UNIVERSIDADE DE SO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR E BIOAGENTES PATOGNICOS

II CURSO DE VERO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

APOSTILA DIDTICA
Princpios e Aplicaes das Principais Metodologias em Biologia Celular e Molecular

Ribeiro Preto Janeiro 2005

II CURSO DE VERO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR E BIOAGENTES PATOGNICOS FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRO PRETO USP 17 A 29 DE JANEIRO DE 2005

APOSTILA DIDTICA PRINCPIOS E APLICAES DAS PRINCIPAIS METODOLOGIAS UTILIZADAS EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

ORGANIZAO
Profa. Dra. Angela Kaysel Cruz (Coordenadora da Ps-graduao) Alana Maria Cerqueira de Cataln Ana Isabela Lopes Sales Carol Kobori da Fonseca Deise Cristina Poleto Humberto Freire Boncristiani Jr. Lvia Maria Rosatto Moda Marlei Josieli Agusto Reginaldo Donizeti Rossi Shirlei Octaclio da Silva Stella Felippe de Freitas

REALIZAO
Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patognicos da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto USP

APOIO
FAEPA CAPES/PROAP

AGRADECIMENTOS

Agradecemos a todos os professores que contriburam para a elaborao dessa apostila e para a realizao do II Curso de Vero de Biologia Celular e Molecular da FMRPUSP: Ademilson Panunto Castelo Angela Kaysel Cruz Constance Oliver Claudia Maria Leite Maffei Cludio Roberto Simon Eduardo M. Laicine Enilza Maria Espreafico Eurico de Arruda Neto Jorge Cury de Almeida Jorge E. Moreira Jos Csar Rosa Lewis Joel Greene Luiz Ricardo Orsini Tosi Marcelo Brocchi Maria Clia Jamur Maria Cristina Roque A Barreira Maria Luisa Pa-Larson Nadia Monesi Paulo Srgio Rodrigues Coelho Ricardo G.P. Ramos Richard J. Ward Roy E. Larson Rubens Bertazolli-Filho Wilson Arajo da Silva Jnior

PREFCIO

Essa apostila parte do material didtico do II Curso de Vero de Biologia Celular e Molecular da rea de ps-graduao em Biologia Celular e Molecular da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto USP. Um dos objetivos do curso a divulgao de conhecimento cientfico e das principais abordagens tcnicas utilizadas na rea. Na parte terica do curso sero discutidos os principais temas da Biologia Celular e Molecular, abordando conceitos j bem estabelecidos e questes em discusso na literatura atual sobre a estrutura e funo dos componentes celulares e as principais vias de regulao do funcionamento celular. A parte prtica ser constituda de mini-cursos prticos que visam colocar o aluno em contato com algumas das abordagens metodolgicas utilizadas na produo do conhecimento nessa rea. Embora, existam inmeras abordagens na investigao cientfica em Biologia Celular e Molecular, cada mini-curso tem um objetivo especfico e portanto, abordar apenas um determinado conjunto de metodologias. O objetivo da apostila fornecer conhecimento bsico sobre os princpios e aplicaes de grande parte das metodologias utilizadas na rea. Assim, cada aluno ter acesso s informaes sobre as principais tcnicas utilizadas durante o curso de vero, mesmo aquelas com as quais no ter contato prtico durante o mini-curso para o qual foi selecionado. Alm disso, a apostila certamente fornecer subsdios para uma melhor compreenso das abordagens que os alunos estaro utilizando em seus mini-cursos.

NDICE I. TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE ............................................................................. 7 INTRODUO .......................................................................................................................... 8 CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR............................................................................. 8 ENZIMAS DE RESTRIO ...................................................................................................... 9 CONSTRUO DO DNA RECOMBINANTE .......................................................................... 11 DNA LIGASE........................................................................................................................... 12 TRANSFORMAO BACTERIANA ....................................................................................... 12 VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR ............................................................................ 13 CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE................................ 17 BIBLIOTECA DE cDNA........................................................................................................... 18 BIBLIOTECA GENMICA....................................................................................................... 19 II. ANLISES DE DNA............................................................................................................... 21 INTRODUO ........................................................................................................................ 22 ELETROFORESE DE DNA..................................................................................................... 22 ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE) ............................................................... 23 SOUTHERN BLOTTING ......................................................................................................... 23 REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) ................................................................... 25 SEQENCIAMENTO DE DNA................................................................................................ 26 BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................... 29 ANLISES DE RNA................................................................................................................... 30 INTRODUO ........................................................................................................................ 31 NORTHERN BLOTTING ......................................................................................................... 32 RT-PCR................................................................................................................................... 34 MICROARRANJOS DE DNA .................................................................................................. 34 CONSTRUO DE BIBLIOTECA SUBTRATIVA ................................................................... 37 SAGE - SERIAL ANALISYS OF GENE EXPRESSION .......................................................... 37 DIFFERENTIAL DISPLAY....................................................................................................... 39 HIBRIDAO IN SITU ............................................................................................................ 42 BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................... 47 IV. ANLISES DE PROTENA................................................................................................... 49 INTRODUO ........................................................................................................................ 50 ELETROFORESE DE PROTENAS ....................................................................................... 50 ELETROFORESE UNIDIMENSIONAL E WESTERN BLOTTING .......................................... 50 ELETROFORESE BIDIMENSIONAL ...................................................................................... 52 5

EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS .................................................................. 55 PRODUO DE ANTICORPOS ............................................................................................. 61 ESPECTROMETRIA DE MASSA ........................................................................................... 62 BIOFSICA DE PROTENAS ................................................................................................... 64 BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................... 67 V. CULTIVO CELULAR ............................................................................................................. 69 ESPAO FSICO E EQUIPAMENTOS ................................................................................... 70 MATERIAIS DE USO NO CULTIVO ....................................................................................... 70 AMBIENTE FSICO IN VITRO ................................................................................................ 70 MEIOS DE CULTURA ............................................................................................................. 71 SUBCULTIVO ......................................................................................................................... 71 CONTAMINAO: COMO EVIT-LA, RECONHEC-LA E ELIMIN-LA .............................. 71 TIPOS DE CULTURAS CELULARES ..................................................................................... 72 UTILIZAO DE CULTURAS PRIMRIAS ............................................................................ 73 ESTABELECIMENTO E MANUTENO DE UMA LINHAGEM CELULAR ........................... 73 BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................... 73 VI. MICROSCOPIA..................................................................................................................... 74 MICROSCOPIA PTICA ........................................................................................................ 75 MICROSCOPIA DE FLUORESCNCIA ................................................................................. 76 MICROSCOPIA CONFOCAL .................................................................................................. 77 MICROSCOPIA ELETRNICA DE TRANSMISSO.............................................................. 78 MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA ................................................................. 80 BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................... 81 VII. INTERFERNCIA FUNCIONAL .......................................................................................... 82 INTRODUO ........................................................................................................................ 83 GERAO E ANLISE DE ORGANISMOS MUTANTES ...................................................... 83 ORGANISMOS TRANSGNICOS .......................................................................................... 86 TRANSFECO DE CLULAS .............................................................................................. 88 INTERFERNCIA MEDIADA POR RNA (RNAi) E SILENCIAMENTO GNICO .................... 93 BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................... 96 VIII. NOES BSICAS DE BIOSSEGURANA..................................................................... 98 INTRODUO ........................................................................................................................ 99 PRINCPIOS BSICOS DE SEGURANA EM LABORATRIOS DE BIOLOGIA ................. 99 BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................... 104

I. TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE Redao: Humberto Freire Boncristiani Jnior - Doutorando.

INTRODUO A estrutura do cido desoxi-ribonuclico (DNA) foi descoberta no incio da dcada de 50, quando tornou-se claro que a informao hereditria das clulas era codificada pela seqncia de nucleotdeos do DNA. At a dcada de 70, o DNA era o componente celular mais difcil de ser analisado. Sua sequncia de nucleotdeos de enorme tamanho e monotonia qumica era geralmente analisada atravs de meios indiretos como a sequncia de protenas e anlises genticas. A partir da dcada de 70 novas tecnologias foram desenvolvidas permitindo o isolamento e a purificao de genes especficos num processo chamado de clonagem gnica. Na verdade, muitas destas tcnicas so provenientes da Microbiologia, Bioqumica, Imunologia e Gentica Microbiana e permitiram que a anlise do DNA ganhasse um novo enfoque. O DNA tornou-se ento, a molcula mais fcil de ser analisada, sendo possvel isolar regies especficas, obt-las em grande quantidade e determinar a sua seqncia numa velocidade de milhares de nucleotdeos por dia. Atualmente, cerca de 50 anos depois da descoberta da dupla-hlice, evidente um progresso incrvel no conhecimento da biologia celular e molecular, sendo que temos genomas de vrios organismos seqenciados completamente, incluindo humanos. Entretanto, o maior desafio comea agora, que compreender como a informao gentica armazenada no DNA permite o desenvolvimento e a manuteno dos organismos, desde a mais simples bactria unicelular, com cerca de 500 genes, aos seres humanos por exemplo, com aproximadamente 30.000 genes. A Tecnologia do DNA recombinante, como se convencionou denominar o conjunto de tcnicas de manipulao do DNA, tem uma ampla aplicao. Ela pode ser usada para estudar os mecanismos de replicao e expresso gnica, a determinao da seqncia de um gene e conseqentemente da protena que ele codifica, ou no desenvolvimento de culturas microbianas capazes de produzir substncias teis tais como a insulina humana, hormnio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades. Sua aplicao comercial ou biotecnolgica parece ter um potencial inesgotvel. Como conseqncia do desenvolvimento desta tecnologia atualmente possvel realizar investigao de paternidade e o diagnstico de doenas genticas e infecciosas atravs da anlise de DNA. CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR A origem do termo clonagem vem da Gentica Bacteriana que considera uma colnia de bactrias como um clone porque todos os indivduos so geneticamente idnticos bactria inicial. A tcnica central da metodologia do DNA recombinante a clonagem molecular, a qual consiste no isolamento e propagao de molculas de DNA idnticas. A clonagem molecular compreende pelo menos dois estgios importantes. Primeiro, o fragmento do DNA de interesse chamado de inserto ligado a uma outra molcula de DNA chamada de vetor para formar o que se chama de DNA recombinante. Segundo, a molcula do DNA recombinante introduzida numa clula hospedeira compatvel, num processo chamado de transformao. A 8

clula hospedeira que adquiriu a molcula do DNA recombinante agora chamada de transformante ou clula transformada. Um nico transformante, em condies ideais, sofre muitos ciclos de diviso celular, produzindo uma colnia que contm milhares de cpias do DNA recombinante. ENZIMAS DE RESTRIO As enzimas de restrio ou endonucleases de restrio so enzimas com a capacidade de clivar a dupla hlice de DNA em regies especficas, determinada pela sua sequencia nucleotdica. Foram descobertas na dcada de 50 e so divididas em vrias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos stios de reconhecimento e clivagem. As enzimas do Tipo II, as mais importantes na Tecnologia do DNA Recombinante, so proteinas monomricas ou dimricas e clivam o DNA no mesmo stio do seu reconhecimento. O stio de reconhecimento deste tipo de enzima normalmente uma seqncia palindrmica, isto , ela tem um eixo de simetria e a seqncia de bases de uma fita a mesma da fita complementar, quando lida na direo oposta (Figura 1). Estas enzimas reconhecem seqncias especficas de 4 a 8 pares de base (pb) na molcula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. H 2 tipos distintos de clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da seqncia especfica, gerando extremidades abruptas, ou b) os cortes so feitos simetricamente, porm, fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas. Estes dois tipos de clivagens e suas conseqncias esto mostrados na Figura 1. Atualmente, mais de 1000 enzimas de restrio j foram identificadas. A nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviao do nome do microrganismo do qual a enzima foi isolada. A primeira letra representa o gnero e as outras duas a espcie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrio denominada de EcoRI purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferncia de resistncia RI, enquanto que a Hind III isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III.

a) Clivagem no eixo de simetria

b) Clivagem simtricamente situada ao redor do eixo de simetria

...TC GA... ...AG CT...

...GAA TTC... ...CTT AAG...

3 '

5 '

+
5 ' 3 ' 3 '

+
5 '

5 '

3 '

Molculas com extremidades abruptas

Molculas com extremidades coesivas

Figura 1. Os dois tipos de clivagem feitos por enzimas de restrio. As setas indicam os stios de clivagem e as linhas pontilhadas representam o centro de simetria da sequncia.

O interesse por estas enzimas de restrio aumentou em 1973 quando se percebeu que elas poderiam ser usadas para fragmentar o DNA deixando extremidades de fitas simples de DNA que permitiam a ligao dos fragmentos. Isto significava que a recombinao poderia ser efetuada em tubos de ensaio. Alm disto, DNA bacteriano poderia recombinar com DNA humano ou de qualquer outra espcie, abrindo a possibilidade de clonar genes humanos e expressa-los em larga escala, possibilitando a obteno de grandes quantidades da protena de interesse. Uma importante conseqncia da especificidade destas enzimas de restrio que o nmero de clivagens feito por cada uma delas no DNA de qualquer organismo definido e permite o isolamento de fragmentos deste DNA. Portanto, cada enzima de restrio gera uma famlia nica de fragmentos quando cliva uma molcula de DNA especfica. A famlia de fragmentos gerados por digesto com enzima de restrio geralmente detectada pela separao destes fragmentos por eletroforese em gel de agarose (princpios descritos no captulo II). Os fragmentos migram em funo de seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente (Figura 2). Este perfil eletrofortico serve como uma "impresso digital" do DNA analisado.

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Sentido da migrao

Pares de base

Figura 2. Molculas de DNA de tamanhos diferentes podem ser separadas por eletroforese. Molculas menores movem-se mais rapidamente que molculas maiores, tornando-se portanto separadas em bandas. O DNA corado com brometo de etdio, uma molcula que fluoresce quando iluminada com luz Ultra Violeta.

CONSTRUO DO DNA RECOMBINANTE Uma enzima de restrio particular reconhece somente uma seqncia nica de bases. DNAs de origens diferentes sob a ao da mesma enzima de restrio produzem fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de dois diferentes organismos (por exemplo, bactria e homem) podem ser ligados por renaturao das regies de fita simples. Alm disto, se a ligao for "selada" com a enzima DNA ligase, depois do pareamento de bases, os fragmentos sero ligados permanentemente. A tcnica de DNA recombinante tem um interesse especial se uma das fontes de DNA clivado for um plasmdeo. A figura 3 mostra uma molcula de DNA de plasmdeo que tem somente um stio de clivagem para uma determinada enzima de restrio. A mesma enzima usada para clivar DNA humano. Se os fragmentos de DNA humano so misturados com o DNA plasmidial linearizado, permitindo a ligao entre eles, uma molcula de DNA plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada. Este plasmdeo hbrido pode ser inserido numa bactria atravs de transformao e ento o inserto ser replicado como parte do plasmdeo. Geralmente, antibiticos so acrescentados ao meio da cultura para selecionar somente as linhagens que portam os plasmdeos (o plasmdeo usado para esta finalidade porta resistncia a pelo menos um antibitico).

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AC GT
Plasmdeo de E.coli DNA humano

TGCA

TGCA ACGT

TGCA ACGT

Enzima

Enzima

GCA T

T ACG
DNA ligase

TG

CA T
G

AC

TG
CA T
G

Figura 3. Construo de uma molcula de DNA hbrida a partir de fragmentos de diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrio.

DNA LIGASE Conforme mencionado anteriormente, esta enzima promove a ligao dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrio. A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia (Figura 4). A E.coli e o fago T4 codificam uma DNA ligase capaz de selar fragmentos de DNA com dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli e de outras bactrias requer NAD+, enquanto que a isolada do bacterifago T4 requer ATP como cofator.

DNA

3' OH + O
-

AC

Plasmdeo hbrido

O P O
5'

DNA

O DNA-Ligase
ATP ou NAD

O DNA 3' O
-

P O

5'

DNA

Figura 4. DNA ligase catalisa a juno de duas fitas de DNA que so partes da molcula da dupla-hlice.

TRANSFORMAO BACTERIANA O processo de transformao constitui um evento de alta importncia na tcnica de manipulao gnica. A transformao natural descrita por Griffith, em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, um evento raro. No entanto, em 1970, Mandel e Higa encontraram 12

que a E.coli tornou-se marcadamente competente para transformao com DNA exgeno, quando a bactria foi suspensa em cloreto de clcio gelado e submetida a um curto choque trmico 42oC. Estes mesmos autores tambm verificaram que as bactrias crescidas at a fase log eram mais competentes do que aquelas isoladas de outros estgios do crescimento. O procedimento do cloreto de clcio que usado at hoje produz uma eficincia de transformao da ordem de 105 a 107 transformantes por micrograma de DNA (a eficincia de transformao geralmente expressa como o nmero de clulas transformadas, obtido a partir de um micrograma de DNA plasmidial intacto). O tamanho e a conformao da molcula do DNA, afetam o processo de transformao. Plasmdeos pequenos so mais facilmente incorporados pela clula bacteriana competente; DNA linear pobremente incorporado, talvez pelo fato de sofrer degradao pelas enxonucleases presentes no espao periplasmtico. Outra maneira tambm muito usada na captao induzida de DNA a tcnica de eletroporao. As clulas alvo so colocadas em uma soluo contendo um gene de interesse. Essa soluo exposta a um pulso eltrico de alta voltagem e durao muito curta, que provoca uma queda temporria da membrana celular, e com aparecimento de poros na membrana, atravs dos quais o DNA pode penetrar na clula e finalmente atingir o ncleo, onde pode ser incorporado ao genoma. Tambm tem sido utilizada a eletroporao em espermatozides. VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR Aps o isolamento de uma informao gentica, por exemplo um fragmento de DNA obtido pela clivagem com enzimas de restrio, este fragmento dever ser inserido numa outra molcula de DNA diferente, capaz de amplificar aquela informao gentica em centenas de cpias. Este processo de amplificao obtido atravs do uso de molculas de DNA que so os chamados vetores de clonagem molecular. Atualmente, os tipos bsicos de vetores usados na metodologia do DNA recombinante apresentam caractersticas especiais que os tornam excelentes veculos de clonagem em diferentes situaes. A seguir, vamos apresentar os principais tipos de vetores atualmente em uso na biologia molecular.

Plasmdeo Plasmdeos so pequenas molculas de DNA dupla fita, contendo os elementos necessrios para a sua replicao e pelo menos um gene que confere resistncia a antibitico (Figura 5). Estes elementos genticos extra cromossomais variam de 5 a 400 kilobases e comumente esto presentes em duas ou mais cpias por clula. Os plasmdeos presentes num grande nmero de cpias so usados como veculos de clonagem desde que capacitem a

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amplificao do segmento do DNA neles clonado. Um plasmdeo para ser um bom vetor de clonagem deve conter as seguintes propriedades: a) possuir uma origem de replicao (O), ou seja, uma seqncia de DNA que permita que o vetor seja replicado na clula hospedeira; b) apresentar dois ou mais stios nicos de clivagem para endonucleases de restrio. O conjunto destes stios, denominado de Mltiplos Stios de Clonagem (MSC), o local onde o inserto incorporado ao vetor de clonagem; c) possuir um gene que codifica um produto que distingue a clula transformada da clula no transformada. Por exemplo, muitos vetores de clonagem carregam o gene que confere resistncia ampicilina (AmpR). As clulas transformadas com tais vetores so capazes de crescer num meio contendo o antibitico, enquanto que as clulas no tranformadas acabam morrendo. A figura a seguir ilustra as principais caractersticas estruturais de um plasmdeo. Um dos passos fundamentais no processo de clonagem molecular o uso de enzima de restrio que produz extremidades compatveis durante a clivagem do DNA a ser clonado (inserto) e a do DNA receptor (vetor).

AmpR

MSC

Figura 5. Estrutura molecular de um plasmdeo tpico usado em clonagem molecular. Esto representados o gene de resistncia (AmpR), a regio de mltiplos stios de clonagem (MSC) e a origem de replicao (O).

Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, esta molcula hbrida dever ser introduzida numa clula hospedeira geralmente bactrias, por um processo chamado de transformao, para que o vetor possa sofrer replicaes e consequentemente amplificar o nmero de cpias do inserto. A bactria transformada ser facilmente reconhecida pela aquisio de um novo fentipo dado pelo plasmdeo, ou seja, capacidade de crescer em meios contendo antibitico.

Fagos Um dos vetores mais utilizados nos processos de clonagem molecular o denominado bacterifago , o qual comporta-se como um vrus da E.coli. Durante o ciclo ltico, os genes envolvidos no processo de lisognia so dispensveis e consequentemente a regio de 14

integrao do genoma do fago pode ser totalmente substituda por um outro fragmento de DNA, sem que haja qualquer alterao nos processos envolvidos na via ltica. Uma das maiores vantagens de usar o fago como vetor de clonagem que o DNA inserido no fago empacotado in vitro. Embora a eficincia de empacotamento seja cerca de 10%, uma vez que os fagos so empacotados teremos 100% de eficincia na infeco da E.coli hospedeira. Este processo altamente eficiente quando comparado com o da transformao bacteriana com plasmdeos. Neste caso, os melhores resultados situam-se ao redor de 108 transformantes por g de DNA o que significa que menos de 1 em 1000 plasmdeos so incorporados na E.coli hospedeira. Atualmente, existem vrios derivados do fago nos quais um ou mais stios de restrio flanqueiam a regio de recombinao, facilitando a sua substituio por um outro DNA. Estes so os chamados vetores de substituio. Um exemplo tpico destes vetores o EMBL3, no qual a regio de recombinao flanqueada pelas enzimas de restrio EcoRI, BamHI e SalI. Esse vetor quando quando clivado pode receber fragmentos de DNA variando de 10,4 a 20 kb, como mostra a figura abaixo. Outros derivados do fago so os chamados vetores de insero. Neste tipo de vetor, os fragmentos de DNA que podem ser inseridos devem ter no mximo at 7kb de tamanho para no alterar os processos de empacotamento do genoma do fago.

Cosmdeos A clonagem de fragmentos de DNA no fago apresenta uma limitao, pois o fragmento a ser clonado no pode ser maior do que cerca de 15kb. Na maioria das vezes, esta dimenso suficiente para conter um gene completo, incluindo as sequncias flanqueadoras. Entretanto, muitos genes apresentam dimenses da ordem de 35 a 40 kb e nestes casos, a tcnica usada para a clonagem deste tipo de fragmento a chamada clonagem em cosmdeos. Os cosmdeos, so plasmdeos que contm um fragmento de DNA do fago que inclui o stio cos, que so regies de fita simples na extremidade do plasmdeo, com cerca de 12 nucleotdeos, os quais so complementares na sequncia de bases e atravs delas que o DNA assume a forma circular quando ele injetado na clula hospedeira. Estes cosmdeos podem ser usados como veculos de clonagem molecular empregando o sistema de empacotamento in vitro que reconstitui a estrutura do fago (cabea e cauda) e assim usado para infectar a clula hospedeira. As enzimas do sistema de empacotamento do fago reconhecem os dois stios cos situados de 35 a 49 kb de distncia e neste caso, somente fragmentos desta ordem de tamanho sero convenientemente empacotados. O DNA genmico de interesse clivado com uma enzima de restrio que produz grandes fragmentos de DNA, os quais sero ligados ao 15

cosmdeo, tambm clivado com a mesma enzima. A situao ideal que cada fragmento do DNA genmico apresente um stio cos nas suas extremidades. Durante o empacotamento, as enzimas do sistema reconhecem os stios cos situados a uma distncia dentro de 49Kb, clivam estes stios e empacotam estas molculas. O DNA do cosmdeo injetado no interior da clula hospedeira, circulariza igual ao DNA do fago e replica como um plasmdeo normal, sem expresso de qualquer funo do fago. As clulas infectadas sero selecionadas com base na resistncia adquirida a um determinado antibitico.

