderno exclusivo para el laboratorio en el que consignar todos los pre-
informes, los resultados, el anlisis y discusin de resultados, las conclusiones y la bibliografa.
Cada prctica de laboratorio iniciar con una explicacin y puesta en comn de los objetivos, del
procedimiento y de los cuidados particulares que se debern tener en su desarrollo.
Recuerde que cada pre-informe debe contener:
1) Ttulo de la prctica
2) Objetivos
3) Procedimiento:
Antes de cada laboratorio, el estudiante deber elaborar un diagrama de flujo en el que indique la
secuencia de pasos en que se realizarn las actividades necesarias para el desarrollo del laboratorio.
El diagrama de flujo facilita la comprensin, y provee una visin clara de lo que se va a hacer, muestra las
relaciones entre las diferentes actividades propuestas, sirve de gua para el desarrollo del laboratorio y
facilita el trabajo en equipo y la comunicacin.
A continuacin se incluye una gua general para la elaboracin de un diagrama de flujo:
a) Identifique todas las actividades, el principio, y el fin del laboratorio que va a realizar. Qu es lo
primero que se realiza?, Qu es lo siguiente que se realiza?, Qu es lo ltimo que se realiza?
b) Identifique qu se requiere para desarrollar cada una de las actividades.
c) Construya el diagrama de flujo.
Empiece identificando el inicio del proceso; posteriormente identifique la primera actividad del proceso y
escrbala dentro de un rectngulo. Luego determine y registre la siguiente actividad y siga as
sucesivamente con las dems actividades necesarias para el desarrollo del laboratorio hasta las que las
registre todas. Utilice la siguiente simbologa:

Rectngulo redondeado: El smbolo de inicio y terminacin de un proceso es un rectngulo
redondeado. Para indicar el inicio escriba dentro del rectngulo la palabra <<inicio>>.
Para indicar el final escriba la palabra fin dentro del rectngulo. As queda indicado el
punto de partida y de terminacin de un flujo.
Rectngulo regular: El smbolo de actividad es un rectngulo, en el que se hace una breve
descripcin de ella.
Flecha: La lnea de flujo indica el camino del proceso que conecta las actividades. Las flechas
se utilizan para indicar la direccin del flujo.
Crculo: El crculo representa un punto de conexin entre procesos. Se utiliza cuando es
necesario dividir un diagrama de flujo en varias partes, por ejemplo por razones de espacio
o simplicidad. Una referencia debe de darse dentro para distinguirlo de otros. La mayora
de las veces se utilizan nmeros en los mismos.

Rombo: El rombo se utiliza para representar una condicin. Normalmente el flujo de
informacin entra por arriba y sale por un lado si la condicin se cumple o sale por el lado
opuesto si la condicin no se cumple. Para comprender el uso de los smbolos en el
diagrama, tenga en cuenta las siguientes reglas:
Reglas para la elaboracin del diagrama de flujo:
- Los diagramas de flujo deben escribirse de arriba hacia abajo, o de izquierda a derecha.
- Los smbolos se unen con lneas, las cuales tienen en la punta una flecha que indica la direccin en que
fluye la informacin, o los procesos. Se deben de utilizar solamente lneas de flujo horizontal o vertical
(nunca diagonales).
- Se debe evitar el cruce de lneas.
- No deben quedar lneas de flujo sin conectar.
- Todo texto escrito dentro de un smbolo debe ser legible, preciso, evitando el uso de muchas palabras.

El informe de cada prctica debe presentarse en la Plantilla informes Lab Bioqumica.docx que
encontrar en d:\Mis documentos\MyDropbox\Lab-Bioquimica
Para la discusin de resultados tengan en cuenta el significado de la palabra discusin.
Segn el diccionario de la RAE, discusin significa: Anlisis o comparacin de los resultados de una
investigacin, a la luz de otros existentes o posibles. Y segn el diccionario Oxford (Discussion: a
detailedtreatment of a topic in speechorwriting, que traducido significa: Un tratamiento detallado de un
tema en una presentacin oral o en un escrito.
Tenga en cuenta el significado de la palabra discusin para que redacte la discusin de sus resultados.
Haga nfasis en los aspectos importantes observados en el desarrollo del laboratorio, la concordancia
entre los resultados esperados y los encontrados y en las conclusiones que se deriven de ellos. Cuando
haya desacuerdo plantee una explicacin argumentada, para ello debe entender la reaccin que se estaba
analizando y explicar el por qu los resultados no fueron los que deberan obtenerse y plantear una
solucin.
En la discusin de resultados tambin se pueden incluir sugerencias para mejorar la eficiencia de la
prctica. Estas sugerencias tambin deben ser argumentadas.
No debe repetir, de forma detallada, los datos u otras informaciones ya incluidas en los resultados.
Explique en el apartado de discusin el significado de los resultados, las limitaciones del estudio. Se
compararn las observaciones realizadas con sus concepciones anteriores y analice si concuerdan o no; si
no concuerdan trate de explicar por qu. Relacione las conclusiones con los objetivos del estudio, evite
afirmaciones poco fundamentadas y conclusiones insuficientemente avaladas por los datos. Podrn
incluirse recomendaciones cuando sea oportuno. Recuerde que las conclusiones del trabajo deben
derivarse directamente de los resultados del mismo.
Figuras.
Cada figura debe estar numerada con nmeros arbigos. La numeracin debe indicarse en el texto y en la
parte posterior de la figura. Escribir los nombres de los ejes en forma clara y tan cerca como sea posible e
indicar las unidades utilizando el sistema internacional de unidades.
Tablas.
Las tablas deben numerarse con nmeros arbigos e ir encabezadas por un ttulo breve e informativo.
Referencias bibliogrficas.
Las citas a la literatura deben indicarse en nmeros arbigos encerrados entre parntesis y enumerarse
consecutivamente segn el orden de aparicin dentro del texto. Las referencias bibliogrficas deben
seguir el formato presentado en los siguientes ejemplos y numerado en arbigo sin parntesis:
Ejemplo 1: Artculo publicado en una revista:
1. Corma A.; MartnezTriguero J. The Use of MCM-22 as a Cracking Zeolitic Additive for FCC. J.Catal.
1997. 165 (1): 102-105.
Ejemplo 2: Libro:
1. Smith, A. B. Textbook of Chemistry. Washington, D.C. American Chemical Society. 1972. pp. 75.
Ejemplo 3.Captulo de libro:
1. Ferst A. The Three-Dimensional Structure of Proteins. En: Structure and Mechanism in Protein
Science. New York : W.H. Freeman and Company. 1997. pp. 1-50.
Ejemplo 4.Tesis:
1. Meyer, B. N. Brine Shrimp Toxicity; Certain Components of Stapelia, Coryphanta, Lupinus and Quinoa .
Ph. D. Thesis, Purdue University, West Lafayette, IN, 1983, p. 35.
Ejemplo 5.Patente:
1. Davis, R. U.S. Patent 5,708,591, 1998.

Esta manera de citar la literatura se tom de las instrucciones que la revista colombiana de qumica exige
a los autores: http://www.unal.edu.co/rcolquim/instrucciones/instrucciones5.htm
Reconocimiento de las normas de seguridad en el
laboratorio de bioqumica.
El laboratorio de bioqumica es un lugar donde se desarrollan prcticas elegidas por el docente para
confirmar y reafirmar los conocimientos tericos impartidos en el saln de clase. Al realizar cada prctica
deben seguirse las instrucciones y observar y registrar lo que sucede. Es importante sealar la necesidad
de seguir todos los pasos indicados en cada prctica para obtener los resultados correctos de cada
experimento. En todas las prcticas debern anotarse las observaciones, los resultados y las conclusiones.
En el caso de que el experimento no resultara como est planeado, el alumno deber investigar, consultar
y agotar todas las posibilidades para lograr un desarrollo correcto. Si no se lograra el objetivo de la
prctica, debe preguntar al docente, l le explicar en donde est la falla y la manera de corregirla. De esta
forma se lograr desarrollar una actitud crtica hacia la materia, un mejor aprovechamiento de clase
prctica y un apoyo mayor a la clase terica.
Medidas de seguridad en un laboratorio
Localiza los dispositivos de seguridad ms prximos. Estos dispositivos son elementos tales como extintores, lava
ojos, ducha de seguridad, salida de emergencia.
1. No deben efectuarse experimentos no autorizados, a menos que estn supervisados por el docente.
2. Cualquier accidente debe ser notificado de inmediato al docente o al auxiliar del laboratorio.
3. Uso indispensable de bata como medida de proteccin.
4. Los tubos y varillas de vidrio y objetos calientes deben colocarse sobre tela de asbesto y en un lugar no
muy accesible de la mesa de trabajo, para evitar quemaduras as mismo o a un compaero.
5. Los tubos de ensayo calientes, con lquido o no, deben colocarse en una gradilla de alambre o dentro de
un vaso de precipitados.
6. Cuando se calientan sustancias contenidas en un tubo de ensayo, no se debe apuntar la boca del tubo al
compaero o a s mismo, ya que pueden presentarse proyecciones del lquido caliente.
7. La dilucin de cidos concentrados debe hacerse de la siguiente manera:
Utilizar recipientes de pared delgada.
Aadir lentamente el cido al agua resbalndolo por las paredes del recipiente, al mismo tiempo que se
agita suavemente. NUNCA AADIR AGUA AL CIDO, ya que puede formarse vapor con violencia
explosiva.
Si el recipiente en el que se hace la dilucin se calentara demasiado, interrumpir de inmediato y
continuar la operacin en bao de agua o hielo.
8. No se debe probar ninguna sustancia. Si algn reactivo se ingiere por accidente, se notificar de
inmediato al docente.
9. No manejar cristalera u otros objetos con las manos desnudas, si no se tiene la certeza de que estn
fros.
10. No se debe oler directamente una sustancia, sino que sus vapores deben abanicarse con la mano hacia
la nariz.
11. No tirar o arrojar sustancias qumicas, sobre nadantes del experimento o no, al desage. En cada
prctica deber preguntar al profesor sobre los productos que pueden arrojar al desage para evitar la
contaminacin de ros y lagunas.
12. Cuando en una reaccin se desprendan gases txicos o se evaporen cido, la operacin deber hacerse
bajo una campana de extraccin.
13. Los frascos que contengan los reactivos a emplear en la prctica deben mantenerse tapados mientras
no se usen.
14. No trasladar varios objetos de vidrio al mismo tiempo. No se debe usar equipo de vidrio que est
agrietado o roto. Este material se debe depositar en un contenedor para vidrio, no en un recipiente
destinado para la basura.
15. No utilice nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento. En caso de duda,
pregunte siempre al profesor.
15. No ingerir alimentos ni fumar dentro del laboratorio.
16. Se deber mantener una adecuada disciplina durante la estancia en el laboratorio. El orden es
fundamental para evitar accidentes. Se debe mantener el rea de trabajo ordenada, sin libros, abrigos,
bolsas, exceso de recipientes de desecho de productos qumicos y elementos innecesarios o intiles.
17. Estar atento a las instrucciones del docente.
18. Es indispensable lavarse las manos despus de realizar un experimento y antes de salir del laboratorio.
19. Lea las etiquetas de seguridad. Las botellas de reactivos contienen pictogramas y frases que informan
sobre su peligrosidad, uso correcto y las medidas a tomar en caso de ingestin, inhalacin, etc. Algunos
aparatos pueden contener informacin del mismo tipo. Lee siempre detenidamente esta informacin y ten
en cuenta las especificaciones que se sealan en ella.
20. Preste atencin a las medidas especficas de seguridad. Las operaciones que se realizan en algunas
prcticas requieren informacin especfica de seguridad. Estas instrucciones son dadas por el profesor y/o
recogidas en la gua de laboratorio y debes de prestarles una especial atencin.
En caso de duda, consulta al profesor. Cualquier duda que tengas, consltala con tu profesor. Recuerda que no est
permitido realizar ninguna experiencia no autorizada por tu profesor.
21. Cuando se presente algn derrame de reactivos, se debe llamar a los auxiliares de laboratorio o a los
profesores para verificar el riesgo del producto qumico y proceder posteriormente a realizar la limpieza
del mismo.
22. Al finalizar cada prctica de laboratorio, se debe entregar el material de vidrio asignado a cada grupo
de trabajo totalmente limpio.
23. Se debe trabajar sin prisas, pensando en cada momento lo que se est haciendo y con los materiales y
reactivos ordenados. No se deben realizar bromas, correr, jugar, empujar, etc. En el laboratorio.
24. Durante la prctica de laboratorio no se deben usar celulares, ipod, porttiles o cualquier otro equipo
de comunicacin ya que esto interfiere con la concentracin, pone en peligro su seguridad en el
laboratorio, adems de interrumpir el desarrollo normal de la prctica.


