UNIDAD 1.

HISTOLOGA Y SUS MTODOS DE ESTUDIO

Tema 1. Introduccin a la histologa Objetivo terminal: Destacar la importancia del estudio de la histologa.

DEFINICIN DE HISTOLOGA De acuerdo a la traduccin literal histologa significa el estudio del tejido. Deriva del griego histos: tejido de telar y logos: estudio o conocimiento de. Las primeras investigaciones histolgicas fueron posibles en el ao 1600, cuando se incorpor el recin inventado microscopio a los estudios anatmicos. La anatoma, que es el estudio de la forma y estructuras de los organismos vivos, comienza a dividirse gradualmente en dos ramas: 1) anatoma macroscpica, que comprende el estudio de las estructuras visibles a simple vista y, 2) anatoma microscpica, la cual requiere el uso del microscopio. La anatoma microscpica incluye las siguientes ciencias: Citologa. Estudia la estructura microscpica de las clulas. Histologa. Estudia la estructura microscpica de los tejidos. Organologa. Estudia la estructura microscpica de los rganos.

HISTORIA DE LA HISTOLOGA El fundador de la histologa fue Marcelo Malpighi (1628-1694). En el ao 1665, Robert Hook estudi el tejido vegetal en cortes de corcho y observ que el tejido vegetal estaba formado por

pequeas cmaras a las que denomin clula, tambin fue quien desarroll el primer microscopio compuesto y es a partir de este que los avances tecnolgicos lograron disear los ms modernos microscopios usados en la actualidad. Bichat a finales de 1700, introduce el trmino tejido. Brown en el ao 1833, descubre el ncleo celular. Los adelantos tecnolgicos conducen al desarrollo de la generalizacin ms bsica de la ciencia la Teora Celular, que fue desarrollada por Schleiden (1838), para el reino vegetal y por Schwann (1839), para el reino animal y no es ms que el reconocimiento de que la clula es el elemento fundamental del organismo, al que, en ltima instancia se deben trasladar todos los procesos vitales y que las plantas y los animales son agrupaciones de estas unidades vivas potencialmente independientes. Remak en el ao 1852, descubri que las clulas se originan por divisin de otras clulas y que el proceso se origina en el ncleo. Virchow (1852) confirma este hallazgo en la famosa teora ovnis cellula e cellula (toda clula se origina de otra). Koelliker en el mismo ao, establece la clasificacin de los cuatro tejidos fundamentales, es decir, tejido epitelial, tejido conectivo, tejido muscular y tejido nervioso. En el ao 1932, Knoll y Ruska construyen el primer microscopio electrnico.

OBJETIVOS DE LA HISTOLOGA Comprender la estructura de las clulas, tejidos y rganos a nivel microscpico incluyendo relaciones tridimensionales entre sus componentes bioqumicos. Comprender la relacin entre la subestructura y funciones normales de las clulas, tejidos y rganos. Establecer una base para el aprendizaje de la histologa, relacin entre las estructuras anormales de tejidos y rganos, y los defectos funcionales.

Proporcionar una base para el estudio de los tejidos y rganos enfermos. En base a lo expuesto, la histologa ocupa un lugar central entre la educacin y la

investigacin mdica. Al explicar las interrelaciones entre clulas, los tejidos y la estructura y composicin molecular de los rganos, la histologa representa el nexo de unin entre la bioqumica, la fisiologa y la gentica por un lado, y los procesos patolgicos y la clnica por el otro lado.

COMPONENTES QUMICOS ELEMENTALES DE LA CLULA Las estructuras microscpicas son una ordenacin concreta de los componentes qumicos, los mismos se dividen en inorgnicos, los cuales son agua y sales minerales, y orgnicos que incluyen los carbohidratos, lpidos, protenas y cidos nucleicos. De los elementos de la tabla peridica slo una veintena conforman a los seres vivos y de acuerdo al porcentaje de tomos en la materia viva se clasifican en tres grupos: Primer grupo. Incluye carbono (C), hidrgeno (H), nitrgeno (N) y oxgeno (O2). Son indispensables para la formacin de carbohidratos, protenas, lpidos y cidos nucleicos. Comprenden entre el 2 y 60% de la composicin celular. Segundo grupo. Son sodio, potasio, cloruro, los cuales forman las soluciones salinas; magnesio, calcio intervienen como elementos indispensables en ciertas reacciones enzimticas; fsforo participa en la transferencia de energa y azufre interviene en la formacin de los enlaces peptdicos en las protenas. Este grupo representa entre el 0,02-0,1% de los componentes de la materia viva. Tercer grupo. Corresponde a boro, silicio, vanadio, manganeso, hierro, cobalto, cobre, zinc y molibdeno. Son indispensables para el funcionamiento de las enzimas.