Vrus A biologia molecular dos vrus de DNA e RNA foi extensivamente estudada antes do advento da metodologia do DNA recombinante. O vrus SV40, isolado de clulas tumorais de macacos, foi um dos primeiros sistemas virais utilizados para introduzir genes em clulas de mamferos. O DNA do SV40 apresenta 5.200 pares de bases e pode ser dividido em duas regies quanto a expresso gnica viral. Estas regies so chamadas de regio precoce e regio tardia. A regio precoce expressa atravs do ciclo ltico, enquanto que a expresso dos genes da regio tardia ocorre somente aps o incio da replicao do DNA viral. Entre estas duas regies situa-se a origem de replicao do DNA do vrus. A produo de DNA recombinante no vrus SV40, pode ser realizada atravs da substituio do segmento de expresso precoce ou do segmento de expresso tardia. Apesar deste sistema viral ter sido usado como vetor de expresso em muitas estratgias de clonagem, existem algumas desvantagens de seu uso. Uma delas que o gene a ser clonado no pode ser grande, a outra que as clulas hospedeira s podem ser clulas de macacos e finalmente, o genoma da clula hospedeira pode sofrer rearranjados ou delees. Atualmente, dois outros sistemas virais mais versteis esto em uso, so eles o vrus da vaccinia e o Baculovrus, os quais podem aceitar genes bem maiores do que aqueles aceitos pelo SV40. Um inconveniente para estes dois sistemas virais que ambos apresentam um grande genoma e o gene a ser clonado s pode ser inserido por processos de recombinao dentro das clulas, o qual bastante lento em relao aos processos tradicionais em uso na metodologia do DNA recombinante. Finalmente, um sistema viral bastante promissor so os retrovrus que so vrus cujo material gentico o RNA e apresentam um ciclo bastante diferente dos mencionados anteriormente que so ciclos lticos. Os retrovrus infectam uma grande variedade de clulas de mamferos e o seu RNA transcrito reversamente para DNA o qual incorporado ao genoma da clula hospedeira. Neste estado ele produz continuamente novas partculas virais, juntamente com o produto do gene nele clonado. Devido a sua versatilidade, os retrovrus so atualmente os vetores eleitos para uso em terapia gnica. 16

Bacterifago M13 O bacterifago M13 um fago filamentoso da E. coli e contm uma nica fita de DNA envolvida por protenas virais. Durante o seu ciclo, a clula hospedeira infectada pela fita (+) a qual servir como molde para a sntese da outra fita (-). A dupla fita denominada de forma replicativa, permanece no interior da clula hospedeira e amplificada at 200 cpias por clula, quando ento a fita negativa no mais se replica e a fita positiva continua a ser sintetizada, adquire as protenas da cpsula viral e sai da clula hospedeira atravs de processo no ltico. A grande utilidade deste sistema de clonagem a sua facilidade na produo de DNA fita simples, facilmente recupervel do sobrenadante de uma cultura lquida da E.coli infectada com este vetor o que facilita muito no processo de sequenciamento pelo mtodo desenvolvido por Sanger.

Fagomdeos Apesar do bacterifago M13 apresentar grande aplicabilidade especialmente nos processos de seqenciamento de DNA, foram desenvolvidas outras geraes de fagos, os quais reunem as vantagens do fago M13 e a do plasmdeo. Os primeiros foram os vetores da srie pEMBL e mais tarde os plasmdeos pTZ, pBluescript e pGEM (+/-). Estes vetores so chamados de fasmdeos ou fagomdeos e apresentam as seguintes caractersticas principais: fagomdeo apresenta um verstil MSC, permitindo a clonagem de grandes insertos sem maiores dificuldades, alm de que, as enzimas situadas neste stio foram ordenadas de tal modo a permitir uma alternativa interessante durante o processo de sequenciamento. utilizando uma combinao estratgica de duas enzimas de restrio, possvel criar terminaes 5' e 3' proeminentes, tornando agora uma extremidade (a do inserto) susceptvel ao da Exonuclease III. Esta estratgia, permite a obteno progressiva e controlada de vrios fragmentos deletados do inserto, os quais aps a recircularizao tornam-se apropriados para o sequenciamento. Este procedimento, facilita o seqenciamento de um grande inserto de DNA, sem a necessidade de mltiplas subclonagens como usual no sistema M13 ou a sntese de vrios oligonucleotdeos internos, usados como iniciadores no processo de seqenciamento. CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE A obteno de uma molcula de DNA recombinante, atravs da ligao de um fragmento de DNA de interesse com o DNA de um vetor, um processo direto e relativamente simples. Entretanto, problemas especiais surgem quando o fragmento de interesse constitui uma frao pequena do DNA total. Este o caso encontrado comumente quando o objetivo 17

o isolamento de genes presentes em uma nica cpia num genoma complexo, ou quando o objetivo o isolamento de clones portadores do DNA complementar RNA mensageiro raro. Deste modo, claro que quando queremos clonar um determinado gene ou o DNA complementar da mensagem ou mensagens por ele codificado(s) necessria a obteno de colees de clones recombinantes, portadores de molculas representantes de todo o genoma, ou de colees de clones de cDNAs derivados de toda a populao de mensageiros da clula ou tecido de interesse. Essas colees de clones de DNA recombinante so chamadas de bibliotecas: Biblioteca Genmica, no caso dos clones terem sido obtidos a partir do DNA genmico ou Biblioteca de cDNA, no caso dos clones terem sido construdos a partir de DNA complementar. O DNA de organismos superiores bastante complexo: por exemplo, o genoma haplide de mamfero composto de aproximadamente 3x109 pares de bases (pb). Portanto, se o fragmento de interesse tiver 3000 pb, ele compreender somente 1 parte em 106 de uma preparao do DNA total. De modo similar, uma espcie de mRNA particularmente rara pode compreender somente 1 parte em 105 ou 106 da frao de RNA mensageiros de uma clula. Deste modo, para que seja garantida a presena na biblioteca de pelo menos uma verso de todas as seqncias da populao alvo, um dos pontos principais na construo de bibliotecas teis a obteno de grandes quantidades de clones. Embora a soluo deste problema envolva estratgias especficas no preparo do DNA alvo e na escolha do vetor de clonagem, em linhas gerais a construo de bibliotecas genmicas e de cDNAs segue um procedimento bsico bastante semelhante. Nos dois casos, o DNA genmico ou os cDNAs so preparados para a insero no vetor escolhido. O vetor e o DNA alvo so ligados e introduzidos em E. coli atravs de infeco ou em alguns casos, por transformao direta. BIBLIOTECA DE cDNA A descoberta da enzima transcriptase reversa, uma DNA polimerase dependente de RNA encontrada predominantemente em vrus de RNA de tumor, tornou possvel a sntese in vitro de DNA usando-se como molde mRNA. O DNA produto dessa reao o DNA complementar ou cpia da mensagem, abreviadamente chamado de cDNA. A sntese e possvel clonagem de cDNAs contriburam para grandes avanos na anlise da estrutura e expresso de genes de eucariotos e propiciaram uma revoluo tecnolgica nas indstrias farmacutica e de alimentos. Esses clones so comumente isolados de bibliotecas de cDNA, construdas a partir da populao de mRNA isolada da clula ou do tecido de interesse. Portanto, em comparao com bibliotecas do genoma total essas bibliotecas so enriquecidas com seqncias gnicas. Uma vez que o cDNA cpia da mensagem, ele no contm introns e apresenta significativamente poucas seqncias que no codificam para protenas (Figura 6). A ausncia de introns permite que cDNAs relativos a clulas de eucariotos superiores sejam diretamente transcritos e traduzidos em bactrias e em outros microorganismos, permitindo 18

assim a produo em grande escala de polipeptdios importantes tanto na rea de pesquisa como na rea aplicada. A ausncia de introns tambm facilita a determinao direta da seqncia da mensagem e subseqente deduo da seqncia de aminocidos da protena por ela codificada. Isso tem resultado na identificao da seqncia de uma enorme quantidade de protenas, algumas vezes mesmo antes de terem sido identificadas gentica ou bioquimicamente.

Figura 6. Diagrama representando de forma simplificada as diferenas entre um fragmento de DNA genmico e do cDNA relativo a ele.

De modo resumido, o procedimento para a sntese, clonagem e isolamento de cDNAs especficos envolve 4 etapas: 1) Sntese in vitro de cDNAs de fita dupla a partir de RNAs mensageiros isolados do tecido de interesse. 2) Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor escolhido. 3) Introduo dos cDNA recombinantes nas clulas hospedeiras, onde sero replicados. Isto resultar na amplificao dos recombinantes e dependendo do vetor utilizado, na expresso das protenas codificadas pelas mensagens que deram origem aos cDNAs. 4) Identificao dos clones de interesse atravs de um processo de triagem dos clones recombinantes. BIBLIOTECA GENMICA Para se obter informaes sobre a estrutura molecular de um gene de eucariotos necessrio o isolamento da poro do DNA genmico que contenha toda a unidade de transcrio, mais as regies flanqueadoras onde se localizam os elementos controladores da expresso desse gene. O modo mais eficiente para se conseguir isolar essa poro do DNA atravs do uso de uma biblioteca genmica, que deve conter clones portando fragmentos de DNA representantes de todo o genoma do organismo em questo. Deste modo, o aspecto 19

principal considerado na construo de uma biblioteca genmica est na obteno de um nmero grande de clones portando fragmentos do genoma, obtidos aleatoriamente. O tamanho necessrio de uma biblioteca genmica, para que um dado fragmento de interesse esteja entre os fragmentos clonados, determinado pelo tamanho do fragmento clonado e pelo tamanho do genoma. Deste modo, a estratgia bsica na construo de bibliotecas genmicas busca minimizar o nmero de clones necessrios atravs da clonagem de fragmentos de DNA de maior tamanho possvel, e maximizar a eficincia da clonagem, atravs da utilizao de vetores baseados no fago . Basicamente, a construo da biblioteca genmica envolve os seguintes passos: a)isolamento de DNA de alto peso molecular, que posteriormente quebrado de modo a produzir fragmentos de tamanho compatvel com o vetor de clonagem. b)ligao desses fragmentos no vetor e introduo dos recombinantes obtidos nas clulas hospedeiras.

BIBLIOGRAFIA Apostila de Gentica Molecular e Tecnologia do DNA Recombinante (2003) -

http://morpheus.fmrp.usp.br/td/apostila.php

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II. ANLISES DE DNA

Redao: Ana Isabela Lopes Sales - Doutoranda Dra. Mrcia A. S. Graminha - Ps-doutoranda.

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INTRODUO Como mencionado no captulo anterior nas ltimas dcadas foram desenvolvidas vrias abordagens para o estudo do DNA, sendo a Tecnologia do DNA recombinante, discutida no captulo I, a base para estes avanos. Neste tpico abordaremos algumas das tcnicas para anlise direta do DNA como eletroforese, Southern blotting, reao em cadeia da polimerase (PCR) e seqenciamento. A eletroforese uma tcnica utilizada rotineiramente para separao de fragmentos de DNA, simplesmente para anlise ou para posterior utilizao dos fragmentos separados e purificados. Em seguida, discutiremos a tcnica de Southern blotting, utilizada na identificao de fragmentos especficos de DNA gerados aps anlise de digestes enzimticas do DNA. Tambm abordaremos a tcnica de PCR que permite a obteno de grandes quantidades de trechos especficos do DNA, que tem aplicaes diversas facilitando anlises como identificao de mutaes, clonagem e seqenciamento, sendo amplamente utilizada no diagnstico de doenas e em cincia forense. Finalmente trataremos dos princpios envolvidos na tcnica de seqenciamento do DNA. ELETROFORESE DE DNA Fragmentos DNA diversos podem ser facilmente separados pelo uso de eletroforese. Neste mtodo, um campo eltrico aplicado para mover os fragmentos de DNA atravs dos poros de uma matriz. Esta matriz pode ser de poliacrilamida (polmero de acrilamida) ou de agarose (polissacardeo isolado de algas marinhas), dependendo da faixa de tamanho que se deseja separar. A eletroforese convencional em gel de agarose separa fragmentos de 0,5 a 25kb, enquanto a eletroforese em campo pulsado, discutida abaixo, separa molculas de ~10 a >2000kb. Para fragmentos menores do 0,5 kb pode ser utilizada eletroforese em gel de poliacrilamida, que dependendo das condies do gel pode separar fragmentos de DNA que diferem entre si por um nico nucleotdeo. Em todos os casos o princpio bsico da eletroforese o mesmo. O DNA tem carga eltrica negativa, ento quando submetido a um campo eltrico ele migrar para o plo positivo. O tamanho do DNA determina a taxa na qual ele passa atravs do gel, permitindo uma separao efetiva de misturas de fragmentos de tamanhos diferentes. Os fragmentos menores atravessam a malha com maior facilidade e por isso migram mais rapidamente em direo ao plio positivo. O DNA permanece intacto durante o processo, podendo posteriormente ser eludo do gel e utilizado em outros procedimentos como clonagem, preparao de sondas, construo de bibliotecas, etc. O DNA pode ser visualizado sob luz UV corando-se o gel em uma soluo de brometo de etdio, um corante que se liga fortemente ao DNA tornando-o fluorescente. Neste caso ele absorve a luz UV e emite energia como uma luz visvel de cor laranja. Para visualizao do DNA, podem ser utilizados tambm outros corantes fluorescentes, precursores radioativos ou ainda colorao por prata. Aps a colorao observa-

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se uma srie de bandas, cada qual correspondendo a um fragmento cujo peso molecular pode ser estabelecido pela calibrao com molculas de DNA de peso conhecido (Figura 2). ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO (PFGE) Molculas pequenas (entre 0,5 e 25kb) passam fcil e rapidamente atravs dos poros de geis de agarose; no entanto, molculas maiores que 25kb no so efetivamente resolvidas por esta tcnica padro. Uma soluo para este problema foi encontrada em 1984, quando Schwartz e Cantor relataram o desenvolvimento da tcnica de Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE). Neste mtodo, campos eltricos ortogonais pulsados e alternados so aplicados no gel de agarose. Assim, DNAs de alto peso molecular contidos em blocos de agarose (protocolo de apoio) podem ser separados. necessrio equipamento especializado que consiste numa plataforma para o gel de agarose com eletrodos em disposio hexagonal (Figura 7), uma bomba peristltica associada a um sistema de refrigerao (chiller) e uma fonte de energia programvel. PFGE tem sido principalmente utilizado para mapeamento gnico e separao de cromossomos para avaliaes de caritipos ou construo de bibliotecas cromossomoespecficas. Esta tcnica vem sendo muito utilizada de uma forma geral e tem se mostrado particularmente til para o estudo de Leishmania, entre outros protozorios, cujos cromossomos no so visualizveis atravs das tcnicas de citogentica convencionais. Assim, PFGE utilizado para separar e visualizar os cromosomos deste organismo. SOUTHERN BLOTTING A tcnica de Southern blotting, desenvolvida por Edwin Southern na dcada de 70, utilizada na identificao de fragmentos especficos de DNA gerados aps digesto enzimtica. Esta tcnica utilizada no estudo da organizao do genoma atravs de mapeamento de stios de restrio e segmentos de DNA para os quais existem sondas moleculares. O DNA a ser analisado (DNA total do organismo), digerido com uma ou mais enzimas de restrio. Estes fragmentos so separados de acordo com o tamanho atravs de eletroforese em gel de agarose e podem ser visualizados aps colorao com brometo de etdio. Os fragmentos presentes no gel so desnaturados e transferidos do gel (em geral por capilaridade ou vcuo) para membrana de nilon ou nitrocelulose (Figura 8). Este processo preserva a distribuio dos fragmentos no gel, criando uma rplica deste na membrana. A membrana submetida a aquecimento (80C) ou exposio luz ultravioleta para que ocorra a ligao covalente entre ela e os fragmentos de DNA. A membrana ento incubada em condies de hibridao com uma sonda especfica marcada radioativamente ou com fluorescncia. Neste caso, uma sonda um fragmento de DNA ou RNA conhecido que ir hibridar com seqncias complementares presentes na membrana, o que permite a identificao do DNA de interesse entre os diversos fragmentos gerados na digesto. Aps a hibridao so feitas lavagens com solues com concentraes salinas e temperatura apropriada para a eliminao de ligaes inespecficas e 23

os hbridos de DNA especficos so detectados por exposio a filmes sensveis a radioistopos ou fluorescncia. A anlise de hibridao sensvel e permite a deteco de genes de cpia nica em genomas complexos.

CHEF

Campo Eltrico 1 amarelo

Controle de tempo

Campo Eltrico 2 branco

Figura 7. Posio dos eletrodos e direo da migrao do DNA numa eletroforese de campo pulsado do tipo CHEF, contour-clamped homogeneous eletric fields.

DNA Digesto
com enzima de restio

Eletroforese em gel de agarose

Transferncia do DNA para membrana

Hibridao com sonda especfica Membrana de Nilon

Figura 8. Esquema do procedimento de Southern blotting.

0,5kg
Placa de Vidro Papel Toalha Filtro de Nylon Papel de Filtro

Gel de agarose

Soluo alcalina

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Este processo preserva a distribuio dos fragmentos no gel, criando uma rplica deste na membrana. A membrana submetida a aquecimento (80C) ou exposio luz ultravioleta para que ocorra a ligao covalente entre ela e os fragmentos de DNA. A membrana ento incubada em condies de hibridao com uma sonda especfica marcada radioativamente ou com fluorescncia. Neste caso, uma sonda um fragmento de DNA ou RNA conhecido que ir hibridar com seqncias complementares presentes na membrana, o que permite a identificao do DNA de interesse entre os diversos fragmentos gerados na digesto. Aps a hibridao so feitas lavagens com solues com concentraes salinas e temperatura apropriada para a eliminao de ligaes inespecficas e os hbridos de DNA especficos so detectados por exposio a filmes sensveis a radioistopos ou fluorescncia. A anlise de hibridao sensvel e permite a deteco de genes de cpia nica em genomas complexos. REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) A reao em cadeia da polimerase possibilita a amplificao de uma seqncia rara de DNA a partir de uma mistura complexa, sem a necessidade de clonagem molecular. Esta tcnica amplamente utilizada em pesquisa bsica, em medicina forense e no diagnstico de doenas genticas e infecciosas. Inicialmente, necessria a construo por sntese qumica de dois oligonucleotdeos de DNA (iniciadores) complementares as extremidades de cada fita de DNA, flanqueando a regio de interesse. Estes oligonucleotdeos servem como iniciadores da sntese de DNA in vitro, que catalisada pela DNA polimerase. Um ciclo de PCR comea com a desnaturao por calor (95C), que promove a separao da fita dupla de DNA. A reao resfriada na presena de um excesso dos dois oligonucleotdeos, possibilitando a hibridizao dos dois iniciadores com a seqncia complementar presente no DNA alvo. Em seguida, a reao incubada para atividade da DNA polimerase, produzindo novas fitas de DNAs a partir dos iniciadores e utilizando o quatro desoxirribonucleotdeos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) (Figura 9). Cada novo ciclo da reao inicia-se com o aquecimento para desnaturao da dupla fita de DNA, seguido de resfriamento para hibridao dos iniciadores e sntese de uma nova fita pela DNA polimerase a partir dos iniciadores, sendo que as fitas de DNA recm sintetizadas servem de molde no ciclo seguinte. Portanto, em cada ciclo sintetizado o dobro do DNA produzido no ciclo anterior (Figura 10). Usualmente, so realizados de 20 a 30 ciclos para amplificao de um segmento de DNA especfico dentro de um genoma.

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Figura 9. As 3 etapas do ciclo de PCR (http://allserv.rug.ac.be/~avierstr/index.html).

Nas primeiras iniciativas para amplificar fragmentos de DNA utilizava-se a enzima DNA polimerase da Escherichia coli, que possui atividade mxima a 37C. Esta enzima deveria ser adicionada a cada ciclo pois o passo de desnaturao inativa a enzima. Um importante avano ocorreu com a descoberta da enzima Taq DNA polimerase (Saiki et al, 1988) oriunda da bactria Thermus aquaticus. A Taq DNA polimerase possui atividade tima a 72C e permanece razoavelmente estvel mesmo a 95C e com isto, a enzima adicionada somente no inicio do processo . Alm de ser utilizada para a amplificao de um segmento especfico de DNA dentro de um genoma, a metodologia de PCR pode ser utilizada para amplificar um segmento ou toda a seqncia de um produto gnico, o que ser discutido no captulo seguinte. SEQENCIAMENTO DE DNA A partir do final da dcada de 70 tornou-se possvel a determinar a seqncia nucleotdica de fragmentos de DNA. O desenvolvimento da metodologia descrita por Sanger e cols associado a avanos tecnolgicos, permite que hoje genomas inteiros sejam seqenciados. O princpio do mtodo de terminao da cadeia para seqenciamento de DNA baseiase na sntese de DNA in vitro realizada na presena didesoxirribonucleotdeos. Um DNA purificado pode ser sintetizado in vitro em uma mistura que contm molculas de fita nica de 26

DNA, enzima DNA polimerase, um DNA iniciador que possibilita a polimerase iniciar a sntese de DNA utilizando os desoxirribonucleotdeos. Alternativamente, na presena de didesoxirribonucleotdeos (ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP) na reao, o elongamento da cadeia de DNA bloqueado pela incorporao do nucleotdeo sem um grupo OH na posio 3'.

Figura 10. Os primeiros 4 ciclos de um PCR em detalhes. No terceiro ciclo, duas duplas fitas que apresentam o tamanho correto so copiadas (as duas fitas com o mesmo tamanho). No quarto ciclo, 8 duplas fitas que apresentam o tamanho so copiadas (http://allserv.rug.ac.be/ ~avierstr/index.html).

No mtodo originalmente desenvolvido por Sanger para seqenciamento de DNA, uma fita complementar sintetizada utilizando um mistura de desoxirribonucleotdeos, um deles marcado com P32 ou S35. So realizadas 4 reaes independentes, contendo uma pequena quantidade de um tipo de didesoxirribonucleotdeo em cada uma das reaes. Cada reao produz um conjunto de cpias do DNA inicial que terminam em diferentes pontos da sua seqncia. Os produtos destas quatro reaes so separados por eletroforese, utilizando quatro raias paralelas em um gel de poliacrilamida e os fragmentos so detectados atravs da marcao radioativa. Em cada um das raias, as bandas representam fragmentos que foram terminados em dado nucleotdeo em diferentes posies do fragmento inicial de DNA. Pela anlise da ordem das bandas, comeando pelo final do gel atravs das quatro raias, pode-se determinar a seqncia do DNA recm sintetizado (Figura 11). Este mtodo ainda amplamente utilizado, sendo que vrios avanos tornaram o seqenciamento de DNA uma tcnica simples e rpida. Os principais avanos foram a adaptao da PCR ao mtodo de terminao da cadeia e a utilizao de didesoxirribonucleotdeos marcados com diferentes corantes fluorescentes (fluorocromos). A 27

utilizao de fluorocromos permite que todas as quatro reaes sejam realizadas em um nico tubo e o produto da reao de seqenciamento seja separado em uma nica raia do gel.

Figura 11. Seqenciamento de nucleotdeos pelo mtodo do trmino do crescimento da cadeia. Lehninger, Principles of Biochemistry. Figura 10-36, p. 352.

Atualmente, todo o processo de seqenciamento de DNA pode ser realizado em seqenciadores automticos. Nestes equipamentos o produto da reao de seqenciamento separado por eletroforese em gel ou em capilar, os fluorocromos so excitados por um feixe laser, os sinais fluorescentes so amplificados e detectados por tubos fotomultiplicadores ou nos modelos mais modernos por cmaras CCD. Anlises computacionais identificam cada nucleotdeo pelo comprimento de onda de emisso especfico de cada fluorocromo. As bases so identificadas de acordo com a forma do pico fluorescente e a distncia entre picos sucessivos (Figura 12).

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Figura 12. O produto da reao de seqenciamento submetido eletroforese em uma raia de gel. medida que os fragmentos passam pelo feixe de laser, os fluorocromos so excitados e a luz emitida detectada por um fotomultiplicador. Esta informao traduzida na forma de seqncia atravs de um computador.

BIBLIOGRAFIA Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A. e Struhl K., Preparation and Analysis of DNA in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1999. Sambrook, J, Russell, DW, 2001 Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York.

