49575164-Manual-ABC-I Hematologia

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS SECCION CIENCIAS DE LA SALUD HUMANA
QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO MANUAL DE LABORATORIO DE ANALISIS BIOQUMICO CLINICOS I AUTORES: Q.F.B. Q.F.B. M en C Q.F.B. Q.F.B. Q.F.B. AGOSTO MARTHA PATRICIA CAMPOS PEON RENE DAMIAN SANTOS GLORIA LETICIA ARELLANO MARTNEZ MA. DE LOURDES GALVAN RUIZ BEATRIZ LUCIA GONZALEZ MALDONADO OMAR ASAF RUIZ CAZARES DE 2008
NDICE Pg Presentacin 2 Reglamento de Laboratorio 3 Practica No. 1. Toma de muestra de sangre venosa 5 Practica No. 2. Citometra hemtica 14 Practica No. 3. Grupos sanguneos y pruebas cruzadas 25 Practica No. 4. Pruebas de coagulacin 33 Practica No. 5. Qumica sangunea I y glucosa posprandial 43 Practica No. 6. Qumica sangunea II 51 Practica No. 7. Urianlisis 59 Referencias 70
PRESENTACION En este manual se presenta la informacin necesaria para realizar adecuadamente la s prcticas de la asignatura de Anlisis Bioqumico Clnicos I, adems de formar parte del material de consulta para los estudiantes y aplicar a los estudiantes que se encuentren cursando la asignatura de Anlisis Bioqumico Clnico I y a los profesores que participen en esta asignatura. El manual fue elaborado por los profesores qu e participan en la asignatura. El manual consta de 7 prcticas, que estn organizadas en 10 puntos, que a continuacin se resumen, para mejor comprensin del manual. 1. Marco terico. En el se da un panorama de la importancia del estudio e incluye una seccin denominada informacin complementaria, que comprende una serie de preguntas o temas que el alumno debe responder previo a la realizacin de la prctica. 2. Objetivo u objetivos de la prctica. 3. Materiales. Este punto incluye un listado del material requerido por equipo de trabajo y por grupo, los reactivos necesarios para la prctica, as como la muestra biolgica requerida para la misma. 4. Mtodos. En este apartado se desglosan las determinaciones que se realizarn durante la sesin experimental. Cada determinacin incluye su fundamento, el significado clnico y el procedimiento a seguir. 5. Disposicin de residuos. Se ndica la forma de desechar los residuos generados durante la prctica. 6. Diagrama de flujo. Consiste de una hoja en blanco en la que el alumno plasmara en forma de diagrama la secuencia a seguir en la sesin experimental. 7. Resultados. En algunas prcticas este punto viene desglosado por clculos aritmticos y una tabla de resultados, en la cual se deben incluir el valor de referencia y la interpretacin de los resultados. 8. Discusin. Este apartado se incluyo con el fin de que alumno plasme en el mismo manual su anlisis y discusin de resultados, evitando el manejo de otras libretas. 9. Conclusiones. Tiene la misma intencin del punto 8. 10. Referencias consultadas. Es un punto en el cual el alumno deber anotar las referencias que empleo para realizar su discusin y elaborar sus conclusiones. Se ha incluido tambin en el manual, el reglamento del laboratorio, que se ha ubic ado al inicio del manual, con la finalidad de que el alumno lo tenga siempre a la ma no y recuerde cuales son los lineamientos que debe seguir en el laboratorio, para un mejor desarrollo de las prcticas. Los Profesores de la Asignatura
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLN DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS REGLAMENTO GENERAL PARA LOS LABORATORIOS CODIGO: DOC-CB-FESCDEX01-00 No de REVISIN: 1) Este reglamento aplicar para personal acadmico, alumnos y laboratoristas. 2) Para todo trabajo realizado en el laboratorio deber utilizarse bata blanca con manga larga. 3) La tolerancia para el inicio de la sesin de laboratorio ser hasta de 10 minutos a partir de la hora sealada. 4) Por seguridad, no deben cerrarse las puertas del laboratorio con llave durante las prcticas. 5) En todo momento deber mostrarse una conducta adecuada en el rea de trabajo. 6) Queda prohibido en los laboratorios: a) Tirar basura fuera del cesto. b) Ingerir alimentos y/o bebidas. c) Fumar. d) Recibir visitas. e) La entrada a los inter-laboratorios a toda persona ajena a los mismos. f) Realizar reuniones o convivios en los laboratorios. g) Salir del laboratorio en el horario asignado para la sesin experimental. h) Sentarse sobre las mesas de trabajo. i) Mover el mobiliario de su lugar. j) Utilizar las gavetas para guardar material que no corresponda a la asignatura.
7) Los residuos peligrosos deben depositarse en los contenedores destinados para tal fin, entendiendo por residuo peligroso: elementos, sustancias, compuestos, desechos o mezclas de ellos que en cualquier estado fsico representan un riesgo para el ambiente, la salud o los recursos naturales, por sus caractersticas corrosivas, reactivas, explosivas, txicas, inflamables o biolgico-infecciosas (Art. 3 de la Ley General del Equilibrio y Proteccin del Ambiente). 8) Dentro del laboratorio no se permite el uso de telfonos celulares, reproductores de sonido o cualquier medio electrnico de entretenimiento. 9) El acceso al laboratorio se permitir nicamente cuando est presente un profesor. 10) El uso del laboratorio para trabajo extraordinario, deber programarse con el responsable del laboratorio en un horario que no interfiera con aquel destinado para el desarrollo de las prcticas. para solicitar material y equipo, es requisit o indispensable que el alumno llene debidamente el vale de material (FPE-CBDEX-01-09/CSH-a) y lo entregue a la persona responsable, dejando como depsito la credencial vigente de la UNAM. 11) El alumno deber revisar el material y/o equipo al momento de recibirlo indicando cualquier anomala (faltante o material daado) y ser devuelto en las condiciones en que se recibi, de no hacerlo, se har acreedor a las sanciones establecidas en cada laboratorio. 12) Es obligacin de todos mantener limpio y ordenado el lugar de trabajo y todo e l laboratorio.
PRACTICA No. 1 TOMA DE MUESTRA DE SANGRE VENOSA Patricia Campos P. 1.1 MARCO TERICO El volumen total de sangre en un adulto es 7 a 8% de su peso corporal; siendo el 55% la porcin lquida llamada plasma cuya composicin corresponde fundamentalmente 90 % agua y el 10 % diferentes metabolitos. El 45% restante de la sangre se comp one de elementos celulares eritroides, plaquetarios y leucocitarios. Para que una muestra tenga significado biolgico, debe ser representativa y homognea, por lo que se debe tener conocimiento sobre: -La distribucin y concentracin de cada metabolito en los diferentes tipos de lquidos orgnicos. -Estado biolgico del metabolito a estudiar (si est libre o conjugado). -La produccin, utilizacin y regulacin homeosttica. Debe recordarse que una muestra de sangre nos va a reflejar el perfil biolgico de l paciente del momento en que se ha efectuado la extraccin. Existen diferentes tcnicas de extraccin de muestra sangunea -Puncin venosa -Puncin capilar -Puncin arterial Para tomar la decisin de cundo usar cada una de estas tcnicas se debe considerar los siguientes factores: -Edad del paciente -Condiciones del paciente -Tipo de pruebas a realizar La tcnica de venopuncion, como esta descrita en la estandarizacin, contempla desde: -Condiciones inherentes del paciente (peso, edad, vena no visible, hospitalizado ) Seleccin del material -Posicin de la toma -Seleccin del sitio de puncin -Puncin venosa (preferentemente con sistema de puncin al vaci) -Eliminacin de punzo cortantes
Las venas ms comnmente utilizadas son las del rea ante cubital (vena baslica, ceflica y cubital media), debido a su accesibilidad, fcil manejo y comodidad para el paciente. La venopuncin es la ms utilizada en el laboratorio clnico ya que es un mtodo sencillo para la obtencin de sangre, esta suele hacerse en la vena media ceflica que corre por el interior del brazo y es visible en el pliegue del codo. En casos en los cuales resulta difcil localizar la vena, puede hacerse resaltar diciendo a l paciente que cierre y abra la mano, mediante el masaje o por combinacin de ambos procedimientos. Se puede realizar de una manera accesible en la mayora de los pacientes ambulatorios o de consulta externa y en algunos pacientes hospitalizad os. La aplicacin del torniquete es recomendada para el caso de venas profundas, poco visibles y poco palpables. Debe sujetarse con medio nudo para que pueda quitarse jalando el extremo libre. Para su colocacin, es necesario considerar que se ubiqu e 10 cm. por encima del lugar de puncin; si se coloca ms alto no hay presin, mientras que si est cerca de la zona de puncin hay posibilidad de generar un hematoma; adems no debe estar ms de un minuto en lugar de puncin. Se ha demostrado que la utilizacin del torniquete durante un tiempo mayor a 1 minuto, provoca aumento de un 15% de desviacin en valores de coagulacin y de un 10% en el hematocrito. Los anticoagulantes son sustancias que impiden la coagulacin sangunea, ya sea por sustraccin del calcio del plasma o por neutralizacin de la trombina. Cuando la sangre se obtiene agregando algn anticoagulante, se inhibe la cascada de la coagulacin obteniendo, despus de la centrifugacin, elementos formes separados del sobrenadante que se conoce como plasma. En cambio, si se permite que la muestra coagule, se obtendr cogulo y el sobrenadante se llama suero. La sangre desfibrinada es aquella desprovista de factores de la coagulacin. 1.1.1 Informacin Complementaria -Indique ejemplos de anticoagulantes, su modo de accin, su concentracin y proporcin en que se usa para esta funcin. -Cual es la diferencia entre suero y plasma? Considere su composicin y la metodologa para su obtencin -Que es la hemlisis? Mencione algunas recomendaciones para evitarla -Que se obtiene de la tcnica para la sangre desfibrinada despus de la centrifugacin? -Indique como se observa una muestra sangunea lipmica y cual es la razn
7 1.2 OBJETIVOS - El alumno adquirir los conocimientos necesarios a para poder realizar una venopuncin - El alumno desarrollara la habilidad prctica por medio de la tcnica de la venopuncin para poder obtener una muestra de sangre venosa con calidad e integridad. - El alumno conocer la importancia e influencia de la buena toma de muestra sangunea a travs de los conocimientos y practica adquiridos para poder llevar a cabo un correcto diagnstico y una toma de decisiones teraputicas adecuada. 1.3 MATERIAL 1.3.1 Muestra Biolgica Se utilizarn tres muestras de sangre venosa: 3 ml y 10 ml obtenidos con jeringa, 7 ml obtenidos con tubo al vaco. 1.3.2 Material por equipo 1.3.3 Material por grupo Aplicador de madera Aguja para tubo al vaco Tubo al vaco con gel separador Torundas de algodn con alcohol al 70 % Gasas Cuadros de papel parafilm Balanza granataria de dos platos Frasco con agua corriente y una jeringa Centrifuga Espectrofotmetro con gradilla y 10 celdas limpias Contenedor para punzocortantes Vaso de precipitado de 250 mL Gradilla Pisetas con agua destilada Recipiente para desechos (RPBI) Micropipetas 5 a 40 .l Pipeta graduada de 1 mL (1/100) con propipeta Bao de incubacin a 37 C con gradilla y termmetro Brazos artificiales con solucin cada uno con jeringa Tubo al vaco con Aguja 1.3.4 Reactivos por grupo 1 Gradilla 10 Perlas de vidrio 4 Tapn para tubo de ensaye 13 x 100 1 Propipeta 4 Pipetas pasteur 1 Adaptador para tubos al vaco 3 Bulbo para pipeta Pasteur 1 Piseta con agua destilada 8 Tubo de ensaye 13 x 100 6 Gasas 1 Tapa o base para caja petri 1 Tubo de ensaye 15x150 con tapn de rosca 1 Tubo 12x75 con 1 ml de EDTA 5% EDTA al 5% Hipoclorito de sodio Alcohol al 70% Benzal Agua destilada