Componentes inorgnicos Agua Es el mayor componente de la clula, representa el 70-95% del peso de la clula. El agua es indispensable dado a que casi todas las reacciones qumicas y, en consecuencia, las actividades celulares, ocurren en medio acuoso. Esto se debe a una de las propiedades ms importantes y bsicas del agua, la capacidad de actuar como solvente de sustancias con cargas y polares, lo cual, a su vez, se relaciona con el pequeo tamao de la molcula de agua y su fuerte polaridad. Se puede considerar al agua como un dipolo, puesto que su molcula posee un reparto asimtrico de las cargas. El agua se encuentra en la clula en dos formas: estado libre y ligada. Estado libre. Interviene en el metabolismo y desempea un papel de: a) Solvente estable: La solubilidad del agua est dada por su polaridad y aptitud de ligar el H+, as por los grupos funcionales de la molcula a disolver. Los grupos funcionales miscibles en agua son: Hidroxilo (OH): alcoholes (metlicos, etlicos, proplicos y glicerol). Carboxilo (COOH): cidos (propinico, actico, frmico, entre otros). Cetnicos (CO): cetonas. Aldehidos (CHO): acetoaldehidos. Amino (NH2): aminas (metilaminas, etilaminas). Amido (CONH2): amidas (tormamida, acetamida, entre otros).

b) Medio ionizante: Provoca la disociacin de las sustancias llamadas electrolitos dbiles (COOH y NH2, son los ms abundantes), que liberan o aceptan un protn H+ en medio acuoso.

Estado ligado. Representa slo el 5% del total del agua, est ligada a las protenas donde cumple funciones de constitucin.

Sales minerales Las sales minerales estn presentes en el medio intracelular como en el medio extracelular; sin embargo, sus concentraciones difieren. Las sales minerales se consiguen combinadas a carbohidratos, lpidos o protenas, o bien, libres. En este caso, la mayor parte se encuentran en estado ionizado por el agua en aniones y cationes. Es especialmente caracterstico que la clula posea una elevada concentracin de potasio y magnesio, mientras que el sodio, calcio y cloro estn ms elevados en el lquido extracelular. La mayor concentracin de aniones celulares corresponde al fosfato (tabla 1).

Tabla 1. Concentracin en miliequivalentes por litros de agua de los diferentes iones en los medios intra y extracelular.
IN POT ASIO SODIO CALCIO MAGNESIO CLORO BICARBONATO FOSFATO SULFAT O MEDIO INTRACELULAR 120 5 2 30 5 10 98 20 MEDIO EXT RACELULAR 5 145 4 3 105 28 3 1

Las sales minerales tienen como funcin: Mantenimiento de la presin osmtica: las diferencias de las concentraciones inicas tanto dentro como fuera de la clula permiten mantener una misma presin osmtica intra y extracelularmente. Mantenimiento del pH: los iones H2PO4 - y HPO4= constituyen un sistema tampn que estabiliza el pH de la sangre y lquido tisular. Mantenimiento del equilibrio cido-bsico. Actan como cofactores imprescindibles de procesos enzimticos.

Componentes orgnicos Todas las sustancias orgnicas contienen carbono y stas comprenden los hidratos de carbono, lpidos, protenas y cidos nucleicos.

Hidratos de carbono Son molculas formadas por C, H y O, que tienen la funcin de fuente de energa y de componente estructural para la clula. Se clasifican en monosacridos, disacridos y polisacridos. De los monosacridos las pentosas ribosa y desoxirribosa son las ms importantes, dado a que forman parte de los cidos nucleicos. La hexosa glucosa, es la principal fuente de energa de la clula. Tambin son hexosas importantes la galactosa, que forma parte del disacrido lactosa y la fructosa componente de la sacarosa.