Un comportamiento irresponsable puede ser motivo de expulsin inmediata del laboratorio y de
sancin acadmica.
Otras consideraciones:
Cuida tus ojos. Los ojos son particularmente susceptibles de dao permanente por productos corrosivos
as como por salpicaduras de partculas. Es obligatorio usar gafas de seguridad siempre que se est en un
laboratorio donde los ojos puedan ser daados. No lleves lentes de contacto en el laboratorio, ya que en
caso de accidente, las salpicaduras de productos qumicos o sus vapores pueden pasar detrs de las lentes y
provocar lesiones en los ojos.
Cmo ir vestido al laboratorio. El uso de bata es obligatorio en el laboratorio, ya que son inevitables las
salpicaduras de productos qumicos. La bata ser preferentemente de algodn, ya que, en caso de
accidente, otros tejidos pueden adherirse a la piel, aumentando el dao. Se prohbe el uso de minifalda o
pantalones cortos, sandalias, tenis de tela o cualquier otro tipo de calzado que ponga en riesgo la
seguridad durante la manipulacin de sustancias qumicas o sustancias con peligro biolgico.
El cabello siempre debe estar recogido durante la prctica de laboratorio.
Usa guantes. Es recomendable usar guantes, sobre todo cuando se utilizan sustancias corrosivas o
txicas, igualmente cuando se manipulan cultivos de bacterias, hongos, muestras de sangre y orina. En
ocasiones, pueden ser recomendables los guantes de un solo uso.
Sustancias que deben usarse con precaucin
Todas las que se utilizan en las operaciones y reacciones en el laboratorio de qumica son potencialmente
peligrosas por los que, para evitar accidentes, deber trabajarse con cautela y normar el comportamiento
en el laboratorio por las exigencias de la seguridad personal y del grupo que se encuentre realizando una
prctica. Numerosas sustancias orgnicas e inorgnicas son corrosivas o se absorben fcilmente por la
piel, produciendo intoxicaciones o dermatitis, por lo que se ha de evitar su contacto directo; si este
ocurriera, deber lavarse inmediatamente con abundante agua la parte afectada.

Qu hacer en caso de accidente?
1. En caso de accidente en el laboratorio, hay que comunicarlo inmediatamente al docente.
2. Salpicaduras por cidos y lcalis, lavarse inmediatamente y con abundante agua la parte afectada. Si la
quemadura fuera en los ojos, despus de lavado, acudir al servicio mdico. Si la salpicadura fuera extensa,
llevar al lesionado al chorro de la regadera inmediatamente y acudir despus al servicio mdico.
3. Quemaduras por objetos, lquidos o vapores calientes, aplicar pomada para quemaduras o pasta dental
en la parte afectada. Es caso necesario, proteger la piel con gasa y acudir al servicio mdico.

Prctica 2. Carcter anfotrico y punto isoelctrico de
aminocidos
1. Introduccin
Los aminocidos son las unidades estructurales de las protenas. Todos los aminocidos poseen un grupo
cido (-COOH) y un grupo bsico (-NH
2
), por tal razn, todos los aminocidos libres presentan
caractersticas cido-base.
En el interior celular los aminocidos predominan en forma de ion dipolar o zwitterion (del alemn ion
hbrido). En la forma dipolar el grupo carboxilo se encuentra disociado (-COO
-
) y el grupo amino
protonado (-NH
3
+
), pero la carga de la molcula es neutra. Un zwitterion puede actuar como un cido o
como una base cediendo o aceptando protones.
La protonacin o desprotonacin de los grupo amino y carboxilo depende del pH. Para la glicina el pKa
para el grupo carboxilo y amino es 2,3 y 9,6, respectivamente. Esto significa que a pH inferiores a 2,3 los
grupos carboxilo y amino estarn protonados y la carga neta de la molcula ser positiva. A pH entre 2,3 y
9,6 el grupo carboxilo estar desprotonado y el grupo amino protonado, siendo la carga neta del
aminocido cero. A pH superiores a 9,6 ambos grupos estarn desprotonados, siendo la carga neta
negativa.
Dado que los grupos ionizables de los aminocidos son cidos relativamente dbiles podemos aplicar la
ecuacin de Henderson-Hasselbalch para calcular la fraccin de cada grupo que se encuentra ionizada a un
determinado pH.
| |
log
a
A
pH = pK +
HA
(

, donde A
-
: aceptor de protones y HA: donor de protones
El grupo -carboxilo tiene un pKa entre 1,8 y 2,5, mucho ms bajo que el pKa del cido actico (pKa =
4,8). Esto se debe al efecto inductivo que ejerce el grupo amino que al estar protonado atrae hacia si los
electrones del grupo carboxilo favoreciendo la desprotonacin del mismo. Para un grupo carboxilo que
tenga un pKa de 2,0 la razn de forma desprotonada a forma protonada a pH 7 ser de 100.000 a 1, es
decir, a pH fisiolgico la forma predominante es la de anin carboxilato.
Para el grupo amino el valor de pKa vara entre 8,7 y 10,9. As, para un grupo amino cuyo pKa sea de 10,0
la razn base/cido ser de 1/1000 a pH 7. Estos datos confirman el hecho de que la forma predominante a
pH neutro para los aminocidos es la forma de zwitterion neutro.
2. Objetivos
1. Comprobar el carcter anfotrico de los aminocidos.
2. Determinar los valores de pK de los grupos ionizables de un aminocido.
3. Hallar el punto isoelctrico de un aminocido.
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3. Procedimiento
Dispondremos de soluciones acuosas 0,1 M de los aminocidos E y H.
La prctica consta de dos partes. La primera es de trabajo terico en casa, el cul es indispensable para
realizar la parte experimental. La parte terica es parte del preinforme.
I. Primera parte: Taller
1. Consulte los valores para el pK de los grupos carboxilo y amino correspondientes a uno de los dos
aminocidos, calcule el PI y el pH de una solucin 0,1M. Haga los clculos suponiendo que el
aminocido que Ud. eligi se encuentra como clorhidrato. Hgalos tambin considerando que el
aminocido se encuentra como la sal de sodio.
2. Haga los clculos para la titulacin de 5 mL de solucin 0,1M de uno de los dos aminocidos,
considerando que adiciona alcuotas de 1 mL de HCl 0,1M hasta pH 1,5.
3. Haga los clculos para la titulacin de otros 5 mL de solucin 0,1M del mismo aminocido
considerando que adiciona NaOH 0,1 M hasta pH 12,5.
4. Haga una grfica de la curva de titulacin para el aminocido y dibuje las estructuras del
aminocido a pH 1,5, en el PI, y a pH 12,5.
II. Segunda parte: Experimental.
Titulacin de un aminocido
1. Tome 5 mL de la solucin acuosa de cada aminocido asignado 0,1M en un tubo de ensayo.
2. Calibre el pH metro y determine el pH inicial de la solucin y regstrelo en una tabla de resultados.
3. Adicione dos gotas de un indicador adecuado y empiece la titulacin, adicione 1 mL de HCl 0,1 M
y determine el pH.
4. Contine adicionando cido en alcuotas de 1mL y registando el valor del pH hasta obtener un valor
de pH de 1,5.
5. Registre en una tabla los valores de pH y de cido adicionado.
6. Lave el electrodo con agua destilada y titule con NaOH hasta un pH de 12,5 otros 5 mL de la
solucin de aminocido siguiendo un procedimiento similar a la titulacin con HCl.
7. Determine los valores de pK
a
y calcule los puntos isoelctricos a partir de las curvas de titulacin.
8. Elabore las curvas de titulacin de pH versus milequivalentes de HCl y de NaOH adicionados.
9. Analice e interprete sus resultados. Incluya tabla de datos y curva de titulacin experimental para el
aminocido titulado e inclyala en el informe. Calcule los valores de pK y del PI a partir de las curvas de
titulacin para el aminocido. Calcule la fraccin ionizada de los diferentes grupos a pH 7. Utilice la
ecuacin de Henderson-Hasselbalch.
Incluya una respuesta a las siguientes preguntas de consulta
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1. Pueden comportarse los aminocidos como un buffer intracelular? Argumente su respuesta. Tenga
en cuenta el rango de valores del pKa de los grupos carboxilo y amino de los 20 aminocidos.
2. Cmo separara los aminocidos R, H, D y E de una mezcla a pH 7?
3. Calcule el PI del pptido N-E-A-L.
4. Materiales y reactivos
Soluciones 0,1 M de los aminocidos E y H.
NaOH 0,1 N (titulado)
HCl 0,1 N (titulado)
Vasos de precipitados de 50 mL
Tubos de ensayo
Pipetas de 1 mL
Agitador magntico
pH metro
5. Bibliografa
Segel, I. H. 1.976. Biochemical Calculations.How to Solve Mathematical Problems in General
Biochemistry.Second Edition. John Wiley & Sons, Inc., New York.
Boyer, R. 2000.Modern Experimental Biochemistry. Addison Wesley Longman, San Francisco. Third
Edition.Nelson, D. L., Cox, M. M..2000. Lehninger Principles of Biochemistry, Worth Publishers, Third
Edition, New York.