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ANLISES DE RNA

Fonte: Apostila do mdulo de Tecnologia do DNA Recombinante da disciplina de Gentica Humana e Molecular da FMRP-USP. Edio: Deise Cristina Poleto Doutoranda Dra. Ieda Guedes - Ps-Doutoranda Josane de Freitas Sousa Doutoranda Rafaela Martins Maia Mestranda Valeria Valente - Doutoranda

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INTRODUO Como mencionado no captulo anterior, toda a informao gentica das clulas est contida no DNA. A seqncia de nucleotdeos do DNA dita a seqncia de aminocidos de cada protena que a clula produz. As seqncias de aminocidos, por sua vez, determinam como as molculas iro se enovelar originando protenas distintas com forma e funo prprias. Na verdade, o conjunto de protenas que uma clula expressa (proteoma) que exerce basicamente a maioria das funes necessrias para a manuteno da clula. Entretanto, a produo de protenas no ocorre diretamente a partir do DNA, mas sim atravs de uma molcula intermediria denominada RNA mensageiro (mRNA). Estes RNAs so cpias de segmentos do DNA produzidos na transcrio, que so utilizados diretamente como moldes para a sntese de protenas. Todas as clulas, de bactrias a humanos, expressam sua informao gentica desta maneira, este um princpio to fundamental que denominado dogma central da biologia molecular. Portanto, o conjunto de RNAs mensageiros que uma clula est expressando, ou transcriptoma, reflete de modo geral quais genes esto sendo expressos num determinado momento sob certas condies. Embora, na maioria das vezes, a funo dos genes seja conduzida pelas protenas, h observaes de que a quantidade de protena produzida, em geral, diretamente dependente da quantidade de RNA mensageiros presente na clula. Deste modo, atravs do estudo do padro de expresso de RNAs mensageiros podemos relacionar a atividade gnica com processos biolgicos especficos. Quando o ambiente em que a clula se encontra muda, ou quando a clula necessita mudar sua forma ou seu comportamento, ou quando infectada por algum agente, alguns genes sero "desativados" e outros "ativados". Um nico evento pode alterar a atividade de dzias ou centenas de genes. Os pesquisadores buscam compreender toda a rede de interaes que ocorrem entre as molculas de uma clula, pois se pudermos decodificar tais "programas biolgicos" seremos capazes de entender como clulas normais se tornam cancerosas, como respondem as infeces e muitos outros processos. Independentemente do tipo celular, as clulas eucariticas normalmente contm um transcriptoma complexo, com a presena de um nmero considervel de RNAs mensageiros distintos. Em virtude da funo essencial de manuteno da vida na clula, determinados genes apresentam expresso abundante e constitutiva em praticamente todos os tipos celulares. Entretanto, vrios RNAs so expressos diferencialmente entre tipos celulares distintos ou situaes de estimulao diferentes ou ainda, em condies patolgicas versus fisiolgicas. Esses transcritos podem expressar-se de forma mais ou menos abundante, sendo os mais raros aqueles mais difceis de se identificar. Existem vrias metodologias que permitem o estudo de expresso gnica em nvel de RNA. Algumas delas so voltadas para o estudo de genes especficos como northern blotting e RT-PCR. Outras surgiram mais recentemente e visam o estudo de padres de expresso gnica relacionados a tipos celulares especficos ou com situaes fisiolgicas ou patolgicas determinadas, dentre elas iremos abordar: 31

microarranjos de DNA, construo de bibliotecas subtrativas, differential display e SAGE (Serial Analysis of Gene Expression). Alm disso, pode-se tambm analisar o padro de expresso de um dado gene na prpria clula ou tecido, o que nos permite obter o padro de expresso no somente temporal, mas tambm espacial. Estas anlises so feitas atravs de tcnicas como a hibridao in situ que ser abordada no final deste captulo. NORTHERN BLOTTING Uma tcnica bastante comum e eficiente para a anlise de RNA o Northern blotting. Ela bastante similar ao Southern blotting, incluindo praticamente as mesmas etapas: 1. eletroforese para separao das molculas com base no tamanho, 2. transferncia das molculas do gel para uma membrana de nylon ou nitrocelulose e 3. hibridao com uma sonda especfica. As etapas de transferncia e hibridao so praticamente idticas s do Southern blotting (figura 8), o passo inicial de eletroforese que apresenta as maiores variaes, pois feito em condies desnaturantes. As molculas de RNA so formadas por uma cadeia nica e a maioria delas forma estruturas secundrias decorrentes do pareamento de bases intramolecular, assim, uma eletroforese em condies desnaturantes necessria para que haja uma separao eficiente entre as molculas, baseada no tamanho linear delas. A maneira mais comum de se obter uma boa condio desnaturante para a eletroforese de RNA pela adio de formaldedo ao gel de agarose e ao tampo onde a amostra diluda. Uma outra diferena que como o RNA mais lbil que e o DNA e as nucleases RNA especficas so bastante estveis e ubqas, cuidados adicionais devem ser tomados durante a manipulao com RNA para evitar ou minimizar sua degradao. Estes cuidados incluem o uso constante de luvas e tratamento para inativao de RNAses de todos os materias a serem utilizados, como vidros e cubas de eletroforese (que de preferncia devem ser exclusivos para uso com RNA). A amostra a ser aplicada no gel pode conter a populao total de RNAs da clula (RNAs mensageiros, RNAs ribossomais e RNAs de transferncia), ou somente a frao de RNAs mensageiros previamente purificada. No caso de conter toda a populao de RNAs veremos preferencialmente, aps a eletroforese da amostra corada com um corante para cido nuclico como brometo de etdeo, as duas bandas correspondentes aos RNAs ribossmicos 18 e 28 S (figura 13A), uma vez que so os mais abundantes na amostra.

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Figura 13. Exemplo de resultado obtido em um Northern blot com RNA total. Em A, foto do gel desnaturante de RNA, no qual foram aplicadas oito diferentes amostras de RNA total de linhagens celulares humanas. As amostras foram previamente coradas com brometo de etdio, um corante para cido nuclico. As duas bandas que aparecem fortemente coradas em todas as amostras correspondem ao rRNAs de 18 e 28S. Na raia marcada com M foi aplicado um padro de peso molecular contendo 5 tipos de RNAs de tamanhos conhecidos (indicados esquerda da raia). Em B, imagem do Northern blot do gel de A: as amostras do gel foram transferidas para membrana de nylon, que foi ento incubada com uma sonda, marcada radioativamente, que corresponde a um fragmento de um gene humano. Atravs de complementaridade de bases a sonda hibrida especificamente com o RNA transcrito por esse gene e assim o sinal da banda correspondendo a este RNA pode ser detectada aps exposio da membrana a um filme de raios X.

De modo geral, em clulas de mamferos, os RNAs mensageiros correspondem a apenas 0,5 % do total. RNAs mensageiros de mdia e alta abundncia (para ser considerado abundante um determinado mRNA deve perfazer cerca de 1% da populao de mRNAs) podem ser facilmente detectados em Northern blot utilizando RNA total. Para deteco de mRNAs pouco abundantes necessrio utilizar uma amostra contendo a frao de RNAs mensageiros enriquecida. Para isso, feito um passo de purificao no qual, primeiramente o RNA total desnaturado por calor para que os mRNas exponham a cauda de poliA (presente na grande maioria dos mRNAs e ausente nos RNAs estruturais). Posteriormente eles so incubados com oligonucleotdeos de fita nica formados somente por dTTP, chamados oligo(dT), acoplados a uma resina. Por complementaridade de bases ocorrer a hibridao entre as caudas de poli(A) e o oligo(dT), imobilizando os mRNAs na resina enquanto os demais RNAs permanecem livres na soluo e so eliminados com lavagens. Aps a eliminao da grande maioria dos RNAs sem cauda de poli(A), os mRNAs (poliA+) so eludos aps a desestabilizao dos hbridos oligo(dT):cauda poli(A), o que feito removendo-se os sais presentes na soluo. Como j dissemos, os passos de transferncia das amostras do gel e de hibridao so semelhantes aos do Southern blotting. Um exemplo do resultado obtido aps a hibridao 33

de um Northern blot de RNA total com uma sonda para um gene especfico pode ser visto na figura (13B). Como podemos ver, ela permite a deteco de um tipo especfico de RNA numa amostra complexa (contendo todos os RNAs, mensageiros e estruturais presentes numa determinada clula ou tecido). Essa deteco especfica importante para vrios propsitos, como determinao do tamanho correto do mRNA expresso por um determinado gene, verificao de seu padro de expresso (comparando amostras de diferentes tipos celulares ou em diferentes condies fisiolgicas e patolgicas) e determinao do nmero de mRNAs transcritos a partir de um gene por splicing alternativo, entre outras. RT-PCR Uma outra tcnica, mais sensvel e mais rpida do que o Northern blot, utilizada para deteco da expresso de um determinado mRNA a RT-PCR (Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction). Como vimos no captulo sobre Anlises do DNA, a PCR uma metodologia que permite a amplificao de um segmento de DNA especfico determinado pelos primers utilizados na reao. Alm de ser utilizada para a amplificao de um segmento especfico de DNA dentro de um genoma, a metodologia de PCR pode ser utilizada para amplificar um segmento ou toda a seqncia de um produto gnico, utilizando-se RNA de uma determinada clula ou tecido. Entretanto, como a Polimerase utilizada na metodologia de PCR uma DNA Polimerase depedente de DNA, ela no pode usar RNA diretamente como molde para a amplificao. Assim, inicialmente realizada uma reao de transcrio reversa onde, pela ao da Transcriptase Reversa, o RNA utilizado como molde para gerao de cDNA (ver captulo sobre DNA recombinate), que ento utilizado como molde em uma PCR subsequente. Essa abordagem muito til para se analisar de maneira rpida a expresso de genes de interesse, pois uma vez que a PCR realizada a partir de cDNA, o fragmento correspondente ao gene de interesse s ser amplificado naquelas clulas ou tecidos onde o gene expresso. Alm disso ela pode ser utilizada para clonagem de um cDNA de interesse (desde que j se tenha alguma informao de sua seqncia) sem a necessidade de se construir uma biblioteca de cDNA para isol-lo. MICROARRANJOS DE DNA Com relao aos estudos de expresso gnica, abordagens amplamente utilizadas, como Northern blot e RT-PCR, so bastante sensveis e precisas, porm permitem o estudo de um ou poucos genes de cada vez. Os Projetos Genoma, alm de terem gerado informao sobre as sequncias dos genomas de diversos organismos, impulsionaram um grande desenvolvimento tecnolgico que resultou no aparecimento de novas metodologias de anlises genticas. Uma dessas novas metodologias, os microarranjos de cDNA, permite no s a anlise de expresso de genes especficos mas de padres de expresso caractersticos de 34

certos tipos celulares, estgios de desenvolvimento, condies patolgicas e muito mais. Com a utilizao dessa nova metodologia portanto possvel analisar a expresso de milhares de genes simultaneamente, determinando-se quais deles so expressos em tipos celulares especficos, em momentos e condies particulares, sempre atravs da comparao de duas situaes diferentes. Como no caso do Northern blot, a metodologia de microarranjos baseia-se na propriedade de hibridao dos cidos nuclicos. Mas ao contrrio do Northern, onde o RNA total de determinadas clulas ou tecidos est imobilizado em uma membrana de nylon e o fragmento correspondente ao gene de interesse marcado para a hibridao; no microarranjo, os milhares de fragmentos de DNA que representam genes especficos esto imobilizados num suporte slido, que pode ser uma membrana de nylon, ou uma lmina de vidro e o RNA total que marcado antes de hibridar com os fragmentos gnicos imobilizados. A metodologia que usa a lmina de vidro como suporte a que permite a anlise de maior nmero de genes. Na figura 14 podemos ver um esquema representando os principais passos de um experimento com microarranjos de DNA. Primeiramente, os fragmentos representando genes especficos (derivados, por exemplo, de uma biblioteca de clones de cDNA) so amplificados por PCR e aplicados sobre a lmina por um rob que automaticamente fixa lamina os fragmentos de DNA em minsculos crculos com dimetro da ordem de 0,1 mm ou menos, formando os spots. Cada spot na lmina contm milhares de cpias do fragmento de DNA que representa um determinado gene e sua posio exata fica registrada. Ento, o RNA total de clulas em duas diferentes condies isolado e marcado com dois fluorocromos (corante fluorescente) distintos. A marcao do RNA geralmente ocorre atravs da sntese de cDNA utilizando a transcriptase reversa, onde um dos nucleotdeos fornecidos est conjugado com o corante fluorescente. Para o RNA extrado de clulas na condio 1, a sntese de cDNA feita fornecendo-se um dos nucleotdeos marcado com um fluorocromo vermelho e para o RNA extrado de clulas na condio 2, a transcrio reversa feita na presena de um nucleotdeo marcado com um fluorocromo verde. Os dois cDNAs marcados so misturados e incubados sobre a lmina contendo o microarranjo, para que possa ocorrer a hibridao entre o cDNA marcado e os fragmentos de genes na lmina. Os spots correspondentes aqueles genes que forem expressos na condio 1, ficaro marcados de vermelho, pois havia RNA correspondente a ele na amostra da condio 1 que foi convertido em cDNA marcado com o fluorocromo vermelho. Aqueles que forem expressos na condio 2 ficaro marcados de verde. Os genes que forem expressos em quantidades equivalentes nas duas condies ficaro amarelos, dada a sobreposio de marcao com os cDNAs de ambas as situaes. Estes resultados so obtidos atravs da utilizao de programas de computador que analisam a imagem do microarranjo hibridizado e quantificam a intensidade do sinal de cada spot.

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Figura 14. Esquema da preparao e anlise de microarranjos de DNA.

Este tipo de abordagem est sendo amplamente utilizado para o monitoramento de padres de expresso gnica caractersticos de diferentes situaes, como por exemplo, leveduras crescendo na presena de glicose versus leveduras crescendo na presena de lcool ou clulas de diferentes tipos de cncer em relao a clulas normais. Isto possvel devido a disponibilizao da seqncia genmica dos organismos, no caso da levedura por exemplo, foram analisados microarranjos de DNA contendo cerca de 6000 clones o que representa praticamente todos os genes desse organismo. Nesses experimentos observou-se que quando as leveduras passam de uma condio de fermentao de glicose para crescimento em meio com etanol, seu padro de atividade gnica se altera visivelmente, sendo que cerca de 900 genes so transcritos mais ativamente e outros 1200 tm sua atividade diminuda. Os resultados de experimentos com microarranjos de DNA normalmente revelam um grande nmero de genes que tem sua expresso alterada quando se muda de uma condio para outra. Muitos deles so normalmente genes de funo desconhecida e a anlise do microarranjo pode revelar um grupo de genes com os quais eles se relacionam atravs do padro de expresso, o que pode ajudar bastante na predio da possvel funo desses genes. Esta anlise feita usando-se uma tcnica chamada de clustering, atravs da qual grupos de genes que tm expresso regulada de maneira coordenada podem ser identificados. Os resultados dessa anlise so organizados e mostrados em imagens criadas por programas de anlise que permitem a fcil visualizao desses grupos e fornecem tambm a informao sobre o nvel de expresso dos mesmos em cada uma das situaes. Genes que so ativados 36

ou reprimidos simultaneamente numa dada circunstncia podem compartilhar funes, fazendo parte de uma mesma maquinaria multi-protica ou atuando em processos celulares comuns. Esta , portanto, uma abordagem de grande utilidade para o atual momento da cincia, a fase ps-genmica ou do genoma funcional. CONSTRUO DE BIBLIOTECA SUBTRATIVA A hibridao subtrativa uma tcnica poderosa que permite a comparao de duas populaes de RNAs mensageiros e a obteno de clones que so expressos em uma delas mas na outra no. No necessria nenhuma informao sobre um gene especfico, o que se pretende o isolamento de clones de cDNA correspondentes a transcritos expressos preferencialmente em uma das situaes. Existem vrios mtodos para a gerao de bibliotecas subtrativas, mas o princpio bsico em todos os casos o mesmo. Inicialmente, purifica-se o RNA poliA+ de cada populao de clulas e faz-se a sntese de cDNA. Uma das populaes de cDNA aquela que vai ser testada (teste) a outra a que vai dirigir a subtrao (referncia). O cDNA teste colocado em contato com excesso do cDNA de referncia em condies que permitam o anelamento de molculas complementares. Desse modo, os transcritos expressos em ambas as populaes formaro hbridos, enquanto que os cDNAs exclusivos da situao teste no. Os hbridos so ento separados dos cDNAs fita-simples e estes so convertidos para cDNAs de fita dupla e clonados no vetor de preferncia do pesquisador. Assim, obtm-se uma biblioteca de cDNA dos genes expressos na situao de interesse. A figura 15 descreve o mtodo de hibridao subtrativa tradicional, que tem funcionado com sucesso para vrios casos. Entretanto, esse procedimento no muito adequado para a deteco de transcritos raros. Atualmente esto sendo utilizadas metodologias baseadas em amplificao seletiva de seqncias diferencialmente expressas, o que permite a deteco de transcritos raros de forma eficiente e reprodutvel. SAGE - SERIAL ANALISYS OF GENE EXPRESSION Serial Analisys of Gene Expression, ou SAGE, uma tcnica experimental designada para obter uma medida direta e quantitativa da expresso gnica, baseada em dois princpios, representao de RNA mensageiros (cDNA) por pequenas seqncias chamadas de tags (10-14 bp em comprimento) e a juno serial desses tags para clonagem, formando assim uma longa molcula de DNA para posterior anlise por sequenciamento. O sequenciamento dos clones concatmeros resulta na identificao dos tags individuais, sendo que o nvel de expresso do transcrito quantificado pelo nmero de vezes que um tag em particular observado.

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Figura 15. Representao esquemtica dos principais passos da produo de bibliotecas subtrativas segundo a metodologia convencional de anelamento dos RNAs teste e referncia, e separao dos hbridos. Figura retirada e modificada de Watson et al 1992, Recombinant DNA, Figura7-9, p. 112.

Este mtodo pode ser aplicado para estudar o perfil de expresso gnica de um dado tecido ou tipo celular, identificar novos genes, caracterizar transcriptomas, bem como estudar o padro de expresso gnica em condio normal, patolgica, ou no desenvolvimento, atravs 38

da comparao de perfis construdos para pares de clulas que so mantidas em condies diferentes. A figura abaixo (16) mostra uma representao esquemtica do procedimento do SAGE: Explicando a figura, a dupla fita de cDNA sintetizada tendo como molde os RNA mensageiros atravs de um primer oligo(dt). O cDNA ento clivado com uma enzima de restrio (chamada enzima de ancoragem, AE na figura). Qualquer enzima que reconhea quatro bases pode ser utilizada, porque elas clivaro a cada 256 bp (44) em mdia, enquanto que os RNA mensageiros so, em geral, mais longos. Atualmente, NlaIII, a enzima mais freqentemente usada. A poro 3 do cDNA clivado com NlaIII e sua poro 5-terminal so ento recuperadas ligando-se a beads revestidas com estreptavidina. Aps dividir a reao em duas partes, dois adaptadores independentes so ligados, utilizando o terminal coesivo deixado pela NlaIII, em cada poro. Estes adaptadores so desenhados para conter um stio de restrio para enzimas tipo IIS ( normalmente ForkI ou BsmFI, e so chamadas enzimas formadoras de tag, na figura TE) que fica prximo ou se sobrepe parcialmente a sequncia de NlaIII. As reaes so digeridas com enzima tipo IIS (BsmFI), as pores liberadas so recuperadas. As pores terminais dos produtos se tornaro blunt pela ao da T4 DNA polimerase, que ir preencher as extremidades coesivas do s tags. As duas pores (tag com adaptador-A e tag com adaptador-B) so unidas novamente e ligadas. Como os terminais - 5 dos adaptadores so bloqueados por um grupo amino, somente os terminais derivados dos RNA mensageiros sero capazes de ligarem, em uma orientao cauda - cauda". Os produtos so amplificados por PCR, clivados pela enzima de ancoragem, NlaIII, e ento separados por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Os fragmentos ditags flanqueados por extremidades coesivas NlaIII so isolados e ligados para obter concatmeros, estes so recuperados por PAGE e clonados em um vetor plamidial para sequenciamento. Uma nica reao de sequenciamento pode fornecer informao de 30 a 35 diferentes. DIFFERENTIAL DISPLAY O Differential Display (DD) considerado um mtodo simples que permite efetuar comparaes simultneas entre clulas relacionadas, clulas em condies alteradas ou mesmo entre diferentes tecidos. Para o isolamento determinados RNAs dentre o volume de RNA total, o DD envolve a utilizao de diferentes primers ancoradores contendo cerca de 14 bases T (oligo (dT)), direcionados cauda de poli (A) dos mRNAs (Liang & Pardee, 1992). Esses primers so empregados individualmente em reaes de transcio reversa para a sntese de cDNA, os quais sero amplificados por reaes de PCR atravs da combinao dos primers ancoradores com primers arbitrrios degenerados, contendo de 9 a 10 bases, dirigidos extremidade 5' dos cDNAs (Figura 17). SAGE tags

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Figura 16. Esquema do procedimento da tcnica SAGE (retirado de Yamamoto, M. et al. 2001).

Os primers arbitrrios pareiam em diferentes posies do cDNA em relao aos primers ancoradores. Alm dos reagentes normalmente adicionados sntese de cDNA, tambm sero adicionados nucleotdeos marcados radioativamente ([
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P] - dATP). Aps a amplificao, os

fragmentos obtidos relativos aos cDNAs sero separados atravs de eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida, transferidos para membrana e expostos a filme de raio-X, para subseqentemente visualizao em autorradiogramas (Figura 18).

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AAAAAAAAA-3

-- 3 TTTTT...primer ncora -5
Transcrio Reversa AAAA...3 TTTTT... pri mer ncora -5 Reao de PCR

5 - primer arbitrrio

-TTTTT... primer ncora -5

5 - primer arbitrrio

AAAA...3 TTTTT...primer ncora -5

Figura 17. Diagrama do mtodo Differencial Display. A parte superior da figura indicaa etapa em que o RNA total extrado da amostra transcrito reversamente atravs do uso de primer ncora, cujo poli (dT) se anela cauda poli (A) dos mRNAs. Em seguida, essa primeira fita sintetizada de cDNA amplificada atravs de PCR, onde alm dos primers ncora sero adicionados primers arbitrrios dirigidos ao 5' dos RNAs, na presena de dATP marcado radioativamente, dentre os demais reagentes da reao. Aps a PCR, os fragmentos amplificados sero separados em gel desnaturante de poliacrilamida (Modificado de Martin, K.J. & Pardee A.B., 1999).

Figura 18: Representao esquemtica da anlise comparativa das amostras de cDNA (X e Y) por eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida, indicando pela seta a banda diferencialmente expressa (Modificado de http://genhunter.com/products/rnaimage/index.htm#schematic).

