TEMA 1.- INTRODUCCIN A LA BIOCATLISIS APLICADA Y A LAS BIOTRANSFORMACIONES. LA BIOCATLISIS DENTRO DEL MARCO DE LA BIOTECNOLOGA. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA BIOCATLISIS.

DISEO DEL BIOCATALIZADOR.GENERALIDADES.

BIOTRANSFORMACIONES:
Procesos en los que se emplean Biocatalizadores para la transformacin de sustratos no naturales para dicho Biocatalizador

BIOCATLISIS APLICADA
Empleo de un Biocatalizador (enzimas o clulas, libres o inmovilizadas) para logra una Biotransformacin bajo condiciones adecuadas, con el objetivo de btener un producto de una utilidad aplicada concreta. ORGENES: DESDE LA NOCHE DE LOS TIEMPOS. HOMERO describe la produccin de queso agitando la leche con un palo proveniente de una higuera (se libera una proteasa, ficina, que coagula la leche). La leche se almacenaba en bolsas hechas con estmagos de terneras recin sacrificadas, y se converta en una sustancia semislida, cuya compresin originaba un material ms seco y ms conveniente de almacenar = queso.

ESTO NO ES PROPIAMENTE CIENCIA; ES ARTE.

PRIMEROS PASOS INDUSTRIALES:

En 1875, en Copenhague, Christian Hansen crea una compaa que fue la primera en usar industrialmente para la preparacin del queso una preparacin enzimtica estandarizada llamada RENNET, que es una mezcla de quimosina (o renina) y pepsina, obtenida (hoy da tambin) con una extraccin con sal de la cuarta cavidad estomacal de terneras lactantes.

En 1913, Otto Rhm (fundador de Rhm and Haas) patent un detergente con tripsina.

En los aos 30 se empezaron a usar pectinasas en las industrias de zumos.

Primer proceso realmente industrial, en 1955 con la comercializacin de glucoamilasa.

CUAL ES EL VERDADERO PUNTO DE PARTIDA DE LAS BIOTRANSFORMACIONES?

Tradicionalmente se asocia el comienzo de las Biotransformaciones con los trabajos de A. Zaks y A. Klibanov a mediados de los aos 80, donde se demostraba que ciertas enzimas (lipasas) podan trabajar de manera eficiente en disolventes orgnicos inmiscibles con el agua.
Zaks, A. and Klibanov, A. M. (1984) Science 224, 12491251. Zaks, A. and Klibanov, A. M. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 31923196

No obstante, estos hechos ya se conocan con anterioridad! En efecto, ya en los aos 30 un bioqumico polaco (Ernest Aleksander Sym) describi procesos de sntesis orgnica catalizada por lipasas en medios orgnicos.
Sym, E.A. (1933) ber die esterasewirkung III. Biochem. Z. 258, 304324 Sym, E.A. (1933) ber die esterasewirkung IV. Biochem. Z. 262, 406425 Sym, E.A. (1936) Eine methode der enzymatischen estersynthesen. Enzymologia 1, 156160

POR QU ESTE HECHO FUE DECISIVO?

Porque elimin las reticencias que el uso de biocatalizadores supona para los Qumicos Orgnicos. EXCUSAS MS HABITUALES PARA NO USAR BIOCATALIZADORES 1.- Las enzimas son muy caras.
A primera vista, parece irrefutable. Los precios oscilan entre $100,000/kg para una enzima de diagnstico (lctico deshidrogenasa) hasta $100/kg para las preparaciones crudas de amilasasa. Para las enzimas ms tiles en Biotransformaciones, los precios oscilan entre $500 hasta $20,000/kg, dependiendo de la pureza.

No obstante, no debe considerarse tanto el precio en s cuanto su contribucin al precio final del producto. Ejemplos: Transaminasa ($20-30/kg) para la produccin de p-fluoro-L-fenilamina ($500/kg). El costo final de la penicilinacilasa en la produccin de Penicilina G es de aproximadamente $1/kg. El costo final de la aspartasa en la produccin de cido L-asprtico es menor de aproximadamente $0.1/kg. Finalmente, si comparamos con los precios de los catalizadores qumicos, veremos que no existe mucha diferencia!