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Prctica 3. ESPECTROFOTOMETRA. Mtodos de
cuantificacin de protenas.
Curva de calibracin
Elaboradapor:MarthaCeciliaDazaEspinosa
1.INTRODUCCIN
Cuantificacin qumica: Mtodos espectroscpicos y noespectroscpicos. La ley de Lambert Beer; sus
limitaciones. Cuantificacin de protenas por tcnicas espectrofotomtricas. Absorcin UV de protenas y cidos
nuclicos.FundamentosdelosmtodosdeLowry,BiuretyBradford.
La espectrofotometra es un mtodo de anlisis ptico muytil en bioqumica. El espectrofotmetro es un
instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una
cantidad desconocida de soluto con una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. La
espectroscopia UVvisible (longitud de onda comprende entre 190 y 800 nm, mire la figura) se utiliza para
identificaralgunosgruposfuncionalesyparadeterminarlaconcentracindesolucionesconsolutosqueabsorban
enesterangodelongituddeonda.
Absorbanciadeprotenasa280nm
Aunque ninguno de los 20 aminocidos hallados en las protenas absorbe luz en la regin visible del espectro
electromagntico,tresdeellos(tirosina,triptfanoyfenilalanina)absorbensignificativamenteenlaregindelUV
cercano(alrededorde280nm).Dadoquelasprotenasposeenrestosdeaminocidosaromticos,lasmedidasde
absorcin a 280 nm constituyen un mtodo rpido para la determinacin del contenido de protena de una
solucin.
Transmitanciayabsorbancia
Cuando la luz atraviesa o se refleja en la muestra, la cantidad de luz absorbida es la diferencia entre la radiacin
incidente (Io) y la transmitida (I). La cantidad de luz absorbida se expresa como transmitancia o absorbancia. La
transmitancianormalmentesedaentrminosdeunafraccinde1ocomoporcentaje,ysedefinecomoseindicaa
continuacin:
T=I/I
0
,o,%T=(I/I
0
)X100
Laabsorbanciasedefine:A=logT
Para la mayora de las aplicaciones se utilizan valores deabsorbancia, ya que la relacin entre sta y tanto
laconcentracincomoelpasopticoes,normalmente,lineal.
13
Objetivos
1. Conocer la tcnica de espectrofotometra UV-Vis para cuantificacin de protenas.
2. Aprender a preparar una curva de calibracin para determinacin de concentracin de protenas.
3. Comparar la sensibilidad de la cuantificacin de protenas usando el mtodo de Bradford con la
medicin de absorbancia a 280 nm.
PreguntasdeConsulta:
1) Cules son las partes de un espectrofotmetro? Imprima una copia de un espectrofotmetro e indique las
partes.Esindispensableparapoderhacerlaprctica.
2) Indiqueculesladiferenciaentretransmitanciayabsorbanciaycomoserelacionanmatemticamente.
3) EnquconsistelaleydeBeerLambert.
4) Quesyquimportanciatieneunacurvadecalibracin?
5) Qucuidadosdebetenerenlaprcticaparagarantizarlaprecisinenlacuantificacindeunasustancia?
6) Quesyquimportanciatieneelusodeunblancoenunexperimento?
7) DigacmoserealizalavaloracindeprotenasporelmtodoLowry,BiuretyBradford.
2.MATERIALESYREACTIVOS
- Espectrofotmetro
- TubosdeEnsayo
- Pipetas
- Vasodeprecipitado
- ReactivoBiuret
- Solucinpatrndeprotena(albminasricabovinaocasena)de1,0y5,0mg/mLenNaCl1%
3.PROCEDIMIENTO
Curvadecalibracinydeterminacindelaconcentracindeunamuestraproblema.
a) Calcule el volumen de la solucin patrn de albmina srica bovina (BSA) de concentracin 5g/L para
preparar 3 mL de concentracin 0,5 g/L, 1,0 g/L, 1,5 g/L, 2 g/L, 4 g/L y 5 g/L. Y complete los datos de
la tabla1
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 Problema
[BSA]g/L 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0 5,0 ?
SolucinpatrndeBSA(mL) 0
Aguadestilada(mL) 0
b) Acadaunodelostubos(18)adicinele3mLdelreactivodeBiuretydjelosreaccionarpor20minutos.Leala
absorbanciadelasolucionesa548nm.Eneltuboproblemacoloque3mLdelasolucinproblemayaplquele
elmismoprocedimientoparalacurvadecalibracin.Tengacuidadodequecuandomidalaabsorbanciatodos
lostuboshayantenidoelmismotiempodereaccinconelreactivodeBiuret.
MTODODEABSORCINENELULTRAVIOLETA
c) Determine los valores de absorbancia a 280 nm para las diferentes soluciones (tubos B, 1-7, y para la
muestra problema y haga una grfica (concentracin de BSA vs absorbancia) y determine la
concentracin de la muestra problema por interpolacin. Haga una curva de calibracin utilizando
como solucin patrn, una solucin acuosa de protenas (albmina de huevo o casena) de
concentracin 1 mg/ mL.
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Paralacurvadecalibracin,en9tubosdeensayorotuladosmidalossiguientesreactivos:
TUBO B 1 2 3 4 5 6 7* 8*
Sol. patrn de protena ( mL) - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,5 -
Extracto problema ( mL) - - - - - - - 1,0
NaCl 1% ( mL) 5,0 4,8 4,6 4,4, 4,2 4,0 3,8 4,5 4,0
Mezclebienymidalaabsorbanciaa280nm.
d) Con los datos de absorbancia construya una curva de calibracin (concentracin de BSA vs
absorbancia) y determine la concentracin de la muestra problema por interpolacin. Si la absorbancia
de la muestra problema es superior al valor de absorbancia del tubo 8 haga diluciones hasta obtener un
valor de absorbancia menor.
e) Haga un anlisis comparativo de los resultados.
4.BIBLIOGRAFA
DouglasA.Skoog,JamesHolleryTimothyA.Nieman.Principiosdeanlisisinstrumental.
Quintaedicin.McGrawHill.Madrid,Espaa.
http://es.wikipedia.org/wiki/Curva_de_calibrado
http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/calibracion/calibracion.htm
http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/control.htm
15
Prctica 4. Extraccin y precipitacin fraccionada de
protenas. FraccionamientodelasprotenasdelalecheporpIyprecipitacinsalina
1. INTRODUCCIN
La casena (del latn caseus, "queso") es una fosfoprotena (un tipo de heteroprotena) presente en la leche y en
algunos de susderivados (productos fermentados como el yogur o el queso). En la leche, se encuentra en la fase
solubleasociadaalcalcio(fosfatodecalcio)enuncomplejoquesehadenominadocaseingeno.Latabla1recoge
elcontenidodeestaprotenaenlalechededistintasespeciesdemamferos.
Tabla1.Contenidoproteicoycasenicodelalechedealgunasespeciesanimales.[1],[2],[3],[4],[5]
Componente Especie
Humana Bovina Ovina Caprina
protenas(%deltotallcteo) 1,31,5 3,23,5 5,46,0 3,14,0
casenas(%deltotalproteico) 44,9 82,5 84,8 81,3
Caractersticasdelascasenas
Lascasenassonunconjuntoheterogneodeprotenasporloqueesdifcilfijarunadefinicin.Sinembargo,todas
las protenas englobadas en lo que se denomina casena tienen una caracterstica comn: precipitan cuando se
acidificalaleche apH4,6.Porello, a la casena tambinselesueledenominarprotenainsoluble de la leche.Por
otraparte,yaunquelasprotenasquesedenominancasenassonespecficasdecadaespecie,seclasificanenlos
siguientes grandes grupos de acuerdo con su movilidad electrofortica:
s1
casena,
s2
casena, casena y
casena(vaselaFigura1).Estaltimaesdeespecialintersenlaindustriaquesera,yaquesuhidrlisisenzimtica
por el cuajo (la enzima quimosina) genera una nueva protena, denominada paracasena. Cuando esta ltima
reaccionaconelcalciogeneraparacaseinatodecalcio.Duranteelprocesodemaduracindelqueso,yapartirdela
paracasena, se forman unos macropptidos denominados casenas, responsables de las caractersticas
reolgicasyorganolpticasdelosquesos.
Figura 1. Patrn de electroforsis que se obtiene con las protenas lcteas procedentes de las especies humana
(calle 2) y bovina (calle 3). La calle 1 muestra las protenas de referencia para los pesos moleculares y la flecha
indicaelsentidodemigracindelasprotenas,[1,2,3,http://es.wikipedia.org/wiki/Caseina#cite_note7].
Qumicayfsicadelascasenas
A diferenciade muchas otras protenas, incluso del queso, las casenas no precipitan por accin del calor. Por el
contrario, precipita por la accin de una enzima proteasa presente en el estmago de los mamferos llamada
16
reninayforma un precipitado denominadoparacasena. Si la precipitacinserealizapor la accinde cidos, se le
llamacasenacida.Enlaelaboracindelosquesostienenlugarambostiposdeprecipitaciones.
Las caractersticas de las casenas de la leche de vaca se resumen en la tabla 2. La secuencia aminoacdica (ver
Figura2)delacasenacontieneunnmeroinusualderesiduosdelaminocidoprolina:entre10enla
s2
casenay
35 en la casena. Como resultado, las casenas son relativamente hidrofbicas (poco soluble en agua) y carecen
de estructura secundaria o terciaria bien definidas. En la leche se encuentra como suspensin de partculas que
asemeja a las micelas de surfactantes (pequeas esferas hidroflicas en el exterior e hidrfobicas en el interior).
Estasmicelasdecasenaseestabilizanporionesdecalcioeinteraccioneshidrofbicas.
Otro dato interesante, utilizado para separar las casenas del resto de las protenas lcteas mediante su
precipitacin,esquesupuntoisoelctrico(pI)promedioesde4,6.AestepH,lascasenasseencuentraensupunto
demenorsolubilidaddebidoalareduccindelasrepulsionesintermoleculares,porloqueprecipitan(vulgarmente
sedicequecoagulan).Ahorabien,elpIesdiferenteparacadaunadelasfraccionescasenicas,yaquevaraentreel
4,444.97parala
s1
casenayel5,35,8enlavariantegenticaBdelacasena.
Tabla2.Algunasdelascaractersticasfisicoqumicasdelascasenasbovinas[6,9]
Caracterstica
Casena
s1