Los disacridos se forman por la unin de dos monosacridos con eliminacin de una molcula de agua. Los ms importantes son la sacarosa, es el azcar comn que se acumula en los vegetales, y la lactosa, es el azcar de la leche, que se sintetiza y secreta por las clulas de las glndulas mamarias. Los polisacridos se forman por la unin de muchas molculas de monosacridos. El de mayor importancia es el glucgeno formado por varias molculas de glucosa y representa una sustancia de reserva energtica de la clula animal, se puede detectar en numerosos tejidos y rganos, no obstante, la mayor parte de l se encuentra en las fibras musculares y hepticas. Los polisacridos pueden formar combinaciones con lpidos, denominndose, glucolpidos, los cuales intervienen en la construccin de las membranas celulares, o con protenas como por ejemplos glucoprotenas, que forman parte de las membranas celulares y son componentes de las secreciones de muchas clulas; y los glucosaminoglucanos, componentes esenciales del tejido conectivo. A diferencia del glucgeno, el glucosaminoglucano incluye ms de un tipo de monosacrido en el polisacrido.

Lpidos Representan un grupo heterogneo de sustancias con la caracterstica comn fundamental de ser pocos solubles en agua, pero muy solubles en solventes orgnicos (alcohol, ter, benceno y xileno). Los lpidos se encuentran en la clula como reserva energtica y componente estructural, bajo la forma de membrana. Los lpidos se clasifican en lpidos simples y complejos. Los lpidos simples estn formados por la combinacin de un alcohol y un cido graso. Los ms importantes son los triglicridos y su funcin principal es de depsito de energa

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concentrada, acumulndose como gotas en las clulas, y el esteroide colesterol, que compone las membranas celulares y tambin interviene en la formacin de distintas hormonas, entre ellas, las hormonas sexuales. Los lpidos complejos son steres de cidos grasos y alcohol, que adems contienen una base aminada y cido fosfrico. Los fosfoaminolpidos son un grupo importante, dado a que se encuentran extensamente distribuidos, entre ellos se destacan las lecitinas, es un componente de las membranas celulares y las esfingomielinas forman parte de la capa de mielina de las fibras nerviosas.

Protenas Son polipptidos formados por 50 o ms aminocidos. Un polipptido es un polmero formado por aminocidos que se unen covalentemente unos a otros en secuencia mediante enlace peptdico. Las protenas tienen un importante rol en la estructura y funcin de las clulas y el organismo como unidad. Desde un punto de vista estructural, forman parte de molculas estructurales de las clulas, estructuras extracelulares como las fibras de colgeno que contribuyen a la fuerza de traccin de tejidos como tejido conectivo. Por otra parte, las protenas forman enzimas, anticuerpos y hormonas. Juegan un papel importante en el metabolismo celular, ya que la mayora de las reacciones qumicas son catalizadas por enzimas.

cidos nucleicos Son macromolculas con importancia biolgica esencial, dado que las caractersticas hereditarias tienen su base qumica en el ADN. Existen dos tipos ADN, presente en el ncleo y

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ARN, se sintetiza en el nuclolo y pasa al citoplasma. Las macromolculas estn formadas por nucletidos, cada una compuesta por una base nitrogenada, una pentosa y cido fosfrico.

PROTOPLASMA Estos componentes bioqumicos, orgnicos e inorgnicos, forman la sustancia viva denominada protoplasma, y la integracin de las funciones de estos componentes le otorgan al protoplasma las propiedades de la vida que sealan las funciones de la clula: Absorcin. Es la capacidad de la clula de captar sustancias del medio entorno. Secrecin. Ciertas clulas tiene la capacidad de transformar las sustancias absorbidas en productos especficos, para luego ser eliminados bajo la forma de secrecin. Excrecin. Es la capacidad de las clulas de eliminar el producto de desecho de su metabolismo. Irritabilidad. Es la capacidad de las clulas de reaccionar ante un estmulo. Esta propiedad est ms exacerbada en las clulas nerviosas. Conductividad. Es la capacidad de las clulas de transmitir un impulso. Contractilidad. Es una capacidad especial de las clulas musculares, donde se acortan en una direccin determinada, como reaccin a un estmulo. Respiracin. Se refiere a la respiracin celular donde la clula produce energa a travs de la utilizacin del oxgeno absorbido en la oxidacin de nutrientes. Reproduccin. La clula tiene la capacidad de renovarse por medio del crecimiento y divisin. El crecimiento est limitado a la sntesis de material celular, mientras que la divisin celular es el origen de una clula a partir de otra preexistente.

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Tema 2. Mtodos histolgicos Objetivo terminal: Describir los diferentes mtodos de estudios histolgicos.