SI SE INMOVILIZAN, PUEDEN REUTILIZARSE, CON LO QUE EL COSTO GLOBAL VA A VERSE DISMINUIDO

2 .- Las enzimas son muy sensibles y fciles de desactivar. En efecto, muchas enzimas se desnaturalizan en condiciones de alta temperatura o valores extremos de pH. Inclusive las disoluciones enzimticas con el tiempo pierden actividad a temperatura ambiente. Y eso implica inestabilidad?.

Lo verdaderamente importante por considerar es la ESTABILIDAD OPERACIONAL en las condiciones de trabajo. Existen muchos ejemplos industriales donde las enzimas exhiben excelentes condiciones de estabilidad, especialmente si estn inmovilizadas.

Tambin se pueden usar enzimas de organismos termfilos. Se pueden introducir modificaciones en la enzima para aumentar su estabilidad (DIRECTED EVOLUTION).

3.-Las enzimas son activas solamente sobre sus sustratos naturales Algunas (las ms especializadas) pero otras muchas no. Las hidrolasas, proteasas, esterasas y especialmente lipasas, son capaces de aceptar sustratos muy distintos de los suyos naturales.

Proceso one pot de LONZA en un biorreactor de 15m3 Amidasa de Comomonas acidovorans expresada en E. Coli. El enantimero no reconocido del cido se recicla. El producto es un inhibidor de la beta-galactosidasa.

Proceso de SEARLE, USA La enzima se emplea inmovilizada. El producto se usa para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

4.-Las enzimas solamente trabajan en concentraciones muy bajas de sustrato, por lo que la productividad del proceso biocatalizado es baja. Veamos algunos casos donde no es cierto.

100 g/l

ABACAVIR, anti HIV Ziagen TM

Proceso de Glaxo Wellcome La enzima es una proteasa alacalina, alcalasa. El medio de reaccin es THF/agua. Resultados:50 % de conversion, ee > 99% La concentracin de sustrato es 100 g/l

150 g/l

Proceso de Chirotech Planta piloto en Shasun Chemicals, India La concentracin de sustrato es 150 g/l

5.-Las enzimas solamente catalizan reacciones poco atractivas.

6.-Las enzimas solamente funcionan en medios acuosos, donde los sustratos mas interesantes para un qumico orgnico son insolubles.

Ya veremos ms adelante que esto no es cierto para algunas enzimas

CULES SON LAS VENTAJAS DE LA BIOCATLISIS?

1.- Las enzimas son catalizadores muy eficientes: aceleracin de velocidad del orden de 8 a 12 factores de magnitud se usan a concentraciones del 0.001 al 0.0001%, frente a los catalizadores qumicos (0.1-1%). Si consideramos las condiciones de su uso (T, presin) su eficacia es aun mayor
10.000 a 100.000 kg

1 kg 3$/kg

Se puede usar la enzima inmovilizada, o bien las clula enteras tambin inmovilizadas. Es uno de los procesos biocatalizados de mayor productividad.

2.- Las enzimas no producen contaminacin medioambiental

Las enzimas son protenas y, por tanto, biodegradables. Si se usan soportes inertes (slice, barro de diatomeas), el derivado inmovilizado sigue siendo inocuo para el medio ambiente. Adems, las condiciones suaves de trabajo implican poco consumo energtico , y por tanto poco costo y emisin de gases poco contaminantes, por lo que no se incrementa el efecto invernadero.

3.- Las enzimas trabajan en condiciones suaves de pH, temperatura y presin Este es una de las ventajas ms importantes. Generalmente las enzimas funcionan a T ambiente, presin atmosfrica y pH neutro o cercano a la neutralidad. Por ello se minimiza la generacin de subproductos por reacciones colaterales, lo que conlleva un aumento de la conversin y facilita los procesos de recuperacin de productos (down stream) Uno de los ejemplos mas claros: produccin de acrilamida por Nitto Chemical, Japn.