s2

Concentracinenleche(g/L) 1215 34 911 24
Variantesgenticas ByC A A
1
yA
2
AyB
Masamolecular 23.54523.615 25.226 23.98324.023 19.00619.037
Puntoisoelctrico(pI) 4,444,76 ... 5,075,45 5,77
Restosdeaminocidos(N) 199 207 209 169
El sulfato de amonio es una de las sales ms utilizadas para la precipitacin salina de protenas. Se usa para
precipitarfraccionadamentelasglobulinasquenosonsolublesenaguayparadiferenciarlasdelasalbminas.
Es muy soluble (760 g de sulfato de amonio/1000 ml. de agua a una temperatura de 20C, temperatura
promediodellaboratorio)yelinsulfatodivalentepermitealcanzaraltasfuerzasinicas.
El sulfatodeamonio esexcelentepara realizaruna precipitacin fraccionada, porque,entre otras cosas, hace
que el agua compita entre la disolucin de esta sal o de la protena (formada por muchos grupos carboxilo y
amonio),causandoqueprecipitelaprotena.
Preguntasdeconsulta
1) Consulte la reaccin catalizada por la enzima quimosina (chymosin). Cul es el pH ptimo para
esta enzima? En que aminocidos de la caseina rompe el enlace peptdico?
2) Consulte las aplicaciones alimenticias e industriales de la casena.
3) Consulte el pI para las protenas lactoferrina, albmina srica bovina y lactoalbmina y
lactoalbmina de la leche. Explique el porqu estas protenas no precipitan a pH 4.7 y la casena s.
4) Qu tipo de protenas son las protenas de la leche, solubles a pH de 4,7?
5) Qu otros mtodos, diferentes a la precipitacin salina, se pueden utilizar para precipitar
protenas?
6) Qu otras protenas, adems de las figura 1, forman parte de la protenas de la leche bovina?
NOTA: Buena parte de las respuestas a estas preguntas las pueden encontrar en el trabajo de grado del
qumicoCesarAugustoBernal[10].
2. OBJETIVOS
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1. Analizar el efecto del pH sobre la solubilidad de protenas hidrosolubles en solucin acuosa.
2. Separar protenas de una solucin acuosa de protenas hidrosolubles utilizando precipitacin salina.
3. Cuantificar la concentracin de protenas en diferentes fracciones de leche entera bovina.
3. MATERIALES Y REACTIVOS
- Espectrofotmetro
- Centrfuga
- pHmeter
- TubosdeEnsayo
- Tubosdecentrfuga
- Pipetas
- Vasosdeprecipitados
- ReactivoBiuret
- Papelfiltro
- Embudodevidriosinterizado
- Erlenmeyercondesprendimientolateral
- 100mLdelecheenteranoprocesada,esdecirdecantinanodebolsanidecaja,refrigeradaporgrupo.
- 100mLdesolucindesulfatodeamoniosaturada
4. PROCEDIMIENTO
3.1. Determinacindelasprotenastotalesenlaleche:
a) En un tubo de ensayo tome 1,5 mL de agua destilada y adicione 1,5 mL de reactivo de Biuret.
Mezcle bien y calibre el espectrofotmetro.
b) En otro tubo de ensayo adicione1,5mL de leche y 1,5 mL del reactivo de Biuret, mezcle bien y
mida la absorbancia. Tenga en cuenta la curva de calibracin que obtuvo en la prctica anterior. Si
la absorbancia es mayor a los valores de la curva, haga diluciones hasta que obtenga un valor de
absorbancia en el rango de la curva de calibracin. Para hacer las diluciones use la frmula
V
1
C
1
=V
2
C
2
. Anote los datos de las diluciones para que los tenga en cuenta para calcular la
concentracin de protenas totales en la leche.
3.2. Fraccionamientodelasprotenasdelaleche:
a) Precipitacin de casena por punto isoelctrico.
- Tome 20 mL de leche en un vaso de precipitados y mida el pH.
- Agregue lentamente pequeas alcuotas de HCl, agite con agitacin magntica, hasta obtener un pH
de 4,7. Registre las observaciones del efecto del pH sobre las propiedades de la leche(suspensin de
protenas en agua).
- Filtre el precipitado usando un embudo de vidrio sinterizado. Pese el embudo antes de la filtracin y
el embudo con las casenas (despus de la filtracin). Tenga en cuenta estos pesos para determinar
la concentracin de casenas totales en la leche (%).
- Mida el volumen del sobrenadante y tngalo en cuenta para determinar el % de las protenas de la
leche que son solubles a pH de 4,7.
b) Determinacin de la concentracin de protenas solubles (presentes en el sobrenadante).
- Tome 1,5 mL del sobrenadante y 1,5 mL del reactivo de Biuret, mezcle bien y mida la absorbancia.
Tenga en cuenta la curva de calibracin que obtuvo en la prctica anterior. Si la absorbancia es
mayor a los valores de la curva, haga diluciones hasta que obtenga un valor de absorbancia en el
rango de la curva de calibracin. Para hacer las diluciones use la frmula V
1
C
1
=V
2
C
2
. Anote los
18
datos de las diluciones para que los tenga en cuenta para calcular la concentracin de protenas
solubles totales en la leche.
c) Precipitacin salina de las protenas solubles (presentes en el sobrenadante)
Hagaprecipitacinconsulfatodeamonioal20%,40%,60%y80%.Acadagruposeleasignardosconcentraciones
salinas.
Pararealizarlaprecipitacinsalinatome10mLdelasolucindeprotenassolubles(lechesincasenas,oloquees
lomismoelsobrenadantedelaprecipitacindelascasenas).
Paracalcularelvolumendelasolucinsaturadadesulfatodeamonioquedebeadicionaralos10mL,supongaque
laconcentracindelasolucinsaturadadesulfatodeamonioesdel100%yutilicelafrmula:C
i
*V
i
=V
f
*C
f
.En
estecasotendramos100%xV
i
=(10mL+V
i
)xC
f
.DondeC
f
eslaconcentracinfinaldesulfatodeamoniodeseada,
yV
i
eselvolumendelasolucinsaturadadesulfatodeamonio.Nota:Escomosidiluyramoslasolucinsalina
conlaleche.
Ejemploparaobtenerunaconcentracindesulfatodeamoniodel10%
(100%)(V
i
)=(10mL+V
i
)(10%)
V
i
=1,1mL
Ahora, haga el clculo del volumen necesario para obtener la concentracin de sulfato de amonio que le
correspondi a su grupo yque deber adicionar a los10 mLdelasolucin deprotenasde la lechesolubles a pH
4,7.
Tome el volumen de sulfato de amonio calculado y adicinelo a los 10 mL de las protenas solubles de la leche,
agitelentamenteycentrifuguealmximoderpm(revolucionesporminuto)durante15minutos.Paraestoviertala
solucin en tubos de centrfuga, balancelos (es decir, use un nmero par de tubos y adicione a todos el mismo
volumen)yluegointrodzcalosenlacentrfuga,seleccioneeltiempoyelnmeroderpmycentrifugue.
Cuandosedetengalacentrfuga,retirelostubosytome1,5mLdelsobrenadanteyadicione1,5mLdeBiuret,agite
ymidalaabsorbancia.Tengaencuentalacurvadecalibracinqueobtuvoenlaprcticaanterior.Silaabsorbancia
es mayor a los valores de la curva, haga diluciones hasta que obtenga un valor de absorbancia en el rango de la
curvadecalibracin.ParahacerlasdilucionesuselafrmulaV
1
C
1
=V
2
C
2
.Anotelosdatosdelasdilucionesparaque
lostengaencuentaparacalcular laconcentracindeprotenassolubles,alaconcentracindesulfatodeamonio
queUd.utiliz.
3.3. Anlisisderesultados
Presentelosdatosdeconcentracindeprotenastotales,protenassolublesapH4,7,protenasenelsobrenadante
delasprecipitacionesutilizando20%,40%,60%y80%desulfatodeamonioobtenidasapartirdelecheenterade
bovino.
Incluya los clculos que Ud. realiz para obtener las diferentes concentraciones de protena (tenga en cuenta las
diluciones).
Incluyalagrficadelacurvadecalibracinqueutiliz.
DigaquprotenasestnpresentesenelsobrenadantedelaprecipitacinapH4,7yporqu.
Diga qu protenas estaran presentes en cada uno de los sobrenadantes de la precipitacin salina con sulfato de
amonio(20%,40%,60%y80%).Expliqueelporqudeestosresultados.
Hagaunanlisisydiscusindelosresultados.
19
5.BIBLIOGRAFA
1. Jenness J. 1980. Composition and characteristics of goat milk: Review 1968-1979. Journal of Dairy
Science63(10): 1605-1630.
2. Lonnerdal B. y Forsum E. 1985. Casein content of human milk. American Journal of Clinical
Nutrition41(1): 113-120.
3. Ribadeau-Dumas B yGrappin R. 1989. Milk protein analysis. Le Lait69(5): 357-416.
4. Park Y.W., Jurez M., Ramos M. y Haenlein G.F.W. 2007. Physico-chemical characteristics of goat
and sheep milk. Small RuminantResearch68(1-2): 88113.
5. Willamson M.B. 1944. The amino acid composition of human milk proteins. Journal of Biological
Chemistry156(1): 47 - 52.
6.
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Farrell H.M, Jimenez-Flores R, Bleck G.T, Brown EM, Butler JE, Creamer LK, Hicks CL, Hollar
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Sixth Revision. Journal of Dairy Science '87'(6): 1641-1674.
7. Kunz C y Lonnerdal B. 1989. Human milk proteins: separation of whey proteins and their analysis
by polyacrylamide gel electrophoresis, fast protein liquid chromatography (FPLC) gel filtration,
and anion-exchange chromatography. American Journal of Clinical Nutrition 49(3): 464-470.
8. Van Hekken D.L y Thompson MP. 1992. Application of PhastSystem to the resolution of bovine
milk proteins on urea-polyacrylamide gel electrophoresis. Journal of Dairy Science '75'(5): 1204-
1210.
9. Swaisgoo H.E. 1993. Review and update of casein chemistry. Journal of DairyScience76(10):
3054-3061
10. Bernal C.A. 2009. Purificacin de inmunoglobulinas de suero de leche por tcnicas
cromatogrficas. Trabajo de grado, Escuela de Qumica, Universidad Industrial de Santander.