1.4 METODOS 1.4.1 Tcnica de venopuncin por vaco Para la extraccin de sangre el paciente estar sentado y deber apoyar bien el brazo en una superficie plana, no debe estar de pie o sentado en bancos altos, pues al gunos por el efecto de la puncin se desmayan y es necesario considerar este riesgo. La tcnica de venopuncin que se esquematiza a continuacin es la indicada para el sistema al vaco: a) Preparar el material. (Romper el sello de seguridad de la aguja sin quitar el protector de la misma en presencia del paciente. Colocarlo en el adaptador). b) Localizar la vena con el dedo ndice y/o medio, evitar utilizar el pulgar. c) Limpiar la zona con alcohol isoproplico al 70% de manera circular del centro haci a fuera. Dejar secar al aire. d) Solo si es necesario aplicar un torniquete. e) Sujetar la parte posterior del brazo del paciente a nivel del codo, jalar ligera mente la piel sobre la vena. f) Puncin en ngulo de 45 insertando primero la aguja con el bisel hacia arriba colocndola paralela al trayecto de la vena y posteriormente insertar el tubo (respetando el orden de la toma). g) Retirar la ligadura en cuanto la sangre empiece a fluir (si es necesario). h) Dejar llenar el tubo hasta el volumen preestablecido (frecuente error preanaltico , que afecta la relacin sangre anticoagulante y por lo tanto la calidad de la muestra). i) Mezclar suavemente los tubos con anticoagulantes o aditivos. j) Insertar el siguiente tubo en el caso de toma mltiple. k) Cuando se finaliza la toma, primero se debe retirar el tubo y posteriormente la aguja. l) Presione el sitio de la venopuncin con una torunda con alcohol y coloque un
apsito adhesivo elstico. 1.4.2 Tcnica de venopuncin con jeringa. Seguir los pasos a, b, c, d y e del procedimiento 1.4.1 e) Quitar el tapn de plstico de la jeringa cuidando que el bisel de aguja se encue ntre hacia arriba colocarla en ngulo de 45 y paralela al trayecto de la vena. f) Perforar la piel a lo largo de la cara lateral de la vena, avanzar la aguja y perforar la pared de la vena.
g) Al subir espontneamente la sangre (se observa una ligera gota en la cubeta de la aguja) jalar ligeramente el mbolo con movimiento constante. h) Cuando se tiene suficiente cantidad de sangre, se quita el torniquete, se ret ira la aguja rpidamente y se aplica una torunda por ltimo un apsito adhesivo elstico. i) Para el manejo de la muestra obtenida con jeringa se retira la aguja de la je ringa y la sangre se vaca lentamente por la pared de los diferentes tubos a usar con y/o sin anticoagulante. Mientras se llenan los tubos sucesivamente, invertir con suavida d los tubos con aditivos que ya se han llenado 1.4.3 Obtencin de Plasma La sangre obtenida por puncin venosa con jeringa (3 ml) se vaca inmediatamente en el tubo con la cantidad adecuada de anticoagulante. Es importante recordar quita r la aguja para vaciar el contenido de la jeringa. Se mezcla por inversin lenta con el anticoagulante, evitando la formacin de burbuj as y se centrifuga a 2.500 rpm/ 5 -10 min. El tubo se saca de la centrifuga y se separa cuidadosamente el plasma con una pi peta Pasteur, vacindolo en otro tubo. El plasma tambin se puede obtener por el mtodo de tubo al vaco, el cual puede contener dos diferentes anticoagulantes, EDTA al 5 % (tubo de tapn lila) o citrat o sdico al 3,8 % (tubo de tapn azul), que se elegir dependiendo de las determinaciones que se realizarn a la muestra. 1.4.4 Obtencin de Suero La muestra de sangre obtenida con tubo al vaco de tapn rojo, se coloca en forma inclinada (mayor superficie de contacto) en el bao de incubacin a 37 C durante 10 minutos. El coagulo (observe la retraccin si se presenta), se separa ligeramente de las paredes con un aplicador de madera, y se centrifuga a 2.500 rpm/5 -10 min. El tu bo se retira de la centrifuga y se separa el suero con pipeta Pasteur, vacindolo en otro tubo de ensayo. El suero tambin puede obtenerse tomando la muestra con jeringa y depositndola en un tubo de ensayo sin anticoagulante. 1.4.5 Obtencin de sangre desfibrinada La muestra de sangre venosa obtenida con jeringa se vaca en un tubo con tapn de rosca que contenga al menos el mismo nmero de perlas de vidrio que mililitros de sangre se vaya a desfibrinar. A continuacin se aplica un movimiento de inversin
suave del tubo constante. Al cabo de 2-3 minutos se observar que el ruido que las perlas hacan al chocar contra las paredes del tubo, deja de orse, eso se debe a qu e la fibrina que se va formando en el proceso de la coagulacin, se deposita sobre e llas, atrapndolas. A partir de ese momento se prosigue el movimiento rotatorio durante 10 minutos. Posteriormente se separan con mucho cuidado la sangre lquida en un tubo de ensaye que se lleva a centrifugar y las perlas de vidrio en la tapa o base de una caja Petri las cuales se lavan con agua destilada separando la fibrina que se ad hiri a ellas. La sangre lquida se centrifuga a 2.500 rpm/5 - 10 min. 1.5 DISPOSICIN DE RESIDUOS 1.5.1 Eliminacin de punzocortantes La eliminacin de punzocortantes adecuada es parte importante de la toma de muestra. En este caso la eliminacin de aguja de toma mltiple, est de acuerdo a normas nacionales (NOM-087-ECOL-SSA1-2002) y las polticas de buenas prcticas establecidas en cada laboratorio. Los punzocortantes como agujas y lancetas as como tubos rotos contaminados deben depositarse en el contenedor rojo rgido. En los contenedores existen diferentes capacidades, lo cual permite que el labor atorio seleccione el ms adecuado a su flujo de trabajo y material utilizado. Se debe tom ar en consideracin las instrucciones de utilizacin recomendadas por los fabricantes y cuidar no sobrellenar el contenedor, pues esto puede ser un factor de riesgo par a el personal tcnico y de intendencia. Con una adecuada eliminacin se disminuyen los eventos de puncin accidental tanto para el paciente y trabajador de salud, como para el personal de intendencia. 1.5.2 Eliminacin de muestras biolgicas Los tubos para extraccin de sangre contaminados o llenos tienen que recogerse en recipientes apropiados para residuos de material potencialmente infeccioso que e n este caso son bolsas rojas. Los tubos de vidrio que contengan las muestras sern colocados en agua con cloro durante 24 h. La eliminacin de residuos se hace usualmente en instalaciones incineradoras apropiadas.
1.6 DIAGRAMA DE FLUJO
1.7 RESULTADOS 1.7.1 Clculos 1.7.2 Tabla de Resultados Datos Paciente Puncion Tcnica(c/s anticoagulante) Muestra obtenida Observaciones 12
1.8 DISCUSIN 1.9 CONCLUSIONES 1.10 REFERENCIAS CONSULTADAS
PRCTICA No. 2 CITOMETRA HEMTICA 2.1 MARCO TERICO. Aunque existe la tendencia a la automatizacin en la citometra hemtica, la presente prctica est diseada para introducir al estudiante en los procedimientos de laboratorio manuales que puede ser necesario utilizar cuando existen recuentos q ue exceden la linealidad de un instrumento o ste presenta un desperfecto. El mtodo de cianometahemoglobina para la determinacin de hemoglobina y el microhematocrito que permite medir el volumen de los eritrocitos centrifugados, se usan como parte del control de calidad y como mtodos de apoyo de anlisis de varios laboratorios. El hemocitmetro permite realizar recuentos de cualquier tipo de clula sangunea: eritrocito, leucocito o plaqueta que ayudan a detectar anormalidades cuantitativ as, que al hacer un frotis sanguneo, teirlo con colorante de Wright y observarlo al microscopio permite identificar las alteraciones morfolgicas o en el caso de los leucocitos el tipo celular que predomina. Empleando los resultados del recuento eritrocitario, valor de hematocrito y concentracin de hemoglobina se calculan los ndices eritrocticos (ndices de Wintrobe), que aportan datos importantes sobre el tamao, la concentracin de hemoglobina y el peso de hemoglobina de un eritrocito promedio. Datos que facili tan el diagnstico y la clasificacin de las anemias. El recuento de reticulocitos permite evaluar la actividad eritropoytica de la mdul a sea, se hace utilizando tinciones supravitales. La velocidad de sedimentacin globular (VSG), mide la sedimentacin de los eritrocitos en un periodo de 1 hora, que es dependiente de las sustancias conten idas en el plasma y la capacidad de las clulas para sedimentar. Se encuentra alterada en procesos inflamatorios y se usa para monitorear el tratamiento de ciertas enfermedades. Los resultados obtenidos con estos procedimientos se usan en el diagnstico para l a identificacin de afecciones que incluyen: anemias, leucemias, infecciones, as como , trastornos hereditarios de los leucocitos; y adems son tiles para el pronstico y vigilancia teraputica de diversos padecimientos.
2.1.1 Informacin complementaria. -Cules son las instrucciones que se dan a un paciente a quien se le realizar una citometria hemtica? -Justificar matemticamente y sealar c/u de los factores a considerar en la obtencin del factor 36,8 utilizado para calcular la concentracin de hemoglobina y sus unid ades. 2.2OBJETIVOS El alumno aplicar los conocimientos adquiridos en la parte terica, para realizar u na citometria hemtica. El alumno interpretar los resultados obtenidos en el laboratorio a fin de estable cer la presencia o no de anemia. El alumno aprender a identificar la morfologa de las diferentes clulas sanguneas con fines diagnsticos. 2.3MATERIALES 2.3.1 Muestra biolgica. Sangre venosa completa obtenida por sistema de vaco con EDTA. 2.3.2 Material por equipo Gradilla Tubo de Wintrobe Tubo de ensaye 13 x 100 Hemocitmetro Tubo de ensaye 12 x 75 Adaptador para tubos al vaco Pipeta de Salhi con manguera de Tubos de ensaye 12x75 con 3 ml de SSF, succin 3ml de reactivo de Turck, 3ml de reactivo Contador de Hayem cada uno Pipeta Pasteur con punta larga con bulbo Microscopio 2.3.3 Material Por Grupo Tubo capilar Celdas /2 gradillas Aguja para tubo al vaco Pipeta graduada de 5 ml c/propipeta Tubo al vaco de tapn lila Gradillas de Sedimentacin Torundas de algodn con alcohol al 70 % Pisetas de agua destilada Gasas Vasos de pp de 250 ml Tubo al vaco con tapn lila Viales limpios c/2 -3 ml de EDTA al 5% Cuadros de papel parafilm Vortex Microcentrfuga Recipiente c bolsa roja para desechos Lector de hematocrito Contenedor para punzocortantes Espectrofotmetros con vaso de precipitado Frascos torunderos c/torundas y alcohol de 500 ml
2.3.4 Reactivos Reactivo de Drabkin (Hemoglobina) Benzal Etanol 70% Hipoclorito de sodio Lquido de Turck Reactivo de Wright Reactivo de Hayem Buffer de fosfatos para tincin de Wright Cloruro de sodio 0,9% (SSF) Azul de cresilo brillante 2.4 MTODOS 2.4.1 Hemoglobina: Mtodo de la cianometahemoglobina Fundamento. Para la determinacin de hemoglobina se utiliza el reactivo de Drabkin , el cual contiene un detergente que permite la lisis de los eritrocitos y, por lo tanto la liberacin de la hemoglobina. Posteriormente, el ferricianuro de potasio la reduce a metahemoglobina, que se estabiliza por la unin con los iones CN-(cedidos por el KCN) formando cianometahemoglobina que tiene una absorbancia mxima a 540 nm. Significado clnico. El valor de referencia de la hemoglobina para mujeres es de 1 2 a 16 g/dl y para hombres de 14 a 18 g/dl. La disminucin de hemoglobina indica anemi a, que puede deberse a deficiencia en las sustancias que intervienen en su formacin, alteraciones en los rganos que la sintetizan y disminucin en la produccin o destruccin excesiva de los eritrocitos. Procedimiento. -Colocar 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo 13x100 -Llenar la pipeta de Sahli hasta la marca de 20 con ayuda una boquilla. -Secar el exceso de sangre con una gasa limpia. -Sin dejar caer alguna gota de sangre, depositar la muestra en el tubo con el reactivo de Drabkin, enjuagando la pipeta con un poco del reactivo. -Tapar el tubo con papel parafilm. Homogenizar la preparacin en un vrtex. -Incubar 3 minutos a temperatura ambiente. -Leer a 540 nm antes de 5 minutos. Multiplicar la absorbancia obtenida por 36.8 para obtener la concentracin de hemoglobina en g/dl. 2.4.2Cuenta de eritrocitos: Mtodo del hemocitmetro Fundamento. El nmero de clulas por mm3 estar determinado por un factor de dilucin en la pipeta de Thoma para eritrocitos, por el conteo de las cinco cuadrcu las secundarias del hemocitmetro y por el volumen de la cmara. Las clulas contadas en el objetivo 40X correspondern a los eritrocitos despus de un tratamiento con el diluyente de Hayem, compuesto de bicloruro de mercurio, sulfato de sodio y cloru ro de sodio, que permite la lisis de los leucocitos, y conservar a los eritrocitos en un ambiente isotnico.