MICROSCOPIO Existen dos tipos de microscopios los microscopios pticos de luz y los microscopios electrnicos.

Propiedades de las lentes El poder de resolucin es el factor ms significativo de una buena imagen, el mismo se define como la menor distancia que debe existir entre dos puntos del objeto para poder visualizarse por separados. El poder de resolucin determina la calidad (claridad y mayor riqueza en detalles) de la imagen y depende de la longitud de onda de la luz empleada y la apertura numrica del objetivo y condensador. El aumento es el producto de la multiplicacin del aumento del objetivo por el del ocular, esta propiedad de la lente permite amplificar el tamao del objeto en estudio. La apertura numrica (NA) es una medida de la capacidad del microscopio de agrupar las refracciones de los rayos de luz producidos por los pequeos detalles de la muestra y depende del ndice de refraccin en que est trabajando la lente y la mitad del ngulo superior del haz de luz. El valor de NA aumenta a medida que el objetivo se acerca a la muestra. El ndice de refraccin es la relacin existente entre la velocidad de la luz en el vaco y el medio que atraviesa. Es una medida del ndice de dispersin de la luz.

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Se manejan los ndices de tres medios como aire que es 1, vidrio que es 1,52 y aceite de cedro, 1,515. Este ltimo es el que se utiliza con los objetivos de inmersin (son aquellos que requieren de un lquido interpuesto entre la lente frontal y la superficie de la muestra), dado que es el lquido cuyo ndice de refraccin se acerca al vidrio (lentes, cubre y portaobjetos) estableciendo un medio homogneo al paso de la luz a travs de la muestra anulando la brusca refraccin de los rayos de luz al pasar del vidrio (cubre y portaobjetos)-aire, y aire-lente del objetivo, tal como acontece cuando se utilizan los objetivos secos.

Tipos de microscopios de luz Microscopio compuesto de campo brillante. Es el de mayor uso en la prctica. Se caracteriza porque est compuesto por una serie de lentes y el campo de la muestra est completamente iluminado. La bombilla es elctrica con alambre de tungsteno. Las muestras histolgicas tienen que ser traslcidas y colorearse para proporcionar contraste. Microscopio de campo oscuro. Usa un condensador especial, donde la luz que llega al objetivo es la dispersada por las pequeas partculas de la muestra. La muestra se observa como una estructura luminosa sobre un fondo oscuro. Se usa para el estudio de estructuras vivas muy pequeas con poco contraste con el microscopio de campo brillante, como es el caso del Treponema pallidum en bacteriologa clnica. Microscopio de contraste de fase. Se fundamenta en las diferencias de ndice de refraccin de los componentes tisulares, que son transformadas en diferencia de intensidad que son distinguidas por el ojo humano. Posibilita la observacin de muestras sin colorear, por lo que es til para estudiar material vivo como los cultivos de tejidos.

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Microscopio de interferencia. Tiene el mismo principio que el microscopio de contraste de fase; sin embargo, permite cuantificar la masa de los componentes de las clulas y tejidos, al comparar un haz de luz de referencia con las diferencias de fases. Microscopio de fluorescencia. Usa como fuente de luz la luz ultravioleta, la cual se hace incidir sobre la muestra marcada con compuestos fluorescentes (fluorocromos), estos son excitados y emiten una luz visible al ojo humano. Se utiliza en las tcnicas de inmunufluorescencia o tinciones fluorescentes. Microscopio de luz polarizada. Se basa en la propiedad de ciertas estructuras de dividir la luz polarizada (luz que vibra en un slo plano) en dos componentes con velocidades distintas (estructuras birrefringentes o anisotrpicas). Aquellas estructuras que no dividen la luz polarizada se denominan isotrpicas. Se utiliza para obtener informacin respecto a la estructura a nivel molecular y el estudio de clulas vivas. Microscopio de luz ultravioleta. Utiliza luz ultravioleta que tiene la mitad de longitud de onda (250 nm) que la luz visible (500 nm), duplicando el poder de resolucin. La formacin de la imagen se registra sobre una pelcula fotogrfica. Se utiliza en la deteccin de cidos nucleicos que absorben esta luz.