20
Prctica 5. Determinacin de la actividad enzimtica de la
peroxidasa extraida de hojas de palma africana y su inhibicin
por el efecto de la temperatura.

1.OBJETIVO
El primer paso en el estudio de una enzima en indeterminado material biolgico suele ser comprobar que
efectivamente dicha enzima esta presente en el material. Para ello hay que poner de manifiesto que realmente
existesuactividadcataltica,yquedichaactividadesdebidaaunaprotena.Elobjetivodeestaprcticaesextraer
ensolucinlaenzimadeunaplantaycuantificarsuactividadadiferentesdiluciones.
2.FUNDAMENTO.
Laperoxidasaesunaenzimaque cataliza la oxidacindeunamplionmerodesustratosorgnicos e inorgnicos,
utilizando el poder oxidante del perxido de hidrgeno (el cual es el sustrato). Es utilizada ampliamente en
bioqumica clnica. As, los ensayos para la determinacin y cuantificacin de metabolitos como glucosa, cido
rico, colesterol otriglicridos en fluidos biolgicos usan peroxidasa como enzima acoplada. Tambin seutiliza en
inmunoensayos para la deteccin de virus tan conocidos como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
causante del SIDA o el herpesvirus. La peroxidasa tambin se utiliza como biocatalizador para la generacin de
productos de inters biotecnolgico e industrial como resinas fenlicas, adhesivos, antioxidantes, antiestticos y
protectores de radiacin magntica, colorantes alimentarios y componentes bioactivos de detergentes. En este
experimento,paraanalizarlaactividaddelaenzimaseutilizaralasolucinextradadelaplantayreaccionaracon
soluciones de H2O2. La enzima descompone el peroxidoy libera O2 libre que reacciona con un compuesto
(Guayacol) que al oxidarse forma una solucin coloreada (Tetraguayacol) y de esta forma puede ser detectado a
unalongituddeondaenelrangovisible.
Consultequefuncionesdesempenaestaenzimaenplantasyunaaplicacinindustrialdelaenzimaeinclyaloen
supreinforme.
3.MATERIALESYREACTIVOS.
Solucinextractora:Bufferfosfato60mM,NaCl0.1MpH7.0
Solucindeperoxidasa:Picar2gramosdehojadepalmaafricanayhomogenizarcon20mldelasolucion
extractoraenlicuadoradurante23minutos,incubardurante30minutosatemperaturaambienteyluego
centrifugara5000rpmdurante15minutos.Usarelsobrenadantecomosoluciondeperoxidada
Bufferfosfato10mMpH6.0parapreparacindesolucionesdesustratos.
Solucindesustratos:Disolver10uldeperoxidodehidrogeno(30%)y40uldeguayacolen20mldebufferfosfato
pH6.0
4.PROCEDIMIENTO
Prepararen5tubosdeensayo100uldelasolucindeperoxidasacadaunadelassiguientesdiluciones:,1/5,
1/10,1/25,1/50.
21
Llevarconunapipeta3mldelasolucindesustratoalaceldadelespectrofotmetro,colocarlalongituddeondaa
470nmycalibrarlaabsorbanciaaceroconestasolucin.
Pararealizarlaslecturasdeabsorbanciaadicioneprimero100uldelasoluciondeperoxidasa(5experimentos,1
paracadadilucion)alacelda,inmediatamenteadicione3mldesolucindesustratoyregistreelvalordela
absorbanciacada15segundosporunperiodoentre35minutos.
Dibujeunagraficaparalos5experimentosdeabsorbanciaVStiempo.
Determinelaactividaddelaperoxidasasabiendoqueelcoeficientedeextincinmolara470nmdeltetraguayacol
es5200M1cm1.
Utilicelasiguienteecuacin:
Act=(m(3.1)(60)(1x103))/5200donde
m=pendientedelagraficaparacadaexperimentodedilucindeperoxidasa
3.1=volumentotalenmldelasolucinenlaceldadelespectrofotmetro
60=factordelapendientedesegundosaminutos
1x103=factordemmolaumolparaelvalordeMdelcoeficientedeextincin.
Determinarlaconcentracindeprotenautilizandoelmtodode
Biuret(conestandaresdeBSA).
Utilizarlosvaloresdeconcentracindeprotenaparamirarelcomportamientoyelucidarunvaloraproximadopara
laactividadespecificadelaenzima.
EFECTODELATEMPERATURAENLAACTIVIDADDELAENZIMA.
1.Seleccionarunadelasdilucionesdelaenzimadelexperimentoanterior.
2.Adicionar1mldeestadilucinauntubodeeppendorf,taparloycalentarloenunbaoa95C.
3.Sacar0.1mldeestasolucinalos0,5,10,15,30minutosdeincubacinyenfriarlosinmediatamenteenunvaso
conhielo.
4.Realizarelexperimentoquesehizoanteriormenteconestadilucinparadeterminarlaactividaddelamisma
formaqueloanteriorparacadavalordetiempo.Delosdatosobtenidoscomparelosvaloresdeactividadparala
enzimasincalentaryalcalentarladilucinacadatiempo.
Literatura
SakharovY.I.,BautistaA.G.,SakharovaV.I.,RojasA.&PletjuschkinaY.O.(1999)Peroxidasadeplantastropicales
Revistacolombianadequmica.28,1:4560.
Rev.Colomb.Quim.v.38n.3Bogotsep./dic.2009
22
Prctica 6. ANLISISCUALITATIVODECARBOHIDRATOS
Introduccin
Loscarbohidratossonloscompuestosorgnicosmsabundantesdelabiosferayasuvezlosmsdiversos.Son
constituyentesestructuralesdelosvegetalesytambindelostejidosanimalesylaprincipalfuentedeenergayde
esqueletoscarbonadosdelosseresvivos.
Segnelnmerodemolculas,loscarbohidratospuedendividirseencuatrograndesgrupos:
1. Monosacridos:
Pentosas
- Xilosa (madera), Dribosa y Ddesoxiribosa(cidos nuclicos), y arabinosa (gomas, muclagos y pectinas
quenormalmenteingerimosdentrodemermeladasydulces)
Hexosas(son24pero,solamente4tienenimportanciabiolgica).Dglucosapresenteenlosfrutosmadurosyen
todaslasclulas.Dmanosasiempreaparececombinada,nuncalibre.Dgalactosaasociadaconlpidoscomplejos,
puedeserconvertidaenglucosaenelhgado.Dfructosaseencuentraenlamielyenlosjugosdefrutas.Tieneun
sabormuydulce.
2. Disacridossesubdividenenmaltosa,lactosaysacarosa.Maltosapresenteenlamaltaocebadagerminada
yesmuysolubleenagua.Lactosa:Eselazcardelalecheyespocosolubleenagua.Sacarosa:Eselazcar
demesa,seobtienedelacaadeazcarydelaremolacha,yesmuysolubleenagua.
3. Oligosacridos:trisacridos:larafinosaseencuentraenlaslegumbres.
- Tetrasacridos:estaquiosa,elmsestudiado,seencuentraenlassemillasdesoja.
4. Polisacridos:
- Almidn: est constituido por dos polmeros de Dglucosa, uno lineal la amilosa y el otro ramificado, la
amilopectina. La amilosa es un polmero lineal formado por 250300 unidades de oDglucopiranosa,
unidas exclusivamente por enlaces o (14). La amilosa se disuelve fcilmente en agua adquiriendo una
estructurasecundariacaracterstica,deformahelicoidal,enlaquecadavueltadelahlicetiene6unidades
de glucosa. La amilopectina es un polmero ramificado compuesto por unas 1000 unidades de oD
glucopiranosa. Adems de las uniones o (14) contiene uniones o (16). Las uniones o (16) estn
regularmente espaciadas (cada 2530 residuos de glucosa), y son los puntos por donde se ramifica la
estructura.Cadaramacontienenicamenteunioneso(14).
- Glucgeno:esunpolmerodemolculasdeDGlucosaunidasporenlaceso(14)yo(16),presenteen
hgado y en los msculos. Es un polisacrido de reserva de las clulas animales y ayuda controlar los
cambiosdepresinosmticaquelaglucosalibrepodraocasionarenlaclula.
- Celulosa: Es el principal componente de la pared celular de los vegetales. Se puede considerar como la
molcula orgnica ms abundante en la Naturaleza. Es un polmero lineal de varios miles de glucosas
unidasporenlaces|(14).
- Inulina:Apareceenlostubrculosdedalia,ajosycebollas.Liquenina:presenteenlosmusgosylquenes.
- Mucopolisacridos:Cumplenfuncindesostn,nutricinycomunicacinintercelular.
23
Objetivos
1. Explorarladiversidaddelaqumicadeloscarbohidratos
2. Identificarcualitativamenteazcaresreductores,pentosas,cetosas,monosacridosypolisacridos.yel
azcarpresenteenunhidrolizadodepolisacrido(problema).
3. Diferenciarcualitativamentealmidndecelulosa.
Procedimiento
1. Consulteyescribalasreaccionesqumicasentreloscarbohidratosqueutilizarenlaprcticaylosindicadores
queemplearparasudeteccincualitativa.
2. Identificacincualitativademonosacridosydisacridos
Tome4tubosdeensayoyetiqutelosconlosnmerosdel1al4.
Adicioneacadaunodelotubos2mLdelosdiferentesreactivos:Barfoed,Benedict,SeliwanoffyBial.
Adicione0,5mLdeglucosaacadatubo,mezclebienycolquelosenunbaodeaguahirvientepor5a10minutos
yregistrelaformacindecoloryeltiemporequeridoparasuaparicin.
Lavebienlostubos,squelosyrepitaelprocedimientoanterior,peroahoraconfructosayvuelvaalavarlostubos,
asecarlosyrepitaelprocedimientoconlactosa,sacarosa,pentosa,almidnycelulosa.
Hagaunatablaconlos28datoscorrespondientesalos6carbohidratosyalas4pruebas,analicesusresultadosy
disctalosteniendoencuentalaqumicadelosdiferentescarbohidratosyplanteelareaccinindicadoradeltipo
decarbohidrato.
3. Diferenciacincualitativadecelulosayalmidn
Observeelaspectofsicodelacelulosaydelalmidnydesussolucionesal1%yregistresusobservaciones.
- Determinelasolubilidadenaguacaliente.
- Determine los productos de hidrlisis con amilasa salival. Para esto tenga en cuenta la informacin de la
siguientetabla:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8
Celulosa (mL) 1 1 1 1
Almidn (mL) 1 1 1 1
-amilasa (mL) 0,5 0,5 - - 0,5 0,5 - -
Benedict *(mL) 0,5 0,5 0,5 0,5
Lugol, I
2
/KI, (mL) 0,5 - 0,5 0,5 - 0,5
*Coloquelostubosenunbaodeaguahirvientepor5a10minutosyregistrelaformacindecoloryeltiempo
requeridoparasuaparicin.
24
Conbaseenlosresultados,digaculdelosdospolvosblancosescelulosayculesalmidn.Explique.
Determineculesdeloscarbohidratosestudiadossonmonosacridos,disacridos,agentesreductores,cetosasy
pentosas.
Analiceeinterpretesusresultados.
Elaboreuninformedelaprcticaeincluyaunarespuestaa:
1.Enquformaseencuentranlocarbohidratosenlasclulasanimales?
2.Mencioneelnombreylafuncinde3carbohidratospresentesenlasclulasanimales.
3.Incluyalasreaccionesparacadaunadelaspruebasutilizadasenellaboratorio.
Materialesyreactivos
Reactivos:
Barfoed(monosacridos)
Benedict(azcaresreductores)
Seliwanoff(cetosas)
Bial(pentosas)
Lugol(Yoduroal1%:KIal2%)
Solucionesal1%deglucosa,fructosa,lactosa,sacarosa,unapentosa,almidnycelulosa(carboximetilcelulosa).
Alfaamilasasalival
Material
Tubosdeensayo(porlomenos4)
Gradilla
Pipetas
Baotermostatado
Bibliografa
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Sacarosa:Glucosa+fructosa
Lactosa:Galactosa+glucosa
Benedict:Precipitadorojoladrillopositivoparaazcaresreductores.Glu,Fru,Xyl,
ELreactivotieneunacoloracinazulclaro.
Barfoedprecipitadorojoladrillopositivoparamonosacridos,sisecalientademasiadodafalsopositivocon
disacridos.
Elreactivotieneunacoloracinazulclaro
Bialpositivoparapentosascolorazulverdoso.Lasolucintieneunacoloracinamarilla.
Seliwanoffpositivoparacetosascolorrojo.Lasolucinestransparente