Significado clnico. El valor de referencia para hombres es de 4,0 6,2 x 106 clulas / mm3, el de mujeres es de 4,0 6,2 x 106 clulas / mm3. El aumento de eritrocitos se observa en la hemoconcentracin, en afecciones del bazo. Su disminucin se manifiesta en las anemias, cuyo origen puede ser la prdida excesiva de sangre, destruccin acelerada o produccin inadecuada de eritrocitos. Procedimiento. -Llenar la pipeta de Thoma para eritrocitos (roja) con sangre hasta la marca de 0.5 con ayuda una boquilla. -Secar el exceso de sangre con una gasa limpia. -Sin dejar caer alguna gota de sangre, llenar con el lquido diluyente de Hayem hasta la marca de 101 sin pasar de la marca. -Tapar los extremos de la pipeta con papel parafilm. -Mezclar el contenido en el agitador para pipetas de Thoma durante 1 min. -Desechar las primeras 3 gotas y se llena el hematocitmetro. -Contar las clulas con el objetivo 40X en las cinco cuadrculas secundarias con la ayuda de un contador mecnico. -Calcular el nmero de eritrocitos/mm3 multiplicando el valor obtenido por 10000. 2.4.3 Hematocrito: Mtodo del Microhematocrito Fundamento. El hematocrito expresa en porcentaje (%) el volumen que ocupan los eritrocitos en una muestra sangunea centrifugada en velocidad y tiempo constante. Significado clnico. El valor de referencia es de 37 a 47% en mujeres y 42 a 52% e n hombres. Su aumento indica policitemia (aumento del nmero de eritrocitos); su disminucin se presenta durante la anemia, hipovolemia y durante el embarazo. Procedimiento. -Llenar un capilar de 75 mm hasta partes por capilaridad con la sangre previamente homogenizada. -Sellar el extremo vaco del tubo con un encendedor. -Colocar el tubo capilar sellado en la microcentrfuga con la parte sellada hacia el lado opuesto al centro de la centrfuga. -- Centrifugar 5 minutos (10.000 rpm) o 10 minutos (5.000). -Calcular el microhematocrito con ayuda del lector de microhematocrito o de acuerdo a la siguiente frmula: -Hto= Vol. de eritrocitos (mm) / Vol Total de sangre (mm) x100 -Reportar en %.
2.4.4 ndices de Wintrobe: VCM, HCM, CHCM Fundamento. Se trata de indicadores obtenidos mediante clculos aritmticos, que involucran los valores de hemoglobina, nmero de eritrocitos/mm3 y hematocrito, y que permiten la clasificacin morfolgica de las anemias. Significado clnico. Los valores de referencia son: -VCM = 80 100 fl; un valor < 80 fl indica anemia microctica; mientras que por arriba de 100 fl indica anemia macroctica. Esta relacionada con la anisocitosis. HCM = 26 a 34 pg y CHCM = 32 36 g/dl; valores menores al de referencia indican anemia hipocrmica; mientras que valores por arriba del lmite de referencia indican anemia hipercrmica. Procedimiento. Para obtener los ndices de Wintrobe es necesario tener los valores de hemoglobina , nmero de eritrocitos/mm3 y hematocrito, utilizando las siguientes frmulas. Volumen Corpuscular Medio (VCM) = Hto / No. eritrocitos X 10 = [fl] (femtolitros ) Hemoglobina Corpuscular media (HCM) = Hb / No eritrocitos. X 10 = [pg] (picogram os) Concentracin de HCM (CHCM) = Hb / Hto X 100 = [g/dl] 2.4.5 Cuenta de Reticulocitos: Tincin supravital Fundamento. Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros que contienen restos de rRNA (cido ribonucleico ribosomal). Cuando son sometidos a colorantes llamados supravitales, como el azul de cresilo brillante, este precipita sobre los restos de rRNA permitiendo observarlo en forma de cuentas de rosario , que los eritrocitos maduros no contienen. Significado clnico. El valor de referencia es de 5 a 20 reticulocitos/1.000 eritr ocitos o 0,5 a 2,0 %. Cuando se presenta la destruccin acelerada de eritrocitos (anemia hemoltica, sangrado excesivo, hemorragia), el nmero de eritrocitos aumenta. Procedimiento. -Colocar en un tubo 12x75, 5 gotas de colorante azul de cresilo brillante -Adicionar 5 gotas de sangre homogenizada. -Mezclar sin agitar ni generar burbujas. -Incubar 15 minutos a temperatura ambiente, -Con esta preparacin realizar un frotis y dejarlo secar al aire. -Observar con el objetivo de 100X, buscando una zona de la extensin donde el nmero de eritrocitos sea aproximadamente 100, contando el nmero de reticulocitos presentes. -Repetir el conteo en al menos en tres campos distintos. Expresar el nmero de
reticulocitos observados por cada mil eritrocitos o en tanto por ciento. 2.4.6 Cuenta de leucocitos: Mtodo del hemocitmetro Fundamento. El nmero de clulas por mm3 estar determinado por un factor de dilucin en la pipeta para glbulos blancos, por el conteo de las cuatro cuadrculas primarias del hemocitometro y por el volumen de la cmara. Las clulas contadas en e l objetivo 10X correspondern a los leucocitos despus de un tratamiento con el diluyente de Turck , compuesto de cido actico glacial, que lisa a los eritrocitos, y azul de metileno (colorante de contraste) que permite observar fcilmente a los leucocitos. La fuerte agitacin es importante para este cometido. Significado clnico. El valor de referencia es 5.000 a 10.000 leucocitos/mm3. Los leucocitos son clulas de la defensa (inmunidad) que incrementan en procesos inflamatorios o infecciosos. Su disminucin se observa durante la inmunosupresin (por el usos de frmacos), inmunodeficiencia (algunos virus pueden ocasionarla) o en la leucopoyesis alterada. Procedimiento. -Llenar la pipeta de Thoma para leucocitos (blanca) con sangre hasta la marca de 0.5 con ayuda de una boquilla. -Secar el exceso de sangre con una gasa limpia. -Sin dejar caer alguna gota de sangre, llenar con el lquido diluyente de Turck hasta la marca de 11 sin pasar de la marca. -Tapar los extremos de la pipeta con papel parafilm. -Mezclar el contenido en el agitador para pipetas de Thoma durante 1 min. -Desechar las primeras 3 gotas y se llena el hematocitmetro. -Contar las clulas con el objetivo 10X en las cuatro cuadrculas primarias con la ayuda de un contador mecnico. -Calcular el nmero de leucocitos/mm3 multiplicando el valor obtenido por 50. 2.4.7 Cuenta diferencial de leucocitos: tincin de Wright Fundamento. La extensin de la sangre sobre un portaobjetos (frotis) permite aprec iar mejor la morfologa de las clulas sanguneas. El conteo diferencial es posible gracia s a la tincin de Wright, cuyo colorante est compuesto de azul de metileno (que tie de color azul las partes cidas de las clulas) y eosina (que tie las partes alcalinas) disueltos en metanol (que permite la fijacin de las clulas), adicionando a la preparacin buffer de fosfatos (que rehidrata a las clulas despus de la exposicin al metanol). De esta manera, es posible realizar la cuenta diferencial de las pobla ciones leucocitarias, adems de observar la morfologa y caractersticas de tincin de los
20 eritrocitos y plaquetas. Significado clnico. El valor de referencia relativo y las alteraciones comunes de las clulas leucocitarias son las siguientes: - Neutrfilos segmentados = 45 a 60%; la neutrofilia se observa durante procesos inflamatorios agudos e infecciosos; la neutropenia se presenta en la depresin de la mdula sea, inmunodeficiencia o inmunosupresin. - Linfocitos = 20 a 40%; la linfocitosis se manifiesta en alteraciones virales y en respuesta a procesos infecciosos; la linfopenia se observa en procesos similares a la neutropenia. - Monocitos = 0 a 7%; la monocitosis - Neutrfilos en banda = 0 a 5 %; su nmero se observa incrementado cuando los neutrfilos segmentados disminuyen por reaccionar ante el agente infeccioso. - Eosinfilos = 0 a 4%; la eosinofilia se presenta principalmente en respuesta a cuadros alrgicos y durante las parasitosis. - Basfilos = 0 a 1%; la basofilia se manifiesta cuando los eosinfilos aumentan, pues se trata de clulas que controlan la respuesta alrgica. Como se mencion, en el frotis sanguneo tambin se observan las plaquetas (forma y tamao) y los eritrocitos, cuyas observaciones deben relacionarse a lo determinado por los ndices de Wintrobe, de acuerdo a lo siguiente: . Anisocitosis: diferentes tamaos del eritrocito; siendo un microcito si su tamao es menor 7 .m; normocito si va de 7 a 8 .m y macrocito si es mayor a 8 .m. Esta caracterstica se relaciona con el VCM. . Anisocroma: diferentes caractersticas de tincin; es hipocrmico si se ti dbilmente; normocrmico si tiene una coloracin normal e hipercrmico si su tincin es intensa. Esta caracterstica se relaciona con el HCM y CHCM. . Poiquilocitosis: cambios permanentes en la forma del eritrocito. No mantiene relacin con los ndices de Wintrobe. Procedimiento. - Colocar una gota de sangre perfectamente homogenizada en un portaobjetos. - Hacer la extensin de sangre con un movimiento suave y firme con la ayuda de otro portaobjetos. - Secar al aire. - Cubrir el frotis completamente con colorante de Wright durante 7 minutos (cuidar que no se seque el colorante). - Sin tirar el colorante agregar el buffer de fosfatos durante 15 minutos.
- Decantar y enjuagar con agua destilada. -Contar al microscopio en el objetivo de 100X, 100 clulas leucocitarias con ayuda de un contador mecnico. Al mismo tiempo que se recorre el frotis observar la morfologa de eritrocitos y plaquetas. 2.4.8 Velocidad de sedimentacin globular: Mtodo de Wintrobe Fundamento. La velocidad de sedimentacin globular (VSG) est determinada por la propiedad de sedimentacin de las clulas sanguneas por influencia de la gravedad y depende de las caractersticas del plasma y su relacin con las clulas. Significado clnico. El valor de referencia para hombres es 0 a 15 mm/h y para mujeres es 0 a 20 mm/h. Si la VSG est aumentada se demuestra la presencia de inflamacin o destruccin celular, como en el caso de lupus eritematoso generalizado , artritis reumatoide, infecciones crnicas y agudas, fiebre reumtica, hepatitis, inf arto al miocardio, embarazo, menstruacin. Procedimiento. -Colocar el tubo de Wintrobe en la gradilla de sedimentacin cuidando que est perfectamente bien nivelada. -Con la ayuda de la pipeta Pasteur llenar el tubo de Wintrobe hasta la marca de 10 1 con sangre previamente homogenizada. -Dejar reposar durante una hora evitando cualquier movimiento. -Hacer la lectura de los milmetros (mm) sedimentados en una hora. 2.5 DISPOSICIN DE RESIDUOS Los tubos con sangre y muestra biolgica se depositarn en los contenedores dispuestos para cada fin. Las agujas se desecharn en el contenedor rojo de punzocortantes. Los guantes, torundas, papel y dems material desechable contaminado con sangre se depositarn en la bolsa roja de residuos peligrosos biolgico-infecciosos (RPBI). Los empaques de jeringas, agujas, guantes, algodn e incluso los mismos guantes, s e desecharn en el bote de la basura si no estn contaminados con muestra biolgica.