As bandas reconhecidas como diferencialmente expressas so ento excisadas do gel desnaturante, purificadas e re-amplificadas por PCR empregando a mesma combinao de primers responsvel por amplific-la. Com intuito de confirmar se h expresso diferencial, esse cDNA poder ser empregado como sonda em experimentos de hibridao, como northern blot, hibridao in situ ou em ensaio de proteo a RNAse. Assim, apenas aqueles cDNAs que tiverem sua expresso diferencial confirmada nos ensaios de hibridao podero ser clonados e posteriormente seqenciados. A seqncia obtida partir do DNA pode ser empregada para busca da identidade do gene em bancos pblicos de dados. Em perodos contemporneos ao desenvolvimento da metodologia inmeras vantagens 41

eram enumeradas, sugerindo que o DD representava uma das maiores contribuies s ferramentas de anlise da expresso gnica da biologia molecular. Entretanto, com o decorrer dos anos as desvantagens oferecidas pelo mtodo foram sendo detectadas, sendo necessrio o surgimento de propostas de mudanas tcnicas para melhor-lo. As principais crticas referiam-se amplificao inespecfica e ineficiente, que resultavam do pequeno tamanho dos primers empregados e baixa temperatura usada durante a fase de anelamento nas reaes de PCR; a redundncia de clones, em virtude da freqncia de clones correspondentes ao mesmo gene; o grande nmero de falsos positivos detectados, principalmente resultantes de contaminao da banda de cDNA excisada; alm disso, um outro fator questionado seria a sensibilidade do DD, uma vez que a quantidade de dNTPs presentes durante a PCR limitaria a identificao de transcritos raros. Com intuito de solucionar esses problemas e de aumentar a reprodutibilidade do mtodo, as adaptaes tcnicas publicadas referem-se ao uso de primers arbitrrios mais especficos e, alteraes no programa de ciclagem das reaes de PCR, as quais passariam a ser realizadas em duas etapas que diferem quanto durao dos ciclos e extringncia. Alm disso, para garantir a reprodutibilidade do padro de bandas diferencialmente expressas, as reaes de PCR deveriam ser realizadas em duplicatas, e separadas por eletroforese em raias adjacentes para facilitar a seleo de apenas as bandas. (Martin, K.J. & Pardee, A.B., 1999). Os fragmentos selecionados so ento seqenciados e assim so identificados genes canditados a apresentar expresso diferencial entre as situaes em estudo. HIBRIDAO IN SITU Como j mencionamos, o padro de expresso dos genes pode ser elucidado ou por deteco do produto final, a protena ou do intermedirio, o RNA mensageiro. Para visualizao do padro de expresso in situ, as protenas podem ser detectadas atravs da tcnica de imunocito/histoqumica e os RNAs mensageiros, atravs da hibridao in situ (HIS). As tcnicas de imunocito/histoqumica e HIS permitem uma anlise espacial da expresso da molcula em questo. Isto significa saber em que regio especfica do tecido ou clula est presente a protena ou o RNA mensageiro. Esta anlise da expresso gnica in situ de crucial importncia para definir no somente o padro de expresso do gene, mas elucidar sua funo. Uma vez que a expresso da protena e do RNA mensageiro nem sempre se correlacionam, visualizar o padro de expresso de ambos pode trazer informaes distintas. A deteco do padro de expresso da protena um guia mais fiel dos stios de ao dos genes do que o dos RNAs mensageiros. Contudo, a imunocito/histoqumica exige a utilizao de anticorpos especficos para detectar a protena em questo. A metodologia envolvida na produo de anticorpos est descrita no prximo captulo. Por outro lado, as sondas especficas de RNA utilizadas na HIS so obtidas a partir da clonagem do DNA ou por sntese 42

de um oligonucleotdeo, comercialmente adquirido. A HIS utilizada para detectar transcritos em clulas, tecidos e em organismos inteiros, bem como em embries em vrios estgios de desenvolvimento. Logo, a HIS uma ferramenta muito informativa e de alta especificidade. Um hbrido, dentre outras definies, significa a formao de uma fita dupla atravs do pareamento de duas fitas simples de cidos nuclicos complementares. Logo, hibridar significa parear fitas complementares, que podem ser de DNA com DNA, de DNA com RNA ou de RNA com RNA. Portanto HIS uma tcnica usada para caracterizar, localizar e detectar seqncias especficas de DNA em cromossomos e de RNA em sees de tecido morfologicamente preservado ou em preparaes de clulas, atravs do pareamento de fitas complementares. Aqui, abordaremos apenas HIS para deteco de RNA mensageiro. A fita sense do gene contm a informao a ser transcrita em RNA mensageiro e conseqentemente, ser traduzida em protena. Desta forma, a fita antisense serve como molde, durante a transcrio pela RNA polimerase, com a qual o RNA recm-transcrito se pareia, formando um hbrido RNA-DNA (Figura 19). Este o princpio da HIS, onde usa-se a seqncia de nucleotdeo da fita antisense como a sonda para encontrar e parear com o RNA mensageiro. A sequncia fita sense do gene utilizada como controle negativo.

Tipos de Hibridao in situ a) Quanto ao tipo de sonda As sondas utilizadas, na deteco do RNA mensageiro podem ser de DNA, RNA e oligonucleotdeos sintticos. O tamanho da sonda deve ser uma deciso entre a especificidade, quanto maior melhor, e a facilidade de penetrao na clula, quanto menor melhor. Normalmente, so utilizadas sondas de DNA e RNA entre 200 e 300 pares de bases e de oligonucleotdeo de 30-50 pares de bases, devido aos custos na sntese. A preocupao em relao ao tipo de sonda , principalmente, quanto a sua especificidade. A estabilidade do pareamento de RNA com RNA maior que DNA com RNA. Deste modo, ao utilizar sondas de RNA pode-se realizar lavagens com maior estringncia, aumentando a especificidade e eliminando qualquer sinal inespecfico. Ainda a utilizao de sondas de RNA permite a utilizao da fita sense como controle. As sondas de DNA, antes de utilizadas, so desnaturadas, permitindo o que as fitas sense e antisense se separem, mas estas fitas so utilizadas juntamente na hibridao. Com isso ocorre competio da fita sense com o RNA mensageiro a ser detectado, diminuindo muito o sinal e, alm disso, no possvel a utilizao da fita sense como controle do experimento. Um outro problema na utilizao de sondas de DNA a diminuio da estringncia de lavagem, devido a menor estabilidade do pareamento DNA-RNA. Este tambm um problema verificado com a sonda de oligonucleotdeo, uma vez que menor em tamanho para manter a estabilidade tem que ser diminuda a estringncia de lavagem. 43

Figura 19. Esquemas mostrando a transcrio. A) seqncia de DNA com as fitas sense e antisense (molde) e a seqncia de RNA mensageiro transcrita a partir do molde. B) durante a transcrio, a fita dupla de DNA desespiraliza e as fitas se separam permitindo que a fita molde seja transcrita pela RNA polimerase e em seguida volta a conformao original (modificado a partir de Nelson DL & Cox MM, 2000, figura 26-1).

b) Quanto ao tipo de deteco O mtodo de HIS, quanto ao tipo de deteco pode ser: radioativo, fluorescente ou colorimtrico. Para tal so utilizados nucleotdeos marcados com radioistopos, no mtodo radioativo, com diferentes fluorocromos, no mtodo fluorescente e com digoxigenina e biotina, no mtodo colorimtrico. As sondas de DNA e oligonucleotdeos so marcadas por nick translation e randomprimer ou ainda, por polymerase chain reaction (PCR). Na reao de marcao nick translation a enzima terminal transferase adiciona uma pequena cauda de nucleotdeo marcada na extremidade 3 do fragmento a ser utilizado como sonda. Na reao random-primer, a enzima klenow sintetiza um novo DNA baseado no molde, sendo que o nucleotdeo marcado adicionado durante a sntese e, portanto, incorporado na fita inteira, no somente na cauda. A sonda de RNA produzida por transcrio in vitro, onde uma RNA polimerase (T3, T7 ou SP6 RNA polimerase), transcreve a seqncia de DNA. Geralmente, a seqncia de DNA clonada em vetor de transcrio, que possui stios de ligao para as RNAs polimerases. Outro 44

modo de realizar a transcrio construir primers, para gerar a seqncia de DNA por PCR, contendo stios de ligao para RNAs polimerases, eliminando a etapa de clonagem. Durante a transcrio in vitro so adicionados UTPs marcados. A deteco do sinal radioativo feita ou por emulso ou filme fotogrfico. No mtodo fluorescente a deteco do sinal feita diretamente usando um microscpio de fluorescncia. A deteco no mtodo colorimtrico feita utilizando um anticorpo anti-digoxigenina ou antibiotina conjugado com fosfatase alcalina ou peroxidase. Na converso dos substratos NBT/BCIP pela fosfatase alcalina e DAB/imidazole pela peroxidase. Um precipitado formado, que visualizado por microscopia de luz. O mtodo fluorescente pode ser convertido em colorimtrico, usando um anticorpo contra o fluorocromo utilizado conjugado com fosfatase alcalina.

Entendendo os passos da hibridao in situ Aps a deciso de qual tipo de sonda e qual mtodo de deteco utilizar, algumas variveis devem ser discutidas, pois so pontos crticos de um experimento de HIS. So elas: a) Permeabilizao essencial que a sonda encontre o seu alvo (mRNA) na clula. Para a sonda atingir o alvo, dever atravessar a membrana celular, que dever estar permevel. A ao da fixador na clula, tecido ou animal inteiro resulta em cross-linking das protenas, o qual pode se tornar mais um obstculo para a boa infiltrao da sonda. Finalmente, o mRNA pode estar envolvido pelas protenas, o que pode mascarar a seqncia alvo. Portanto, o primeiro passo a ser considerado a permeabilizao da amostra. H diferentes reagentes usados nos procedimentos de permeabilizao, que podem estar alguns ou todos presentes dependendo da amostra utilizada. importante conhecer a amostra e deste modo escolher e adequar quais elementos devem ser utilizados para trat-la. Os reagentes comuns usados na permeabilizao so cido clordrico (HCl), os detergentes como triton X-100, dodecil sulfato de sdio (SDS) ou Tween 20 e proteases, como a proteinase K. A precisa ao do HCl no conhecida, mas possvel que a extrao das protenas e a hidrlise da seqncia alvo ajude a diminuir o nvel de sinais inespecficos. O tratamento com detergentes usado para permeabilizar a membrana, por extrao dos seus lipdeos. Este se constitui em um passo crtico no tratamento de clulas intactas, seces feitas em criostato e organismos inteiros. A proteinase K uma endopeptidase inespecfica, que ataca todas as ligaes peptdicas em condies especiais de pH e dificilmente inativada. Ela usada para remover protenas esto envolvendo a seqncia alvo. As concentraes e durao da incubao com proteinase K devem ser otimizadas e o monitoramento deste passo essencial, considerando que a digesto pode levar a destruio total do tecido ou clula. 45

b) Pr-tratamentos e pr-hibridao Os passos de pr-tratamento e pr-hibridao so geralmente realizados para evitar sinais inespecficos, principalmente em mtodos de deteco que utilizam a peroxidase e a fosfatase alcalina. Estes passos permitem neutralizar a peroxidase e a fosfatase alcalina endgena, as quais no neutralizadas geram sinais inespecficos. Para peroxidase, tratamento com H2O2 em metanol e para fosfatase alcalina, levamisol. Outro pr-tratamento utilizado a acetilao com cido actico e trietanolamina. Este passo somente utilizado com sondas de RNA, pois alm de diminuir o sinal inespecfico, inativa RNAses endgenas que poderiam atacar a sonda, podendo ajudar no aumento do sinal especfico. A fixao efetivamente protege o RNA-alvo da digesto por RNAses endgenas e sondas de oligonucleotdeos e DNA, mesmo desnaturado, so resistentes RNAse. A pr-hibridao envolve a incubao da clula ou tecido ou organismo com uma soluo composta com todos os elementos da soluo de hibridao menos a sonda. c) Hibridao A hibridao depende da habilidade da sonda parear-se fita de mRNA complementar, portanto a composio da soluo de hibridao crtica para controlar a eficincia do processo de hibridao. A temperatura, na qual metade das seqncias de nucleotdeo est presente em forma de fita simples referida como Tm e depende de vrios fatores, inclusive do contedo de G+C. Os fatores que influenciam a pareamento da sonda com alvo, determinam a estringncia da hibridao. So eles: * temperatura - a curva relacionando taxa de renaturao e temperatura mostra que possui ocorrer renaturao na faixa de 16o C a 32o C abaixo da Tm. * pH entre pH 5 e 9, a taxa de renaturao contante, independente do pH. Normalmente o pH utilizado nos tampes de hibridao varia entre 6.5 7.5. Aumentos no pH aumenta a maior a estringncia. * concentrao de ction monovalente ctions monovalentes (por exemplo, ons de sdio) interagem com cidos nuclicos (principalmente no grupo fosfato) de modo que a repulso eletrosttica entre as duas fitas diminui com o aumento da concentrao de sal, ou seja altas concentraes de sal aumentam a estabilidade do hbrido. Baixas concentraes afetam drasticamente a Tm, bem como a taxa de renaturao. .* presena de solventes orgnicos o DNA desnatura a 90o 100o C em 0,2M Na++. Para HIS isto implica que as preparaes deveriam hibridar apelo menos a 65 por tempo prolongado, o que destruiria toda a morfologia da amostra. Os solventes orgnicos, como a formamida, diminuem a estabilidade trmica da dupla fita. Logo, a hibridao pode ser realizada entre 30o 45o C em 50% de formamida.

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d) Lavagens A sonda pode hibridar em seqncias que so parcialmente e no completamente homlogas seqncia da sonda. A lavagem, ps-hibridao, do material desnatura estes hbridos, removendo as sondas livres. As lavagens devem ser realizadas com estringncia estabelecida baseada no tipo de sonda utilizada. A estringncia de lavagem pode ser manipulada variando a temperatura e as concentraes de formamida e de sal. Dependendo do tipo de sonda utilizada na hibridao, a estringncia pode ser aumentada, melhorando a especificidade do sinal.

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IV. ANLISES DE PROTENA Redao: Josane de Freitas Sousa Doutoranda Juliana A. C. da Silva Doutoranda Lucimara Chioato Doutoranda Lyris Martins Franco de Godoy Doutoranda Roberto Ruller Doutorando Valeria Valente - Doutoranda Edio: Alana Maria Cerqueira de Cataln - Mestranda

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INTRODUO Como dissemos, as protenas so as principais efetoras das funes celulares. Portanto, o estudo do padro de expresso, da estrutura e atividade das protenas fornece valiosas informaes a respeito do funcionamento celular. Existem vrias abordagens que permitem o estudo das protenas presentes num determinado tipo celular ou tecido. Elas podem ser separadas atravs de suas propriedades fisico-qumicas (vrios tipos de cromatografia e eletroforese), podem ser detectadas in situ ou a partir de extratos celulares com a utilizao de anticorpos especficos, produo de anticorpos, ou ainda analisadas estruturalmente. Algumas das metodologias relacionadas com estes tipos de abordagem sero descritas abaixo. ELETROFORESE DE PROTENAS As protenas presentes num extrato celular ou numa frao deste podem ser separadas atravs de eletroforese de acordo com suas propriedades fsico-qumicas. Na eletroforese unidimensional, mais rotineiramente utilizada, as protenas so separadas em gel desnaturante de poliacrilamida de acordo com seu peso molecular. O resultado desta eletroforese um perfil de bandas, onde cada uma representa um ou mais polipeptdeos de determinado peso molecular. As protenas presentes numa amostra podem ser submetidas a um processo de separao muito mais refinado, a eletroforese bidimensional, que baseia-se em duas propriedades fsicoqumicas das protenas, o ponto isoeltrico e o peso molecular. A seguir esto descritos cada um destes procedimentos e suas aplicaes. ELETROFORESE UNIDIMENSIONAL E WESTERN BLOTTING O mtodo de eletroforese mais conhecido e mais rotineiramente utilizado para separao de protenas o SDS-PAGE (sigla em ingls para Eletroforese em Gel de Poliacrilamida com Docedil Sulfato de Sdio). Os gis de poliacrilamida so formados pela copolimerizao de molculas de acrilamida (as quais formaro polmeros), com monmeros de NN-metilenobisacrilamida, os quais fazem com que os polmeros de acrilamida sejam ligados covalentemente, atravs da formao de ligaes cruzadas entre eles. Um gel de poliacrilamida possui uma estrutura semelhante uma esponja, com poros distribudos ao longo de toda a matriz. O tamanho mdio dos poros de um gel determinado pelas porcentagens de acrilamida e bis-acrilamida utilizadas. Basicamente, quanto maior a concentrao de acrilamida utilizada, menores sero os poros formados na matriz. Durante a corrida eletrofortica, as molculas so foradas a migrar atravs da matriz do gel, devido voltagem aplicada. Molculas maiores so retardadas pelo gel mais do que molculas menores, fazendo com que a velocidade de migrao seja diferente e permitindo sua 50

separao. Para cada gel em particular, molculas menores do que o poro da matriz migram livremente, como se estivessem em soluo, enquanto que aquelas maiores do que o poro no chegam a entrar no gel. Assim, atravs da escolha da porcentagem de acrilamida do gel, possvel separar e analisar molculas de diferentes faixas de massa molecular, variando de 5 a 200kDa, de acordo com a necessidade de cada experimento. As protenas apresentam uma carga resultante, positiva ou negativa, que depende da sua composio de aminocidos. Portanto, se submetidas a um campo eltrico (um processo chamado eletroforese) elas iro migrar de acordo com a sua carga resultante, o seu tamanho e sua forma. Para que a taxa de migrao e, conseqentemente, a separao das protenas seja regulada apenas com base em suas massas moleculares, torna-se necessria a anulao de suas cargas intrnsecas. Na SDS-PAGE, a carga intrnseca das protenas anulada pela adio de SDS amostra, ao gel e ao tampo utilizado durante a corrida eletrofortica. O SDS um detergente aninico que desnatura as protenas, envolvendo a cadeia polipeptdica na razo aproximada de 1,4g de SDS por grama de protena. Alm de promover sua desnaturao, a ligao do SDS mascara a carga intrnseca das protenas, formando complexos aninicos com carga lquida negativa constante por unidade de massa. O SDS tambm rompe ponte de hidrognio, bloqueia interaes hidrofbicas e em combinao com um agente redutor, como o DTT, elimina as estruturas terciria e secundria das protenas, minimizando diferenas entre suas formas moleculares. Sob essas condies, as protenas apresentam-se na forma de polipeptdeos lineares com densidades de carga (n de cargas/unidade de comprimento) iguais e uma separao eletrofortica exclusivamente por massa molecular possvel. Durante a eletroforese elas iro migrar para o plo positivo do gel numa velocidade que dependar basicamente de seu tamanho, e no da carga nem da forma. Dessa forma, obtm-se um perfil de bandas que podem ser visualizadas com a utilizao de um corante para protenas como por exemplo o azul de Coomassie (Figura 20A). Cada banda representa polipetdeos de mesmo tamanho, cuja massa molecular pode ser estimada pela sua posio no gel atravs de comparao com marcadores de tamanho conhecido. Esse procedimento pode ser usado tanto para identificar e determinar o peso molecular dos componentes proticos de uma amostra complexa (extrato celular total) quanto de determinadas fraes celulares. Entretanto, na identificao dos componentes proticos de uma amostra complexa o processo de eletroforese bidimensional descrito no prximo tem bem mais eficiente e refinado. Uma determinada protena, que tenha sido separada por um dos mtodos de eletroforese, pode ser identificada atravs do uso de um anticorpo especfico. Para isso, primeiramente deve-se transferir as protenas separadas no gel para uma folha de nitrocelulose (um papel especial no qual as protenas podem ser fixadas) e em seguida essa folha deve ser incubada numa soluo contendo o anticorpo acoplado a um marcador. Esse marcador pode ser um istopo radioativo, um corante fluorescente ou uma enzima de atividade facilmente 51

detectvel. Esse procedimento de transferncia e deteco de protenas chamado de Western blot (figura 20B).

Figura 20. Exemplo de resultado de SDS-PAGE e Western blot. Em A, extratos totais de protena de clulas humanas em cultura foram submetidas a SDS-PAGE e o gel foi posteriormente corado com um corante para protenas chamado SYPRO Orange. Cada banda presente no gel corresponde a um ou mais polipeptdeos de um determinado tamanho. Na raia indicada por M foi aplicado um padro de peso molecular, onde cada banda corresponde a um polipeptdeo de tamanho conhecido. Uma rplica no corada do gel foi submetida a transferncia para membrana de nitrocelulose que foi posteriormente incubada com um anticorpo para a protena Miosina V, cuja banda correspondente pode ser observada na figura em B.

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL Atualmente a eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida o mtodo mais eficiente de separao simultnea de milhares de protenas diferentes, possibilitando a anlise de amostras complexas, como extratos celulares. O mtodo consiste basicamente de duas corridas eletroforticas, sendo elas: focalizao isoeltrica em gel de poliacrilamida com gradiente de pH imobilizado (IEF) disponvel comercialmente em faixas estreitas (pH 4-7, 5-6, etc) ou amplas (pH 310) seguida da eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sdio (SDS-PAGE). O gel bidimensional (2-D) resultante pode ser corado com prata ou coomassie blue, sendo a colorao de prata cerca de cinco vezes mais sensvel. Os mapas 2-D so digitalizados e analisados com o auxlio de softwares especializados, capazes de fornecer informaes quantitativas e qualitativas sobre cada spot presente no gel, como pI e massa molecular aparente. 1 Dimenso IEF

A IEF um mtodo eletrofortico que separa protenas de acordo com seus pontos isoeltricos (pI). Protenas so molculas anfotricas, podendo apresentar carga lquida positiva, negativa ou igual a zero, dependendo do pH do ambiente ao seu redor. A carga lquida ou carga total de uma protena a soma de todas as cargas (positivas e negativas) das 52

cadeias laterais de seus aminocidos e de seus grupamentos amino- e carboxi-terminal. O ponto isoeltrico de uma protena o pH especfico no qual sua carga lquida igual a zero. Protenas apresentam-se positivamente carregadas em ambientes com pH abaixo do seu pI e negativamente carregadas em ambientes com pH acima do seu pI (Figura 22A). Se a carga total de uma protena plotada versus o pH de seu ambiente, a curva resultante intercepta a abscissa no seu respectivo ponto isoeltrico (Figura 22B).

Figura 21. Esquema de Eletroforese Bidimensional : (1) uma mistura complexa de protenas submetida focalizao isoeltrica (IEF) em um gradiente imobilizado de pH (IPG). Nesta primeira dimenso as porteinas so separadas por sua carga e focadas em seu ponto isoeltrico (pI); (2) na segunda dimenso, as protenas so separadas pela massa molecular relativa ( Mr) em um gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). (Mir, L. , 2004).

Figura 22: A. Carga resultante de uma cadeia polipeptdica em diferentes condies de pH. e B. Grfico

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da carga resultante de uma protena em funo do pH do ambiente (Berkelman, T. e Stenstedt, T. 1998).