Tipos de microscopios electrnicos Los microscopios electrnicos emplean como fuente luminosa un haz de electrones con longitud de onda aproximada de 0,005 nm, elevando notablemente el poder de resolucin. Las lentes son campos electromagnticos que modifican el trayecto del haz de electrones en una atmsfera al vaco, al igual como se refracta el haz de luz visible en las lentes de cristal. La

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imagen formada se registra sobre una pantalla fluorescente o pelcula fotogrfica, dado a que el haz de electrones no es visible por el ojo. Existen dos tipos de microscopios electrnicos: Microscopio electrnico de transmisin. Permite la observacin en detalles a escala macromolecular. Los electrones atraviesan el objeto. Microscopio electrnico de barrido. El haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que choca contra ella, permite una gran magnificacin de las imgenes.

CLASIFICACIN DE LOS MTODOS HISTOLGICOS Los mtodos histolgicos se clasifican como: 1) Los basados en la observacin directa de clulas y tejidos vivos. 2) Los que analizan material muerto o inanimado. En un punto medio se ubican los mtodos de centrifugacin que permiten el aislamiento de componentes de clulas vivas.

VENTAJAS Y LIMITACIONES DE LOS MTODOS HISTOLGICOS Ventajas. Permiten la observacin de estructuras microscpicas y la interpretacin de los procesos fisiolgicos. Limitaciones. La obtencin de material para estudio histolgico interfiere con el desarrollo de los procesos que se estudian. Ciertos procedimientos utilizados implican muchas posibilidades de modificacin del aspecto de las estructuras, debidas a causas tcnicas y dejan sin respuestas numerosas incgnitas referidos a los procesos celulares vitales.

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MTODOS BASADOS EN LA OBSERVACIN DE CLULAS Y TEJIDOS VIVOS

Coloracin vital y supravital Existen colorantes pocos inocuos que son captados selectivamente por las clulas, de modo, que la localizacin del colorante permite detectar grupos celulares o sus organelas. En la coloracin vital se inyecta el colorante en el animal vivo. En la coloracin supravital, el colorante se agrega directamente sobre la clula o tejido luego de haber sido extrado del organismo, por ejemplo (p. ej.): azul de tripn, carmn de litio, rojo neutro, verde jano, alizarina.

Cultivo de tejidos Permiten los estudios de crecimiento, diferenciacin y divisin de clulas. Comprende la aplicacin de ciertas tcnicas para el cultivo in vitro de clulas, tejidos y rganos. Tipos: Cultivo celular. Es el crecimiento y expansin de las clulas in vitro procedentes de la migracin o disgregacin espontnea, mecnica o enzimtica de un tejido determinado, p. ej.: cultivos de clulas sanguneas para el estudio del nmero y morfologa de los cromosomas (cariotipo). Cultivo de clulas HeLa para la formacin de hbridos (fusin de dos clulas) en la elaboracin de anticuerpos monoclonales, cuya utilizacin tiene gran importancia en la investigacin inmunohistoqumica. Cultivo de oocitos til en las tcnicas de fertilizacin. Cultivo de tejidos y rganos. Comprende la transferencia de tejidos u rganos (embrionarios o maduros) a un medio de cultivo. Son tiles en los estudios de la clonacin donde se cultiva tejido ovrico o el rgano para la recuperacin de oocitos que sirven como clulas receptoras.

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Fraccionamiento celular Se basa en el uso de la fuerza centrfuga para separar los componentes celulares, de acuerdo con el coeficiente de sedimentacin de cada uno de ellos. Esta tcnica permite determinar la composicin bioqumica y funcional in vitro de las organelas celulares. Se reconocen dos tipos: Centrifugacin deferencial. Es la ms usada, previamente, el tejido es homogeneizado. El sobrenadante es sometido a fuerzas centrfugas crecientes. Las organelas ms densas precipitan primero. El sobrenadante de cada centrifugacin es sometido a una fuerza centrfuga mayor, separndose as los componentes celulares. Centrifugacin por gradientes de densidad. En la centrifugacin por gradiente de densidad el homogeneizado se coloca en una solucin cuya concentracin aumenta a medida que se acerca al fondo. Tras la aplicacin de una fuerza centrfuga las organelas se detienen en la profundidad de la solucin que posea su misma densidad. Permite obtener fracciones ms puras.