2.7 RESULTADOS 2.7.1 Clculos 2.7.1 Tabla Datos del Paciente Nombre______________________________________ Edad______ Sexo____ Determinacin Resultado Valor de Referencia Observaciones Hemoglobina Hematocrito VSG Eritrocitos HCM VCM CMHC Reticulocitos Leucocitos Neutrfilos segmen. Neutrfilos en banda Linfocitos Monocitos Basfilos Eosinfilos
2.8 DISCUSIN 2.9 CONCLUSIONES 2.10 REFERENCIAS
PRCTICA No. 3 GRUPOS SANGUNEOS Y PRUEBAS CRUZADAS Omar Ruiz C. 3.1 MARCO TERICO Las clulas sanguneas contienen molculas en la superficie de la membrana que difieren de un individuo a otro. Las sustancias que se encuentran en los eritroc itos y que son responsables de la incompatibilidad sangunea, se han llamado antgenos eritrocitarios y han sido descritos alrededor de 23 grupos diferentes. Estos div ersos antgenos forman a los grupos sanguneos que son biomolculas presentes al nacimiento, cumplen con las leyes mendelianas y son detectadas porque reaccionan especficamente con un anticuerpo. El sistema ABO fue el primer grupo sanguneo que se describi, son una secuencia de 5 a 7 carbohidratos y se encuentran en la membrana de los eritrocitos como glicolpidos o en lquidos corporales como glicoprotenas. Lo constituyen los tipos A, B, AB y O. Pero existen variantes como el antgeno Bombay y el antgeno de Lewis. Los carbohidratos del sistema ABO sirven de transportadores de iones para los eritro citos. El factor Rh (de Macaccus rhessus, primate donde se descubri al inocular sus eritrocitos en conejos) es una lipoprotena transmembranal cuya seccin reaccionante es el antgeno D, aunque existen otros 43 antgenos ms que lo componen, la identificacin de este antgeno describe un individuo Rh positivo. El Rh est involucrado en la anemia hemoltica del recin nacido. Su papel fisiolgico de la lipoprotena es el transporte de iones con gasto de ATP. Los sistemas ABO y Rh son los ms estudiados debido a que son los ms inmunognicos, es decir, que provocan una respuesta inmune ms severa, tomando gran importancia para el caso de transfusiones. Otros grupos sanguneos que han tomado importancia en el banco de sangre son el sistema Kell, Duffy, Kidd, Luthe ran, MN y Lewis. Los grupos sanguneos se estudian principalmente en los casos de transfusin o trasplantes, en el estudio de estados hemolticos inmunolgicos; medicina forense, exclusin de paternidad, homicidio, violaciones o en antropologa fsica (origen o migracin tnica, mezcla racial). Debido a la presencia de otros grupos sanguneos, en el banco de sangre se emplean las pruebas cruzadas. Dichas pruebas someten el plasma del receptor con eritroci tos del donador y viceversa. Si existe alguna incompatibilidad sangunea, ser detectada por una reaccin antgeno-anticuerpo observndose en forma de aglutinacin. La
reaccin de aglutinacin es utilizada tambin en la determinacin de los grupos sanguneos. 3.1.1 Informacin complementaria -Qu es la eritroblastosis fetal o anemia hemoltica del recin nacido? -Investiga cul es la utilidad del suero de Coombs y la albmina en la prctica. -Cul es la secuencia de carbohidratos de los diferentes antgenos del sistema ABO? -Describe el proceso de preparacin de 2 ml de suspensin de eritrocitos al 5%. -Investiga los requisitos que debe cumplir el donante y otros anlisis que se real izan a la unidad de sangre donada. 3.2 OBJETIVOS -El alumno conocer la importancia de los grupos sanguneos en el banco de sangre atravs del estudio de incompatibilidades. -El alumno determinar los grupos sanguneos ABO y Rh de una muestra de sangre a travs de reacciones de aglutinacin. -El alumno analizar la compatibilidad de dos muestras para una transfusin a travs de las pruebas cruzadas. -El alumno conocer la utilidad del suero de Coombs con diferentes pruebas. 3.3 MATERIALES 3.3.1 Muestra biolgica Sangre venosa completa obtenida por sistema al vaco con EDTA Suspensin de eritrocitos A al 5% Suspensin de eritrocitos B al 5% 3.3.2 Material por equipo 1 Placa de porcelana 1 Bulbo para pipeta Pasteur 8 Tubos de ensaye de 12 x 50 1 Pipeta graduada 1/100 de 1 ml 2 Tubos de ensaye de 13 x 75 1 Pipeta graduada 1/10 de 5 ml 2 Pipetas Pasteur 1 Vaso de precipitados de 100 ml 1 Adaptador para sistema la vaco 2 Tapones de goma para tubos de 13 x 75 1 Gradilla 3.3.3 Material por grupo Aplicadores de madera Balanza de doble plato Agujas 21G x 1 frascos con agua Centrfuga Vasos de precipitados de 500 ml Tubos al vaco con EDTA Contenedor para punzocortantes Lancetas Contenedores para biolgicos Bao mara a 37C con 2 gradillas, 1 tubo y un infecciosos
termmetro Jeringa Algodn 3.3.4 Suero Suero Suero Suero Reactivos hemotipificador Anti-A Solucin salina fisiolgica (SSF) hemotipificador Anti-B Albmina al 22% hemotipificador Anti-D Alcohol etlico al 70% de Coombs
3.4 MTODOS 3.4.1 Tipificacin Clsica Fundamento. La tipificacin clsica utiliza la reaccin de aglutinacin para observar si existen los antgenos A y/o B en los eritrocitos. Si existe alguno de ellos, reacc ionarn especficamente con anticuerpos anti-A o anti-B que harn que aglutinar produciendo una prueba positiva. Significado clnico. Una aglutinacin positiva indica la presencia del antgeno, ya se a A , B , ambos ( AB ) o no aglutinacin ( O ); as mismo, el antgeno indica el grupo sanguneo a la que pertenece la muestra. Procedimiento. -Colocar una gota de suero anti-A en un extremo de la placa. -Colocar una gota de suero anti-B en otro extremo de la placa. -Agregar una gota de sangre completa prximo a cada gota de suero. -Mezclar bien con un aplicador de madera y rotar la placa por 2 minutos -Observar si existe o no aglutinacin en menos de 2 minutos (se debe observar 3.4.2 Tipificacin Inversa Fundamento. Identifica los anticuerpos anti-A o Anti-B (tambin llamados isoaglutininas) presentes en el suero o plasma de la muestra, los cuales reaccio nan especficamente con eritrocitos conocidos A o B . Significado clnico. La presencia de aglutinacin indica la presencia de anticuerpos anti-A (si aglutina el tubo A) o anticuerpos anti-B (si aglutina el tubo B). El grupo sanguneo ser A si slo aglutina en el tubo B; grupo sanguneo B si slo aglutina en el tubo A; O si aglutina en ambos y AB si no se encuentra aglutinacin en alguno de los tubos. Procedimiento -Colocar -Colocar -Agregar -Incubar al tubo A 5 gotas de suspensin de eritrocitos A. al tubo B 5 gotas de suspensin de eritrocitos B. 5 gotas de suero o plasma problema a cada tubo. 15 minutos a 37C, centrifugar a 2.000 rpm por 1 minuto.
-Observar si existe o no aglutinacin moviendo un poco el fondo del tubo. 3.4.3 Antgeno D (Rh) Fundamento. El antgeno D da una fuerte reaccin de aglutinacin con anticuerpos anti-D determinando as el factor Rh como positivo. Significado clnico. La aglutinacin positiva indica una sangre Rh positiva, en el c aso contrario se deber hacer la prueba de Du para asegurar que sea Rh negativa. Procedimiento. -Colocar una gota de suero anti-D en un extremo de la placa. -Agregar una gota de sangre completa prximo a la gota de suero. -Mezclar bien con un aplicador de madera y rotar la placa por 2 minutos. -Observar si existe o no aglutinacin en menos de 5 minutos. 3.4.4 Deteccin del factor Du (solo si el Rh es negativo o dudoso) Fundamento. Esta prueba se aplica cuando el Rh es negativo o dudoso en la prueba de Antgeno D. El Rh est compuesto por varios determinantes antgnicos (C, D, E, c, d, e) siendo el D el que da una mejor reaccin. Para facilitar la aglutinacin se ag rega suero de Coombs para detectar estos antgenos ya que reaccionan dbilmente. Significado clnico. Si existe aglutinacin en el tubo con anti-D, la sangre es de l a variedad Du y es Rh positiva; El tubo con albmina es el control negativo y no deb e existir aglutinacin. Si ambos tubos no presentan aglutinacin, la sangre es Rh negativa. Procedimiento. -Colocar a cada tubo 1 gota de suspensin al 5% de eritrocitos problema. A un tubo colocar una gota de suero anti-D y al otro una gota de albmina -Incubar ambos tubos a 37C durante 15 minutos. -Lavar 3 veces con SSF -Despus de decantar agregar a cada tubo 2 gotas de suero de Coombs -Centrifugar a 2.000 rpm 1 minuto y observar si existe aglutinacin moviendo el botn. 3.4.5 Pruebas cruzadas Fundamento. Estas pruebas determinan si existe compatibilidad sangunea entre el donante y el receptor a travs de enfrentar sus sueros y eritrocitos en una prueba in vitro. De esta manera se descartan anticuerpos irregulares y de otros grupos
sanguneos diferentes al ABO y Rh que pudieran reaccionar al momento de la transfusin. Significado clnico. Despus de agregar el suero de Coombs y no observar aglutinacin en ambos tubos hay compatibilidad del 100%. Si slo existe aglutinacin en el tubo de la Prueba Mayor, existe un 75% de incompatibilidad; por otro lado si slo aglutina el tubo de la Prueba Menor, hay un 25% de incompatibilidad. La aglutina cin en ambos tubos indica 100% de incompatibilidad. Procedimiento 1 (medio salino) -Colocar 2 gotas de suero o plasma del receptor y 2 gotas de suspensin de eritrocitos del donador (Prueba Mayor). -Colocar 2 gotas de suero o plasma del donador y 2 gotas de suspensin de eritrocitos del receptor (Prueba Menor). -Mezclar y centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto. -Observar si existe aglutinacin, de lo contrario incubar 15 min. a 37C. -Centrifugar a 1.000 rpm por 1 minuto. Observar si hay aglutinacin. -Si no hay aglutinacin o es dudosa, lavar 4 veces con SSF. -Decantar, mezclar y agregar 2 gotas de suero de Coombs. -Mezclar y centrifugar a 1.000 rpm, 1 min. Observar aglutinacin. Procedimiento 2 (medio proteico). -Colocar 2 gotas de suero o plasma del receptor y 2 gotas de suspensin de eritrocito del donador (Prueba Mayor). -Colocar 2 gotas de suero o plasma del donador y 2 gotas de suspensin de eritrocitos del receptor (Prueba Menor). -Agregar 2 gotas de albmina y seguir los pasos del 3 al 8 del procedimiento de medio salino. NOTA: los tubos en medio salino y medio proteico pueden realizarse simultneamente 3.5 DISPOSICIN DE RESIDUOS Los tubos con sangre y muestra biolgica se depositarn en los contenedores dispuestos para cada fin. Las agujas y lancetas usadas de desecharn en el contenedor rojo de punzocortantes . Los sobrenadantes resultados de los lavados con SSF se decantarn en un vaso con hipoclorito de sodio. Los Guantes, torundas, papel y dems material desechable contaminado con sangre se depositarn en la bolsa roja de residuos biopeligrosos.
Torundas, servitoallas, guantes, envolturas y dems material no contaminado se desechan en el contenedor de basura municipal 3.6 DIAGRAMA DE FLUJO
3.7 RESULTADOS Datos del Paciente Nombre______________________________________Edad______ Sexo____ 3.7.1 Tablas Tipificacin Clsica y Antgeno D Suero hemotipificador Anti-A Anti-B Anti-D Aglutinacin Antgeno presente (A, B ninguno -O-) (+) Aglutin (-) No aglutin Tipificacin Inversa Suspensin de eritrocitos Eritrocitos A Eritrocitos B Aglutinacin Isoaglutinina presente (anti-A, anti-B) (+) Aglutin (-) No aglutin Determinacin del Factor Du. (Antgeno D negativo o dudoso) Aglutinacin Muestra con albmina Muestra con suero de Coombs (+) Aglutin (-) No aglutin Grupo sanguneo Factor Rh Pruebas Cruzadas Proceso Centrifugacin 1000 rpm/ 1 min Incubacin a 37C y centrifugacin Lavado con SSF y suero de Coombs Medio PM salino Pm Medio PM proteico Pm (+) Aglutin PM. Prueba Mayor Pm. Prueba Menor (-) No aglutin Grupo sanguneo Donador Grupo sanguneo Receptor % Compatibilidad % Incompatibilidad