A presena de um gradiente de pH crtica para a tcnica de IEF. Em um gradiente de pH, sob a influncia de um campo eltrico, as protenas migram em direo aos plos positivo ou negativo, dependendo de suas caractersticas. Protenas positivas migram em direo ao ctodo (-), enquanto que protenas negativas migram em direo ao nodo (+). Durante a migrao ao longo do gradiente, as protenas vo se tornando progressivamente menos carregadas, at atingirem o ponto onde apresentam carga lquida igual a zero (pI), onde ficam imobilizadas. Se uma protena afasta-se do seu pI por difuso, ela imediatamente ganha carga e migra de volta ao seu ponto original. O gradiente de pH utilizado na IEF formado pela distribuio de anflitos (pequenas molculas solveis, anfotricas e com grande capacidade tamponante prximo ao seus pI) com diferentes valores de pI ao longo de gis de poliacrilamida em forma de tubos ou fitas estreitas. A concentrao de acrilamida nesses gis muito baixa (~3%), produzindo uma malha com poros grandes (ver seo SDS-PAGE) e fazendo com que o tamanho das protenas no seja um fator limitante para a migrao. A IEF realizada sob condies desnaturantes e redutoras a que apresenta a melhor resoluo, uma vez que cada protena tende a estar presente em uma nica configurao e que a agregao e interaes intermoleculares so minimizadas. A desnaturao e solubilizao das protenas pode ser atingida na presena de uma mistura de uria em alta concentrao e de um detergente no inico ou zwitterinico (CHAPS, Triton X-100 ou NP-40). O uso de detergentes inicos no recomendado para evitar que a carga dos mesmos mascare a carga das protenas, causando interferncia no processo de focalizao. Para permitir o completo desdobramento das protenas a partir da quebra das pontes dissulfeto, utiliza-se ainda um agente redutor, como o ditiotreitol (DTT), adicionado amostra imediatamente antes do uso. 2 dimenso SDS-PAGE Uma vez separadas por ponto isoeltrico durante a IEF, as protenas so submetidas SDS-PAGE, onde so separadas por massa molecular (Mr). Essa etapa pode ser realizada em gis de poliacrilamida com diferentes concentraes de acrilamida, dependendo da faixa de massa que se deseja abranger. Os princpios da SDS-PAGE foram descritos no tem anterior sobre eletroforese unidimensional e Western blotting. Deteco das Protenas e Anlise dos Gis Bidimensionais Os gis resultantes so ento corados por prata ou azul de coomassie e podem ser digitalizados para posterior anlise. A anlise dos mapa 2-D realizada com o auxlio de softwares especializados, capazes de prover informaes quantitativas e qualitativas sobre cada protena presente no gel. Esses programas de anlise permitem ainda realizar 54

comparaes entre vrias imagens simultaneamente, tornando possvel comparar amostras provenientes de diferentes experimentos e identificar diferenas e semelhanas entre elas. Protenas de interesse podem ento ser retiradas do gel e caracterizadas atravs de mtodos como a espectrometria de massa e o sequenciamento N-terminal. Limitaes da Bidimensionais As limitaes so principalmente decorrentes da complexidade das clulas eucariticas, devido a grande quantidade de protenas diferentes ser sendo superior a capacidade de visualizao em apenas um gel 2-D A segunda importante considerao refere-se a concentrao de protenas dentro da clula que pode variar muito tornando difcil a deteco das menos abundantes. A complexidade envolvida em estudos de proteoma das clulas eucariticas no se deve apenas ao grande nmero de protenas e diferenas em sua concentrao, mas tambm s diferentes caractersticas fsico-qumicas das protenas, como ponto isoeltrico extremo, hidrofobicidade e massas moleculares (de 5 kDa a 500 kDa). Protenas hidrofbicas (ex.: protenas de membranas) so geralmente insolveis, de difcil extrao e migrao durante a primeira dimenso, exigindo a adio de reagentes alternativos que aumente a solubilidade . Devido complexidade e limitaes atuais de separao de protenas, uma nova tendncia vem surgindo no sentido de reduzir a complexidade das misturas de protenas e se estudar compartimentos celulares. Vrias organelas vm sendo estudadas, podendo-se destacar os exossomos, fagossomos , ncleos , complexo de Golgi e mitocndrias As vantagens do pr-fracionamento em organelas so: reduo do nmero de protenas e, portanto, da complexidade da amostras devido ao pr-fracionamento e localizao dos processos bioqumicos especficos dentro de um tipo de organela celular. Alm disso, o prfracionamento das organelas, pode permitir o isolamento de protenas presentes com baixo nvel de expresso nas clulas. EXPRESSO DE PROTENAS HETERLOGAS O uso de protenas produzidas heterologamente, isto , em organismos diferentes daqueles que lhes deram origem, tem crescido muito nos ltimos anos. As vantagens de produzir estas protenas, geralmente ligadas a outras protenas (tag), cujas caractersticas facilitam o processo de purificao e deteco, so agora amplamente reconhecidas. Estas protenas quimricas so chamadas protenas de fuso. Os genes caracterizados e identificados, ou parte dos mesmos, podem ser expressos em diversos organismos para a obteno de grandes quantidades de protenas para estudos diversos, tais como: anlise da atividade biolgica da protena, estudos da relao entre estrutura e funo, interaes, produo de anticorpos, produo de protenas para fins teraputicos, produo de vacinas e produo de enzimas. 55

Para a produo de protenas heterlogas so necessrias algumas consideraes sobre a clula hospedeira a ser utilizada, o vetor apropriado para a expresso da protena e as caractersticas da protena tag qual a protena de interesse estar ligada. Isso diz respeito aos meios mais adequados para posterior purificao e deteco da protena de fuso.

Clula hospedeira e Vetores Para a expresso de protenas recombinantes necessrio a escolha adequada da clula hospedeira, sempre tendo como referncia qual ser a aplicao final desta protena recombinante (Tabela I). Para a clonagem do gene de interesse, todos os vetores utilizados possuem um conjunto de stios nicos de restrio em seguida seqncia promotora. A escolha do vetor depende da clula hospedeira a ser utilizada. Uma vez que a clula hospedeira foi selecionada, muitos vetores podem ser adequados, desde simples vetores de expresso at aqueles que levam a protena de fuso a ser secretada no meio de cultura (Tabela II). Um fator chave, que tem aumentado o uso de vetores que levam produo de protenas de fuso, a facilidade de purificao da protena expressa. importante lembrar que todas as tcnicas de expresso possuem vantagens e desvantagens que devem ser consideradas antes de se optar por uma em especfico. A tcnica mais popular para a expresso de protenas heterlogas a expresso em E. coli.

Expresso de protena heterloga em E. coli Pretendemos neste tpico descrever os passos bsicos envolvidos na expresso de protenas heterlogas em E. coli, desde a clonagem da seqncia de DNA codificante at a resoluo dos problemas mais comuns durante a expresso.

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Tabela I: Clulas hospedeiras mais comumente utilizadas na produo de protenas heterlogas. Clula Hospedeira Bactria Escherichia coli Vantagens

Desvantagens

Bactria Staphylococcus aureus Clulas de mamferos

Sistema muito bem conhecido e com muitas referncias; Pode ser utilizada com uma ampla variedade de vetores; Fcil crescimento; Grande quantidade de protenas recombinantes (at 50% do total de protenas da clula). Secreta a protena de fuso no meio de crescimento. A protena recombinante possui a mesma atividade biolgica que a protena nativa; H vetores para expresso em clulas de mamferos; Pode-se crescer a cultura em larga escala. Protocolos bem estabelecidos; No h deteco de endotoxinas; Fcil manuseio; Facilitao da glicosilao e da formao de pontes dissulfeto; Somente 0,5 % das protenas secretada; Produo em larga escala. Muitos mecanismos de processamento so similares outras clulas eucariticas; Ocorre a parada da expresso de protenas da clula hospedeira, gerando altos nveis da protena recombinante. Sistemas bem estabelecidos para a fermentao de fungos filamentosos; Baixo custo; Pode secretar grandes quantidades de protena recombinante no meio de cultura.

No h modificaes pstraducionais; Atividade biolgica e imunogenicidade podem ser diferentes da protena natural; Clulas gram negativas contm altos nveis de endotoxinas. No expressa altos nveis de protena recombinante como a E. coli; Patognico. Alto custo e difcil crescimento das clulas; Clulas manipuladas podem ser geneticamente instveis; Baixa produtividade comparada com microorganismos; Expresso gnica mais dificilmente controlada; A glicosilao no idntica aos sistemas de mamferos.

Leveduras

Clula de inseto (vetor Baculovirus)

Fungos

No possui informaes para mecanismos de glicosilao; A protena nem sempre funcional; Alguma diferena nas propriedades funcional e antignica entre a protena recombinante e a nativa. Nvel de expresso baixo; Gentica ainda no bem conhecida; No h vetores viveis. Baixa eficincia de transformao; Longo perodo de gerao.

Plantas

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Tabela II: Vantagens e desvantagens sobre o uso de vetores de protena de fuso e protena intacta. Vetores Vantagem Desvantagem Protena de fuso ou Compartimentos celulares podem O tag pode interferir com a ser utilizados como alvo; estrutura da protena, afetando hbrida o seu dobramento e sua funo Produz um marcador para a biolgica; expresso; simples, utilizando Os stios de clivagem para a Purificao cromatografia; remoo do tag nem sempre so 100% especficos. Fcil deteco; Ideal para protenas secretadas, facilitando o processo de purificao da mesma do meio de cultura. no so necessrios passos de Difcil purificao e deteco; Protena sem fuso clivagem da protena. Pode haver problemas com a ou intacta solubilizao da protena. Clonagem em Vetor de Expresso O procedimento para a clonagem de um fragmento de cDNA para expresso exatamente igual a qualquer clonagem, como descrito no captulo sobre Tecnologia do DNA recombinante. No entanto, deve se tomar o cuidado para que a seqncia seja clonada na direo certa e em fase de leitura correta com o ATG iniciador do sinal de traduo de genes procariticos. Alm disso, um vetor para expresso em E. coli deve apresentar as seguintes caractersticas:

Origem de replicao Marcador para seleo: gene que confere resistncia a antibiticos como ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol, neomicina para a seleo das colnias contendo o vetor. Ex. o gene da -lactamase que confere resistncia a ampicilina. Promotor para transcrio: como os vetores de expresso so normalmente projetados no sentido de produzir protena em abundncia, o DNA codificante para uma dada protena deve ser colocado sob o comando de um promotor forte (exemplos: lacZ, tac (trp+lacZ), l -pR, l -pL, pf
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do bacterifago T7) e regulvel, isto , contendo um repressor para manter os nveis

basais de expresso do gene insignificantes at a induo, o que se faz geralmente por adio de IPTG, no caso por ex. do repressor lacI, ou choque trmico, no caso do repressor cIts857.

Sinal de terminao da transcrio Sequncias para controle da traduo, como por ex., um stio de ligao ao ribossomo para a iniciao da traduo (Shine-Dalgarno) e um ATG iniciador. Um sinal de terminao da traduo (cdon de terminao) tambm deve estar presente no vetor ou no inserto a ser clonado, ou deve ser adicionado. Um MSC para facilitar a insero do gene de interesse na orientao correta. 58

Dentre os principais vetores utilizados com sucesso para a produo e purificao de protenas de fuso podemos citar:

pGEX: apresenta a glutationa-S-transferase de Schistosoma japonicum (26 kDa) como protena marcadora (tag), permitindo a purificao da protena de fuso em coluna de agarose-glutationa. pMAL: apresenta a protena ligante de maltose (PLM) de bactria (42 kDa) como tag, permitindo a purificao da protena de fuso em coluna com amilose (um polissacardeo de maltose) acoplada. pQE: apresenta um "tag" de 6 resduos de histidina e permite a purificao das protenas de fuso em colunas quelantes de Ni2+. pUR: cuja fuso um fragmento da -galactosidase. Uma vez construdo, o vetor de expresso contendo a seqncia codificadora da

protena de interesse introduzido em E.coli por transformao.

Expresso da Protena Heterloga Aps a clonagem em vetor de expresso e subseqente transformao em E. coli, os clones obtidos passam por um processo de seleo para a identificao de quais clones possuem a seqncia de interesse em fase correta de leitura para a produo da protena. Esta anlise pode ser feita por digesto do DNA do plasmdio com enzimas de restrio ou por reao de PCR. Estas anlises so procedimentos bastante simples, entretanto devem ser feitas com muita cautela e ateno uma vez que seu objetivo selecionar o clone recombinante correto. Aps esta primeira anlise, os clones positivos, em relao ao tamanho e orientao da seqncia, devem ser seqenciados para confirmao da seqncia e fase de leitura e possveis mutaes que possam ter ocorrido durante o processo de clonagem. Com a confirmao dos clones que possuem a seqncia do DNA de interesse em fase correta de leitura, inicia-se a fase de expresso da protena. Os clones so inoculados em meio lquido que contenha o marcador para seleo (ex. ampicilina) e aps a cultura de bactria atingir determinada D.O. (densidade ptica), faz-se a induo do promotor forte (ex. lacZ), por adio de indutor (no exemplo, IPTG). Aps algumas horas de induo a cultura centrifugada, as clulas so coletadas e processadas para a posterior purificao.

Purificao da Protena de Interesse Como j foi dito, o procedimento mais utilizado para a produo de protenas heterlogas o de expressar a protena de interesse em fuso com um "tag" especfico, o qual permita a fcil purificao atravs de cromatografia por afinidade. So usadas resinas s quais esto acoplados ligantes, aos quais o tag liga-se especificamente. Geralmente os vetores de expresso de protenas de fuso utilizados em E. coli possuem uma regio, inserida 59

imediatamente antes do stio de clonagem, que codifica stio sensvel a uma determinada protease (ex: fator Xa, trombina). Assim, aps, a protena de fuso haver se ligado resina, ela tratada com a protease adequada e clivada. O tag continuar ligado resina e a protena de interesse poder ser obtida por eluio. Devido ao procedimento de protelise ser relativamente trabalhoso e nem sempre eficiente, em casos que o tag no interfira nos passos subseqentes, utiliza-se a prpria protena de fuso, por exemplo, para experimentos funcionais, produo de anticorpos, etc.

Problemas Mais Comuns Embora a produo de protenas de fuso seja geralmente muito simples, eficiente e de baixo custo financeiro, podendo suprir de imediato, necessidades da pesquisa bsica, muito importante salientar que a situao exposta acima nem sempre atingida com facilidade. Na grande maioria das vezes, protenas de eucarioto produzidas em bactria no so solveis; s vezes podem ser txicas para a clula; algumas so expressas em baixos nveis; em alguns casos a conformao da protena de fuso pode mascarar o tag, impedindo sua ligao resina de afinidade e tornando a purificao menos eficiente; outras formam agregados extremamente insolveis mesmo na presena de SDS/ -mercaptoetanol; algumas tm a sua atividade biolgica plenamente recuperada, porm outras so inativas. Assim sendo, podemos citar alguns dos problemas mais comuns que ocorrem com a produo de protenas heterlogas em E. coli:

Protenas txicas: algumas protenas so txicas para a clula hospedeira. Uma alternativa produo de protena citoplasmtica, torn-la uma protena de secreo. Para tanto basta clonar o DNA de interesse em fuso com uma seqncia codificante para um peptdeo sinal de procarioto. Um exemplo a expresso do hormnio fator de crescimento epidermal humano (hEGF) sob o comando do promotor da fosfatase alcalina (phoA) e com a seqncia sinal desta. Protenas instveis: isto pode ser resolvido reduzindo-se a temperatura de crescimento ou mudando-se para uma linhagem de bactria deficiente em uma ou mais proteases (ex. BL21). Mesmo assim comum se obter algum nvel de fragmentao da protena expressa. Baixos nveis de expresso: pode ocorrer pelas razes acima, alm de outras, como, por exemplo, instabilidade do mRNA, traduo ineficiente. Protenas insolveis: protenas de eucariotos produzidas em bactria so geralmente precipitadas na forma de corpos de incluso e requerem procedimentos adicionais de desnaturao para solubiliz-las e de renaturao para mant-las solveis e funcionais. Isto nem sempre um problema, pois a formao de corpos de incluso pode proteger a protena contra a degradao por proteases bacterianas e tambm facilitar a purificao. Pode-se tambm tentar atenuar a formao de corpos de incluso alterando as condies de 60

expresso, por exemplo, crescendo-se a cultura a temperatura mais baixa aps a induo ou utilizando um promotor mais fraco. PRODUO DE ANTICORPOS Anticorpos so protenas que reconhecem um antgeno de forma especfica e com alta afinidade, sendo definido como uma imunoglobulina capaz de se combinar especificamente com o antgeno que causou sua produo em um animal suscetvel. Os anticorpos so produzidos por linfcitos B em resposta presena de molculas estranhas ao corpo, sendo de grande importncia nos mecanismos de defesa do organismo. Na Biologia Celular e Molecular os anticorpos so importantes ferramentas amplamente utilizadas para o estudo das protenas. Eles podem ser utilizados para caracterizao do padro de expresso e quantificao de protenas atravs de Western blot, imunocito e histoqumica e tambm para anlises de interao protica como por exemplo em experimentos de imunoprecipitao. Os anticorpos, coletivamente denominados imunoglobulinas (Ig), so formados por quatro subunidades ligadas entre si por quatro pontes dissulfeto. Estas quatro subunidades so constitudas de duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L). A forma dos anticorpos se assemelha a de um Y, sendo que na parte de cima se encontram dois stios idnticos de ligao ao antgeno, o que possibilita a ligao cruzada entre eles, podendo desta forma produzir uma malha antgeno/anticorpo, isto , um precipitado. Os anticorpos so classificados em IgA, IgD, IgE, IgM e IgG, sendo que o IgG representa 75% das Ig totais e devido a isso to largamente utilizado nas tcnicas envolvendo anticorpos. O stio de reconhecimento dos antgenos est localizado onde as partes variveis de H e L se encontram, fazendo com que variaes tanto de H como de L alterem este stio, sendo que o responsvel pela imensa variedade de anticorpos possveis parece ser a combinao das variaes destes dois stios. Um certo antgeno pode ser reconhecido por vrios anticorpos sendo que cada um deles reconhece uma parte diferente ou se liga de uma forma diferente ao antgeno, atravs de uma parte deste denominada epitopo. At antgenos pequenos como o grupo dinitrofenil podem ser reconhecidos por vrios anticorpos, ou seja, possuem vrios epitopos. Desta forma, um antgeno grande, como uma protena, pode possuir inmeros epitopos, cada qual induzindo a produo de um anticorpo especfico. Para as anlises de protenas podem ser produzidos dois tipos de anticorpos:

Policlonais - Anticorpos policlonais (como diz o nome) derivam-se de vrios clones, ou seja, originam-se a partir de diferentes linfcitos B, o que significa que reagem com vrios epitopos do antgeno (por exemplo, vrias partes de uma protena). Monoclonais - Este tipo de anticorpo provm de somente um linfcito B, selecionado artificialmente e replicado diversas vezes como um clone. Desta forma, este anticorpo reconhece um nico epitopo. 61

Produo de Anticorpos Policlonais 1. Purificao do Antgeno - O primeiro passo para a produo de um anticorpo a purificao do antgeno. Isto pode ser realizado de diversas formas, usando tcnicas de purificao como cromatografia e eletroforese. 2. Imunizao - A imunizao realizada aplicando-se no animal (coelho, camundongo, cabra etc.) o antgeno juntamente com conjunto de substncias que ativam o sistema imunolgico, denominado de coadjuvantes, como por exemplo o coadjuvante de Freud. Aps alguns dias, o sangue do animal recolhido e, atravs de centrifugao, separado o soro, no qual se encontram os anticorpos. 3. Purificao dos Anticorpos - Na maioria dos casos possvel utilizar o soro, pois a grande maioria de anticorpos ali presente so os anticorpos sintetizados contra o antgeno injetado, mas em alguns casos necessrio separar a frao das imunoglobulinas ou at o anticorpo especfico. Isto geralmente realizado com cromatografia por afinidade, na qual se usa a anti-imunoglobulina, a protena A ou o prprio antgeno como fase estacionria numa coluna de afinidade. ESPECTROMETRIA DE MASSA Um espectrmetro de massa um instrumento analtico que determina a massa molecular de compostos qumicos. Isto feito pela ionizao destes compostos e posterior separao dos ons moleculares de acordo com sua razo massa por carga (m/z). Os espectrmetros so constitudos, basicamente, de uma fonte de ionizao, um analisador de massa (que mensura a razo m/z dos analitos ionizados) e de um detector (que registra os ons detectados em cada valor de m/z). O resultado do processo um espectro que fornece a massa molecular das molculas analisadas e/ou informaes estruturais sobre as mesmas. As protenas de interesse so submetidas digesto enzimtica in situ, normalmente com a utilizao de tripsina, sendo os peptdeos resultantes da digesto extrados do gel e submetidos anlise nos espectrmetros de massa, onde so ionizados positivamente, podendo assumir uma ou mltiplas cargas. A formao dos ons realizada atravs da induo de ganho ou perda de carga das molculas (p.ex. ejeo de eltrons, protonao ou desprotonao). Os ons gerados so ento separados e tm suas massas moleculares determinadas com base na sua razo massa/carga (m/z). As abordagens mais utilizadas para caracterizao e identificao de protenas por espectrometria de massa so o Peptide Mass Fingerprint ou mapeamento de massas peptdicas, e o Tandem Sequencing ou sequenciamento peptdico. A anlise por Fingerprint baseia-se na determinao das massas dos peptdeos tripsnicos (ons parentais) gerados aps a digesto de uma protena (Figura 23). Uma vez que a tripsina uma enzima stio-especfica (cliva a ligao peptdica no lado C-terminal de arginina e lisina), a populao de peptdeos gerados aps a digesto depende da sequncia de cada 62

protena e virtualmente exclusiva da mesma. Para essas anlises, um espectrmetro tipo MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight) o mais adequado, pois apresenta alta sensibilidade e permite determinar a massa de peptdeos com grande preciso (erro de 0,1 a 0,2 Da). A tcnica de seqenciamento de peptdeos por espectrometria de massa baseia-se na determinao das massas dos peptdeos gerados aps a fragmentao de um on parental, que pode ser realizada de vrias maneiras. O mtodo de fragmentao mais utilizado a Dissociao Induzida por Coliso (CID), que pode ser realizada em espectrmetros do tipo ESIMS. (Electrospray Ionization Mass Spectrometer). Nessa tcnica, conhecida tambm como MS/MS, ons parentais so selecionados individualmente e direcionados para uma cmara de coliso, onde so bombardeados com um feixe de argnio. O processo de coliso promove a clivagem da molcula, especialmente nas ligaes peptdicas, gerando uma nova populao de ons, denominados de ons filhos. Os ons filhos gerados desta dissociao so ento resubmetidos separao e tm suas massas determinadas, originando um espectro de MS/MS. A diferena de massa entre dois ons filhos consecutivos representa a massa do aminocido perdido durante a clivagem. Portanto, a partir da anlise seqencial do espectro, possvel determinar a estrutura primria do peptdeo selecionado (Figura 24).

Figura 23. Espectro de Fingerprint - MALDI-TOF. No espectro esto representados os ons parentais resultantes da digesto in situ com tripsina, utilizado na anlise de Fingerprint.

A combinao de cromatografia de fase reversa e de troca inica (cromatrografia em duas dimenses) com o mtodo de identificao individual dos componentes por espectrometria de massa tem demonstrado bons resultados para a anlise de protenas em misturas complexas com diferentes nveis de concentrao, tendo como vantagem a capacidade de identificar at centenas de protenas em uma nica experincia. Tal combinao 63

pode ser til quando necessrio um alto grau de recobrimento das sequncias, como no caso do estudo da mutao de um nico aminocido, ou ainda no estudo de protenas de membranas pouco acessveis por outros mtodos.

Identificao de Protenas em Bancos de Dados Recursos de Bioinformtica As informaes obtidas pelos mtodos de caracterizao j descritos, tais como pI, massa molecular, fingerprint de massa e estrutura primria de peptdeos/protenas, servem como base para a identificao de protenas de interesse. Esse processo feito a partir da comparao com informaes contidas em bancos de dados, atravs da utilizao de programas encontrados em sites especializados, dentre os quais destacam-se o ExPaSy (http://us.expasy.org) o Protein Prospector (http://prospector.ucsf.edu) e o BLAST (http://www.ncbi.nih.gov/BLAST).

L B 3 7 3 - s p o t 1 , in s itu tr y p d ig , c o o m a s s ie G , C 1 8 3 0 u l o f 7 0 % M e O H , 0 .0 2 % F o r m ic , n flw , m c a
L Y R IS -L B -0 0 9 1 (1 .0 2 1 ) C n (T o p ,1 , H t); S m (S G , 3 x 3 .0 0 ); S b (2 ,3 5 .0 0 ) 100
1 1 9 .9

D a u g h te rs o f 5 4 8 E S + 4 .4 1 e 4
5 4 9 .1

a2

R
%
8 8 .8 7 0 .0 1 1 7 .4 5 9 .9 1 3 2 .7 1 4 3 .1

1 7 5 .1

1 9 1 .0

N
b2
2 1 8 .8

A
b3
3 3 4 .0 2 8 8 .8 2 5 5 .4 2 6 5 .8 3 0 0 .1 3 2 5 .8 3 5 9 .7 3 7 3 .3

A
4 3 1 .2

2 0 1 .0 2 2 9 .9 1 7 0 .1 2 5 2 .9

4 1 4 .3 4 4 9 .0 4 0 3 .5

4 7 7 .2

4 9 2 .2 5 1 7 .0

5 6 0 .7 5 4 1 .2 5 6 6 .2

4 5 9 .1

0 50 100 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550

m /z

6 4 7 .0

Lx

D
8 7 6 .4

7 6 0 .9

6 3 0 .2 5 8 0 .0 6 0 7 .5

6 6 3 .1

6 8 5 .9 7 0 8 .3 7 1 9 .1 6 7 4 .2

8 5 7 .4 7 4 3 .3 7 7 9 .1 8 0 3 .0 8 1 0 .2 8 4 5 .4 8 9 6 .1 9 2 8 .6

9 4 6 .7 9 4 5 .0 9 4 8 .8 9 8 1 .2 1 0 3 7 .0 1 0 4 3 .9 1 0 7 2 .5 1 0 8 8 .5

0 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050

m /z 1100

Figura 24. Espectro de Seqenciamento CID (MS/MS) ESI-MS. O espectro mostra uma srie de ons filhos obtidos aps fragmentao do on parental de m/z 548 [+2H].diferena entre os valores m/z entre os ons foi utilizada para deduzir a seqncia de aminocidos do peptdeo (FADLxSEAANR).