MTODOS BASADOS EN EL ANLISIS DE MATERIAL MUERTO El mtodo de uso cotidiano en histologa es el que permite obtener preparaciones histolgicas permanentes (cortes) para la observacin al microscopio ptico. El material o espcimen a emplear se clasifica segn la procedencia del tejido y la finalidad de estudio. Se distinguen dos tipos: Material histolgico. Es toda muestra de tejido obtenida de animales o individuos sanos, con la finalidad de estudiar la composicin y estructura normal. Los tejidos normales de humanos se obtienen habitualmente a partir de cadveres.

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Material anatomopatolgico. Son muestras que proceden de animales o individuos enfermos, que son utilizadas para el diagnstico o investigacin etiolgica de la enfermedad. El material anatomopatolgico procede de necropsias, biopsias, extensiones citolgicas o patologa experimental. El conjunto de manipulaciones y mtodos empleados para la confeccin de preparados histolgicos recibe el nombre de Procesamientos Histolgico de Tejidos y comprende los pasos de fijacin, inclusin, corte y coloracin.

Procesamiento histolgico de tejidos para microscopia ptica Fijacin El objeto de la fijacin es conservar la composicin qumica y estructural del tejido con la menor alteracin posible con respecto a la que posea in vivo, por ello debe realizarse en el menor tiempo posible para evitar la autlisis y putrefaccin. Segn su mecanismo de accin los agentes fijadores se clasifican en dos grupos: 1) Fijadores por mtodos fsicos. 2) Fijadores por mtodos qumicos.

En el primer caso se emplea el enfriamiento por congelacin que evita la autlisis y putrefaccin. Los fijadores por congelacin son tiles para estudios de la morfologa y funcin de tejidos que requieren mantener intacta la estructura antignica y actividad enzimtica. En el segundo caso emplea sustancias lquidas que bloquean la autlisis al desnaturalizar e insolubilizar las protenas, algunas evitan tambin el crecimiento bacteriano. La fijacin con procedimientos qumicos puede ser por:

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Inmersin: se sumerge la muestra en el lquido fijador. Perfusin: se administra el fijador por va vascular a los tejidos y clulas antes de estos ser extirpados (p. ej.: el embalsamamiento).

Los fijadores qumicos se clasifican de acuerdo a su mecanismo de accin sobre los tejidos: Fijadores por deshidratacin del tejido: es eliminada el agua libre y ligada de las protenas, estas ltimas precipitan. Este cambio proteico es conocido con el nombre de desnaturalizacin. Son ejemplos la acetona, alcohol etlico, alcohol metlico. Son tiles para el mantenimiento de la estructura antignica en los estudios histoqumicos e

inmunohistoqumicos. Fijadores por cambios en el estado coloidal de las protenas: precipitan las protenas sin sustraer el agua de los tejidos, al cambiar el punto isoelctrico de ellas. Son ejemplos el cido actico, cido crmico, cido tricloroactico. Se utilizan para estudios del ncleo, sistema nervioso, descalcificacin sea. Fijadores que actan por formacin de sales con los tejidos: el agente fijador es un catin, por lo general mercurio o cromo, o un derivado orgnico como el cido pcrico. Son fijadores de accin rpida y provocan un notable endurecimiento por lo que es recomendable usarlos en mezclas fijadoras. Son ejemplos el cloruro de mercurio, dicromato de potasio, cido pcrico. Son excelentes en la conservacin de los caracteres morfolgicos celulares, no disuelven lpidos, ni glucgeno. Son excelentes mordientes intensificando las coloraciones nucleares y citoplasmticas.

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Fijadores por reticularizacin de las protenas: se produce desnaturalizacin de las protenas por rotura de los puentes de hidrgenos, con la formacin ulterior de una malla reticular por asociacin entre los grupos qumicos desenmascarados por el lquido fijador. Por lo comn el mismo fijador forma nexos de unin con los grupos qumicos contribuyendo con la formacin de la red. En este grupo se encuentra el fijador ms usado para los estudios histolgicos en la microscopia ptica; el formaldehido o formalina al 40%. Es el ms barato, preserva bien las clulas y tejidos, no endurece mucho, es un buen desinfectante, produce escasa retraccin tisular, es compatible con la mayor parte de las tinciones.

Mezclas fijadoras Proceden de la combinacin de fijadores simples, los cuales pretenden sumar las ventajas de cada uno de ellos amortiguando sus inconvenientes. Se clasifican como: Contienen formol: lquido de Bouin, Zenker formol. No contienen formol: lquido de Zenker.