PRCTICA No. 4 PRUEBAS DE COAGULACIN Lourdes Galvn R. 4.1 MARCO TERICO La hemostasia es el trmino que se aplica al conjunto de fenmenos que detienen o combaten el sangrado de un vaso sanguneo lesionado, el cual provoca una serie de modificaciones fsicas y bioqumicas de las sustancias participantes hasta llegar a la transformacin de la sangre lquida en un trombo o cogulo slido, que sella con eficacia los vasos rotos. Por lo que las hemorragias son consecuencia de anomalas en la fase vascular, plaquetaria y/o en los factores de la coagulacin. El proceso de la coagulacin se verifica en tres fases: 1) Aparicin de actividad tromboplastnica. La tromboplastina es una sustancia celul ar que se encuentra en plaquetas y tejidos transformando la: 2) Protrombina en trombina siendo necesaria la presencia de calcio. La protrombi na es una protena que se sintetiza en el hgado y es dependiente de la vitamina K. 3) Transformacin de fibringeno en fibrina, que mediante la participacin de la trombina logra gelificarse produciendo redes que recubre elementos celulares de la sangre y finaliza con la formacin de un cogulo. En estas tres fases intervienen 16 factores de la coagulacin que se activan en cascada formando: la va intrnseca, la va extrnseca y la va comn. Siendo de gran utilidad la realizacin de diversas pruebas en el laboratorio que a yuden a la identificacin correcta de la alteracin en cualquiera de los tres sistemas ant es mencionados. El citrato trisdico al 3,8 % es el anticoagulante recomendado para pruebas de coagulacin ya que conserva a los factores que participan en este proceso. La dosificacin en que se utiliza es 1 parte de anticoagulante para 9 partes de sangr e. El EDTA al 5% slo se recomienda para realizar conteo plaquetario ya que acta inhibiendo el proceso de agregacin, sin embargo no es til para pruebas de coagulacin ya que inactiva algunos factores lbiles. La dosificacin en la que se utiliza es 0,02-0,04 ml de anticoagulante para 1 ml de sangre. En la presente prctica se realizarn pruebas que apoyan a la evaluacin de la hemostasia: el tiempo de sangrado valora integralmente a la coagulacin, el tiempo de coagulacin del plasma y el tiempo de tromboplastina parcial activada evalan el sistema intrnseco mientras que el tiempo de protrombina lo hace con el sistema extrnseco. Tambin se har la evaluacin cuantitativa de las plaquetas.
34 4.1.1 Informacin complementaria - Esquematiza la cascada de coagulacin completa. - Define petequia, hematoma y prpura. - Seala los cuidados que se deben tener al realizar pruebas de coagulacin. 4.2 OBJETIVO El alumno conocer y seleccionar la muestra til para realizar cada una de las pruebas de coagulacin indicadas para esta prctica y, mediante el conocimiento de los fundamentos de cada mtodo, aplicar la tcnica adecuada para obtener resultados confiables que reflejen el estado de salud o enfermedad del paciente respecto a la hemostasia. 4.3 MATERIALES 4. 3.1 Muestras biolgicas . Sangre venosa anticoagulada con EDTA obtenida con jeringa . Sangre venosa anticoagulada con citrato trisdico obtenida con jeringa . Plasma rico en plaquetas (PRP) obtenido de la muestra citratada . Plasma pobre en plaquetas (PPP) obtenido de la muestra citratada 4.3.2 Material por equipo 1 Gradilla 15 Tubos de ensaye (12x75) 6 Tubos de ensaye (13x100) 2 Pipetas Pasteur 2 Pipetas de vidrio de 1 ml (1/10) 1 Pipeta salhi con manguera y boquilla 1 Cmara de Neubauer 1 Caja Petri c/algodn (cmara hmeda) 1 Frasco con 10 ml de SSF (0,9%) 1 Propipeta 1 Tapn de hule para tubo 13x100 1 Contador 1 Cronmetro 1 Microscopio 1 Marcador indeleble 4.3.3 Material por grupo Baos para incubacin con gradilla Termmetros Gradillas Tubos de ensaye 15x150 Pipeta graduada de 1 ml (1/100) Pipetas graduadas de 1 ml (1/10) Pipetas graduadas de 5 ml Pipetas graduadas de 10 ml Propipetas Centrfuga (16 tubos) Balanza Frascos con agua y una jeringa Torundas Tubos capilares Lancetas Cuadros de parafilm para tubo 12x75 Cuadros de papel seda (5x5cm) Cuadros de papel filtro (2x5cm) Jeringas de 10ml c/aguja (21x32mm) Contenedor para punzocortantes Contenedor para desechos
4.3.4 Reactivos Solucin de EDTA al 5% Etanol al 70% Citrato trisdico al 3,8 % Determinaciones de TTPA Cloruro clcico (0,025M) Determinaciones de TP Oxalato de amonio al 1% 4.4 MTODOS Recomendaciones -Identificar perfectamente el material y los reactivos a utilizar. -Rotular en forma clara cada uno de los tubos de ensaye y revisar la jeringa a emplear. -Dosificar en un tubo 13x100 la cantidad necesaria de citrato trisdico al 3,8 % p ara 6ml de sangre. -Dosificar en un tubo 12x75 la cantidad necesaria de EDTA al 5% para 1ml de sang re. 4.4.1 Extraccin de sangre y procedimiento de separacin de muestras -Colocar el torniquete poco apretado y mantenerlo el menor tiempo. Al momento de la puncin deber causar el mnimo dao a los tejidos para evitar que la sangre se contamine con tromboplastina tisular. -Obtener 10 ml de sangre. -Utilizar los primeros 3 ml para la prueba de Tiempo de coagulacin (Ver procedimiento) -Vaciar 1ml en el tubo con EDTA tapar y mezclar por inversin. Utilizar esta muest ra para el conteo plaquetario. -Vaciar los 6ml restantes en el tubo con citrato trisdico, taparlo y mezclar bien por inversin. Centrifugar a 1.500 rpm/10 min y separar con una pipeta Pasteur 1ml del plasma rico en plaquetas (PRP), vaciarlo en tubo 13x100. El PRP se utiliza para el tiempo de coagulacin del plasma. -El resto de la muestra sangunea se centrifuga a 3.000 rpm/15 min y separar en tu bo 13x100 todo el plasma pobre en plaquetas (PPP). Esta muestra se utiliza para tie mpo de protrombina y tiempo de tromboplastina parcial activada. 4.4.2 Conteo plaquetario Fundamento. Se emplea sangre anticoagulada (con EDTA) la cual se diluye en Oxalato de amonio al 1% que lisa el resto de las clulas sanguneas para permitir el recuento de plaquetas en el hemocitmetro. Significado clnico: (Valor de referencia: 150.000-450.000 plaquetas/mm3) a) Trombocitopenia, trombopenia o plaquetopenia:
*Disminucin en la concentracin de las plaquetas, por debajo de 130.000/mm3, causas: i) Disminucin de la trombopoyesis: pancitopenia, anemia mieloctica ii) Trombopoyesis ineficaz: Trombopenias hereditaria, Hemoglobinuria paroxistica nocturna, Dficit de cido flico o de vitamina B 12 iii) Aumento de la destruccin de las plaquetas: Prpura trombcitopnica idioptica, Prpura trombtica trombocitopnica, Hiperesplenismo, Sepsis bacteriana, Coagulacin intravascular diseminada. b) Trombocitosis: *Aumento en la concentracin de plaquetas, por encima de 450.000/mm3, causas: i) Primarias: Trombocitemia esencial u otros sndromes mieloproliferativos. ii) Secundarios: esplenectoma, infecciones que cursan con una formacin de depsitos purulentos, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, neoplasias malignas. Procedimiento: -En un tubo (12x75) que contiene 1,98 ml de oxalato de amonio al 1 % fro, agregar 0,02 ml de sangre con pipeta de Sahli. -Tapar el tubo con papel parafilm y mezclar. -Refrigerar 15 min. -Llenar cmara de Neubauer y colocarla dentro de la cmara hmeda durante 5 min. -Limpiar la base de la cmara. -Observar al microscopio (10x), buscar la cuadrcula central. -Cambiar el objetivo a (40x) con baja intensidad de luz contar las plaquetas observadas. NOTA: Las plaquetas se observan en forma ligeramente alargada o circular y prese ntan refringencia. CALCULO = # de plaquetas contadas x FACTOR = # de plaquetas/ mm3 4.4.3 Tiempo de coagulacin Fundamento. Es el tiempo que tarda en formarse el cogulo en una muestra de sangre sin anticoagulante, al ponerse en contacto con una superficie de vidrio. Esta prueba permite la deteccin de trastornos en la va intrnseca o la va comn de la coagulacin. Significado clnico. Valor de referencia 5 -10 min. Se encuentran tiempos alargados en dficit de factores de la va intrnseca por ejempl o hemofilia, en casos de afibrinogenemia, en fibrinolisis excesiva y en terapias c on
heparina. Debido a esto ltimo la prueba se utiliza en el control de tratamientos heparnicos. Procedimiento -Rotular previamente 3 tubos de ensaye 13x100: del 1 al 3 -Vaciar en cada tubo 1ml de la sangre extrada, comenzando por el tubo 1, momento en el que se activa el cronmetro; cuidar que los tubos tengan el mismo volumen pa ra que la prueba sea vlida. -Incubarlos a 37 C en posicin vertical. -A los 4 min. sacar el tubo 1 y revisarlo inclinando suavemente, regresarlo a in cubar, seguir revisando cada 30seg y conforme transcurre el tiempo disminuirlo a 15seg mantenindolo el menor tiempo fuera de incubacin hasta detectar la coagulacin. -Ahora se revisar el tubo 2 de la misma forma y una vez coagulado ste revisar el tubo 3. -Finalmente se reporta el tiempo del tubo 3 que es el menos manipulado. 4.4.4 Tiempo de coagulacin de plasma (Test de Howell): Fundamento. Mide el tiempo que tarda en coagularse un plasma rico en plaquetas (PRP) cuando se vuelve a recalcificar. Significado clnico. Valor de referencia: 90-130segundos. La utilidad e interpretacin de la prueba son similares a las del tiempo de coagul acin, su nica ventaja, es que no se precisa realizarlo inmediatamente despus de la extraccin de la muestra. Procedimiento -Marcar tres tubos de ensaye 12x75 y depositar en cada tubo: -0,2 ml de PRP incubar a 37 C por 3 min. -Trabajar cada uno de los tubos de la siguiente manera: -Adicionar 0,2 ml de CaCl2 (0,025M) a 37 C, -Mezclar, cronometrar e incubar, revisar aproximadamente a los 40 seg. Continuar *** *** -Fuera del bao inclinar el tubo suavemente y cerca de una fuente de luz. *** -Observar la aparicin de los primeros filamentos de fibrina en las paredes de l tubo, esto indica el punto final de la prueba. *** -Detener el cronmetro y registrar el tiempo. Reportar el promedio de los 3 resultados.
4.4.5 Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA). Fundamento. Es el tiempo que tarda en coagular un PPP en presencia de un sustitu to del f3p que consiste en una suspensin de fosfolpidos, obtenidos a partir de cerebr o de conejo y se conoce como cefalina, pero adems contiene una sustancia activadora de los factores de contacto que puede ser: caoln, polvo de vidrio, elgico. Esta prueba sirve para explorar la va intrnseca y la va Significado clnico. Valores de referencia: 30-42 seg. Tiempos prolongados se presentan ante dficit de factores de la va el control de tratamientos con anticoagulantes, en concreto, de las heparina. Procedimiento -Marcar tres tubos de ensaye 12x75 y depositar en cada tubo: -0,1 ml de PPP e incubar a 37 C por 2 min. -Trabajar cada uno de los tubos de la siguiente manera: -Agregar 0,1ml de reactivo de TTPa, mezclar e incubar 2 min. a 37 C. -Agregar 0,1 ml de CaCl2 (0,025M) a 37 C, mezclar, cronometrar, incubar y leer aprox. a los 25 seg. Continuar *** 4.4.6 Tiempo de protrombina (TP) o Tiempo de Quick. Fundamento. Es el tiempo que tarda en coagular un PPP, cuando se pone en contacto con un exceso de calcio y de tromboplastina hstica obtenida a partir de extracto de cerebro o pulmn de conejo o humano. Esta prueba sirve para explorar a la va extrnseca y la va comn. Significado clnico. Valores de referencia: 11-15 seg. Tiempo de protrombina est alargado en pacientes con dficit de factores de la va extrnseca, en pacientes sometidos a terapias con dicumarinas y en pacientes que sufren algunos trastornos hepticos. Procedimiento -Marcar tres tubos de ensaye 12x75 y depositar en cada tubo: -0,1 ml de PPP e incubar a 37 C por 2 min. -Trabajar cada uno de los tubos de la siguiente manera: -Agregar 0,2 ml de reactivo de TP mezclar, cronometrar, incubar y leer aprox. a los 8 seg. Continuar *** 4.4.7 Tiempo de sangrado con la tcnica de Duke Fundamento. Es el tiempo que transcurre desde la lesin a un grupo de capilares hasta la formacin del trombo blanco plaquetario. Se determina efectuando una celite o cido comn. intrnseca y para terapias con