BIOFSICA DE PROTENAS Renovelamento Protico Um problema comum encontrado na expresso de protenas heterlogas em hospedeiros procariotos a produo de uma forma insolvel de protena chamada corpo de incluso. Corpos de incluso so agregados proticos de estrutura aleatria desprovidos de atividade funcional encontrados no citoplasma das clulas hospedeiras. O processo de renovelamento envolve basicamente o isolamento destes corpos de incluso, desnaturao e renaturao protica. O isolamento desses agregados a primeira etapa do processo, 64

envolvendo repetidas passagens por detergentes, sonicao e centrifugao, que fundamental, uma vez que esses corpos so densos, precipitados baixa velocidade enquanto a maioria das protenas bacteriana permanece no sobrenadante. Aps o isolamento dos corpos de incluso, etapa relativamente simples do processo, na desnaturao e renaturao protica que encontram-se as principais dificuldades, pois necessrio encontrar as melhores condies fsico-qumicas para cada protena expressa. Na etapa de desnaturao so utilizados agentes desnaturantes (tiocianato de guanidina, hidrocloreto de guanidina e uria) e redutores, que facilitam o rompimento das pontes dissulfeto formadas incorretamente durante a expresso permitindo dessa forma a solubilizao da protena de interesse. Quanto maior o nmero de dissulfetos da protena maior dever ser a concentrao do desnaturante e redutor utilizado. As etapas subseqentes envolvem a retirada do agente desnaturante permitindo maior estabilidade das interaes hidrofbicas essenciais para o equilbrio termodinmico da estrutura nativa da protena expressa, alm da adio de agentes oxidantes e redutores que permitem a formao de dissulfetos termodinamicamente mais estveis. Aps o processo de renovolemanto, a protena recombinante purificada de acordo com suas caractersticas fsico-qumicas e um dos experimentos subseqentes a anlise da estrutura secundria.

Analise Estrutural das Protenas 1. Dicroismo Circular de Biomolculas O dicrosmo circular (CD) uma tcnica propcia para estudos de biomolculas em soluo. A tcnica exclusivamente sensvel assimetria do sistema. CD por definio a diferena na absoro da esquerda (Al) e da direita (Ar) de uma luz "circularmente" polarizada (Circularly polarized light - CPL). A atividade tica de aminocidos devida principalmente sua assimetria decorrente da presena de tomos de carbono-, os quais podem produzir o que chamamos de um efeito quiral e possvel interferncia desses tomos nos cromforos vizinhos. As bandas de CD de protenas ocorrem em duas regies do espectro, na regio compreendida entre 170 e 250nm denominada de UV-distante, a qual est dominada pela ligao peptdica, e a outra regio compreendida entre 250-300nm correspondente ao denominado UV-prximo, na qual h uma maior contribuio dos aminocidos aromticos. As bandas que esto relacionadas ao UV-distante revelam informaes a respeito das ligaes peptdicas e da estrutura secundria da protena e so frequentemente empregadas para monitorar a estrutura secundria no curso das transies estruturais. Em relao s hlices- e a folhas-, estas estruturas secundrias apresentam um espectro de CD caracterstico na regio do UV-distante (170-250nm). Em protenas com suas formas estruturais nativas, a composio dos elementos de estrutura secundria altamente definida, 65

resultando em um espectro de CD caracterstico. J o espectro de CD correspondente ao UVprximo (250-300nm) tem representao direta e sensvel sobre o estado nativo da protena, sendo por este motivo muitas vezes usado para avaliar o estado de enovelamento protico. A -hlice de "mo direita " a estrutura secundria dominante em muitas das protenas globulares, sendo assim muito relevantes neste estudo. Sabe-se que o espectro de CD destas estruturas caracterizado pela banda negativa com magnitude mxima de separao em 222nm. Uma outra caracterstica estrutural regular de uma protena que elas possuem, na ausncia de random coil, um forte sinal negativo de CD abaixo de 200nm, e uma banda positiva entre 218nm em muitos sistemas. Protenas dobradas corretamente no possuem elementos random coil.

2. Anlise da Fluorescncia de Protenas Uma variedade de molculas biolgicas possuem naturalmente fluorforos (substncias capazes de exibir fluorescncia) intrnsicos. Nas protenas o triptofano o aminocido mais fluorescente, seguido pelos resduos de tirosina e fenilalanina. Os resduos de Trp so responsveis geralmente por mais de 90% do total de fluorescncia da protena. Sabe-se que as propriedades fluorescentes do triptofano devem-se a seu ncleo indol. O grupo indol do triptofano e seus derivativos so altamente sensveis polaridade do seu microambiente, portanto a emisso mxima da protena refletida da mdia de exposio dos seus resduos de triptofano para a fase aquosa. So observadas mudanas espectrais na emisso resultante de vrios fenmenos, como associao de ligantes ou interaes protena-protena, desnaturao, entre outros. Em particular, os estudos de fluorescncia dos aminocidos aromticos Tyr e Trp fornecem informaes sobre as variaes ocorridas no "microambiente" destes resduos. A metodologia vantajosa por oferecer resultados satisfatrios sobre as alteraes na conformao terciria da protena, com a vantagem de utilizar quantidades reduzidas de protenas. A fluorescncia da maioria das protenas dominada pela emisso do resduo triptofano. O ncleo indlico incluindo os seus derivados muito sensvel polaridade do seu microambiente. Como conseqncia, o espectro de emisso do resduo de triptofano pode refletir a polaridade do ambiente que o circunda. A caracterizao deste ambiente do Trp e consequentemente da protena em que o mesmo est inserido pode ser feita atravs de estudos de fluorescncia intrnseca do triptofano (FIT). A absoro das protenas em 280nm devida aos resduos de tirosina e de triptofano. Em comprimentos maiores, como 295nm, a absoro primariamente do resduo de triptofano. Isso sugere que este resduo pode ser seletivamente excitado de 295 a 305nm, fato confirmado experimentalmente. Os espectros de emisso de fluorescncia dos aminocidos aromticos so mostrados na Figura 25 A emisso do resduo de tirosina em gua ocorre em 302nm e relativamente insensvel polaridade do solvente. A emisso mxima do triptofano na gua 66

de 348nm sendo altamente dependente da polaridade do microambiente. Nos experimentos com protenas, estas so excitadas em um comprimento de onda prximo a 280nm ou maiores. Conseqentemente, a fenilalanina no excitada na maioria das situaes, pois tem um pico mximo de absoro prximo a 260nm. Assim a emisso desse resduo muito baixa e raramente observada.

Intensidade de Fluorescncia

1 .0

302 nm Tyr

282 nm Phe 0 .5

348 nm Trp

0
240 280 320 360 400 440 480

Comprimento de onda (nm)

Figura 25- Espectro de emisso de fluorescncia de fluorforos naturais (retirado de Lakowicz, J. R, 1983).

BIBLIOGRAFIA Apostila do mdulo de Tecnologia do DNA Recombinante da disciplina de Gentica Humana e Molecular da FMRP-USP. Berkelman, T. and Stenstedt, T.: 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients Principles & Methods Amersham Biosciences, 1998. Creighton T. E., Protein Structure A Practical Approach 2 edio. Figeys, D., Mcbroom, L.D. and Moran, M.F.: Mass spectrometry for the study of protein-protein interactions. Methods, 24, pp.230-9, 2001. Guido Lenz. Apostila de Mtodos Imunolgicos, 1997. Introduction to Antibodies Chemicon International, Inc, 1998. Lahm, H.W. and Langen, H.: Mass spectrometry: A tool for identification of proteins separated by gels. Electrophoresis 21, pp.2105-14, 2000. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy, Plenum Press. 495 pp. ,1983. 67

Link, A.J.: 2-D proteome. Analysis Protocols. New Jersey, Humana Press Inc., 1999. Mir, L. org. Genmica. Ed. Atheneu. So Paulo 139-162. 2004. OFarrel, P.H.: High-resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, pp.4007-21, 1975. Privalov P.L. Stability of proteins: Small globular proteins. Adv Protein Chem 33:167-169, 1979. Privalov P.L., Gill S.J. Stability of protein structure and hydrophobic interaction. Adv Protein Chem 39:191-235, 1988. The Recombinant Protein Handbook Protein amplification and Simple Purification Amershan Pharmacia Biotech. Ward R.J, de Oliveira AH, Bortoleto RK, Rosa JC, Faca VM, Greene LJ,2001. Refolding and purification of Bothropstoxin-I, a Lys49-phospholipase A2 homologue, expressed as inclusion bodies in Escherichia coli. Protein Expr Purif. Feb; 21(1): 134-40. Westermeier, R.; Naven, Tom. Proteomics in Pratice. A laboratory Manual pf protome analysis. WILEY-VCH. 2002. Wilkins, M.R., Willians, K..L., Appel, R.D. and Hochstrasser, D.F.: Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics. Germany, Springer-Verlag Berlim Heidelberg, 1997. Yan, J.X., Wait, R., Berkelman, T., Harry, R.A., Westbrook, J.A., Wheeler, C.H. and Dunn, M.J.: A modified silver staining protocol for visualization of proteins compatible with matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray ionization-mass spectrometry. Electrophoresis 21, pp.3666-72, 2000.

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V. CULTIVO CELULAR Redao: Adriana Maria Mariano Silveira e Souza - Doutoranda Daniel Giuliano Cerri - Doutorando Devandir Antnio de Sousa Jr. - Iniciao Cientfica Fabiana Matioli - Mestranda Liliana Martos Nicolette - Mestranda Maria Raquel Isnard Moulin- Doutoranda Michel Farchi Guiraldeli - Doutorando Patrcia Andressa de Almeida Buranelo - Mestranda Rodrigo Orlandini de Castro - Mestrando

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ESPAO FSICO E EQUIPAMENTOS O espao fsico, bem como os equipamentos necessrios para a montagem de um laboratrio de cultivo, so de elevada importncia, pois visam a no contaminao das linhagens celulares que esto sendo cultivadas, bem como proporcionam condies fsicas semelhantes s condies in vivo das clulas. O espao fsico para a montagem de um laboratrio de cultivo deve ser uma sala fechada, com piso liso e sem textura, bancadas de fcil limpeza e deve conter luz ultravioleta para esterilizao do ambiente interno. Existem equipamentos que so indispensveis para a montagem de um laboratrio de cultivo ideal como: centrfuga, estufa de CO2, capela de fluxo laminar, microscpio invertido, microscpio de fluorescncia, bomba de vcuo, freezer (-20; 80C), container de nitrognio lquido, geladeira e banho-maria. MATERIAIS DE USO NO CULTIVO Atualmente existe uma grande variedade de tipos e tamanhos de materiais plsticos estreis descartveis (pipetas, garrafas e placas de cultura, filtros, etc.) disponveis para cultivo celular, tornando esta atividade menos trabalhosa e mais barata. As garrafas e placas plsticas de cultura tm suas superfcies tratadas para que tenham diferentes cargas ou so cobertas com fatores de adeso e matriz extracelular. O uso de placas e frascos de vidro em cultivo celular, em virtude de ser mais trabalhoso pela necessidade de constantes lavagens e esterilizaes, restringe-se a certos procedimentos em que as clulas devem crescer sobre vidro para a obteno de melhores resultados. AMBIENTE FSICO IN VITRO Para que o cultivo celular seja adequado, necessrio que se reproduza in vitro um ambiente fsico semelhante ao ocupado pela clula in vivo, o qual deve ser constantemente monitorado atravs do controle da temperatura, pH, osmolaridade e presena de gases. A temperatura de cultivo geralmente de 37C, simulando a temperatura fisiolgica do corpo humano, e o pH geralmente deve ser mantido entre 7,0 e 7,4. No entanto, variaes da temperatura e pH podem ser adaptadas para diferentes linhagens celulares. A osmolaridade mantida atravs dos sais, glicose e aminocidos contidos no meio de cultivo. Os principais gases envolvidos no processo de cultivo celular so o O2, que constitui entre 90 e 95% dos gases presentes na atmosfera da cultura e o CO2, que participa como parte do sistema de tamponamento e perfaz cerca de 5% dos gases presentes. Pequenas alteraes na temperatura, pH, osmolaridade e concentrao dos gases podem ser toleradas pelas clulas, porm mudanas bruscas levam a alteraes no crescimento e funcionamento das mesmas, podendo tambm levar a apoptose celular.

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MEIOS DE CULTURA Os meios de cultura tm a finalidade de suprir as necessidades fisiolgicas da clula para garantir seu crescimento e multiplicao in vitro. O meio de cultura fornece nutrientes essenciais que so incorporados pela clula, tais como aminocidos, cidos graxos, acares, elementos inorgnicos (cobre, selnio e ferro), vitaminas e cofatores. Outros ons e molculas tambm podem ser necessrios para manter as propriedades qumicas do ambiente celular. Alguns componentes no meio podem desempenhar mais de um papel, como o bicarbonato de sdio, que pode atuar como fonte de carbonato, e tambm na manuteno do pH e osmolaridade apropriados. Todo meio composto primariamente por gua, portanto a fonte de gua que ir compor o meio crtica para sua qualidade (normalmente utilizada gua bi-destilada ou MilliQ). Depois de pronto, o meio de cultura deve ser filtrado e no momento da filtragem alguns componentes, como o soro, e antibitico-antimicticos podem ser adicionados. A concentrao e o tipo de soro podem variar de acordo com a linhagem celular, existindo ainda culturas celulares que exigem meios livres de soro. SUBCULTIVO O cultivo celular exige um ritual de manuteno das linhagens celulares, o subcultivo. O subcultivo deve ser feito periodicamente para fornecer novos nutrientes e tambm espao para o contnuo crescimento celular. A freqncia dos subcultivos depende de caractersticas prprias de cada linhagem celular. Os procedimentos para o subcultivo das linhagens celulares envolvem a remoo do meio de cultura em que as clulas cresceram, lavagem das clulas nas placas, dissociao das clulas aderentes (freqentemente por mtodos enzimticos), centrifugao das clulas, ressuspenso e diluio das clulas em meio de cultura fresco e replaqueamento em frascos de cultura. CONTAMINAO: COMO EVIT-LA, RECONHEC-LA E ELIMIN-LA Pode-se dizer que a contaminao uma ocorrncia qual todas as pessoas que trabalham com cultura de clulas esto sujeitas. Uma vez presente, a contaminao no pode ser ignorada, pois causa alteraes no metabolismo e no funcionamento celular. Desse modo, todos os dados provenientes do estudo com estas clulas no sero fidedignos. Normas de como montar e manter um ambiente ideal para se trabalhar com clulas in vitro tentam minimizar a ocorrncia de contaminao. Entretanto, infelizmente, mesmo em um ambiente ideal a contaminao pode ocorrer. Como ento, reconhec-la? Certos agentes contaminantes como, por exemplo, os fungos podem ser observados mesmo sem o auxlio de um microscpio. J outros, como por bactrias ou leveduras, necessitam de um microscpio relativamente poderoso para sua observao. A contaminao 71

por bactrias ou leveduras geralmente pode ser detectada tambm atravs da modificao de algumas caractersticas do meio de cultura: este fica turvo, e o pH torna-se muito cido em decorrncia dos produtos do metabolismo das leveduras ou bactrias. Um frasco de cultivo com estas caractersticas deve ser analisado em um microscpio, e se confirmada a contaminao, deve ser desprezado, tomando-se todas as precaues para evitar maiores danos. Um outro tipo de contaminante extremamente preocupante para as pessoas que trabalham com cultura de clulas o micoplasma. Em comparao s bactrias ou leveduras, os micoplasmas crescem muito vagarosamente, entretanto, alteram a funo e o metabolismo das clulas, ocasionam aberraes cromossmicas, interferem com a sntese de cidos nuclicos e de um modo geral, mudam o comportamento celular. Por serem muito pequenos, os micoplasmas precisam ser marcados com um corante fluorescente, como por exemplo, o Hoeshst 33258, para serem detectados e observado ao microscpio. O tipo de contaminao mais difcil de ser detectado a contaminao cruzada entre linhagens celulares diferentes. Esta contaminao pode durar anos sem ser descoberta e certamente ir invalidar todos os experimentos realizados com as linhagens contaminadas. Para evit-la, no se deve manusear tipos diferentes de clulas ao mesmo tempo dentro do fluxo laminar. Alm disso, deve-se lavar as mos e trocar de luvas entre o manuseio de linhagens celulares diferentes, bem como sempre usar material estril e de preferncia descartvel. TIPOS DE CULTURAS CELULARES Existem diferentes tipos de culturas celulares, que podem ser utilizados de acordo com o objetivo do estudo a ser desenvolvido e/ou com o tipo celular que se deseja estudar. Basicamente, as culturas celulares podem ser classificadas da seguinte forma: (i) Cultura Primria - cultura iniciada a partir de clulas dissociadas, partes de tecido (explante) ou rgos retirados diretamente de algum organismo; (ii) Cultura Secundria - cultura propagada aps o primeiro subcultivo de uma cultura primria; (iii) Linhagem Celular Contnua constituda por clulas que apresentam capacidade de sobrevivncia infinita, sendo freqentemente referida como estabelecida ou imortal. A imortalizao das clulas pode ser realizada por transformao, uma alterao permanente no gentipo, que pode ser espontnea ou induzida por meios qumicos (p. ex, gs mostarda), fsicos (radiao UV) ou por vrus (ST40).

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UTILIZAO DE CULTURAS PRIMRIAS Quando se deseja estudar clulas j diferenciadas de um organismo, como macrfagos, fibroblastos, neurnios ou clulas T in vitro, ser requerida uma cultura primria. ESTABELECIMENTO E MANUTENO DE UMA LINHAGEM CELULAR Aps os processos de dissociao e transformao das clulas de interesse, para se estabelecer uma linhagem celular imortal deve-se:

Considerar a fonte das clulas (conhecer seu comportamento in vivo); Otimizar o seu crescimento (mantendo o meio de cultura sempre fresco, densidade subconfluente das clulas, realizando subcultivos peridicos e tendo os nutrientes do meio e hormnios maximizados) e definir as condies ideais para cada tipo celular, por exemplo, clulas epiteliais crescem melhor a 34C e clulas endoteliais preferem CO2 a 2,5%; Verificar se a diferenciao das clulas e a sua funo permanecem inalteradas; Manter as clulas a uma alta densidade; Congelar as clulas periodicamente durante o processo de tentativa de se estabelecer a linhagem. Aps a caracterizao morfolgica e bioqumica da linhagem, necessrio registr-la

em um banco de clulas como o ATCC (American Type Culture Collection) para que a mesma fique disposio de pesquisadores do mundo inteiro. BIBLIOGRAFIA Freshney, R. I. Culture of animal cells a manual of basic technique. 4 Edio. Wiley-liss, New York, 2000. Mather, J. P.; Roberts, P.E. Introduction to cell and tissue culture : theory and technique. 1 Edio, Plenum Press, New York, 1998.

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VI. MICROSCOPIA Redao: Josane de Freitas Sousa - Doutoranda Lvia Maria Rosatto Moda - Doutoranda Shirlei Octaclio da Silva Doutoranda Valeria Valente - Doutoranda

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MICROSCOPIA PTICA O microscpio ptico formado de parte mecnica e parte ptica. A parte ptica consiste de trs sistemas de lentes: o condensador, a objetiva e a ocular (Figura 26). O condensador concentra a luz e projeta um feixe luminoso sobre o objeto em estudo. A objetiva projeta uma imagem aumentada do objeto em direo ocular, que novamente amplia a imagem e a projeta sobre a retina, assim a ampliao total do microscpio bastante significativa, chegando comumente a um aumento de at 1000x. Em termos prticos, neste tipo de microscopia possvel obter-se imagens ntidas de objetos de at 0,5 m, pois existe um limite de resoluo que depende do comprimento de onda da luz utilizada e da abertura numrica das lentes. Este limite de resoluo a menor distncia para que duas partculas apaream como objetos separados. Com a utilizao de luz UV e objetiva de imerso em leo, o limite de resoluo destes microscpios de 0,2 m.

Figura 26. Desenho mostrando os componentes de um microscpio ptico e o trajeto do feixe luminoso, desde sua fonte (lmpada) at o olho do observador. Retirado de Junqueira & Carneiro, 1999.

Neste instrumento, os objetos so examinados por transparncia. Assim, como rgos ou tecidos delgados so raros, a maioria dos materiais precisa ser reduzida a cortes finos, suficientemente transparentes para serem examinados ao microscpio. Estes cortes so feitos com um instrumento denominado micrtomo. Antes de serem cortados, entretanto, os tecidos devem passar por uma srie de tratamentos. O procedimento de preparao das amostras 75

pode variar de acordo com o material a ser estudado, mas envolve algumas etapas comuns, conforme descrito a seguir: - Fixao: a fim de evitar a destruio das clulas por autlise, ou por bactrias, os tecidos removidos do corpo de um animal devem ser adequadamente tratados imediatamente aps sua retirada. Este tratamento denominado fixao e sua principal funo insolubilizar as protenas dos tecidos. O fixador mais usado para microscopia ptica o formaldedo a 4% em soluo tamponada (pH 7,5). - Desidratao: tem a funo de remoo da gua dos tecidos. A desidratao feita em uma bateria de lcool ou acetona em vrias concentraes crescentes, normalmente distribudas entre 70% e 100%. - Clareamento ou Diafanizao: o lcool ou acetona so substitudos por uma substncia miscvel com o material de incluso. Para a incluso em parafina, usa-se xilol ou benzol. Os tecidos embebidos nessas substncias tornam-se translcidos. - Impregnao com Parafina: feita por parafina fundida, geralmente realizada em estufa a 60C. A parafina penetra nos vasos, nos espaos intercelulares e mesmo no interior das clulas, impregnando o tecido e tornando mais fcil a obteno dos cortes no micrtomo. - Incluso: A incluso tem como finalidade a obteno do bloco de parafina de forma regular para ser cortado no micrtomo. Os blocos de parafina, contendo os tecidos includos, so secionados pela navalha de ao do micrtomo, obtendo-se cortes de 6 a 8 m de espessura. Estes cortes so estirados em gua quente e depois colocados nas lminas. A maioria dos tecidos incolor, o que torna difcil sua observao ao microscpio ptico. Devido a isso, foram desenvolvidos mtodos para a colorao dos tecidos, de modo a tornar seus componentes visveis. A maioria dos corantes comportam-se como cidos ou bases que tendem a formar ligaes salinas com radicais ionizveis presentes nos tecidos. Existem diferentes tipos de corantes, que podem ser de uso geral ou especficos para marcar determinados componentes celulares (acares, lipdeos, etc...). Eles podem ser utilizados separadamente ou combinados para possibilitar a viusualizao de diferentes estruturas. A colorao dupla pela Hematoxilina e Eosina (HE) a mais usada em rotinas histolgicas (figura 27). MICROSCOPIA DE FLUORESCNCIA Molculas fluorescentes podem ser utilizadas na marcaro e visualizao de clulas e componentes celulares de modo eficiente. Uma molcula fluorescente absorve luz de um determinado comprimento de onda e emite luz num comprimento de onda maior. Corantes fluorescentes, utilizados para marcao de clulas, so detectados atravs de microscopia de fluorescncia. O microscpio de fluorescncia similar ao microscpio de luz comum, exceto pelo fato de que a luz incidente passa atravs de dois grupos de filtros. O primeiro deles filtra a luz antes que ela alcance o objeto, para selecionar o comprimento de onda que excita um 76

determinado corante fluorescente. O segundo grupo de filtros bloqueia a luz incidente deixando passar somente a luz emitada pelo objeto, permitindo a visualizao de estruturas especficas que tenham sido seletivamente marcadas pelo corante fluorescente. Essa microscopia bastante utilizada para se detectar protenas ou outras molculas especficas em clulas ou tecidos.

Figura 27. Em A, epitlio estratificado pavimentoso no-queratinizado. Este epitlio reveste e protege superfcies midas do corpo, como os lbios, vagina e nus (colorao por HE). Em B, epitlio estratificado pavimentoso queratinizado que reveste a pele, e importante na defesa contra o dessecamento e invaso microbiana (colorao por HE). Retirado de Junqueira & Carneiro, 1999).

