2/15/2010

Bacteriofagul. Caractere morfobiologice. Utilizarea practic a bacteriofagilor

(fag vegetativ) vegetativ)

Proprietatile biologice ale bacteriofagului

Bacteriofagi sunt numite virusurile ce infecteaz bacteriile. Un virus este un organism (o unitate genetic) care nu are structur celular, nu posed metabolism propriu i este capabil s se reproduc doar n celula-gazd.

Bacteriofagii sunt parazii intracelulari obligatorii ale celulelor bacteriene. Toate bacteriile pot fi infectate de ctre bacteriofagi. In majoritatea cazurilor, un fag anume infecteaz doar celulele unui singur gen, unei anumite specii sau a unei tulpini specificitatea fagului. Aceast specificitate de infecie este determinat de prezena receptorilor pentru acest fag la suprafaa bacteriei-gazd.

Structura bacteriofagului Structura fagilor corespunde regulilor generale ce se refer la structura virusurilor. 1. Acid nucleic (ADN sau ARN, mai frecvent dublucatenar, linear sau circular). 2. Inveli proteic numit capsid, cu rol de protecie a materialului genetic. Prin receptorii de la suprafa contribuie la infecia gazdei. 3. Unii fagi pot conine i enzime (ex.: lizozim, endolizina).

Capsida este constituit din subuniti proteice, capsomere, aranjate simetric ntr-o ordine distinct, conferind forma fagului. Exist 3 forme morfologice principale de fagi: Fag icosaedric: are form sferic constituit din 20 fee triungiulare, 30 muchii i 12 vrfuri (simetrie cubic a capsidei). Fag cilindric: reprezint bastonae proteice formate din capsomere, asamblate ntr-o structur tubular (simetrie helicoidal a capsidei).

2/15/2010

Fag complex: este constituit din cap icosaedric ataat la o coad helicoidal. Coada este format din doua tuburi concentrice, un tub intern rigid - canalul axial, care este inconjurat de teaca cozii, un manon contractil. Gulerul cozii (colul) se afl la jonciunea capului cu coada. La partea distal a cozii se afl o plac hexagonal, placa bazal, la fiecare apex fiind ancorate cte un croet i o fibr. Ele reprezent sistemul de fixare a fagului pe bacteria receptoare i contribuie la injecia materialului genetic n celul. Nu toi fagii au o astfel de morfologie. Unii au coad lunga i non-contractila, alii - coada scurt, sau far coad. Exist i fagi filamentoi.

Interaciunea dintre bacteriofag i celula-gazd Bacteriofagii exist n stare de virioni extracelulari, iar la infectarea unei bacterii ei pot duce la doua tipuri de infecii: Infecie litic: determinat de fagii viruleni. La finele ciclului de multiplicare bacteria infectat este lizat elibernd fagii nou-formati. Infectie nelitica sau lizogen: determinat de fagii temperai (moderai). Ei infecteaz bacteriile fr a le distruge.

INFECTIA LITIC (ciclul biologic al fagului virulent) Adsorbia. Dupa o ciocnire intmpltoare, fagul se fixeaz prin intermediul plcii bazale (la inceput prin fibrele sale, apoi prin croete) de un receptor specific la nivelul peretelui celular bacterian (uneori flageli sau pili).

2/15/2010

Penetrarea. Dup fixarea ireversibil a fagului pe peretele bacterian, n urma aciunii unei enzime (ex. lizozim) care perforeaz peretele, are loc contracia manonului care apropie capul de placa bazal, canalul axial penetreaz membrana citoplasmic a bacteriei i ADN fagic este injectat in bacterie.

Expresia genomului viral (biosinteza componentelor fagice, maturizarea). Dup penetrarea ADN viral n bacterie (fag vegetativ), timp de aproximativ 12 minute, virionul nu este depistat n bacteria infectat. Aceasta este faza de eclips. Ea coincide cu sinteza enzimelor virale care vor asigura ulterior: replicarea ADN fagic; sinteza proteinelor fagice; asamblarea acestor elemente.