pequea herida estandarizada (3 mm de profundidad) y midiendo el tiempo que tarda en cesar el sangrado. Significado clnico. Valor de referencia: 1 -3 min. El tiempo de sangrado est alargado en las prpuras vasculares, en las trombocitopenias, en las trombopatas congnitas, en la enfermedad de von Willebrand y en los sujetos que han tomado acetilsaliclico. Procedimiento. -El lbulo de la oreja debe estar caliente ya sea frotndolo o aplicando compresa de agua caliente. -Limpiar con una torunda con alcohol (70 %). Dejar secar. -Hacer una incisin o herida de aprox. 3 mm de profundidad con una lanceta estril. -Al aparecer la primera gota de sangre cronometrar, dejarla que caiga sobre el p apel filtro o absorberla con ste, sin tocar la piel cada 15 30 segundos. -La muestra deja de tomarse cuando cesa la hemorragia. -Detener el cronmetro. Registrar el tiempo. 4.5 DISPOSICIN DE RESIDUOS Las agujas y lancetas se depositarn en contenedor para punzocortantes. Las jeringas con tapn, guantes, torundas y papel filtro con sangre desechar en contenedor para residuos biolgicos. Los tubos con muestras biolgicas se desechan en contenedores con hipoclorito de sodio al 6 %, que el laboratorista designar para tal fin.
4.7 RESULTADOS 4.7.1 Clculos 4.7.2 Tabla de Resultados Datos del Paciente Nombre______________________________________Edad______ Sexo____ Determinacin Resultado Valores de referencia Interpretacin Tiempo de sangrado Tiempo de coagulacin TCP TP TTPa Conteo plaquetario 41
PRCTICA No. 5. QUMICA SANGUNEA I Y GLUCOSA POSPRANDIAL Beatriz Gonzlez M. 5.1 MARCO TERICO La qumica sangunea est compuesta por una serie de pruebas de rutina que ayudan a evaluar el estado general del paciente y permite saber si se requiere alguna determinacin ms especializada. Para realizar estas pruebas es necesario realizar un ayuno de 8 a 10 horas, con la finalidad de que no afecta a la muestra la presencia de quilomicrones formados despus de la comida y que los analitos no se alteren por un ayuno prolongado. Asimismo, las muestras ictricas y hemolticas pueden alterar la determinacin. En un principio comprenda las determinaciones de glucosa en ayuno, urea, creatini na y cido rico. Actualmente, la qumica sangunea se realiza en los laboratorios como un perfil de hasta 30 analitos, que pueden incluir lpidos, protenas, enzimas y electrolitos. La glucosa en ayuno es la prueba principal para el diagnstico y seguimiento de la diabetes mellitus, aunque debe realizarse en dos ocasiones con 2 semanas de diferencia. De esta manera se ha propuesto la realizacin de la curva de toleranci a oral a la glucosa, que adems permite distinguir entre diabetes e intolerancia a l a glucosa; sin embargo, esta prueba requiere un mnimo de 4 tomas de muestra (en ayuno y 1 cada media hora u hora). Existe la alternativa de la glucosa posprandi al, que requiere 2 tomas de muestra (en ayuno y dos horas despus de la ingesta de alimentos ricos en carbohidratos), teniendo el inconveniente de que el desayuno que toma el paciente no est estandarizado por los laboratorios. Para esta prueba es necesario que el paciente lleve tres das antes una dieta de entre 150 g y 250 g d e carbohidratos, por ejemplo, 2 rebanadas de pan tostado con mermelada en el desayuno, comida y cena. La urea es un producto de desecho formado a partir del metabolismo de las protena s y junto con la creatinina, producto de la degradacin de la creatina a partir del metabolismo muscular, permiten la evaluacin del funcionamiento renal. A su vez, el cido rico es un producto de desecho del metabolismo de las purinas (adenina y guanina) que se utiliza en el diagnstico del sndrome gotoso, que consis te en la precipitacin de cristales de cido rico en las articulaciones, provocando inflamacin y dolor.
5.1.1 Informacin complementaria - Explique la utilidad de la ley de Lambert-Beer en la realizacin de la prctica. -Indique las longitudes de onda que conforman el rango UV-Visible en el espectro electromagntico. -Defina cada uno de los siguientes conceptos: Solucin patrn, Solucin blanco, Solucin control - Qu factores adems del ayuno pueden afectar a las determinaciones? 5.2 OBJETIVOS -El alumno conocer la importancia del rango UV-Visible del espectro electromagntico en las determinaciones de Qumica Clnica. -El alumno conocer el fundamento y la tcnica de las determinaciones, a travs de la realizacin de las mismas, para que con base a sus resultados valore el estado clnico del paciente. 5.3 MATERIALES 5.3.1 Muestra biolgica Suero obtenido en tubo al vaco de tapn rojo. Plasma obtenido con tubo al vaco de tapn lavanda. Nota: El desayuno que el paciente tomar inmediatamente despus de la primera toma de muestra es el siguiente: 250mL de jugo de naranja natural, un plato con cerea l azucarado en leche y un pltano, una rebanada de pan tostado con mermelada. 5.3.2 Material por equipo 1 gradilla 1 adaptador para tubos al vaco 1 tapn para tubo de ensaye 13x100 1 propipeta 15 tubos 12x75 1 pipeta graduado de 1 ml (1/100) 3 tubo de ensaye 13x100 5 puntas amarillas para micropipeta 2 pipetas pasteur con bulbo 1 cronmetro 5.3.3 Material por grupo Tubo al vaco de tapn rojo o dorado Recipiente para desecho RPBI Tubo al vaco de tapn lila Pipetas graduadas de 5 ml Aguja verde para tubo al vaco Pipetas graduadas de 1 ml Algodn para torundas Pisetas con agua destilada Aplicador de madera Centrfuga Papel parafilm Balanza Gasas Micropipeta de 5 a 40 ul Espectrofotmetro UV-Visible Micropipeta de 5 a 50 ul Celdas para espectrofotmetro Bao de agua Vaso de precipitado de 250 ml Contenedor para punzocortantes Agitador vrtex Termmetro
45 5.3.4 Reactivos Alcohol para las torundas Agua destilada Hipoclorito de sodio Kit para determinacin de: - glucosa - creatinina - urea - cido rico 5.4 MTODOS 5.4.1 Glucosa: mtodo enzimtico colorimtrico Fundamento D-glucosa + O2 + H2O2 cido glucnico + H2O2 H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol 4-(p-benzoquinona-iminofenazona) + 2H2O quinonimina roja (. = 505 nm) GOD: glucosa oxidasa; POD Peroxidasa Significado clnico. El valor de referencia de la glucosa en ayuno es de 60 100 mg/dl. La determinacin de glucosa apoya al diagnstico y seguimiento de la diabetes mellitus; puede existir hiperglucemia en alteraciones hipofisiarias (acromegalia , Sndrome de Cushing), tiroideas, traumatismos. La hipoglucemia se presenta en ayunos prolongados, por efecto del tratamiento errneo de diabetes, posterior a la ingesta prolongada de etanol, cuando hay insulinoma o enfermedades crnicas hepticas. El valor de referencia de la glucosa posprandial es hasta 140 mg/dl. La realizac in de glucosa posprandial apoya al diagnstico de estados prediabticos y de diabetes mellitus. Procedimiento La tcnica de las determinaciones que se realizarn en la presente y siguiente prcticas son diferentes de acuerdo al fabricante de los reactivos utilizados. Generalmente siguen el siguiente esquema: Blanco Patrn Muestra RT (ml) Patrn (.l) Muestra (.l) que indica el uso de soluciones blanco, patrn y muestra, que son tratados bajo la s misma condiciones de incubacin y lectura de longitud de onda. Para la descripcin d e GOD POD
46 las tcnicas es necesario consultar el manual de uso (inserto) de los reactivos a utilizar, verificando su vigencia. 5.4.2 Creatinina: mtodo de Jaff Fundamento Creatinina + cido pcrico Picrato de creatinina Significado clnico. El valor de referencia para mujeres es de 0,6 a 1,1 mg/dl y p ara hombres es de 0,7 a 1,4 mg/dl. La creatinina es el mejor indicador de la funcin r enal. Aumenta en sangre cuando hay alteraciones glomerulares, necrosis o atrofia del msculo esqueltico, hipertiroidismo y durante el puerperio. 5.4.3 Urea Fundamento: mtodo colorimtrico Urea + H2O CO2 + 2NH4 + NH4 + + salicilatos + hipoclorito indofenol (570 nm) Fundamento: mtodo de la ureasa-UV Urea + H2O CO2 + 2NH4 + NH4 + + .-cetoglutarato + NADH (340 nm) + H+ NAD+ + glutamato GLDH: glutamato deshidrogenasa Significado clnico. El valor de referencia es de 10 a 45 mg/dl. La hiperuremia (azoemia) puede clasificarse en: -prerrenal: deshidratacin; shock; disminucin del volumen sanguneo, fallo cardiaco, catabolismo incrementado de las protenas (fiebre, estrs y quemaduras) -renal: enfermedad renal crnica, deshidratacin, catabolismo incrementado de las protenas -postrenal: obstruccin del tracto urinario La hipouremia se manifiesta en alteraciones hepticas, mala nutricin, ingesta alta de lquidos y en el embarazo. 5.4.4 cido rico Fundamento cido rico + O2 + H2O Alantona + H2O2 + CO2 H2O2 + 4-aminoantipirina + DCBS quinonimina roja (. = 505 nm) + H2O DCBS: dicloro bencensulfnico Medio alcalino Ureasa Ureasa Uricasa POD GLDH
Significado clnico. El valor de referencia es de 2,5 a 7,5 mg/dl. La hiperuricemi a primaria se observan cuando hay defectos enzimticos hereditarios; la hiperuricemi a secundaria se presenta en insuficiencia renal; en gota, litiasis renal, insufici encia renal, sndrome de Lesh Nyhan y preeclamsia. La hipouricemia se manifiesta cuando hay dieta baja en purinas, tratamiento excesivo con alopurinol, sndrome de Fanconi (defectos de la resorcin tubular), enfermedad heptica. 5.5 DISPOSICIN DE RESIDUOS - Las agujas deben depositarse en el contenedor rojo para punzocortantes. - Los algodones manchados ligeramente de sangre se depositan en la bolsa de basu ra municipal. En caso de que se presenten algodones empapados en sangre deben depositarse en la bolsa roja. -Los guantes de ltex y las servitoallas deben depositarse en la bolsa de basura municipal. -Los tubos con cogulos de sangre y muestras biolgicas deben depositarse en el recipiente con cloro que dispondr el laboratorista para tal fin.
5.7 RESULTADOS 5.7.1 Clculos 5.7.2 Tabla de Resultados Datos del Paciente Nombre______________________________________Edad______ Sexo____ Determinacin Resultado Valor de referencia Observaciones Glucosa en ayuno Glucosa posprandial Creatinina Urea cido rico
PRCTICA No. 6. QUMICA SANGUNEA II Ren Damin S. 6.1 MARCO TERICO Como se explic en la Qumica Sangunea I, los perfiles de esta pueden abarcar hasta 30 determinaciones, de las que se realizaron Glucosa, Urea, Creatinina y cido rico . En la presente prctica se determinarn analitos que estn relacionados con el hgado, que se encuentra en el cuadrante superior derecho del organismo, est dividido en dos lbulos desiguales unidos por el ligamento falciforme y tiene una irrigacin de 1500 ml de sangre por minuto. Se estima que lleva a cabo ms de 500 actividades diferentes entre las que se encuentran: a) Metabolismo de carbohidratos, lpidos, aminocidos y protenas, bilirrubina, hormonas, vitaminas b) Almacenamiento de glucgeno, lpidos, aminocidos y protenas, hierro, cobre, vitaminas c) Sntesis de protenas, tales como albmina, protenas de fase aguda, entre otras d) Biotransformacin de toxinas, alcohol, frmacos, bilirrubina, esteroides, otras hormonas e) Hematolgica debido a la produccin de factores de coagulacin y de eritrocitos en el feto f) Excrecin de cidos biliares, colesterol y bilirrubina a travs de la bilis, g) Inmunolgica: Fagocitosis (clulas de Kupffer), secrecin de IgA, produccin de factores del complemento, adems de formar parte del sistema fagoctico mononuclear. Debido a la diversidad de funciones de este rgano, no hay un analito nico que permita evaluar su funcionamiento general. Los analitos que se determinarn durant e la prctica pueden alterarse debido a patologas no relacionadas con el hgado, por lo tanto el diagnstico debe realizarse considerando todos los datos clnicos y de laboratorio. De esta manera observamos que: a) protenas totales, albmina, relacin A/G, colesterol, triglicridos y lpidos totales evalan la capacidad de sntesis y metabolismo heptico; los tres primeros adems apoyan a demostrar el estado nutricional del paciente o la posibilidad de que se presente sndrome nefrtico, mientras que los ltimos determinan el riesgo aterognico e hipertensin;