MICROSCOPIA CONFOCAL No microscpio confocal existem recursos para iluminao do specimen e para coleta da luz emitida de forma que se obtenha a imagem correspondente a um unico plano da preparao. Neste microscpio a luz incidente passa por um orifcio denominado pinhole que seleciona raios do feixe de luz incidente, sendo que a iluminao excitatria direcionada para um nico plano do objeto. Entretanto, na trajetria da luz pontos de outros planos so tambm excitados. Um outro pinhole posicionado de uma maneira que possibilita a passagem apenas do feixe de luz emitido pelos componentes do plano excitado bloqueando a luz de planos fora do foco. Assim, realizado um corte ptico e a imagem formada no detector provm de um nico plano do objeto (figura 28). Geralmente, as clulas so previamente tratadas por compostos fluorescentes, e a luz emitida, sob a excitao de raios laser, captada e tratada em um computador que fornece os sinais para um monitor de vdeo. A imagem do plano focalizado muito ntida e a clula pode ser cortada em fatias pticas que depois podem ser utilizadas para reconstruo de uma imagem tri-dimensional (figura 29).

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Figura 28. Comparao de imagens obtidas atravs de microscopia de fluorecncia comum (A) e microscopia confocal (B) de uma preparao de um embrio de Drosophila em estgio de gstrula marcada com anticorpo anti actina.conjugado com fluorocromo verde (Figura retirada de Alberts et al, 1997).

Figura 29. Viso da superfcie de um embrio de Drosophila melanogaster em estgio de blastoderme. A actina est marcada em verde, e a tubulina em laranja (Figura retirada de Alberts et al, 1997).

MICROSCOPIA ELETRNICA DE TRANSMISSO O microscpio eletrnico utiliza uma fonte geradora de um feixe de eletrns ao invs de uma fonte luminosa (Figura 30), e por isso tem alta resoluo e as imagens obtidas mostram uma riqueza de detalhes surpreendente (Figura 31). Os eltrons so produzidos graas ao aquecimento, no vcuo, de um filamento catdio que emite eltrons. Estas partculas so aceleradas devido a uma diferena de potencial de 60-100 kV existente entre o filamento e o andio, uma placa perfurada que forma um feixe de eltrons. Este feixe defletido por lentes 78

eletromagnticas, de maneira parecida ao que acontece com a luz no microscpio ptico. O condensador focaliza o feixe de eltrons no plano do objeto e a objetiva forma uma imagem deste. O objeto preparado atravs de fixao e impregnao com material eletrondenso (solues de uranila e/ou chumbo) que impregna de maneira diferente os diversos componentes celulares. Quando o feixe de eltrons atinge o objeto, aqueles que encontram regies mais eletrondensas so desviados e os outros que atravessam o material atingem uma tela fosforescente ou placa fotogrfica formando uma imagem. As reas eletrondensas, por barrarrem o fluxo de eletrons, aparecem na imagem como reas escuras. Devido ao fato de serem os eltrons facilmente desviados pelo objeto, torna-se necessrio utilizar cortes muito finos de tecidos (20-100 nm de espessura), o que possvel devido ao desenvolvimento de mtodos especiais de microtomia.

Figura 30. Esquema do trajeto dos eltrons na coluna do microscpio eletrnico. A imagem projetada na tela fluorescente e estudada pelo observador atravs de uma lupa. Retirado de Junqueira & Carneiro, 1999).

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MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA Neste tipo de microscpio, entre a lente eletromagntica e o objeto interposta uma bobina de varredura. Esta bobina provoca um desvio do feixe de eltrons, de tal modo que o mesmo vai incidir sobre o objeto ponto a ponto, em uma seqncia determinada. O objeto, por sua vez, no se deixa atravessar pelo feixe eletrnico, devido a sua espessura (so utilizados materiais intactos ou cortes espessos) e a uma cobertura feita por evaporao de material pesado (por exemplo ouro), sobre sua superfcie. Desse modo, o feixe de eltrons que incide sobre o objeto sofre reflexes, originando eltrons secundrios que so captados por detectores especiais que geram um sinal eltrico, transferido para um monitor de vdeo. A imagem formada permite visualizar, portanto, a superfcie externa dos objetos analisados (Figura 32).

Figura 31. Fotomicrografia eletrnica de transmisso de uma clula de meristema apical de raiz planta (Retirada e modificada de Alberts et al, 1997).

Figura 32. Eletromicrografia de varredura de olho composto de Drosophila melanogaster laranja (Figura retirada de Alberts et al, 1997).

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BIBLIOGRAFIA Alberts, B. et al, 1997. Biologia Molecular da Clula. 3a edio. Art Med, Porto Alegre. Junqueira, L. C. & Carneiro, J. 1999. Histologia Bsica. 9a edio. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro.

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VII. INTERFERNCIA FUNCIONAL Edio: Daniel Leite Gis Gita Doutorando Daniel Maranho Trindade Mestrando Eneri Vieira de S. Leite Mello Doutoranda Fbio Mrcio Squina Doutorando Luciana Cludia Herculano Machado - Doutoranda

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INTRODUO A determinao da funo dos produtos da expresso gnica fundamental para o entendimento dos processos biolgicos em geral e daqueles inerentes s diferentes estratgias evolutivas de cada organismo. Na investigao do papel biolgico de um gene vrios parmetros devem ser considerados, tais como, mecanismos reguladores da expresso gnica durante e aps o desenvolvimento, localizao celular e subcelular de protenas e interaes das protenas nas diferentes vias funcionais. Para estas anlises esto sendo utilizadas abordagens baseadas em superexpresso, represso e complementao gnica. O conjunto destas abordagens que constitui o que denominamos de anlises de interferncia funcional pode ser aplicada em vrios sistemas, tais como: organismos mutantes, organismos transgnicos e clulas transfectadas. Neste captulo trataremos da manipulao desses sistemas e de suas aplicaes para compreenso da funo gnica. GERAO E ANLISE DE ORGANISMOS MUTANTES A anlise fenotpica de mutantes uma forma clssica e eficiente para investigar a funo de genes. As alteraes morfofisiolgicas, provenientes das mutaes que levam a perda ou ganho de funo, podem indicar as vias moleculares afetadas pela mutao. Ademais, em alguns modelos possvel o uso de protocolos de complementao gnica, o que facilita a identificao dos genes envolvidos em vias biolgicas.

Significado fenotpico de mutaes recessivas e dominantes As diferentes formas de um mesmo gene so chamadas de alelos, sendo que indivduos homozigticos apresentam alelos idnticos e os heterozigotos abrigam diferentes alelos. Uma mutao recessiva deve apresentar ambos os alelos com mutao para o fentipo observado (homozigose). Em contraste, as conseqncias de uma mutao dominante podem ser percebidas quando o indivduo apresenta um alelo normal e outro mutante (heterozigose). Uma explicao para essa diferena que para alguns genes a dose de seu produto fundamental para o estabelecimento de uma determinada atividade biolgica. Neste caso, mutao em um alelo suficiente para causar danos fisiolgicos. Enquanto nos genes que no so dependentes de dose, um alelo normal suficiente para o desempenho dos processo fisiolgicos. As mutaes dominantes e recessivas, geralmente esto relacionadas a uma perda de funo, que pode ser ocasionada pela interrupo da expresso, ou alterao da estrutura de uma determinada protena. No entanto, mutaes dominantes podem levar a um ganho de funo. Isto ocorre basicamente de duas formas: causando uma alterao no padro de expresso gnica (aumentando os nveis, ou levando a uma localizao ou expresso temporal 83

inapropriadas ) ou conferindo uma nova atividade ao produto gnico.

Mutagnese Algumas mutaes podem causar apenas uma discreta mudana, mas tambm podem levar a alteraes drsticas no desenvolvimento, na funo celular ou no comportamento de um indivduo. Muitas mutaes tambm podem ser letais para o organismo. Anlise das alteraes fenotpicas dos mutantes uma abordagem importante na caracterizao de vias funcionais. Com este intuto, diversas metodologias de gerao de mutantes nos mais diversos organismos, tem sido estabelecidas. Nas abordagens clssicas de mutagnese, indivduos mutantes so gerados aleatoriamente. Para isto, so utilizados agentes mutagnicos (qumicos ou fsicos) e produzido um grande nmero de mutantes, para posteriormente serem selecionados os indivduos com mutaes no processo especfico de interesse. Alternativamente, pode-se direcionar a mutagnese em genes especficos. Nestas abordagens, fragmentos de DNA exgenos so inseridos no genoma para gerao de mutaes, que so produzidas atravs da recombinao homloga entre um gene especfico ou regies reguladoras com o fragmento DNA inserido no organismo. Nestas abordagens de gentica reversa, o gene especfico alvo da mutao in vitro, em seguida o DNA introduzido na clula para integrar no cromossomo do organismo, para produo das clulas mutantes para anlise funcional. Transformaes deste tipo so rotineiramente realizadas em organismos unicelulares ou complexos, como clulas de mamferos, embries de Drosophila, fungos ou protozorios, visando a produo de mutaes em genes especficos, gerando organismos transgnicos.

Identificao de genes relacionados a mutao Uma anlise gentica simples pode revelar se diferentes mutaes recessivas associadas ao mesmo fentipo esto no mesmo gene ou em genes diferentes. Esta anlise de complementao gentica baseia-se no resgate do fentipo selvagem (ou no) pelo cruzamento entre indivduos mutantes. Alm disso, plasmdeos representantes de uma biblioteca genmica ou de cDNA podem ser transformados em uma clula ou organismo exibindo um fentipo mutante, sendo que a presena do plasmdio albergando o gene de interesse pode promover o resgate do fentipo selvagem. Estudos de complementao gnica tm sido amplamente utilizados para caracterizao funcional de diversos processos biolgicos. A utilizao de tcnicas de DNA recombinante para o isolamento e caracterizao de um gene relacionado a um indivduo mutante tem revolucionado o estudo em biologia celular, por relacionar o fentipo alterado s protenas codificadas pelo gene. Nestas estratgias, a 84

posio cromossmica do gene responsvel pelo fentipo mutante determinada, possibilitando a clonagem do gene normal e a caracterizao do produto gnico de interesse. Em organismos superiores a clonagem de um gene relacionado a uma mutao pode se iniciar pela identificao de um segmento de DNA clonado prximo ao gene de interesse, seguido pelo isolamento de segmentos contguos de DNA e construo de um mapa fsico da regio em questo (cromossome walking). Atravs do padro de segregao de genes nos descendentes e da taxa de recombinao gnica de um determinado locus cromossmico (mapa gentico), pode-se estimar localizaes e distncias cromossmicas. A localizao especfica do gene de interesse feita atravs da correlao do mapa fsico e gentico. A partir da deteco de alteraes na expresso de transcritos, ou na seqncia de DNA entre o indivduo mutante e selvagem pode-se caracterizar o fentipo mutante de interesse.

Gerao de mutantes em uma perspectiva ps genmica O recente seqenciamento do genoma de vrios organismos tem deslocado o enfoque da pesquisa genmica para estudos em larga escala de funo e localizao celular de genes desconhecidos. As estratgias tradicionais que permitem entender a funo e a correlao entre genes so limitadas e laboriosas e no partem da informao contida na seqncia genmica. Com isso, o grande desafio da era ps-genoma a sistematizao de abordagens bioqumicas e genticas para o estudo funcional de genomas. A habilidade de criar grandes colees de mutantes um poderoso recurso para anlise funcional do genoma. Em S. cerevisiae, estratgias de mutagnese do genoma em larga escala tm sido implementadas. Um consrcio internacional produziu rupturas para todas as ORFs anotadas do genoma da levedura, a partir de recombinao homloga de fragmentos gerados por PCR, contendo uma marca de seleo e uma seqncia de 20 nucleotdeos nica (cdigo de barras) flanqueada por regies do genoma da levedura. O fragmento de DNA amplificado por PCR introduzido na levedura, onde substituir o gene alvo por recombinao homloga. Os elementos transponveis tm se mostrado uma ferramenta poderosa para estudos funcionais. Os transposons so elementos genticos amplamente distribudos na natureza, capazes de se mover a partir de uma localizao cromossmica para outra. Os elementos transponveis vm sendo estudados mais detalhadamente em Drosophila, no qual foram identificadas mais de 30 variedades destes elementos. Os componentes fundamentais dos elementos transponveis so o gene (ou genes) da maquinaria molecular necessria para a transposio e as seqncias flanqueadoras, requeridas para o reconhecimento por esta maquinaria. Algumas classes de elementos transponveis apresentam uma alta eficincia de transposio, seleo aleatria do ponto de insero da transposio no DNA alvo e permitem a modificao do transposon para aplicaes especficas. 85

Inseres aleatrias para gerao de mutantes utilizando elementos transponveis vm revolucionando estudos de funo gnica em organismos modelo, como por exemplo Drosophila, para o qual existem diversas colees de mutantes gerados por inseres mediadas por transposons. O uso de um sistema transposio in vitro pode gerar inseres em genes clonados de funo desconhecida, que prontamente podem ser empregados como reagentes para nocaute gnicos. Esta estratgia tm sido empregada para gerao sistemtica de mutantes e descoberta de novos genes em leveduras e fungos. Uma estratgia de marcao por transposon possibilitou uma ampla anlise funcional do genoma de Sacharomyces. cerevisiae, cobrindo cerca de 1/3 dos genes preditos pelo seqenciamento. O nocaute sistemtico de todos os genes de um dado genoma atravs de abordagens de gentica reversa, assim como a anlise sistemtica de interaes protena-protena, a anlise do perfil de expresso de RNA mensageiros por tcnicas de microarrays, por anlise serial da expresso gnica (SAGE) e estudos com protenas de fuso com a GFP (green fluorescent protein) vm sendo utilizados para a investigao da funo gnica, em abordagens em larga escala para anlise de genomas. ORGANISMOS TRANSGNICOS Um organismo transgnico definido como derivado de uma clula cujo genoma foi modificado pela integrao estvel de um fragmento de DNA exgeno. O DNA exgeno pode ser uma sequncia manipulada da mesma espcie ou de outra espcie que tem alguma propriedade desejvel no experimento em particular. Este fragmento de DNA contm geralmente um gene que foi modificado de tal maneira, cuja expresso possa ser identificada neste novo organismo. O gene operacional do DNA exgeno chamado de transgene. Atualmente, possvel a obteno de animais, plantas ou microrganismos transgnicos. Todos os organismos transgnicos podem tambm ser chamados de organismos geneticamente modificados, sendo que o termo transgnico normalmente usado para designar animais, enquanto organismos geneticamente modificados para designar plantas e microrganismos, mas as duas expresses significam a mesma coisa e podem ser usadas em ambos os casos. Organismos transgnicos esto sendo amplamente utilizados em pesquisas bsicas e aplicadas, com diferentes finalidades. A produo de transgnicos em pesquisa bsica tem sido explorada, primariamente para estudar duas questes fundamentais da biologia celular, molecular e do desenvolvimento. Qual a funo biolgica de um determinado gene? Qual a sequncia de DNA especfica requerida para regular o padro de expresso de um dado gene?

Sistemas transgnicos para determinao do papel biolgico de um gene Existem diferentes abordagens utilizando-se transgenes para investigar a funo de um determinado gene tanto durante o desenvolvimento quanto no individuo adulto. A maioria 86

dessas abordagens baseia-se em anlise de ganho de funo ou perda de funo do gene em questo. interessante notar que essas abordagens so complementares e, portanto devem ser realizadas em conjunto, sendo as limitaes tcnicas as nicas restries na escolha e utilizao delas. A anlise de perda de funo possvel quando o transgene inserido no genoma de uma clula leva a uma perda de funo de um gene endgeno. Este fenmeno estabelecido de duas formas: atravs da insero de um transgene que leva a uma ruptura do gene endgeno, como por exemplo, nas recombinaes homlogas ou atravs da insero aleatria de alelos dominantes negativos. Recombinao homloga: Este tpico foi anteriormente abordado. No entanto vale lembrar que diferente de organismos gerados por recombinao homloga, nos organismos transgnicos cujo transgene foi inserido aleatoriamente no genoma, no h substituio do gene endgeno pelo mesmo, porm integrao de cpias adicionais, mutadas ou no, do gene em questo. A insero de alelos dominantes negativos: ocorre quando um transgene, que foi inserido aleatoriamente no genoma de um organismo, expressa uma protena mutada capaz de inativar o gene endgeno, obtm-se um alelo dominante negativo. Neste caso, apesar da existncia do gene endgeno selvagem, possvel analisar a perda de funo de um gene. Este tipo de inativao possvel normalmente com protenas que formam complexos entre si, e quando a protena selvagem se complexa com a sua forma alterada, esta perde a sua funo. A anlise de ganho de funo realizada quando possvel induzir a expresso do transgene para analisar o efeito fenotpico da superexpresso da protena por ele codificada. Neste caso, antes da introduo do gene de interesse na clula, procede-se a uma manipulao gentica atravs de tcnicas do DNA recombinante onde o gene de interesse fusionado a um promotor condicional, que s promover altos nveis de expresso do transgene em determinadas condies. Um promotor condicional muito utilizado em anlise de ganho de funo em Drosophila melanogaster o promotor de heat shock. Genes sob o controle deste promotor tm a sua expresso aumentada quando o animal submetido a tratamentos por tempos determinados a altas temperaturas. Neste caso a expresso do gene ocorre em todo o organismo durante o perodo de heat shock e cessa quando o indivduo volta temperatura ambiente. O promotor condicional tambm pode ser dirigido para um tecido ou tipo celular especfico. Anlise de expresso ectpica. Genes que so normalmente expressos em tempos e tecidos especficos durante o desenvolvimento podem ser geneticamente modificados in vitro para serem expressos em diferentes tempos e tecidos. A anlise deste tipo de transgenes permite avaliar as consequncias da expresso ectpica. Como o gene est sendo expresso em locais distintos do selvagem, este tambm um caso de ganho de funo. Os fentipos 87

resultantes da expresso ectpica do gene podem fornecer informaes importantes a respeito da funo do gene.

Sistemas transgnicos para o estudo das regies reguladoras de um gene A identificao de sequncias especficas de DNA que atuam na regulao da expresso temporal e tecidual dos genes uma questo fundamental para o entendimento dos mecanismos envolvidos na regulao da expresso gnica. Alm do mais, estas sequncias so muito teis na construo de diversos vetores de expresso utilizados em pesquisas bsicas e aplicadas. Por exemplo, as anlises funcionais de ganho de funo ou perda de funo foram otimizadas com a identificao de elementos regulatrios, permitindo a expresso de um dado gene em tecido e tempo especficos. A utilizao de transgenes em animais, como Drosophila e camundongos, vem sendo muito til na identificao de elementos regulatrios. Esta abordagem baseia-se na verificao da capacidade dos elementos regulatrios putativos em dirigir a expresso regulada de um determinado gene. Para tanto, utilizando-se tcnicas do DNA recombinante, fragmentos de DNA candidatos a conterem elementos regulatrios so fusionados a um gene reprter (cujo produto facilmente detectado). Em seguida, essa construo introduzida de um modo estvel no organismo e os animais transgnicos so avaliados quanto ao padro de expresso do gene reprter. Quando e onde o gene em questo estiver ativo, o gene reprter ir anunciar esta atividade no tecido apropriado. Diversos elementos regulatrios foram identificados desta maneira, o que possibilitou a construo de muitos vetores que dirigem a expresso de um dado gene em uma determinada fase do desenvolvimento e em tecidos especficos.

TRANSFECO DE CLULAS Transfeco de clulas um outro sistema para investigao do papel biolgico de um produto gnico e dos mecanismos reguladores de sua expresso. Na maioria dos casos necessrio ser capaz de transferir o gene ou a sua forma manipulada para o interior das clulas. Contudo, uma vez que clulas de mamferos no aceitam DNA exgeno eficientemente, essencial a disponibilidade de mtodos efetivos para a introduo de genes nas clulas. Assim como existe a transformao, ou seja introduo de DNA em bactrias, existem alguns mtodos de introduo do DNA em clulas de mamfero como: transfeco (mtodos fsicos ou bioqumicos), transduo (uso de retro-virus) e recombinao homloga. Os dois primeiros um pouco mais sero detalhados a seguir.

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Transfeco Os mtodos de transfeco podem ser classificados de modo geral em duas categorias: os bioqumicos e os fsicos. Os mtodos bioqumicos incluem precipitao de fosfato de clcio, DEAE-Dextran e transfeco mediada por lipdeos, e as transfeces fsicas so obtidas por eletroporao ou ainda por microinjeo. Este ltimo consiste na introduo do DNA ou mesmo da protena de interesse dentro da clula atravs de um capilar de dimenses diminutas. A escolha do mtodo depende do tipo celular. Por exemplo, linhagens celulares hematopoiticas so mais eficientemente transfectadas por eletroporao do que os mtodos bioqumicos, contudo alguns tipos celulares captam DNA mais eficientemente quando associado com lipdeos catinicos do que com precipitados de fosfato de clcio. Por outro lado, lipdios catinicos podem ser altamente txicos para alguns outros tipos celulares.

Mtodos e Mecanismos A seguir apresentaremos cinco tcnicas para a introduo de DNA em clulas de mamferos: fosfato de clcio, DEAE-Dextran, eletroporao e transfeco mediada por lipossomos (figura 33). Os dois primeiros procedimentos produzem um ambiente qumico o qual resulta na adeso do DNA superfcie celular; o DNA ento endocitado atravs de vias at o momento no caracterizadas. A eletroporao utiliza-se de um campo eltrico para abrir poros nas clulas e presumivelmente o DNA difunde para dentro da clula atravs destes poros. Finalmente a transfeco mediada por lipossomos, a qual no possui um mecanismo totalmente elucidado, se baseia no ligao inica do DNA lipdeos catinicos e neutros formando lipossomos com carga residual positiva a qual media a ligao resduos de carga negativa na superfcie da membrana e promove a sua endocitose. a) Microinjeo O DNA (bem como a prpria protena de interesse) pode ser injetado diretamente em clulas de mamfero utilizando-se de micropipetas capilares de vidro. A injeo pode ser tanto no ncleo quanto no citoplasma, porm o procedimento requer equipamentos especializados de custo alto (micro manipuladores) e pessoal altamente treinado. A microinjeo extremamente eficiente (quando realizada por experts!) e geralmente utilizada em situes onde somente um nmero limitado de clulas receptoras esto disponveis como por exemplo a introduo de DNA em embries ou em situaes quando no existe outra possibilidade outro tipo celular presente ir captar mais eficientemente o DNA do que o tipo celular desejado. Fatores que podem influenciar nesse tipo de transfeco so basicamente o volume injetado que pode causar algum dano clula e a pureza da soluo injetada.

