Universidade Federal de So Paulo - Campus Diadema Graduao em Cincias Ambientais UC: Microbiologia

Conceitos Bsicos da Prtica Laboratorial de Microbiologia e Observao de Alguns Micro-organismos

Autores: Adriana Rodrigues Aline Machiavelli Cynthia Akemi Anno Franco Hana Okabe Silva Juliana Bomjardim Karina de Andrade Chaves Las Mendes Mait Lima Bossi

Docentes: Prof. Dra. Suzan Pantaroto de Vasconcellos Prof. Dra. Karen Spadari Ferreira

Experimento I, realizado no dia 18 de agosto de 2010

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1. Introduo
A Microbiologia definida como a rea da cincia que tem como objeto de estudo os micro-organismos, os quais constituem imenso e diverso grupo de organismos microscpicos que existem como clulas nicas ou conjuntos de clulas. Com base nesse conceito, a microbiologia estuda os organismos procariotos (bactrias, arquias), eucariotos (plantas, animais, protozorios, fungos filamentosos) e tambm seres acelulares (vrus). uma cincia extremamente importante para a sociedade atual, pois a partir das bactrias, permite a pesquisa e o entendimento dos processos que ocorrem na natureza. Alm disso, uma importante ferramenta para a soluo dos inmeros desafios e problemas da Medicina. Para que possa se desenvolver, a Microbiologia faz uso dos mais vrios mtodos de anlise, entre elas a colorao de Gram. A colorao de Gram uma colorao diferencial que consiste no tratamento contnuo de um esfregao de bactrias, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, Iugol (complexo violeta de genciana), lcool etlico a 95% (lcoolacetona) e fucsina (corante de contraste). Tal tcnica permite que as alquotas bacterianas possam ser distintas em dois grupos- Bactrias Gram positivas e Bactrias Gram-negativas- e a determinao do tamanho e da morfologia das alquotas examinadas. O comportamento diferenciado das bactrias frente colorao de Gram decorrente das diferenas qumicas existentes em suas paredes celulares. As bactrias Gram positivas possuem uma parede celular espessa, homognea, geralmente no estratificada e com grande quantidade de peptideoglicano. Deste modo, o precipitado insolvel formado pela ao do Iodol, fica retido no interior da clula pela camada espessa de peptideoglicano, logo, estas clulas no so descoradas permanecendo com a colorao conferida pelo corante cristal violeta. J as bactrias Gram-negativas tm uma parede celular estratificada constituda por uma membrana externa e uma fina camada interna de peptideoglicano (5 a 10%). Assim, o precipitado insolvel, que se forma devido ao do Iodol, removido, as clulas so descoloradas e corando em vermelho pela ao da fucsina. O mtodo descrito acima e os muitos outros utilizados por microbiologistas so realizados em laboratrios e devem seguir condies de segurana conhecidas como GMLP (Good Microbiological Laboratory Practice), objetivando a preveno da disseminao de micro-organismos, uma possvel infeco dos experimentadores por micro-organismos

Universidade Federal de So Paulo - Campus Diadema Graduao em Cincias Ambientais UC: Microbiologia potencialmente patognicos e a contaminao do experimento prtico por micro-organismos exteriores. Assim, o trato com micro-organismos exige o conhecimento de procedimentos especiais de segurana, que vo desde a limpeza da bancada at o descarte correto do material contaminado que foi utilizado durante o experimento, garantindo a obteno de bons e relevantes resultados.

2. Objetivos

3. Materiais e Mtodos
3.1. Materiais Microscpio; Lminas de vidro; Bico de Bunsen; Alas de platina; Cultura de bactrias; Cultura de leveduras; Amostra de saliva humana; Solues para a colorao de Gram: lcool, Lugol,Cristal Violeta, Fucsina; Pipeta; Tubo de ensaio esterilizado contendo gua; gua destilada.

3.2. Mtodos No laboratrio de microbiologia foram realizados trs experimentos, os quais possibilitaram a caracterizao microscpica das culturas de bactrias e leveduras. Para a realizao do primeiro experimento, o qual consistia na caracterizao microscpica de bactrias coradas pela tcnica de Gram, foram utilizadas as seguintes tcnicas: - Flambagem de alas de platina, que a esterilizao atravs do aquecimento gradual da ponta dessa ala utilizando o bico de Bunsen, e, logo aps, com essa ala, foi transferida do tubo de ensaio uma gota de gua para a lmina de vidro e nessa lmina, posteriormente com

Universidade Federal de So Paulo - Campus Diadema Graduao em Cincias Ambientais UC: Microbiologia essa mesma ala foi depositada uma cultura de bactrias e se esperou at que elas se fixassem na lmina; Aps a fixao, foi feita uma anlise atravs da colorao de Gram, que permite distinguir a qual grupo as bactrias pertencem (Gram-positivas ou Gram-negativas). Esse mtodo tratado com as seguintes solues, nessa ordem: - Cristal Violeta (60 segundos) - Lugol (60 segundos) - lcool (30 segundos) - Fucsina (30 segundos) As solues ficaram em contato com a cultura de acordo com o tempo determinado e entre cada soluo, uma pequena quantidade de gua destilada foi colocada na lmina para a remoo superficial das solues. Posteriormente colorao de Gram e a secagem completa da lmina, a anlise no microscpio foi realizada, possibilitando a caracterizao dessas bactrias de acordo com a forma, bordos e elevao. Para o segundo experimento, foi coletada com ajuda de um swab, uma amostra de saliva humana. O procedimento para a anlise e caracterizao dessa amostra semelhante ao realizado com o primeiro experimento, seguindo as mesmas tcnicas. O terceiro experimento foi realizado com culturas de leveduras. O procedimento da flambagem e o transporte da cultura para a lmina foram os mesmos dos demais experimentos. No entanto, para a determinao da colorao atravs do mtodo de Gram, utilizou-se somente a primeira soluo: Cristal Violeta, ficando em contato com a amostra durante 60 segundos. Logo aps a colorao e secagem da lmina com a cultura, pode ser feita a observao ao microscpio.

4. Resultados e Discusses
No primeiro experimento, atravs da observao macroscpica da cultura de bactrias foi possvel verificar que seus bordos eram lisos e a elevao convexa, porm, no foi possvel identificar sua forma, pois as colnias de bactrias estavam muito agrupadas, intensamente grudadas, sendo que, para verificar sua forma, alguma colnia teria que estar isolada. Tambm foi visto que o conjunto de colnias apresentava cor branca, aparncia brilhante e pegajosa.

Universidade Federal de So Paulo - Campus Diadema Graduao em Cincias Ambientais UC: Microbiologia Na observao microscpica, foi observada a organizao das clulas em arranjos de bacilos, sendo as bactrias Gram - Negativas, devido colorao avermelhada que permaneceu na lmina devido ao da fucsina. No segundo experimento.... Na caracterizao macroscpica da cultura de leveduras foi verificada aparncia rugosa, gelatinosa, de cor cru, de forma que as colnias estavam aglomeradas. Na observao microscpica, foi possvel observar que as clulas estavam arranjadas em cocos. Na lmina fornecida para comparao, no se observou praticamente nada no microscpio, pois a amostra poderia estar mida ou velha.

5. Concluso
Aps a realizao do mtodo de colorao de Gram foi possvel concluir que a diferente estrutura da parede bacteriana e, principalmente a espessura da camada de peptideoglicano, a responsvel pelo diferente comportamento das bactrias face colorao de Gram , permitindo que as mesmas possam ser divididas em dois grandes grupos : Gram positivas e Gram negativas.