La escala de produccin es aproximadamente 20.000 toneladas mtricas al ao. El proceso qumico opera a temperaturas de 80-140C y siempre se produce cido acrlico como subproducto. Adems usa un catalizador de Cu que genera subproductos txicos (HCN entre ellos) El proceso enzimtico opera a 10C para generar un 100% de acrilamida

4.- Las enzimas no estn limitadas a su papel natural -alta tolerancia por distintos sustratos -pueden trabajar en medios orgnicos 5.- Las enzimas pueden catalizar un amplio espectro de reacciones HIDROLISIS-SINTESIS DE ESTERES, AMIDAS, LACTONAS, ANHIDRIDOS, EPOXIDOS y NITRILOS OXIDACIONES-REDUCCIONES DE ALCANOS, ALQUENOS, COMPUESTOS AROMTICOS, ALCOHOLES, ALDEHIDOS y CETONAS, SULFUROS Y SULFOXIDOS. ADICION-ELIMINACION DE AGUA, AMONIACO, ACIDO CIANHIDRICO. HALOGENACIONES y DEHALOGENACIONES, ALQUILACIONES y DEALQUILACIONES, ISOMERIZACIONES, CONDENSACIONES ALDOLICAS, ACILOINICA, ADICIONES DE MICHAEL. TRANSPOSICIONES TIPO CLAISEN. CICLOADICIONES DIELS-ALDER

POR TANTO, LA BIOCATLISIS ES EXCELENTE!

CONSECUENCIA: LA FIEBRE DEL ORO

Se lleg a predecir que la Biocatlisis llegara a sustituir por completo a la Sntesis Orgnica. !!. Hoy da ya se acepta que la Biocatlisis no pretende sustituir, sino complementar.

Biocat.

CULES SON LAS DESVENTAJAS DE LA BIOCATLISIS?

1.- Las enzimas son producidas en la naturaleza como un slo enantimero no existen "imgenes especulares" de las enzimas formadas por D-aminocidos se debe hacer un "screening" si se quiere la otra enantioselectividad 2.- Las enzimas requieren parmetros operacionales muy estrechos 3.- Las enzimas presentan su mayor actividad en medios acuosos productos orgnicos poco solubles en agua 4.- Las enzimas pueden sufrir procesos de inhibicin por sustrato: mantener baja la concentracin inicial por producto final: hay que retirar el producto a medida que se forma

ESTADO ACTUAL DE LAS BIOTRANSFORMACIONES

La mayora de los Qumicos Orgnicos la han aceptado como una herramienta ms dentro del arsenal sinttico.
BIOCATAL! ORGANIC SYNTHESIS and ENZYM! 250 200 publicaciones Nmero de 150 100 50 0 82 84 86 88 90 92 94 96 98 00 02 4 www.sciencedirect.com Ao

LIBROS DE TEXTO

LIBROS DE TEXTO

LIBROS DE TEXTO

DOS TIPOS DE APROXIMACIONES

Sinceramente, me da igual saber cmo transcurre la biotransformacin, siempre que obtenga el resultado buscado!

DOS TIPOS DE APROXIMACIONES

Yo s quiero saber el mecanismo del proceso biocatalizado!

CLASIFICACION DE ENZIMAS

ENZIMA

CLASIFICADAS

DISPONIBLES

TIPO DE REACCION oxidacin de enlaces C-H, C-C, C=C, C=O; adicin o eliminacin de H transferencia de grupos aldehido, cetona, acilo, azcar, fosforilo, metilo hidrlisis-formacion de esteres, amidas, epxidos, nitrilos, anhidridos adicin-eliminacin de pequeas molculas sobre enlaces C=C, C=O, C=N isomerizaciones: racemizaciones, epimerizaciones formacin-ruptura de enlaces C-O, C-S, C-N, C-C

UTILIDAD

1.- OXIDORREDUCTASAS

650

90

3 (25%)

2.- TRANSFERASAS

720

90

2 (<5%)

3.- HIDROLASAS

636

125

4 (65%)

4.- LIASAS

255

35

2 (<5%)

5.- ISOMERASAS

120

1 (<5%)

6.- LIGASAS

80

1 (<5%)

Perodo 1987-99

1. OXIDORREDUCTASAS

2. TRANSFERASAS

3.- HIDROLASAS

4. LIASAS

5. ISOMERASAS

Liasas, transferasas e isomerasas

Clulas aisladas

Enzimas aisladas

QU BUSCA UN QUMICO ORGNICO CUANDO USA UNA ENZIMA?