26

Prctica 7. ASPECTOSGENERALESDELASENZIMAS:EFECTODELACONCENTRACINDEENZIMA,DE
LATEMPERATURAYDELpHSOBRELAHIDRLISISDEALMIDN
4. INTRODUCCIN.
La mayora de las enzimas son catalizadores biolgicos de naturaleza protenica. El ARN
tambin presenta actividad cataltica, estas molculas son denominadas ribozimas. Las enzimas
estn presentes en todas las clulas vivas, en todos los tejidos y en todas las estructuras
subcelulares.
Las enzimas son macromolculas cuya estructura secundaria, terciaria y cuaternaria depende de
las interacciones no covalentes (puentes de hidrgeno, fuerzas de London, par inico e
interacciones hidrofbicas). Puesto que la actividad de las enzimas depende de su estructura es
importante mantener su conformacin nativa (estructura activa) mediante un estricto control del
pH, la fuerza inica, los agentes quelantes y la temperatura. Cada enzima tiene un conjunto de
valores ptimos para estos parmetros. Adems cada enzima se caracteriza por tener unos
parmetros enzimticos caractersticos.
Parmetros enzimticos
1. K
m
(constante de Michaelis-Menten, es nica para cada enzima) = concentracin de sustrato
(S) a la que la V
o
es 1/2 V
mx
. Bajo ciertas circunstancias que dependen del tipo de enzima, la K
m

es una medida de la afinidad del enzima por S. Cuanto menor es Km, mayor es la afinidad de la
enzima por S.
2. K
cat
(constante para cada enzima) = nmero de recambio = nmero de molculas de sustrato
convertidas en producto por molcula de enzima y unidad de tiempo, en condiciones de
saturacin de sustrato.
3. V
max
= velocidad mxima terica = la velocidad cuando todos los centros activos estn
ocupados con sustrato (nunca alcanzada en la realidad).
4. Unidad de enzima = cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por min = una
forma comn de expresar la velocidad.
5. Actividad especfica = unidades por mg de protena total de la preparacin enzimtica.

Factores que afectan la cintica enzimtica
L
p
in
E
L
im
g
p
s
L
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la
1
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E
E
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Efecto del pH
Las enzim
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En general
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Figura 1.
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Profesora M
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textil,
midn
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n de
29
5. Objetivos
1. Conocer el efecto de los cambios de pH y de la temperatura sobre la actividad enzimtica.
2. Someter una muestra cruda de -amilasa de origen humano a cambios en el pH y la
temperatura para determinar el efecto en sus parmetros cinticos.

Tabla 1. Test del lugol para el almidn y sus hidrolizados.
Almidn y sus hidrolizados Coloracin de la Reaccin.
Almidn Azul
Amilodextrinas Violeta
Eritrodextrinas Rojo
Acrodextrinas Amarillo ( No reaccin )
Maltodextrinas Amarillo ( No reaccin)
Maltosa Amarillo ( No reaccin )
6. Procedimiento
2. Comparacindelahidrlisisenzimticaynoenzimticadelalmidn.
TUBO 1 2 3 4 5 6
cido clorhdrico 2,0mL 2,0mL
-amilasa salival (enzima) 2,0mL 2,0mL
Agua 2,0mL 2,0mL
Almidn (sustrato)* 2,0mL 2,0mL 2,0mL 2,0mL 2,0mL 2,0mL
Temperatura de incubacin (C) 38 38 38 100 100 100
Tiempo de incubacin (minutos)** 5 5 5 5 5 5
NOTA: AGITE BIEN LOS TUBOS ANTES DE INCUBARLOS. Incube los tubos a la
temperatura indicada durante 5 minutos con el almidn antes de adicionar la enzima o el
HCl.
30
**Al finalizar el tiempo de incubacin enfre los tubos a temperatura ambiente y realice el test de
lugol y de Fehling.
Test de lugol.
Tome 1 mL de muestra de cada uno de los tubos del experimento y aada 1 gota de lugol. Anote
la coloracin de cada tubo y explique sus observaciones. Un cambio en la coloracin del lugol a
azul oscuro, o violeta oscuro o marrn oscuro es indicador de presencia de almidn.

Test de Fehling
Tome 3 mL de muestra de cada uno de los tubos del experimento y aada 1 mL de solucin de
Fehling (Fehling A y Fehling B). Lleve a ebullicin durante 3 minutos. Observe la formacin de
xido de cobre rojo. Anote la coloracin de cada tubo, y explique sus observaciones. La
presencia del precipitado de xido de cobre es indicador de la presencia de azcares reductores.
2. Determinacin de la cintica enzimtica de la amilasa salival.
La determinacin del efecto de la concentracin de enzima, del pH y de la temperatura sobre la
actividad enzimtica de la amilasa salival se evaluar mediante la hidrlisis de almidn utilizando
el test de lugol (I
2
/KI).
2.1. Relacin entre la tasa de reaccin y la concentracin de la enzima.
Prepare diluciones al 40, 60 y 80% de la muestra de saliva con agua destilada. En cuatro tubos
de ensayos prepare las siguientes reacciones:
TUBO 1 2 3 4 5
-amilasa salival (enzima) al 40% 2mL
-amilasa salival (enzima) sin diluir 2mL
Almidn (sustrato) 4mL 2mL 2mL 2mL 2mL
Incube a 38C * * * * *
Reactivo indicador (I
2
/KI)** 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota
*NOTA: Cada minuto, tome 1 mL de cada tubo y agrguele 1 gota de Lugol, anote sus
observaciones. Observe el cambio gradual de la reaccin del azul, al azul rojizo y finalmente al
31
rojo. En la tabla 1 se encuentran los nombres de los productos de la reaccin de la alfa-amilasa
(E) con el almidn (S) y su coloracin respectiva. Relacione las diferentes velocidades de
formacin de las eritrodextrinas con la concentracin de -amilasa presente en cada tubo de
reaccin, y explique cul es el efecto de la concentracin de la enzima sobre la cintica
enzimtica. Si sus resultados no son conclusivos, discuta con base en lo que esperara de
acuerdo con el comportamiento de las enzimas.
2.2Efectodelatemperaturasobrelatasadereaccinenzimtica.
Para evaluar el efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima prepare en tres tubos
diferentes, las siguientes reacciones:
TUBO 1 2 3
-amilasa salival (enzima) 1,5mL 1,5mL 1,5mL
Temperatura* (5 minutos) 100C 38C 0C
Almidn (sustrato) 1,5mL 1,5mL 1,5mL
Tiempo de incubacin 3 minutos 3 minutos 3 minutos
Reactivo indicador (I
2
/KI) 1gota 1gota 1gota
* Enfre la solucin enzimtica del tubo 1(colquelo dentro de hielo) y adicione el sustrato a los
tres tubos, de manera simultnea o con pequeas diferencias de tiempo. Espere 3 minutos y
adicione el reactivo indicador.
Observe las diferencias de color en los tres tubos. Relacione los diferentes productos formados
con las temperaturas evaluadas. Discuta los resultados.
2.3 EfectodelpHenlahidrlisisdelalmidn.
Para evaluar el efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima prepare en tres tubos
diferentes, las siguientes reacciones:
TUBO 1 2 3
Buffer pH 5 1mL
Buffer pH 7 1mL
Buffer pH 9 1mL
-amilasa salival 1,5mL 1,5mL 1,5mL
32
Almidn (sustrato) 1,5mL 1,5mL 1,5mL
Temperatura de incubacin 38C 38C 38C
Mantenga la enzima con el buffer dos minutos y luego adicione el sustrato y agite bien los tubos.
Tome 1 mL de la mezcla enzima sustrato, cada 1 o 2 minutos, y adicione una gota de lugol y
registre sus observaciones. Haga una grafica de pH versus tiempo de aparicin de los distintos
productos de la accin de la enzima. Discuta sus resultados.
7. Materiales y reactivos
Solucin de almidn al 0,5% en una solucin de 0,3 % de NaCl
Lugol (I
2
/KI), reactivo indicador para almidn
Solucin de Fehling.
Solucin de saliva: Para su preparacin, enjuague bien la boca. Tome 20 mL de agua destilada y
mantngalos en la boca por 2 min. Homogeneizando con la lengua. Despus de esto deposite la
mezcla en un vaso de precipitados y fltrela a travs de papel de filtro.
Solucin de cido clorhdrico al 10 %
Buffer fosfato citrato 0,1 M, pHs 5, 7, y 9,0
Baos termostatizados
Tubos de ensayo
Gradillas
Varillas de vidrio
Termmetro
Pipetas
8. Bibliografa
Stroev E.A. V.G. Makarova. 1989. Laboratory Manual in Biochemistry. Mir Publishers. Moscow.
33
Prctica8.EXTRACCIN E IDENTIFICACIN CUALITATIVA DE LPIDOS