Cuando se utiliza la fijacin qumica es necesario tres pasos previos a la inclusin, de modo de acondicionar al tejido extrayndole toda el agua y sustituirla por un medio que sea miscible en el medio de inclusin, continundose por lo tanto con la deshidratacin, aclaracin e infiltracin.

Deshidratacin El objetivo es extraer el agua completamente y sustituirla por alcohol. El tejido es sometido a concentraciones crecientes de alcohol hasta 100%.

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Aclaramiento e infiltracin El objetivo es aclarar el tejido, lo que se logra sustituyendo el alcohol por la sustancia aclarante, en la microscopia ptica se usa el xileno. La infiltracin tiene como objeto impregnar el tejido con el medio a utilizar en la inclusin, como la parafina para la microscopia ptica. El fundamento del proceso es que el medio de inclusin ocupe los espacios intra y extracelulares ocupados anteriormente por el agua y se logra eliminando la sustancia aclarante.

Inclusin La finalidad es proporcionar un bloque rgido que sirva de soporte para el tejido en la elaboracin de cortes. El medio de inclusin fundido a 56 C es colocado en unas L o envases metlicos, el tejido se lleva al fondo dndole una orientacin determinada, una vez solidificada la parafina se obtiene el tejido incluido en un bloque (fig. 1).

Figura 1. Dibujo esquemtico del procedimiento de inclusin del tejido con parafina fundida a 56 C empleando como moldes unas L.

Cortes En la microscopia ptica los cortes deben ser finos oscilando entre 5-10 m de espesor. El equipo utilizado es el micrtomo que emplea cuchillas de acero inoxidable que proporcionan

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cortes entre 3-10 m. El micrtomo tambin

puede utilizar cuchillas de diamante que

proporcionan cortes de 1-5 m. El criostato es un micrtomo que proporciona cortes ms gruesos entre 10-30 m, y es empleado en el procedimiento de fijacin por congelacin (fig. 2).

Figura 2. Dibujo esquemtico de varios tipos de micrtomos. a) micrtomo tipo Minot; b) micrtomo de congelacin, utiliza gas carbnico y proporciona cortes de 5, 10, 15, 20 m.; c) criostato, tiene una cmara frigorfica donde se encuentra el micrtomo, utiliza gas fren.

Montaje En la microscopia de luz los cortes se montan en lminas portaobjetos. En el montaje se hace necesario la utilizacin de sustancias que permitan fijar el corte al portaobjeto como albmina, gelatina (fig. 3).

Figura 3. Dibujo esquemtico del montaje de los cortes. Los cortes son colocados en un bao de Mara a 40 C, luego son colocados en lminas portaobjetos, dejndose secar a 37 C.

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Tincin Tiene como finalidad destacar los componentes celulares y tisulares. Los mecanismos de tincin son fsicos, fisicoqumicos e histoqumicos. Fsicos. Se fundamentan en la propiedad de disolucin e impregnacin del colorante sobre el tejido. En la primera el colorante es ms soluble en el tejido que en el disolvente que acta como transporte, difundiendo el colorante hacia el tejido. Es ejemplo el Sudn III, que es utilizado para la coloracin de las grasas (fig. 4). En el segundo caso el colorante por su gran tamao o precipitacin formando agregados insolubles, queda atrapado entre las mallas celulares y fibras que constituyen los tejidos. Entre estos estn las coloraciones argnticas para el sistema nervioso o tejido conectivo reticular (fig. 5) o las coloraciones selectivas para fibras de colgeno como las tinciones tricrmicas de Mallory y van Gieson.

Figura 4. Fotomicrografa de corte de tejido adiposo con la coloracin Sudan III. Las clulas adiposas se tien de color pardo por accin del colorante Sudan III que por ser ms soluble en el tejido difunde hacia ste.

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Figura 5. Fotomicrografa que muestra fibras reticulares (color negro) teidas con coloracin argntica. Mtodo de impregnacin, basado en la precipitacin de sales de plata sobre estructuras fibrosas.