b) bilirrubinas directa, indirecta y total son pruebas que valoran la biotransfo rmacin y excrecin heptica, conjuntamente indican el origen de la ictericia. 6.1.1 Informacin complementaria - Investigue el metabolismo completo (formacin a eliminacin) de las bilirrubinas. -Cul es la estabilidad y condiciones de almacenamiento de cada uno de los analitos que se evaluarn? -Cul es el tiempo mximo de ayuno para realizar las determinaciones? Por qu? 6.2 OBJETIVOS -El alumno conocer el fundamento y la tcnica de las determinaciones, a travs de la realizacin de las mismas, para que obtenga resultados confiables. -El alumno conocer la importancia clnica de las determinaciones y con base a sus resultados valore el estado clnico del paciente. 6.3 MATERIALES 6.3.1 Muestra biolgica Suero obtenido en tubo de tapn rojo o dorado 6.3.2 Material por equipo 1 gradilla 1 propipeta 5 tapones para tubo de ensaye 13x100 1 pipeta graduado de 1 ml (1/100) 18 tubos 12x75 5 puntas amarillas para micropipeta 5 tubos de ensaye 13x100 5 puntas azules para micropipeta 1 pipetas pasteur con bulbo 1 cronmetro 1 adaptador para tubos al vaco 6.3.3 Material por grupo Tubo al vaco de tapn rojo o dorado Micropipeta de 5 a 40 ul Aguja verde para tubo al vaco Micropipeta de 5 a 50 ul Algodn para torundas Bao de agua Aplicador de madera Termmetro Gasas Papel parafilm Espectrofotmetro UV-Visible Centrfuga Vaso de precipitado de 250 ml Recipiente para desechos (RPBI) Agitador vrtex Contenedor para punzocortantes Mechero Bunsen Pisetas con agua destilada Tripie Pipetas graduadas de 1 ml Tela de asbesto Pipetas graduadas de 2 ml Pinzas para tubo de ensaye Pipetas graduadas de 5 ml
53 6.3.4 Reactivos Kit para determinacin de - protenas totales - albmina - colesterol - triglicridos - lpidos totales - bilirrubinas Alcohol para las torundas Agua destilada Hipoclorito de sodio 6.4 MTODOS NOTA: Para conocer el procedimiento para todas las tcnicas utilizadas en esta prctica es necesario consultar el manual de uso (inserto) de los reactivos disponibles en el laboratorio. 6.4.1 Protenas totales: mtodo del Biuret Fundamento Protenas + Cu2+ Complejo azul violeta (. = 560 nm) Significado clnico. El valor de referencia es 6,1 7,9 g/dl. La hiperproteinemia puede presentarse durante la deshidratacin o diarrea grave. La hipoproteinemia se observa en inanicin o mala absorcin (desnutricin), hepatopatas, sndrome nefrtico, hemorragias. 6.4.2 Albmina: mtodo de verde bromocresol Fundamento Albmina + Verde de bromocresol (VBC) Complejo albmina-VBC (. = 600 nm) Significado clnico. El valor de referencia es 3,5 4,8 g/dl. La albmina es el principal indicador nutricio-proteico. La hiperalbuminemia se manifiesta durante la deshidratacin. La hipoalbuminemia se presenta en alteraciones hepticas, donde puede apoyar a determinar la gravedad y pronstico de enfermos crnicos; tambin se observa en alteraciones renales y gastrointestinales. Con estas determinaciones es posible determinar la cantidad de globulinas, considerando que la suma de estas con la albmina es igual a las protenas totales. La relacin A/G se define como el cociente de la albmina entre las globulinas (protenas totales menos la albmina). 6.4.3 Colesterol: mtodo enzimtico colorimtrico Fundamento steres de colesterol + H2O Colesterol + cido graso Colesterol + O2 Colest-4-en-3-ona + H2O2 Medio alcalino CEH COx Medio alcalino
54 H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol quinonimina roja (. = 505 nm) + 2H2O CEH: Colesterol ster hidrolasa; COx: Colesterol oxidasa; POD: Peroxidasa Significado clnico. El valor de referencia es 60 200 mg/dl. La determinacin de colesterol en forma aislada tiene utilidad diagnstica limitada. La hipercolestero lemia se ha relacionado con la formacin de placas aterosclerticas, con pacientes hipertensos y obesos, en los cuales se incrementa el riesgo de enfermedad cardia ca coronaria. La hipocolesterolemia puede relacionarse con alteraciones en la sntesi s de hormonas esteroideas. 6.4.4 Triglicridos: mtodo enzimtico colorimtrico Fundamento Triglicridos glicerol + cidos grasos Glicerol + ATP glicerol-1-P + ADP Glicerol-1-P + O2 H2O2 + Dihidroxiacetona fosfato 2 H2O2 + 4-aminofenazona + clorofenol quinonimina roja (. = 505 nm) GK: Glicerolcinasa; GPO: glicerol fosfato oxidasa; POD: Peroxidasa Significado clnico. El valor de referencia es 50 150 mg/dl. La hipertrigliceridem ia es un factor riesgo en enfermedades aterosclerticas. Su medicin es importante en e l diagnstico y manejo de hiperlipidemias, que pueden ser de origen gentico o estar relacionadas con nefrosis, diabetes mellitus y disfunciones endocrinas. 6.4.5 Lpidos totales: mtodo de cido fosfrico vainillina Fundamento Lpidos + H2SO4 Cetonas Cetonas + cido fosfrico-vainillina complejo rosa (. = 505 nm) Significado clnico. El valor de referencia es 450 850 mg/dl. El inters en su estud io se debe a su conexin entre hiperlipemia y aterosclerosis, diabetes y enfermedad cardiaca. 6.4.6 Bilirrubinas: mtodo de Van den Bergh Fundamento Bilirrubina directa + cido sulfanlico diazotado azobilirrubina Bilirrubina total + desarrollador + cido sulfanlico diazotado azobilirrubina (. = 530 nm) POD Lipoprotein lipasa GK GPO POD .
Significado clnico. Los valores de referencia son: Bilirrubina directa hasta 0,2 mg/dl, Bilirrubina indirecta hasta 0,8 mg/dl, Bili rrubina total hasta 1,0 mg/dl. La determinacin de bilirrubinas apoya a la evaluacin y clasificac in de la ictericia (hiperbilirrubinemia): Ictericia Defecto fisiolgico Ejemplos de etiologa Preheptica no conjugada Produccin excesiva de bilirrubina Ictericia hemoltica Heptica no conjugada Transporte defectuoso de la bilirrubina Deficiencia de la glururoniltransferasa Sndrome de Gilbert Sndrome de Crigler-Najjar Heptica conjugada: Hepatocelular: lesin del parnquima Hepatocanalicular: parecida a la obstructiva Hepatitis vrica o txica; cirrosis Cirrosis biliar primaria; hepatitis Postheptica conjugada: Obstruccin mecnica del rbol biliar Carcinoma del pncreas o del coldoco; coledocolitiasis 6.5 DISPOSICIN DE RESIDUOS - Las agujas deben depositarse en el contenedor rojo para punzocortantes. - Los algodones manchados ligeramente de sangre se depositan en la bolsa de basu ra municipal. En caso de que se presenten algodones empapados en sangre deben depositarse en la bolsa roja. -Los guantes de ltex y las servitoallas deben depositarse en la bolsa de basura municipal. -Los tubos con cogulos de sangre y muestras biolgicas deben depositarse en el recipiente con cloro que dispondr el laboratorista para tal fin. 55
6.7 RESULTADOS 6.7.1 Clculos 6.7.2 Tabla de resultados Datos del Paciente Nombre______________________________________Edad______ Sexo____ Determinacin Resultado Valor de referencia Observaciones Protenas totales Albmina Relacin A/G Colesterol Triglicridos Lpidos totales Bilirrubina directa Bilirrubina indirecta Bilirrubina total
PRACTICA No. 7 URIANLISIS Leticia Arellano M. 7.1 MARCO TERICO La orina es un filtrado del plasma sanguneo que prcticamente no contiene protenas. La formacin de orina comprende los complejos procesos de filtracin de la sangre, reabsorcin de sustancias esenciales incluyendo el agua y secrecin tubular de ciert as sustancias. Despus de la formacin en el rin, la orina pasa por el urter hacia la vejiga en donde es almacenada temporalmente antes de ser excretada a travs de la uretra. En promedio un adulto joven elimina entre 800 a 1.500 mL en 24 horas. Algunos padecimientos renales o extra-renales modifican las caractersticas fsicas y qumicas de la orina, lo que constituye un indicador importante del estado de salu d. El anlisis de rutina de la orina conocido tambin como urianlisis o examen general de orina, incluye una serie de pruebas de deteccin que permiten descubrir algunos de los padecimientos arriba mencionados. La calidad del urianlisis comienza con una adecuada recoleccin de la muestra de orina, la cual debe realizarse (previa asepsia de genitales) en un recipiente li mpio y seco de preferencia desechable. Para realizar el urianlisis se pueden utilizar muestras emitidas a cualquier hora del da, sin embargo la muestra ms recomendada es la primera orina de la maana, porque es ms concentrada y es ms probable que revele anormalidades. Como la orina contiene sustancias orgnicas e inorgnicas que favorecen la reproduccin bacteriana, se recomienda realizar el urianlisis en orina fresca, de s er posible dentro de los 30 minutos despus de colectada. 7.1.1 Informacin complementaria -Qu indicaciones se le deben de dar a un al paciente que se le realizar un urianlisis? -Cul es la composicin de la orina? -Qu son y en donde se forman los cilindros?
-Qu significa: anuria, poliuria, oliguria, hematuria y cetonuria? 7.2. OBJETIVO El alumno interpretar los resultados emitidos de un urianlisis, relacionando la importancia de la adecuada recoleccin de la muestra de orina, el conocimiento del fundamento de las determinaciones realizadas y la identificacin al microscopio de las estructuras presentes en la orina centrifugada, a fin de descartar alguna enferm edad. 7.3 MATERIALES 7.3.1 Muestra biolgica50 mL de orina recin emitida 7.3.2 Material por equipo de trabajo 3 Tubos de ensaye 13x100 mm 1 Bomba de succin para pipeta Pasteur 1 Gradilla para tubos de ensaye 1 Microscopio ptico compuesto 1 Pipeta Pasteur 7.3.3 Material por grupo Centrfuga con capacidad para tubos de ensaye Portaobjetos 13x100 mm y 2000-3000 rpm. Cubreobjetos Balanza granataria Papel seda para limpiar lentes Piseta con agua destilada del microscopio 7.3.4 Reactivos Tira reactiva para anlisis de orina. 7.4 METODOS -Homogenizar y permitir que la muestra de orina a este a temperatura ambiente antes de realizar el estudio. -Rotular dos tubos 13x100 mm (tubo 1 y tubo 2). Trasvasar aproximadamente 6 mL de orina a cada tubo. 7.4.1. Anlisis fsico de la orina Fundamento La determinacin se basa en la observacin macroscpica de la muestra de orina a fin de detectar alguna alteracin en su aspecto o color. Significado Clnico En la mayora de los casos es escasa la informacin que aporta est determinacin, debido a que la orina normal habitualmente es clara y presenta una amplia gama d e colores, debida a la presencia de pigmentos urocrmicos (urobilina y uroeritrina). Sin embargo existen muchos factores patolgicos y no patolgicos que pueden alterar el color y aspecto normal de la orina.