APROVECHARSE DE LA PRECISIN QUMICA DE LAS MISMAS. ESTA PRECISIN SE PUEDE ABORDAR DESDE 2 PUNTOS DE VISTA: MECANSTICO CINTICO

ASPECTOS MECANSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA

MODELO ENCAJE INDUCIDO KOSHLAND, D.E. Y NEET, K.E. Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 1974, 37, 359

ASPECTOS CINTICOS

+A E +B

[EA]

E+P

[EB]

E+Q

G# = H# - TS# = -RTln (VA/VB)) A/VB

G (kcal/mol) VA/ VB ee (%)

#

0.118 0.651 1.74 2.17 3.14 4.50

1.2 3 19 39 199 1999

10 50 90 95 99 99.9

POR QU SE DISMINUYE LA ENERGA DE ACTIVACIN?

Existen 5 factores que se pueden considerar: 1.- FACTOR PROXIMIDAD y ORIENTACIN

Me + N Me Me

O O

NO 2

O O

k = 4.3 mol-1 l min-1

Me Me N O O

Me + N H Me Me

NO 2 + HO

NO 2

H Me Me N + O O

NO 2 + HO

k = 21500 mol-1 l min-1

2.- CATLISIS CIDO BASE Puede ser: Especfica, si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccin. General, si intervienen contribuciones de H+ y de otras especies que donan o aceptan H+ , como el CH3CO2H, por ejemplo. Esta es la nica que se observa en la catlisis enzimtica 3.- CATLISIS COVALENTE Las reacciones pueden catalizarse por la formacin de intermedios covalentes SI ESTOS SE FORMAN Y SE ROMPEN RAPIDAMENTE.

MECANISMO DE LAS SERIN HIDROLASAS

O H N
(S)

O H N
(S)

N H

N H

NH

HN

NH

HN

His

O
(R)

His
O

O
(R)

O O
(R)

O
(R)

Ser
H N N H O HN O

H N N H O

Ser
HN O

Asp
(Glu) O

Asp
(Glu) O O

HN O

R O

HN

HO

C O R1

C O R1

2 R O C O INTERMEDIO R1 TETRADRICO #1

HN

HN
O

R2O

C O R1

H2O R OH
2

O H N
(S)

N H

NH

HN
N H
(S)

His
O
(R)

O
(R)

H N NH HN

O O H N O N H O HN

Ser

His
O
O
(R)

O
(R)

Asp
(Glu) O

HN

HO C O R1

O O

Ser
H N N O HN

Asp
(Glu) O O

HN

HN

O H R1

C (E) O
HN

INTERMEDIO TETRADRICO #2

ENZIMA ACILADA
O

4.- DISTORSIN DEL SUSTRATO Al entrar al centro activo, el sustrato debe distorsionarse. Eso hace que tenga una geometra y una distribucin electrnica ms cercana a la del estado de transicin.

5.- FACTOR MICROENTORNO Las reacciones qumica se ven afectadas por los disolventes. La existencia de microentornos hace que las microconstantes dielctricas sean diferentes.

LA PRECISIN SE TRADUCE EN: SELECTIVIDAD DE SUSTRATO SELECTIVIDAD DE GRUPO FUNCIONAL REGIOSELECTIVIDAD ESTEROSELECTIVIDAD

SELECTIVIDAD DE SUSTRATO
Incluso conociendo la estructura 3D de una enzima, a veces es difcil entender por qu una enzima reconoce un tipo de sustratos, mientras que otros similares no son transformados, lo que puede ser muy til. Por ejemplo, la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxocidos usando cido L-glutmico o L-Asprtico como donador del grupo amino.

SELECTIVIDAD DE GRUPO FUNCIONAL

Es la capacidad de las enzimas para actuar sobre un grupo funcional determinado en una molcula en la cual existe otro grupo funcional ms reactivo en condiciones qumicas.