Fsicoqumicos. Se basa en la atraccin de cargas opuestas y en la organizacin molecular del colorante. Un ejemplo de atraccin de cargas es el mtodo de tincin empleado en la rutina como lo es la coloracin de hematoxilina y eosina (H-E). La hematoxilina es el colorante bsico que imparte color violeta y tie estructuras cidas (carga negativa) de la clula como el ncleo; las estructuras con afinidad por el colorante bsico son denominadas basfilas. La eosina es el colorante cido (carga negativa) y se fija a las estructuras bsicas (carga positiva) de la clula como el citoplasma, el color proporcionado es rosado; las estructuras afines a los colorantes cidos se les denominan acidfilas. En la tabla 2 se presentan las caractersticas tintoriales de diversas clulas y tejidos cuando se usa la tcnica de H-E (fig. 6). La organizacin molecular del colorante, se refiere a la tincin de metacromasia en donde el colorante con un color previo interacciona con una estructura fuertemente cida, se organiza molecularmente conduciendo a un cambio de color. El azul de toluidina derivado de la anilina es

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un colorante que expresa este efecto de metacromasia, el cual al interaccionar con los grupos sulfatos de los glucosaminoglucanos cambia de su color original azul a prpura (fig. 7). Histoqumicos. Se basa en la reaccin qumica de grupos especficos. Un ejemplo es la coloracin de PAS (Peryodic Acido Schiff). Se fundamenta en la oxidacin de los grupos hidroxilos por el cido peryodico con la formacin de grupos aldehidos, el reactivo de Schiff (leucofucsina) reacciona con ellos formando un producto estable de color rojo magenta (fig. 8). til para la deteccin de carbohidratos como el glucgeno y glucoprotenas.

Mtodos complementarios Citoqumicos e histoqumicos. Son mtodos que tienen como objeto estudiar la estructura qumica y composicin de los tejidos. Se basan en reacciones qumicas especficas de grupos. Uno de los criterios para que un mtodo sea histoqumico es que debe conservar la composicin qumica normal, p. ej.: PAS, reaccin de Feulgen para deteccin de ADN. Histoqumica enzimtica. Comprenden mtodos que tienen como objetivo demostrar la actividad enzimtica, se fundamenta en la especificidad de sustrato. Se usa en la deteccin de fosfatasas alcalina en los neutrfilos que en la clnica es til en la diferenciacin de las leucemias. Tambin estos mtodos son usados para determinar la actividad osteoblstica, detectar defectos enzimticos en la biopsia yeyunal. Mtodos inmunohistoqumicos. Son mtodos que se basan en el uso de anticuerpos marcados con enzimas o fluorocromos, con el fin de localizar molculas especficas, enzimas, hormonas, estructuras tisulares, p. ej.: inmunofluorescencia, ELISA. Hibridacin in situ. Es una tcnica molecular que se basa en la capacidad de las cadenas de cido nucleico de unirse entre s. Permite demostrar la presencia y secuencias de cidos nucleicos

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sobre cortes histolgicos o extensiones citolgicas. Dentro de las aplicaciones estn deteccin de virus, antgenos virales, oncogenes en tejidos normales y neoplsicos.

Tabla 2. Caractersticas tintoriales de distintas estructuras con hematoxilina y eosina (H-E). Clulas y componentes extracelular Ncleo Heterocromatina (cromatina laxa) Eucromatina (cromatina condensada) Nuclolo Citoplasma Ergastoplasma (retculo endoplasmtico rugoso) Citoplasma en general Filamentos citoplasmticos Material extracelular Fibras colgenas Fibras elsticas Coloracin Azul Violeta Azul

Azul Rosado Rosado

Rosado Rosado, en general no se distinguen de las colgenas, para verlas se usan tcnicas especiales Rosado, en general no se distinguen de las fibras colgenas, para verlas se requieren de tcnicas especiales Azul, pero slo si es abundante como en la matriz cartilaginosa Rosado Rosado

Fibras reticulares

Sustancia fundamental

Matriz sea (descalcificada) Membrana basal

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Figura 6. Fotomicrografa de tejido epitelial teido con H-E. Los ncleos (flechas) se tien de color violeta y el citoplasma (puntas de flecha) de color rosado.

Figura 7. Fotomicrografa de mastocitos teidos con azul de toluidina. Los grnulos citoplasmticos son metacromticos, los cuales se hacen evidentes con el colorante azul de toluidina que los colorea de prpura.

Chapa estriada

Clulas caliciformes

Figura 8. Fotomicrografa de corte de intestino delgado teido con PAS. Los clulas caliciformes secretan el carbohidrato mucina, este componente se pone en evidencia cuando reacciona con el colorante de PAS, distinguindose de color rojo magenta. Por otra parte, la chapa estriada de las clulas epiteliales, presentan un glucoclix que contiene polisacridos y tambin son PAS positivo.