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Figura 33. Esquema das metodologias utilizadas para a introduo de DNA em clulas de mamfero. No esquema so mostrados exemplos de transfeco por mtodos fsicos(a e b) e bioqumicos (c e d), alm da transduo ou infeco por retro-vrus (e).

b) Eletroporao A eletroporao envolve a exposio de clulas em suspenso um campo eltrico pulsado que causa a formao transitria de poros na membrana celular, possibilitando a troca de macromolculas entre o ambiente extracelular e o citoplasma. A remoo do campo eltrico resulta no selamento espontneo(a) dos poros, contanto que a fora do campo a durao do pulso estejam dentro dos limites de tolerncia das clulas. Parmetros que afetam este tipo de transfeco so a voltagem (fora com que o campo eltrico atravessa as clulas), o tempo de durao dos pulsos, o tampo de eletroporao, a temperatura (choques trmicos podem ajudar ou atrapalhar dependendo do tipo celular), concentrao do DNA, tipo de clula e fase do ciclo celular em que ela se encontra no momento da eletroporao. c) Fosfato de Clcio O princpio desta tcnica a formao de complexos DNA-fosfato de clcio insolveis em uma soluo supersaturada. Isso obtido pela adio de uma mistura de DNA e cloreto de clcio uma soluo salina tamponada com fosfato e incubando-se essa mistura por um perodo de tempo para permitir a formao do co-precipitados de DNA-fosfato de clcio. A 90

mistura ento adicionada s clulas em meio de cultura, seguida de uma incubao 37oC por um perodo, usualmente entre 6 e 24 horas, dependendo do tipo celular. As molculas de DNA entram nas clulas atravs da endocitose dos co-precipitados de DNA-fosfato de clcio. Vrios fatores influenciam a eficcia deste mtodo como: a concentrao e a qualidade do DNA, o pH no momento da formao dos precipitados e os perodos de incubao. d) Lipdeos Catinicos (Lipossomos) O uso de lipdeos catinicos para transfeco de DNA em clulas de mamferos se tornou bem difundido devido varias caractersticas estes reagentes tornando-os veculos atrativos para o gene-delivery (a entrega de genes clula), particularmente na terapia gnica. Por exemplo, eles so mais seguros que os vetores virais, podem ser produzidos em grandes quantidades, e podem levar grandes fragmentos de DNA para dentro das clulas. Existem vrias formulaes de reagentes de lipdeos para transfeco, mas de um modo geral eles contm uma poro positivamente carregada ligada um componente lipdico neutro. A primeira gerao de reagentes de lipdeos para transfeco continha lipdeos neutros e se baseava nos mtodos de captura das molculas de DNA dentro de lipossomos, atualmente os lipdeos catinicos formam complexos DNA-lipdeo os quais tornaram a eficincia de transfeco independente da encapsulao do DNA. Quando esses reagentes so misturados ao DNA, a parte carregada positivamente atrada pelo esqueleto de fosfato da molcula de DNA e ocorre a formao de complexos DNA-lipdeo. Quando uma suspenso destes complexos adicionada clulas, a carga positiva remanescente atrada a resduos de cido silico (molcula de carga negativa) na superfcie externa membrana celular. O resultado final que o complexo DNA-lipdeo ou se funde membrana celular ou entra na clula por endocitose, transferindo o seu contedo de DNA para o interior da clula. Devido estas propriedades que os lipossomos catinicos possibilitou uma maior eficincia na introduo do DNA em muitos tipos celulares. e) Transduo ou Infeco retroviral Infeco com vetores virais, como por exemplo os vetores retrovirais, outro mtodo eficiente de introduzir DNA em clulas de mamferos. A infeco viral comea pela ligao com receptores da superfcie celular seguida pela internalizaco e mesmo a replicao ou, no caso de retrovirus, integrao no genoma da clula hospedeira. Vetores retrovirais so desenvolvidos a apartir de vrus selvagens atravs da deleo da regio contendo os genes estruturais gag, pol e env, os quais codificam as principais protenas virais, a transcriptase reversa e protenas do envelope. Esta regio deletada utilizada para a clonagem do gene de interesse, deste modo gerando vetores com defeito de replicao os quais requerem complementao da funo viral. Os genes virais que esto faltando podem ser fornecidos tanto pela replicao na presena de um vrus helper ou, mais 91

freqentemente, pela transfeco do vetor em uma linhagem celular empacotadora (clula Phoenix), a qual fornece as funes que esto faltando. A clula Phoenix foi geneticamente modificada de modo a conter os genes que faltam ao vetor retroviral porm no os fornecendo aos retro-virus formados. Deste modo os retro-virus no sero capazes de empacotar novas partculas virais se a clula que eles infectaram no contiver os genes necessrios para tal. As clulas so infectadas pelos retro-virus com alta eficincia. Diferentes linhagens Phoenix com diferentes genes de empacotamento so necessrias para infectar clulas de diferentes organismos, por exemplo um retro-virus que infecta uma clula de camundongo no consegue infectar clulas humanas, caninas ou fenlinas. A figura 34 ilustra todo o procedimento.

Transfeco Estvel versus Transitria Aps a transfeco o DNA exgeno se mantm no ncleo por um perodo limitado de tempo a menos que ele seja integrado ao genoma hospedeiro. Contudo, mesmo no integrado, o DNA transfectado alvo de mecanismos regulatrios que controlam a expresso gnica e desse modo os seus genes podem ser expressos de modo transitrio. Essa expresso gnica transiente tem sido explorada em estudos como o de anlise de seqncias regulatrias e optimizao de condies de transfeco. A integrao do gene transfectado no genoma hospedeiro, por outro lado, resulta na reteno estvel do gene exgeno nas clulas, fornecendo uma expresso constitutiva do mesmo.

Seleo de Clulas de Mamfero Transfectadas A maioria das tcnicas de introduo de DNA em clulas ineficiente, e ento existe a necessidade de seleo daquelas clulas que captaram o DNA e esto expressando o gene nele contido. Existe uma variedade de marcadores de seleo disponveis: os genes de resistncia kanamicina-neomicina (neo ou aph) dos transposons de bactria Tn601 e Tn5, os quais codificam enzimas (aminoglicosideo fosfotransferases) as quais conferem resistncia ao antibitico geneticina (G418); e o gene de Escherichia coli xantina guanina fosforibosiltransferase (gpt) que confere resistncia ao cido micofenlico. Estes marcadores de seleo nem mesmo necessitam estar presente no mesmo vetor se forem co-transfectados. A sensibilidade da linhagem ao antibitico deve ser pr-determinada a fim de selecionar os transfectantes com base na sua resistncia ao antibitico.

Genes-reprter Os genes-reprter so genes usados para localizar, identificar ou analisar outro gene. Eles podem ser ligados seqncia upstream (promotor) de outro gene e transfectados em clulas para estudar o papel de regulao da seqncia upstream em potencial. O gene CAT 92

por exemplo, que codifica a clorafenicol-acetil-transferase, um gene clssico usado para avaliar a regulao gnica em clulas eucariticas. De um modo mais amplo, os genes-reprter pordem ser transferidos para clulas ou bactrias apenas para monitorar se o DNA estranho est sendo expresso ou no. Os genes de resistncia a antibitico so um exemplo.

Figura 34. Esquema ilustrativo da transduo.

Outros genes reprter so -galactosidase, -glucoronidase, luciferase e fosfatase alcalina (se a enzima est presente e interage com o substrato resulta em um produto colorido ou fluorescente). A GFP (uma protena autofluorescente verde da medusa Aequorea victoria), assim como as suas verses mutagenizadas (YFP, CFP e RFP, respectivamente de cor amarela, turqueza ou ciano e vermelha), vm se tornando o gene-reprter de preferncia, pois no requer ativao ou deteco de atividade enzimtica para ser visualizado, somente precisa ser excitado no comprimento de onda adequado. INTERFERNCIA MEDIADA POR RNA (RNAI) E SILENCIAMENTO GNICO Uma abordagem interessante que tem sido atualmente utilizada com grande eficincia para realizao de interferncia funcional baseada numa resposta natural dos sistemas biolgicos presena de RNAs dupla-fita. Grandes quantidades de molculas de RNA antisense podem hibridizar com o RNA sense de um gene transcrito e inibir temporariamente a 93

sntese da protena correspondente. Porm, estudos recentes demonstraram em diversos organismos, que uma preparao de RNA dupla fita, contendo tanto a fita sense como a antisene, pode inibir a atividade de um dado gene de forma ainda mais efetiva. Este fenmeno, denominado Interferncia por RNA, vem sendo explorado para examinar a funo gnica em vrios sistemas tais como clulas em cultura e diversos organismos modelo. Interferncia por RNA (RNAi) um fenmeno pelo qual a introduo, nas clulas, de um RNA de dupla fita (dsRNA) correspondente regio codificadora de um determinado gene, interfere efetiva e especificamente com a atividade do mesmo. O dsRNA induz a degradao do mRNA com seqncia homloga levando a um silenciamento gnico pstranscricional (PTGS) especfico.

Mecanismo do RNAi Abordagens bioqumicas e genticas levaram aos modelos atuais de mecanismo de RNAi. Em um passo inicial, o dsRNA introduzido digerido em pequenos RNAs interferentes (siRNAs) de 21 23 nucleotdeos, os quais so tambm chamados de RNAs guia. Evidncias indicam que siRNAs so produzidos quando a enzima Dicer, um membro da famlia RNase III de ribonucleases dsRNA especficas, cliva dsRNA (introduzido diretamente ou via transgene ou vrus) em um processo dependente de ATP. Sucessivos eventos de clivagem degradam o RNA em duplexes (siRNAs) de 19-21 bp, cada um com 2 nucleotdeos 3 overhangs. Posteriormente, os duplexes de siRNA ligam-se a um complexo nuclesico para formar o que conhecido como Complexo de Silenciamento Induzido por RNA, ou RISC, ento RISC ativo alcana o transcrito homlogo pela interao de pareamento de bases e cliva o mRNA em ~12 nucleotdeos a partir da terminao 3 do siRNA. Descobertas a partir de abordagens bioqumicas e genticas apontam para o fato de que PTGS tenha origem evolucionria antiga. Existem propostas de que PTGS estaria envolvido com mecanismo de defesa contra transposons ou RNA de vrus, talvez antes de plantas e animais divergirem. Foi notado por muitos pesquisadores que o silenciamento de genes, necessrios para RNAi, freqentemente causa severos defeitos de desenvolvimento. Esta observao sugere uma ligao entre RNAi e pelo menos uma via de desenvolvimento. Um grupo de pequenas molculas de RNA, conhecidas como pequenos RNAs temporrios (stRNAs) regulam a sincronizao de desenvolvimento em C. elegans, atravs da represso da traduo de transcritos alvo. Os stRNAs so gerados a partir de transcritos que apresentam uma estrutura em lao. As molculas de RNA dobradas so clivadas pela enzima Dicer (chamada DCR-1 em C. elegans), produzindo stRNAs de 22-nt. Assim, Dicer gera tanto siRNAs como stRNAs e representa um ponto de interseo para as vias de RNAi e stRNA. Recentemente, aproximadamente 100 molculas adicionais de RNA de ~22 nt, chamadas de microRNAs (miRNAs), foram identificadas em Drosophila, C.elegans e clulas 94

HeLa. Muitos destes miRNAs, tambm so formados a partir de molculas de RNA precursoras que se dobram numa estrutura secundria em lao. Acredita-se que os miRNAs de 22 nt, recm descobertos, desempenhem algum papel na regulao da expresso gnica e pelo menos dois deles necessitam de Dicer para sua produo. Parece que o uso de pequenos RNAs para regulao de genes e RNAi um tema comum atravs da evoluo.

Induo de RNAi em clulas de mamferos do mecanismo aplicao Enquanto a presena natural de RNAi tem sido observada numa variedade de organismos (plantas, protozorios, insetos e namatides), na maioria das clulas de mamferos a transfeco de longas molculas de dsRNA (> 30 nt) causa supresso no especfica da expresso gnica, o oposto da supresso gene-especfica observada em outros organismos. Mas, quando siRNAS foram introduzidos por transfeco transiente, estes foram capazes de induzir RNAi de modo eficaz de uma maneira sequncia especfica. A especificidade da sequncia do siRNA muito rigorosa, se um simples pareamento de bases se forma erradamente entre siRNA e seu mRNA alvo, o silenciamento drasticamente reduzido. Muitos pesquisadores esto interessados com o potencial uso de RNAi como uma ferramenta para estudos genmicos funcionais. RNAi j tem sido utilizada para investigar a funo de muitos genes em Drosophila, C. elegans, Trypanosoma brucei zebrafish, clulas de mamferos e em vrias espcies de plantas. Embora este mtodo seja aplicvel a todos estes organismos, a transfeco de siRNA interfere com a expresso gnica transiente, durante estgios iniciais do desenvolvimento, no produzindo efeitos considerveis nos estgios mais tardios. Recentemente, alguns grupos desenvolveram vetores de expresso que expressam siRNAs continuamente em clulas de mamferos transientemente e estavelmente transfectadas. Alguns destes vetores foram construdos para expressar pequenos RNAs em forma de grampo (shRNAs), os quais so processados, in vivo, em molculas do tipo siRNAs, capazes de desenvolverem silenciamento gnico especfico. Esta estratgia est de acordo com experimentos em outros organismos, onde foi desenvolvido um mtodo para expresso de dsRNA na forma de um grampo. O RNA em grampo expresso a partir de um transgene que exibe uma seqncia repetida invertida, passvel de ser controlada de uma maneira temporal e espacial, desde que colocada sob controle de um elemento regulatrio. Portanto, a habilidade em criar rpida e facilmente fentipos de perda de funo tem levado aos pesquisadores a esperana do desenvolvimento, para breve, de terapias gnicas especficas atravs da utilizao de RNAi.

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VIII. NOES BSICAS DE BIOSSEGURANA Redao: Andr Pitondo da Silva - Doutorando Andr Fernando Ditondo Micas - Iniciao Cientfica Gustavo Bueno Gregoracci - Mestrando Gustavo Olszanski Acrani - Mestrando Jos Luiz Proena Mdena - Mestrando Rodrigo Anselmo Cazzaniga -Mestrando

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INTRODUO Todos os organismos que j existiram e que ainda existem na Terra surgiram a partir de um mesmo ancestral comum, o que se reflete nas inmeras caractersticas compartilhadas entre todos os seres vivos. Processos celulares vitais, como a replicao, transcrio e traduo do DNA tendem a possuir mecanismos centrais extremamente similares em organismos to diferentes como uma bactria e um mamfero, possibilitando que organismos de manuseio mais simples sejam usados como modelos biolgicos para desvendar o intricado universo de reaes qumicas que acontecem numa clula. Muito do que se sabe nos dias de hoje sobre biologia celular e molecular veio do estudo e da manipulao com microrganismos em laboratrio. Particularmente, a bactria gram-negativa Escherichia coli e a levedura de brotamento Saccharomyces cerevisiae vm sendo muito utilizadas como modelos biolgicos, principalmente devido as suas altssimas velocidades de diviso celular, o que possibilita a anlise de um grande nmero de clulas em um curto espao de tempo, assim como a grande facilidade de manuteno dessas espcies em laboratrio. Alm disso, muitos outros organismos so estudados como modelos biolgicos, vrios dos quais patognicos ao homem. Tudo isso acarreta na necessidade da utilizao de normas de biossegurana e manipulao de microrganismos em um laboratrio de pesquisa, visando proteo tanto do pesquisador como do ambiente. Com a criao de cepas e linhagens de organismos nocautes, mutantes e transgnicos, a proteo do meio ambiente ganhou fora nos ltimos debates sobre o assunto, principalmente devido incerteza do impacto que esses organismos novos causariam num ecossistema to finamente regulado como o terrestre. Por isso, nesse captulo faremos uma breve narrativa sobre manipulao de microrganismos e biossegurana, com o intuito de introduzir ao leitor como este deve comportar-se em um laboratrio nas mais diferentes circunstncias. PRINCPIOS BSICOS DE SEGURANA EM LABORATRIOS DE BIOLOGIA - proibido comer, beber, fumar ou aplicar cosmticos; - No recomendado pipetar com a boca; - Alimentos e bebidas no devem ser armazenados no laboratrio; - Higiene adequada inclui lavagem constante das mos, especialmente antes de deixar o laboratrio; - Paramentao adequada deve ser utilizada em certos procedimentos, e deve ser removida antes da sada do laboratrio; - Luvas devem ser utilizadas para manuseio de material perigoso; - Vidro e objetos pontiagudos devem ser descartados em invlucros adequados; - Superfcies devem ser limpas constantemente; - Derramamentos e contaminaes devem ser limpos imediatamente; - Quaisquer acidentes devem ser reportados ao supervisor do laboratrio; 99

- Animais no envolvidos em projetos no so permitidos no laboratrio;

Nveis de Biossegurana H quatro nveis de biossegurana, que consistem de prticas e tcnicas de laboratrio, equipamento de segurana e dependncias do laboratrio. Cada combinao apropriada para as operaes realizadas, as rotas de transmisso de agentes infecciosos documentadas ou suspeitas, e para funo e atividade do laboratrio em questo.

Nvel de Biossegurana 1 (NB1) As prticas, equipamentos e dependncias de NB1 so adequadas para laboratrios de graduao e especializao, laboratrios de ensino, e locais cujo trabalho envolve agentes estabelecidos e linhagens de microrganismos viveis que sabidamente no causam doenas em humanos adultos saudveis. Muitos agentes geralmente no associados a doenas em humanos so, contudo, patgenos oportunistas que podem causar infeces em crianas, idosos e indivduos imunodeficientes ou imunodeprimidos. NB1 representa o nvel de segurana bsico, que se apia em prticas microbiolgicas bsicas, sem barreiras especiais primrias ou secundrias recomendadas alm de uma pia para lavagem de mos.

Nvel de Biossegurana 2 (NB2) As prticas, equipamentos e dependncias de NB2 so aplicveis em laboratrios clnicos, de diagnstico ou de ensino, cujo trabalho envolve amplo espectro de agentes naturais de risco moderado presentes na comunidade e associados a doenas humanas de grau variado. Com boas tcnicas microbiolgicas estes agentes podem ser manipulados com segurana em atividades desenvolvidas em bancadas abertas, posto que o potencial para produo de respingos ou aerosol baixo. NB2 apropriado para trabalhos realizados com sangue, tecidos ou fluidos corpreos derivados de humanos cuja presena de um possvel agente infeccioso desconhecida. Perigos primrios para o pessoal trabalhando com esses agentes relacionam-se a acidentes percutneos, exposio de mucosas e ingesto de material contaminado. Enfatiza-se precauo extrema com ndulos ou instrumentos afiados contaminados. Apesar dos organismos envolvidos em NB2 no possurem potencial para transmisso por aerosis, a manipulao de agentes que aumentam o risco de exposio de pessoal deve ser conduzida com utilizao de equipamento de conteno primrio (proteo para face, luvas, jalecos).

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Nvel de Biossegurana 3 (NB3) e 4 (NB4) A manipulao de agentes, que possuem potencial para transmisso por via respiratria, responsveis por doenas srias (NB3) ou extremamente letais (NB4) envolvem estes nveis superiores de biossegurana. So utilizadas barreiras primrias e secundrias, incluindo cmaras seladas, ambientes pressurizados e ventilao especial.

Esterilizao e Desinfeco Durante o manuseio de microrganismos em laboratrio, necessrio estar sempre atento qualidade do material utilizado, seja ele material qumico (solues e reagentes), ou fsico (pipetas, ponteiras, tubos, etc), preocupando-se com o fato deles estarem sempre estreis, para no contaminar o experimento. O cuidado com a esterilizao e desinfeco importante no sentido de se prevenir a contaminao com agentes infectantes do ambiente ou do prprio pesquisador. Sabe-se que superfcies, equipamentos e resduos contribuem em muito para propagao de agentes infecciosos no laboratrio de pesquisa. A desinfeco de ambientes em algumas circunstncias deve ser necessria, de acordo com o nvel de biossegurana requerido em cada ocasio. Alm do conhecimento tcnico dos produtos a serem utilizados, faz-se necessria a implementao de medidas estudadas e programadas para que se atinja os objetivos com a maior eficincia e com baixo custo.

Esterilizao A esterilizao o processo de destruio de todas as formas de vida microbiana (bactrias, fungos, vrus e esporos) mediante a aplicao de agentes fsicos e qumicos. Os agentes fsicos mais utilizados so o vapor saturado sob presso, o calor seco e os raios gama. Entre os agentes qumicos, atualmente, apenas o xido de etileno, o glutaraldedo e o formaldedo so considerados esterilizantes. O processo de esterilizao que maior segurana oferece o vapor saturado sob presso (autoclave), seguindo-se o calor seco (estufa) e os esterilizantes qumicos. A escolha, todavia, depende da natureza do artigo a ser esterilizado. Um artigo considerado estril quando a probabilidade de sobrevivncia dos microrganismos contaminantes for menor do que um para um milho.

Desinfeco Desinfeco o processo de destruio de microrganismos patognicos na forma vegetativa, existentes em superfcies inertes, mediante a aplicao de agentes qumicos ou fsicos. importante lembrar que essa uma condio primordial quando se trata de 101

manipulao de microrganismos em laboratrio. A rea em que o pesquisador est trabalhando (superfcie da bancada, por exemplo) necessita estar o mximo possvel livre de microrganismos que possam vir a contaminar o experimento, o que poderia causar um falso resultado obtido pelo pesquisador. Como principais desinfetantes so utilizados os fenis sintticos, hipoclorito, lcool 70% e lcool iodado.

Normas de preveno e procedimentos em caso de acidentes em laboratrios de pesquisa: Preveno e notificao: O treinamento para a execuo das atividades e a prtica dos procedimentos e normas de biossegurana so decisivos para a preveno de acidentes. Todo acidente deve ser, obrigatoriamente, comunicado chefia do laboratrio! A notificao do acidente o documento onde so registrados as informaes relacionadas ao acidente ocorrido e os danos causados. importante para comprovar a ocorrncia do acidente e suas conseqncias, possibilitando que todas as medidas, inclusive as legais, sejam adotadas. Ocorrendo um acidente fundamental que seja feita uma anlise de suas causas e se adotem medidas corretivas para evitar a sua repetio.

Tipos de Acidentes: Nos laboratrios de pesquisa os acidentes mais freqentes so: a) Exposio a material biolgico: Acidentes com perfurocortantes: Recomenda-se lavar o local com muita gua e sabo. Embora no existam evidncias de que usando anti-sptico ou a prtica de pressionar o local para sada de fludo/sangue da leso reduzam o risco de transmisso de patgenos (HIV, vrus das hepatites virais B e C), o uso de antisspticos no contra-indicado. Assim, a soluo aquosa de Povidine (Polivinil Pirrolidona Iodo PVPI) ou outra contendo iodo (lcool iodado) pode ser usada. Acidentes com microorganismos patgenos: Recomenda-se isolar e sinalizar a rea onde ocorreu o acidente (quebra de lacas de cultura bacteriana, ou derramamento de meios de cultura com o patgeno) e no local jogar uma boa quantidade de hipoclorito (gua sanitria ou soluo de Lisoform) e aguardar 30 minutos para que haja descontaminao dos patgenos. Em seguida (usando luvas) pode-se fazer a lavagem do local e o material utilizado no procedimento deve-se ser encaminhado para esterilizao apropriada. Em caso de contato com a pele, deve-se ser feita a antissepsia com soluo de lcool iodado e antisspticos adequados. 102

Exposio de mucosa ocular: Recomenda-se no friccionar os olhos e lav-los imediatamente em lava-olhos. preciso lavar com muita gua por 10 minutos ou mais at que a substncia seja totalmente removida. Se o acidentado estiver utilizando lentes de contato, elas s devem ser retiradas depois da lavagem. Exposio cutnea: Recomenda-se descontaminar a regio atingida com lcool a 70%. b) Acidentes com substncias qumicas: O procedimento a ser adotado depende do local afetado. Queimadura por cidos: Lavar imediatamente o local com gua em abundncia durante cerca de cinco minutos. Em seguida lavar com soluo saturada de bicarbonato de sdio e novamente com gua. Queimadura por lcalis: Lavar imediatamente o local com gua em abundncia durante cerca de cinco minutos. Em seguida tratar com soluo de cido actico a 1% e novamente gua. cido nos olhos: Fazer uma lavagem com gua corrente por quinze minutos e aps aplicar soluo de bicarbonato de sdio a 1%. Intoxicao por gases ou vapores: remover a vtima para ambiente arejado, deixando-a descansar. Procurar suporte respiratrio. c) Acidentes com radioativos: Em caso de contaminao externa, entendida como a presena de material radioativo na pele, dever ser providenciada a sua remoo, ou descontaminao. Antes de ser iniciada a descontaminao dever ser observado se a vtima possui algum ferimento na pele prximo da regio atendida. Neste caso, tal ferimento dever ser isolado com material impermevel e fita gomada. A descontaminao da pele deve ser feita por lavagem com gua corrente em abundncia e sabo ou detergente. Todo cuidado dever ser tomado para evitar a abraso da pele, o que agrava o acidente por propiciar vias de penetrao do radionucldeo no organismo. No caso de contaminao das mos poder ser provocada sudorese, como via de eliminao do contaminante, atravs da utilizao de luvas. No caso de contaminao de olhos, nariz, boca, couro cabeludo, inalao ou ingesto, as vtimas devero ser encaminhadas para atendimento mdico especializado. Todo material empregado na descontaminao ser considerado como rejeito radioativo e tratado como tal, isto , dever ser segregado e determinado o tempo durante o qual devero ser guardados antes de serem considerados como resduos comuns.

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