REGIOSELECTIVIDAD
Es la capacidad de las enzimas para actuar sobre un grupo funcional determinado en una molcula en la cual existe otro grupo funcional similar o idntico en reactividad.
O R2 R1 (R,S) esteres de cidos grasos con sustituyentes aciloxi en beta O O medio acuoso OCH3 R1 (S) R1 (R) OCH3 OCH3 lipasa de Geotrichum candidum

OH

R2

inalterado

R1 heptilo undecilo pentadecilo 5,5-dibutilpentilo undecilo undecilo

R2 propilo propilo propilo propilo clorometilo heptilo

selectividad (E) 11 20 20 62 3 5

REGIOSELECTIVIDAD

Tyr HO
O O O H N N H H S CH3 CH3 Acilasa H2N N O

H N Gly O

Gly N H

H N Phe O

R NH2

N O H

H H S CH3 CH3

papaina
O O O CO2H H N N H H S CH3 H H H2N N O CO2H

-quimotripsina
S CH3

Acilasa

R= Leu Leu-encefalina R= Met Met-encefalina

REGIOSELECTIVIDAD
OCH3 O HO O H3CO Cl O H3 C HO Cl O H 3C OCH3 O OCH3 O CH3 N H3 C Batrylis alii OCH3 O OCH3 O H3 CO Cl O H3 C HO GRISEOFULVINA (antibitico) Microsporum canis HO OH O OCH3 O H3CO Cl O H3 C H3C O O O hidrlisis qumica del acetato en 6-alfa Chapmann, P. J. y cols.- Biochem. Biophys. . Res. Commun. vol. 20, p. 104 (1965) OH O CH3 N CH3 N -quimotripsina Cercospora melonis O O O O

hidrlisis enzimtica del ester dihidrocinmico en 3-beta Lin, Y.Y. y Jones, J. B. (1973) J. Org. Chem. vol.38, p. 3575

Ref.- BOOTHROYD, B. y cols.

(1961) Biochem. J. , vol. 80, p. 34

REGIOSELECTIVIDAD
OH OH H OH subtilisina N HO butirato de tricloroetilo piridina OH OH H O O N HO 82 %

CASTANOSPERMINA inhibidor de glucosidasa agente antineoplsico tratamiento del SIDA

O OH O H O O N HO 72 %

lipasa de Chromobacterium viscosum butirato de tricloroetilo

MARGOLIN, A.L. y cols.

1990 J.Am.Chem.Soc

., 112, 2849

ESTEREOSELECTIVIDAD
Es la capacidad de las enzimas para reconocer quiralidad o proquiralidad en un sustrato. Es sin duda la propiedad enzimtica ms empleada en Biotransformaciones. Como la quiralidad es una cuestin de espacio, un sustrato debe ubicarse de una manera determinada en tres dimensiones para permitir un alto grado de enantioselectividad. Existe una teora basada en este hecho, como es la llamada REGLA DE LOS TRES PUNTOS, que permite explicar los tres tipos de esteroselectividad enzimtica.

REGLA DE LA UNIN POR TRES PUNTOS A. OGSTON, Nature, 1948, 162, 963 1. DISCRIMINACIN ENANTIOMRICA

D A C C

D A A

accin enzimtica

A
D

C
D

(R)
D C A B

(S)

B
A B B C A

C A

C A

1. DISCRIMINACIN ENANTIOMRICA. ALGUNAS CONSIDERACIONES Todas las reacciones bioqumicas que tienen lugar en los

microorganismos superiores son mediadas por enzimas. Es lgico pensar que los distintos enantimeros de un compuesto bioactivo (frmaco, agroqumico) puedan causar efectos distintos. As, se consideran ESPECIES DISTINTAS. Al ismero de mayor actividad se le llama EUTMERO Al de menor actividad se le llama DISTMERO. A la relacin entre la actividad del eutmero y a la del distmero se le llama COCIENTE EUDSMICO.

S-(+) Carvona OLOR A MENTA

O HO NH2 O R- Asparagina DULCE NH2

R-(-) Carvona OLOR A ALCARAVEA

O H2N O NH2 OH

S- Asparagina AMARGO

H2N HO2C H

SH Me Me

HS Me Me

NH2 CO2H H

S-penicilamina ANTIARTRTICO

R-penicilamina TXICA

O N NH O O R-Talidomida SEDANTE O
O HN

O N O O S-Talidomida TERATOGNICA

DISCRIMINACIN ENANTIOTPICA
pro-R

A
pro-S

accin enzimtica

A
pro-S

C
pro-S

B
A B B

A
pro-R

A pro-S
pro-R

A pro-R

C A

DISCRIMINACIN ENANTIOFACIAL
cara Si

REGLA DE LA SECUENCIA A>B>C B

A C

cara Re ataque Si A A C B B C A C A B C ataque Re