1. Introduccin.
Losestridossonlpidossimples,sedividenenesterolesyesteroides,yestnampliamentedistribuidosenplantas
yanimales:Losesterolessonestridosquetienenunaovariasfuncioneshidroxilo,porejemplo,elcolesterol,que
seencuentraenlabilis,elcerebro,lassuprarrenales,eltejidointersticialdeltestculo,etctera.Lamolculatiene
unadimensinde20delongitudy7a7,5deanchurapor5deespesor.Elcolesterolpuedeestarenestado
libreoesterificado(porejemplocomounsterdeloscidospalmtico,esterico,uoleico).Eltejidonerviosoes
especialmentericoencolesterol,dondeelcolesterolalcanzaconcentracionesde2030gporkgdetejido;las
concentracionesmsaltasdecolesterol(4055g/kg)hansidoreportadasenlamateriablancayenlamdula
espinal.
Losesteroidessonestridosquecontienenunaovariasfuncionescarboniloocarboxilo.Porejemplo,lashormonas
sexuales(estradiol,segregadoporlatecadelosfolculos;laprogesterona,segregadaporelcuerpoamarilloo
lteo;latestosterona,elaboradaporlasclulasintersticialesdeltestculo),lashormonasdelacortezasuprarrenal
ylavitaminaDsonesteroides.
Losesterolesvegetalesofitoesteroles,incluidoselergosterol,elestigmaestol,losBsitoesterolesylos
fucoesterolesestnpresentesenaceitesvegetales,frutosyalgas.
Elcolesterolpuedeextraersedemuestrasbiolgicasconcloroformo,etanolcaliente,terdietlico,acetona,yotros
solventesorgnicos.Escomnlaprcticadeusarunamezcladesolventesorgnicosensuextraccin.Cuando
estinmersoenaguaelcolesterolsehinchayformaunaemulsin.Alcontrariodeotroslpidoselcolesterolno
estasujetoalaprecipitacinporagentesalcalinos.
Setratadeunlpidomuypocosolubleenagua,peroextremadamentesolubleensangre(laconcentracinde
colesterolenelplasmadeindividuossanosesnormalmentede150200mg/dL,locualconstituyeeldobledela
concentracindeglucosasanguneanormal).Estoesexplicabledebidoalapresenciadeunasprotenasllamadas
lipoprotenasplasmticas(principalmenteLDLyVLDL)queposeenlacapacidaddefijaryportantosolubilizar
grandescantidadesdecolesterol.
Laslecitinasquesonsteresdelfosfogliceraldehdoydecidosgrasosycolina(lpidoscomplejos).Lasfunciones
alcohlicassonesterificadasporuncidograsoRCOOH,mientrasqueelcidofosfricoesesterificadoporla
colina.Laslecitinasseencuentranenlamayorpartedelasclulasvivas,siendouncomponenteimportantedelas
membranascelulares.
2. Objetivos
1. Extraerycaracterizarlalecitinayelcolesteroldeyemadehuevo.
2. Determinarcualitativamentelapresenciadecolina,fosfatosyglicerolenunhidrolizadodelecitina.
3. Procedimiento
- Extraccindelpidostotales
R
T
s
R
M
ig
c
Id
T
A
a) Iden
ReactivodeL
Tome2mLd
ulfricoconc
ReaccindeS
Mida1mLde
gualdecido
coloreadoen
b) Desp
etano

dentificacin
Tome1mLd
Adicione1m
Manu
ntificacin d
LibermanBur
elsobrenada
centrado,la
Salkowski
elsobrenada
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Ldesolucin
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s siguientes
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34
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ueloslquido
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pruebas:
1mLdecid
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digo 24726,
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Profesora M
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Martha Cecili
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velaformaci
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ia Daza Espi
otasdecido
sterol.
naunvolume
indeunan
una mezcla
enreposo.
inosa
o
en
illo
de
35
Deteccindecolina
Tome1mLdeladisolucindelecitinaycalientesuavementeenunmecherooenunbaodeaguahirviente.La
trimetilaminaliberadasecaracterizaporunolorapescado
Identificacindeglicerol
Tome2mLdeladisolucindelecitina+2mLdeaguadebromo.Calentarenvitrinaparaexpulsarelexcesode
bromo.Tomar0,4mLdeestasolucin+0,1mLdesolucindenaftolal5%enetanol,agitar.Adicionar40gotasde
cidosulfrico.Calentar2minutosenbaomara,enfriar.Observarlaaparicindecoloracinverde.
Clculosyexpresinderesultados
Incluyaenelinforme:
Porcentajedelpidostotales
Porcentajedelecitinareferidaalayemadehuevoyaloslpidostotales
Porcentajedecolesterolreferidoalayemadehuevoyaloslpidostotales
Interpreteconreaccioneslosresultadosobtenidosenlaspruebasrealizadasparalaidentificacindelosdiferentes
productosobtenidos.
4. Materiales y reactivos.
Extraccindelpidosyanlisisdelecitina
Yemadehuevococida
Mortero
Baomara
Vasosdeprecipitados
Erlenmeyer
Varilladevidrio
Pipetas
Probeta
Balanza
Tubosdeensayo
Embudoypapeldefiltro
Mezclaetanolter2:1
Mezclacloroformoetanol2:1
Aguadebromo
2naftolal5%enetanol
cidosulfricoconcentrado
cidomolbdico
cidoascrbico1mg/mLrecinpreparado
36
Anlisisdecolesterol
Anhdridoactico
cidosulfricoconcentrado
Preguntasdeconsulta
1. Quessaponificacin?
2. Essaponificableelcolesterol?Argumentesurespuesta.
3. Culesdebenserlosvalorespromediodecolesteroltotal,triglicridosylipoprotenas(VLDL,LDL,HDL)en
loshumanos?Sonlosmismosparatodaslasedades?
4. Culessonlasfuncionesdelcolesterolenloshumanos?
5. Deculescompuestoseselcolesterolunprecursor?
6. Enqurganoyapartirdequecompuestosesintetizaelcolesterolenloshumanos?
5. Bibliografa
Bohinski,R.C.Bioqumica.1991.EditorialAddisonwesley.Ed.Iberoamericana..
Nelson, D. L., Cox, M. M..2000. Lehninger Principles of Biochemistry, Worth Publishers, Third Edition,
N.Y.
StroevE.A.V.G.Makarova.1989.LaboratoryManualinBiochemistry.MirPublihsers.Moscow.
Stryer,L.Bioqumica.1.995.EditorialRevert,Barcelona.

37
Prcticas 9 y 10: Extraccin de ADN y estudio de algunas
de sus propiedades

1. INTRODUCCIN
En las clulas eucariotas, el ADN est presente en el ncleo, as como en mitocondrias y cloroplastos. En
procariotas, el ADN se encuentra en el citoplasma celular. La molcula de ADN es el soporte material de
los caracteres hereditarios de una especie y es trasmitida ntegramente a la progenie. Cada cromosoma
eucariota contiene una sola molcula de ADN. Su masa molecular es enorme. El modelo de Watson y
Crick explica las propiedades biolgicas del ADN.
La extraccin de los cidos nuclicos ADN y ARN de las clulas o de virus se hace teniendo en cuenta sus
propiedades qumicas. El ADN es insoluble en alcohol y en soluciones diluidas de NaCl, pero soluble en
soluciones concentradas de NaCl y puede disociarse de las nucleoprotenas con un detergente o con fenol.
Mientras que el ARN es soluble en soluciones diluidas de NaCl, insoluble en alcohol y tambin puede
disociarse de las nucleoprotenas con un detergente o con fenol.
La obtencin de ADN o ARN puros puede hacerse por mtodos cromatogrficos: intercambio inico,
tamiz molecular, afinidad; electroforesis y ultra centrifugacin en gradiente de densidad; o por
hibridacin. La obtencin de ADN nativo es difcil debido al tamao de la molcula y a la presencia de
enzimas hidrolticas.
El ADN y el ARN absorben en el ultravioleta. Las bases nitrogenadas de los oligonucletidos tienen un
mximo de absorcin a 260 nm. Usando una celda de 1 cm de paso de luz, el coeficiente de extincin del
ADN a esta longitud de onda es de 20. Con base en este coeficiente de extincin, la absorbancia a 260 nm
en una cubeta de cuarzo (1 cm) de una solucin de 50 g/mL de ADN de doble hlices es igual a 1. Las
protenas tienen mxima absorcin a 280 nm, debido principalmente a los residuos de aminocidos
aromticos.
La pureza del ADN extrado puede determinarse por el cociente entre la absorbancia a 260 nm y la
absorbancia a 280 nm. Si el valor est entre 1,8 2,0 el ADN est libre de contaminantes celulares.
Valores inferiores indican contaminacin con protenas, fracciones de membrana o fenol, cuando ha sido
utilizado para la extraccin de las protenas.
El ADN se desnaturaliza fcilmente y debe trabajarse con cuidado para obtener un producto
estructuralmente semejante al encontrado en la clula. Debe evitarse la tensin mecnica y condiciones
fsicas y qumicas extremas y deben inhibirse las nucleasas.
Para extraer el ADN de una clula hay que romper sus membranas plasmtica y nuclear. Esta ruptura
puede hacerse por choque osmtico o un mtodo mecnico. Las protenas se disocian del ADN por accin
de un detergente aninico o sales concentradas. Se pueden usar agentes quelantes para remover los
metales, especialmente Ca
++
y Mg
++
que son cofactores de las ADN nucleasas. Las etapas anteriores a la
separacin de las protenas debe hacerse lo ms rpido posible y en fro. El pH se ajusta a valores
medianamente alcalinos para disminuir la interaccin electrosttica entre las protenas y el ADN.
La protena liberada puede extraerse con fenol o precipitarse por desnaturalizacin con cloroformo y
alcohol isoamlico. Despus de varias extracciones de la protena, se adiciona etanol o propanol para
separar la fase acuosa. El ADN precipita en fibras que pueden enrollarse en una varilla de vidrio y
retirarse de la solucin y transferirse a otro tubo. El ADN obtenido nunca tiene la longitud de las
molculas nativas en la clula; la manipulacin provoca rupturas aleatorias. Si el ADN se ha manipulado
38
con cuidado, la longitud de los fragmentos sern aproximadamente la centsima parte de la longitud total
del cromosoma.
Factores que determinan la estructura del ADN
La estructura helicoidal del ADN se mantiene gracias a interacciones no covalentes. Por un lado, el
apilamiento entre las bases adyacentes de una misma hebra favorece interacciones hidrofbicas entre
stas, y por otro, cada base est unida a su pareja mediante puentes de hidrgeno, figuras 1y 2. La energa
libre de las interacciones no covalentes que mantienen la estructura helicoidal del ADN no es muy
superior a la energa de los movimientos trmicos a temperatura ambiente, por lo que es posible
desestabilizar la estructura tridimensional del ADN mediante un simple aumento de la temperatura.