La orina es muy plida o incolora entre otras cosas debido a un elevado consumo de lquidos o a estados patolgicos como la diabetes mellitus. La causa ms comn del color rojo de la orina es la presencia de eritrocitos (hematuria), aunque tambin puede deberse a la presencia de hemoglobina libre o mioglobina. La orina de color castao a negro puede deberse a la excrecin de cido homogenstico, caracterstico de la alcaptonuria. Los pacientes que tienen ictericia obstructiva excretan pigmentos biliares como la bilirrubina, y la orina es de color castao-amarillento a verde-amarillento. En cuanto a la turbidez de la orina, puede ser debida a la presencia de cristale s, leucocitos, clulas epiteliales, bacterias, moco o grasa. Procedimiento -Se puede emplear cualquiera de los dos tubos. Observar el aspecto (presencia o no de turbidez) y color de la orina. Anotar resultados. 7.4.2 Anlisis qumico de la orina El anlisis qumico de la orina empleando tiras reactivas es un mtodo sensible y rpido que ayuda a identificar alteraciones en la composicin de la orina. La tira reactiva es una banda de plstico con pequeos cuadros de papel impregnados con los reactivos necesarios para identificar diferentes analitos en una misma tira. Fundamento -pH. Utiliza dos indicadores, rojo de metilo y azul de bromotimol que cubren la escala de pH que va del 5 al 9. -Glucosa. Se basa en la determinacin enzimtica con glucosa oxidasa, que sigue las mismas reacciones que el mtodo enzimtico colorimtrico para glucosa, empleado en la qumica sangunea 1. -Protenas. Se basa en el cambio de color (de amarillo a azul), del indicador azul de tetrabromofenol en presencia de protenas. -Sangre oculta. Se basa en la actividad tipo peroxidasa de la hemoglobina que cataliza la oxidacin del indicador tetrametilbencidina por la accin de perxido de hidrgeno. -Cetona. La tira reactiva contiene nitroprusiato de sodio que en medio alcalino forma un complejo color castao con el cido diactico. -Nitritos. El nitrito en presencia de una sulfanilamida genera un sal de diazoni o que al reaccionar con una tetrahidrobenzoquinolina produce un colorante azoico de color rojo.
-Gravedad especfica. Se basa en el cambio de pKa de algunos polielectrlitos, con lo que se mide la concentracin inica de la orina, lo cual esta relacionado con el peso especfico. -Bilirrubina. Se basa en la reaccin de acoplamiento de la bilirrubina con una sal de diazonio. -Urobilingeno. Se basa en la reaccin que se lleva a cabo entre el urobilingeno y el dimetilaminibenzaldehido, generando un complejo color amarillo castao. -Leucocitos. La prueba detecta la presencia estearasa leucocitria, esta enzima hidroliza el ster del cido indoxilocarbnico que a su vez, reacciona con el indicador bromosulfoftalena produciendo un color morado. Significado Clnico -pH. El pH de la orina es ligeramente cido alrededor de 6. No existiendo un intervalo normal, ya que puede cambiar de cida a bsica, por factores tales como la dieta. -Glucosa. La presencia de cantidades significativas de glucosa en la orina se ll ama glucosuria. La principal causa de glucosuria es un elevado nivel de glucosa en sangre, ya que por lo general la glucosa aparece en la orina cuando el nivel de glucosa en sangre supera los 160-180 mg/dL, cifra que se conoce como el umbral renal de la glucosa. -Protenas. En condiciones normales existe una mnima cantidad de protenas de bajo peso molecular en la orina (< 20 mg/dL). La presencia de una concentracin elevada de protenas en la orina puede constituir un ndice de enfermedad renal. -Sangre oculta. Se denomina as porque es sangre que no se aprecia a simple vista (microhematuria) y el color de la muestra no resulta afectado. Puede presentarse hematuria en enfermedades renales o lesiones del tractor urinario inferior. -Cetona. Los cuerpos cetnicos se forman durante el catabolismo de los cidos grasos. Cuando la capacidad de los tejidos para utilizar los cuerpos cetnicos es superada, el exceso se excreta en la orina. Lo anterior sucede en casos de inges ta baja de hidratos de carbono, enfermedades como la diabetes mellitus y en la eclampsia entre otros. -Nitritos. La determinacin de nitritos por tira reactiva es un mtodo rpido e indirecto para el diagnstico de bacteriuria e identifica la presencia de bacteria s que reducen el nitrato de la orina a nitrito (Ej. E. coli, Citrobacter, Klebsiel la). -Gravedad especfica. Constituye un ndice del material disuelto en la orina. El intervalo normal vara de 1.003 1.035. Algunas de las causas que producen
aumento del peso especfico son las siguientes: deshidratacin, proteinuria, glucosuria y eclampsia. -Bilirrubina. Normalmente en la orina no existen cantidades detectables de bilirrubina. La presencia de bilirrubina en orina se debe a la presencia de icte ricia por aumento de bilirrubina conjugada. -Urobilingeno. A diferencia de la bilirrubina, existen una pequea cantidad de urobilingeno en la orina (1 unidad Erlich / 100 mL de orina) y su elevacin puede indicar dao heptico. -Leucocitos. En condiciones normales los leucocitos no son detectables por tira reactiva. La tira reactiva dar positiva, solo si existe una cantidad abundante de leucocitos, lo cual se puede deber a la presencia de procesos infecciosos o inflamatorios del tracto urinario. Procedimiento -Emplear el tubo No. 1 y una tira reactiva para urianalisis. -Sumergir la parte reactiva de la tira en el tubo y retirar inmediatamente, teni endo cuidado de retirar el exceso de orina sobre papel absorbente. -Leer los resultados para cada parmetro en el tiempo indicado en la etiqueta del frasco y comparando los resultados con la escala de colores indicada en la etiqueta. El tiempo de lectura no debe exceder de dos minutos. -Debido a que se trata de una determinacin semicuantitativa, los resultados se reportan como negativo (-) o positivo (+) y en caso de ser positivo puede reportarse con +, ++, +++ o ++++, en funcin de la intensidad del color generado. -Anotar resultados. Nota: Las tira reactiva debe mantenerse en el envase original con el desecante y extraerla hasta el momento de emplearla cuidando de no tocar las bandas reactiva s con los dedos y tapar el frasco inmediatamente despus de extraer la tira. 7.4.3 Anlisis del sedimento de la orina El examen del sedimento urinario es una herramienta diagnstica valiosa para la deteccin y evaluacin de trastornos renales y del tracto urinario. El valor de esta prueba depende de una muestra adecuada y del conocimiento de la persona que realiza el estudio. Significado Clnico En condiciones normales la orina es transparente prcticamente no contiene partcula s en suspensin. Sin embargo en algunos casos patolgicos y no patolgicos, se
pueden encontrar estructuras tan diversas como clulas, cilindros, cristales y cue rpos extraos generados por algn medicamento. Clulas. Eritrocitos: Se pueden encontrar de 2-3 por campo y en o de vas urinarias. Leucocitos. Es normal encontrar de 1-2 por campo, pero como infeccin o inflamacin de vas urinarias. Clulas Epiteliales. Provienen de las vas urinarias y -Clulas epiteliales pavimentosas, son clulas grandes gran nmero indican sangrad se incrementan en casos pueden ser: de ncleo pequeo y
provienen de vas urinarias bajas o epitelio vaginal. -Clulas epiteliales piriformes, ms pequeas que las pavimentosos, con un apndice en forma de cola y provienen de vas urinarias altas. Cilindros. Los cilindros son precipitados de protena que pueden o no agrupar clulas o algn otro material y se forman en los tbulos contorneados, razn por la que adquieren su nombre y forma. En funcin de la composicin del cilindro, se pueden encontrar cilindros hialinos, cilindros eritrocitarios, cilindros leucocitarios, cilindros granulosos, cilindros de clulas epiteliales y cilindros cilindros grasos. Cristales. Por lo general no se encuentran cristales en la orina recin emitid, pero aparecen dejndola reposar un tiempo. La presencia de abundantes cristales en la orina resu lta importante en el caso de sospecha de clculos renales o trastornos s. Entre los cristales ms importantes se encuentran los de tirosina, leucina o sulfamida. Como la formacin de cristales depende del pH de la orina, en general se clasifican como: cristales de orina cida y cristales de orina bsica. Cristales de orina cida: Cristales de cido rico. Se presentan en casos como la gota, enfermedades febriles o nefritis. Cristales de oxalato de calcio. Pueden aparecer despus de la ingesta de alimentos ricos en oxalatos y en diabetes mellitus o en alguna enfermedad renal crnica. Cristales de uratos de sodio. Carecen de significado clnico. Cristales de cistina. Aparece en pacientes que presentan cistinuria sistmica. Cristales de orina alcalina:
Cristales de fosfato triple. Se llegan a encontrar en orinas normales, pero tamb in pueden aparecer en algunos procesos patolgicos como cistitis crnica o clculos renales. Cristales de fosfato amorfo. Carecen de significado clnico. Cristales de fosfato de calcio. Pueden estar presentes en caso de clculos renales . Procedimiento -Tapar el tubo No. 2 con papel parafilm y centrifugar a 2500 rpm durante 5 minut os. -Despus de centrifugar, decantar el sobrenadante, dejando aproximadamente 0.5 mL del mismo para resuspender el sedimento. -Con ayuda de una pipeta Pasteur colocar una gota de sedimento resuspendido y cubrirla con un cubreobjetos. -Enfocar en el microscopio primero con el objetivo de 4x y despus con el de 10x (seco dbil) para enfocar la imagen. -Cambar al objetivo de 40x y revisar 15 campos. -Reportar tipo y nmero de estructuras encontradas por campo. En el caso de que las estructuras sean muy abundantes. Se reportar escasos, moderados o abundantes. -Anotar resultados. Nota: Traer para el da se la prctica un atlas de sedimento urinario o laminillas d e color para ayudar a identificar las estructuras encontradas. 7.5 DISPOSICION DE RESIDUOS -La muestra de orina ser desechada en el inodoro, teniendo cuidado de bajar la palanca despus de desecharla. -La tira reactiva empleada en el anlisis qumico deber tirarse en el contenedor con bolsa roja de riesgo biolgico. -El contenedor para la recoleccin de la muestra de orina deber sumergirse durante 15 minutos en un recipiente con una solucin de hipoclorito de sodio y posteriormente desecharse en el bote de la basura. -Los guantes desechables as como el papel secante empleado para retirar el exceso de orina, debern colocarse en el bote de la basura del laboratorio.
7.7 RESULTADOS Datos del Paciente Nombre______________________________________Edad______ Sexo____ Anlisis Fsico Determinacin Resultado Valor de Referencia Observaciones Color Aspecto Anlisis Qumico Determinacin Resultado Valor de Referencia Observaciones Glucosa Protenas Sangre Cetona Bilirrubina Gravedad especfica pH Urobilingeno Nitrito Leucocitos Anlisis de sedimento Resultado Valor de Referencia Observaciones Eritrocitos Leucocitos Otras estructuras
REFERENCIAS 1. (1986) Bauer, John D. Anlisis clnicos; mtodos e interpretacin. 9 Ed. Ed. Revert Mxico 1302 p. p. 2. (1970) Gradwohl, Rutherford Birchard Hayes. Gradwohl s clinical laboratory methods and diagnosis. 7 Ed. Ed. Mosby, USA 3. (1987) Graff, Sister Laurine . Anlisis de orina. Atlas color. Ed. Mdica Panamericana, Argentina. 226 p. p. 4. (1993) Henry, Bernard. Diagnostico y tratamiento clinicos por el laboratorio. Ed . Cientifica y Tecnicas. Espaa 1509 p.p. 5. (2001) Henry, John Bernard. Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 20th Ed. W.B. Saunders Co. U.S.A. 6. (2000) Mckenzie, Shirlyn B. Hematologia clinica. 2 Ed Manual Moderno. Mxico. 873 p. p. 7. (1999) Radillo Gonzlez, Alfredo. Medicina Transfusional. Ed. Prado, Mxico. Cap. 1, 2 y3. 8. (2006) Rojas Espinoza, Oscar. Inmunologa de memoria. 3. Ed. Mdica Panamericana, Mxico. pp. 351-367. 9. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-003-SSA2-1993 10. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-087-ECOL-SSA1-2002

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS SECCION CIENCIAS DE LA SALUD HUMANA

1.6 DIAGRAMA DE FLUJO

1.8 DISCUSIN 1.9 CONCLUSIONES 1.10 REFERENCIAS CONSULTADAS

2.6 DIAGRAMA DE FLUJO

2.8 DISCUSIN 2.9 CONCLUSIONES 2.10 REFERENCIAS

3.8 DISCUSIN 3.9 CONCLUSIONES 3.10 REFERENCIAS

4.6 DIAGRAMA DE FLUJO

4.8 DISCUSIN 4.9 CONCLUSIONES 4.10 REFERENCIAS CONSULTADAS

5.6 DIAGRAMA DE FLUJO

5.8 DISCUSIN 5.9 CONCLUSIONES 5.10 REFERENCIAS

6.6 DIAGRAMA DE FLUJO

6.8 DISCUSIN 6.9 CONCLUSIONES 6.10 REFERENCIAS CONSULTADAS

7.6 DIAGRAMA DE FLUJO

7.8 DISCUSIN 7.9 CONCLUSIONES 7.10 REFERENCIAS CONSULTADAS

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