Asamblarea fagilor. Odat ce compuii capsidei i acizii nucleici se sintetizeaz n cantiti suficiente, are loc asamblarea spontan a particulelor noi de fagi, prin incorporarea acidului nucleic n capsid. Eliberarea. Majoritatea fagilor, dup maturizare, sunt eliberai n urma lizei peretelui bacterian cu enzime ale bacteriofagului (endolizina) Timpul dintre infectie i eliberare (ciclul de reproducere) este de 20-60 minute la 37C, fagii sunt eliberai n valuri de 50-1000 fagi per celul.

2/15/2010

INFECTIA NON LITIC SAU LIZOGEN : FAGII TEMPERAI

Fagii temperai (moderai) atunci cand infecteaz o bacterie pot: - sau induce un ciclu complet de multiplicare, ce duce la liza bacteriei, - sau, mai frecvent, dup injectarea ADN-ului, s integreze acest ADN n cromozomul bacterian prin recombinare specific, formnd un profag (lizogenizare) - sau sa ramn n citoplasm sub form de plasmid. In ultimele dou cazuri bacteria nu moare i, multiplicndu-se, replic genomul viral concomitent cu propriul su genom: bacteria (cultura) este numit lizogen. Ea posed i transmite descendenilor capacitatea de a produce fagi n absena infeciei.

2/15/2010

Proprietile culturilor lizogene 1. Inducia ciclului litic. Profagul pstreaz virulena potenial. Meninerea strii de lizogenie implic sinteza unui represor proteic, codificat de fag. Dispariia lui duce la inducia ciclului litic. Inducia se poate declana spontan la un numar limitat de celule sau poate fi provocat la majoritatea celulelor, de ex., la aciunea unor mutageni, ca razele ultraviolete sau mitomicina C.

Ca urmare, cnd sistemul SOS este activat, proteina RecA scindeaza represorul proteic al fagului, permind expresia ciclului litic. Pentru aceasta profagul trebuie sa fie excizat - operaie invers integrrii. Excizia este efectuat de ctre proteina xis, codificat de fag. Urmeaz replicarea genomului, sinteza componentelor fagului i fagii asamblai sunt eliberai prin liza celulei (profagul - gen potenial letal!).

n timpul replicrii fagului moderat fragmente de ADN bacterian pot fi ntroduse din eroare n particulele virale. Aceti fagi pot n continuare ntroduce n cromosomul altor bacterii ADN bacterian capturat proces de transfer genetic numit transducie. Natura genelor bacteriene transferate poate fi diferit: gene din apropierea locului de inserie a fagului (transducie specific) sau fragmente de ADN bacterian ntroduse din ntmplare n capsida fagului (transducie generalizat)

2/15/2010

2. Imunitate contra suprainfectiei. Bacteriile lizogene sunt imune la fagul virulent omolog profagului gzduit. Acest fag se adsoarbe, injecteaza ADNul, dar fr a se replica sau provoca liza. 3. Conversie fagic (modificarea fenotipului celulei cauzat de genele profagului). Bacteriile infectate cu un fag pot prezenta unele caractere absente la celulele neinfectate. Aceast conversie fagic poate fi cauzat de expresia unor gene ale fagului de ctre celule, sau de inactivarea unor gene cromozomale la integrarea profagului. De ex., tulpinile de Corynebacterium diphtheriae care provoac difteria sunt lizogenizate de un anumit tip de fagi care codeaza i exprim o toxin puternic; toxina eritrogen a Streptococcus pyogenes , etc

Cultura i titrarea bacteriofagilor. Efectul fagilor viruleni asupra culturilor bacteriene

Bacteriofagii sunt cultivai n laborator n mediu de cultur lichid sau solid n prezena bacteriilor omologe. Cultivarea n mediu lichid: Bacteriile sensibile i fagii se ntroduc ntr-un bulion nutritiv (numrul de fagi este mult mai mic dect al bacteriilor). Amestecul este incubat pentru a permite bacteriilor s se multiplice i de a fi infectate de ctre fagi. In consecin, numrul fagilor crete mai rapid dect cel al bacteriilor pn la un punct critic cnd numrul fagilor prezeni este suficient pentru a infecta toate bacteriile culturii. Toate celulele bacteriene sunt lizate n acelai timp, ce duce la dispariia complet a turbiditii culturii (clarificarea mediului).