Fig. 1. Efecto de la temperatura sobre la estructura del ADN
Cuando se calienta un ADN de doble hebra (forma nativa) se rompen las fuerzas de unin entre las dos
hebras y acaban por separarse. Por tanto, el ADN desnaturalizado es de una sola hebra. La transicin
entre el estado nativo y el desnaturalizado se conoce como desnaturalizacin. En determinadas
condiciones, una disolucin de ADN monocatenario (desnaturalizado), puede volver a formar el ADN
nativo (de doble hebra). Este proceso recibe el nombre de renaturalizacin del ADN. Cuando el ADN
renaturalizado se forma a partir de molculas de ADN de distinto origen, o entre una molcula de ADN y
otra de ARN, la renaturalizacin se conoce como hibridacin.
El ADN tambin puede desnaturalizarse por cambios en el pH y en la fuerza inica que afecten las
interacciones que mantienen la estructura de la doble hlice.
Fundamento de la extraccin del ADN
Las principales etapas en el aislamiento del ADN son : ruptura de las clulas por choque osmtico,
digestin enzimtica o por un mtodo mecnico suave, seguido del aislamiento del ncleo, mitocondrias,
virus u otras estructuras subcelulares que contenga ADN. Posteriormente las protenas se disocian del
ADN por la accin de un detergente aninico o sales concentradas. Con frecuencia se agregan agentes
quelantes para remover los metales. El pH se ajusta a valores medianamente alcalinos para disminuir la
interaccin electrosttica con el ADN.
La protena liberada puede extraerse con fenol o precipitarse por desnaturalizacin con cloroformo y
alcohol isoamlico. Despus de varias extracciones de la protena se agrega etanol o propanol para separar
la fase acuosa. La sal hidroflica del ADN precipita en fibras que pueden enrollarse en un varilla de vidrio
y sacarse de la solucin. En este punto, la mayora del ARN queda en solucin. Si se repite el
p
la
T
(r
q
p
d
c
s
2
E
M
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S
N
E
B
E
B
procedimien
a sedimenta
Todas las et
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desnaturaliz
cuando se e
superiores a
2. MATE
Extraccin
Mortero; erl
o de germen
de potasio 6
Solucin st
NaCl 0,15%
Efecto del p
Buffer borat
Efecto del c
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Manu
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40
Preparacin de algunos reactivos
(NaCl 1% EDTA 0,1M pH 8) Pese 3,72g de EDTA, 0,4 g de NaOH, ajuste el pH a 8,0. Agregue 1 g de
NaCl. Complete con agua a 100mL.
(NaCl 0,15%) Pese 150 mg de NaCl y complete con agua a 100mL.
(SDS 25%). Pese 1g de SDS, disulvalo y complete con agua a 4mL.
(Perclorato de potasio 6 M, sobresaturado). Pese 16,62g, disuelva y complete con agua a 20mL.
(Buffer brax 0,05M) Mida 6,25 mL de brax saturado (4M) y diluya con agua hasta 500mL (pH = 9,0). A
partir de esta solucin, prepare 50 mL de los distintos buffer en el rango de pH de 9,5 a 12,5 agregando
base para ajustar el pH. El resto de solucin ajstelo a pH 8,5.
3. PROCEDIMIENTO
Extraccin de ADN
Pese 5g de levadura o de germen de trigo y 10g de arena lavada y coloque la levadura y la arena en un
mortero previamente enfriado y muela vigorosamente durante 5 minutos.
Vierta el homogenizado en un erlenmeyer con tapa y agregue 30 mL de solucin salina con EDTA, agite,
agregue 2mL de dodecil sulfato de sodio (SDS) y llvelo rpidamente a un bao mara a 60C durante 10
minutos.
Enfre a temperatura ambiente (coloque el erlenmeyer en un recipiente con agua de la llave), agregue 5
mL de perclorato de sodio sobresaturado (6M), mezcle, agregue 40 mL de cloroformo-alcohol isoamlico
(24:1 v/v) y agite magntica o mecnicamente por 15 minutos con el erlenmeyer tapado. Transfiera esta
mezcla a dos tubos de centrfuga. Equilbrelos por peso y centrifugue la emulsin a baja velocidad (1000 a
5000 rpm) por 10 minutos.
Retire con cuidado la capa acuosa superior con una pipeta Pasteur, procurando no tomar el precipitado
presente en la interfase. Colquela en un erlenmeyer de 250 mL y agregue lentamente 70 mL de etanol a
la solucin. Mezcle suavemente con una varilla de vidrio, recolecte el material fibroso precipitado
enrollndolo sobre la varilla de vidrio y presionndolo contra la pared para retirar el lquido. Si no obtuvo
fibras, centrifugue a 2500 rmp por 5 minutos y descarte el lquido.
Disuelva el ADN en 2-4 mL de agua con 0,2 mL de buffer salino EDTA. Mida el volumen final.
Lea la absorbancia a 260 nm. Si queda por fuera del rango de lectura, prepare con una alcuota de 0,2 mL
diluciones seriadas: x10, x100, x1000 y lea la absorbancia.
Solucinstock
Prepare una solucin de 70 mL de una solucin de ADN en NaCl 0,15% de una forma tal que la
absorbancia a 260 nm sea 1,0 0,3. Mida tambin la absorbancia a 280 nm.
Si fuese necesario, la solucin stock puede congelarse para realizar posteriormente los ensayos de
rendimiento y propiedades del ADN.
Efecto del pH
Rotule 6 tubos y agregue a cada uno lo siguiente:
41
Tubo B 1 2 3 4 5
Solucin stock mL --- 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Buffer borato 0,05M (0,5mL) 3,0 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
pH del buffer 8,5 8,5 9,5 10,5 11,5 12,5
Mida la absorbancia a 260 nm, empleando el tubo B como blanco para ajustar el 100% T.
Efecto del calentamiento y del enfriamiento rpido
Prepare 11 tubos y agregue en cada uno solucin stock de ADN y buffer borato 0,05 M pH 8,5 en las
cantidades que se indican en la tabla siguiente y caliente los tubos a las temperaturas sealadas.
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Solucin stock de ADN 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Buffer borato 0,05M pH 8,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Calentar 15 minutos a C 20 37 60 70 80 82 84 86 88 90 92
Pase inmediatamente los tubos a un bao de agua hielo, dando vuelta a los tubos para que se enfren
rpidamente. Deje que los tubos alcancen la temperatura ambiente y mida la Abs a 260 nm.
Como blanco para ajustar el 100% T prepare un tubo que contenga 1,5 mL de buffer borato 0,05M pH 8,5
y 1,5 mL de NaCl 0,15%.
Clculo y expresin de resultados.
1. Calcule la concentracin de ADN
g/mL de ADN = Abs 260nm x factor de dilucin x 50 g/mL/unidad de Abs 260nm.
2. Calcule la cantidad de ADN obtenido
g de ADN recuperado = ADN (g/mL) x volumn total (mL)
3. Calcule la pureza del ADN = Abs 260 / Abs 280
4. Grafique la Abs versus pH o versus temperatura (C). Haga las grficas en la misma hoja de
papel para facilitar la comparacin.
5. Interprete los resultados.
4. PREGUNTAS
a) Diga Cul ADN tiene mayor T
m
: ADN con GC = 63% o ADN con GC = 41%?
b) Qu funcin desempean el SDS, cloroformo, alcohol isoamlico, percolrato de sodio, EDTA en la
extraccin del ADN?
c) Cmo se puede purificar el ADN de un extracto de levadura?
5. BIBLIOGRAFA
Wilson, K., Walker, J.M. 1997. Principles and Techniques of Practical Biochemistry.Cambridge
UniversityPress, London.
Plummer, D.T. 1.981. Bioqumica Prctica. Editorial McGraw-Hill Latinoamericana, .S.A., Bogot.

42
Prctica 11: Trabajo de Investigacin Personal

Instrucciones para elaborar el documento del trabajo de investigacin personal
Noviembre 9 de 2012

Ttulo (mximo 15 palabras, 100 caracteres inlcuidos espacios)
Autor o autora, filiacin (ver como se incluyen los autores y su filiacin en un artculo de la ACS)
Tipo de trabajo: Trabajo de investigacin personal para la asignatura Lab. Bioqumica, cdigo 24726.
Fecha (da-mes-ao)
Palabras clave (mximo 5)

Resumen (mximo 150 palabras)

Contenido (mximo 4000 palabras)
Tablas y figuras (mximo 6) con leyendas explicatorias para cada tabla y figura. las figuras deben estar
citadas y explicadas en el texto.

Conclusiones (mximo 150 palabras)

Bibliografa (mnimo 5 artculos posteriores al 2000). El documento debe estar basado exclusivamente en
artculos cientficos que se encuentren en el ISI Web of Knowledge.

No se aceptan citas de libros ni de artculos que no esten en esta base de datos ni documentos de la www.

Pueden usar como modelo para el documento escrito de su trabajo de investigacin el artculo del Journal
of Biological Chemistry que pueden descargar de la carpeta d:\Mis documentos\My
Dropbox\Bioquimica\TIP-Topic and instructions. O usar como modelo un artculo del Chemical
Reviews.

Para ttulos usar fuente TimesNew Roman 14
Para el resto del documento usar fuente TimesNew Roman 12.
Figuras en formato TIFF *.tif
Mximo 15 pginas, puede ser a doble columna.

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