Cultivarea fagilor n mediu solid: Amestecul bacterii-fagi poate fi adugat la geloza topit i rcit la 45 C i apoi turnat n cutia Petri. Bacteriile cresc, se multiplic, formnd o pelicul fin, iar fagii continu s infecteze provocnd liza confluent a culturii bacteriene. Aceste colonii de fagi se manifest sub forma unor pete sterile (plaje). Numrul plajelor indic numrul fagilor infecioi n prelevat (fiecare colonie se formeaz pe contul multiplicrii unui virion fagic).

Bacteriofagii pot fi intlnii n diferite prelevate umane sau din mediul extern. Fagii indic prezena bacteriilor sensibile. IZOLAREA BACTERIOFAGILOR Prelevate: ap, sol, materii fecale, puroi, etc I. Izolarea direct filtrarea prelevatelor prin filtre bacteriene, ultracentrifugare. II. Izolare prin metoda de mbogire fr nsmnare materialul de examinat se inoculeaz ntr-un mediu nutritiv lichid (pentru multiplicarea bacteriile omologe fagului cutat). Peste 10 ore de incubare la 37 C bulionul este supus filtrrii. In filtrat s-au acumulat fagii care s-au inmulit pe contul bacteriilor omologe din prelevat.

2/15/2010

III. Izolare prin metoda de mbogire cu nsmnare inocularea prelevatului ntr-o suspensie bacterian omolog fagului cutat. Cultura bacterian asigur mbogirea fagilor. Peste 10 ore de incubare la 37 C bulionul este supus filtrrii.

INDICAREA BACTERIOFAGILOR 1. Metoda OTTO. Pe placa de geloz din cutia Petri se nsmneaz n gazon suspensia de bacterii omologe fagului. n continuare se aplic o pictur de filtrat care conine fag (cutia poate fi nclinat ca pictura s se preling). Cutia se incubeaz la 37 C timp de 24 ore. Aprecierea: dac n filtrat se aflau fagi omologi culturii bacteriene, n locul aplicrii filtratului se observ o zon de liz (colonie negativ de fag).

2. Metoda FURT Filtratul ce conine fagi se amestec cu geloz topit i se toarn n cutia Petri. Suprafaa cutiei se mparte n 4 sectoare. n fiecare sector se nsmneaz n striuri culturi cunoscute de diferite bacterii. Incubare la 37 C 24 ore. Aprecierea: lipsa creterii bacteriilor ntr-un sector indic prezena fagului omolog.

3. Metoda FISHER Similar cu metoda Furt, doar c suprafaa cutiei se mparte n 10 cadrane, astfel pot fi nsmnate 10 culturi bacteriene i pot fi indicai concomitent mai muli fagi.

TITRAREA BACTERIOFAGILOR Este utilizat pentru determinarea numrului de fagi viruleni n prelevat sau cultur. Metodele de titrare a bacteriofagului Titrarea bacteriofagului n mediu lichid (metoda Appelman) Titrarea bacteriofagului n mediu solid (metoda Gratia)

I. II.

APPELMAN la diluii logaritmice a culturii de fag (10-1.....10-10) n bulion peptonat se adaug suspensie bacterian omolog fagului examinat. Dup 24 ore de incubare la 37 C se apreciaz titrul fagului: diluia maxim a fagului care nc mai provoac liza bacteriilor (mediu clar).

2/15/2010

GRATIA. Dup diluia logaritmic a fagului i adugarea culturii bacteriene, coninutul fiecrui tub se amestec cu geloz topit i amestecul se toarn n cutii Petri. Dup 24 ore de incubare la 37 C se numr plajele formate (coloniile negative de fagi). Numrul plajelor corespunde cu nr de fagi viruleni din materialul de examinat.

APLICAREA PRACTIC A FAGILOR n domeniul terapeutic - Tratamentul i profilaxia maladiilor infecioase n domeniul diagnostic - Fago-identificarea identificarea tulpinilor bacteriene necunoscute cu ajutorul fagilor omologi (metoda Otto, Furt, etc)

- Lizotipizarea (fagotipajul). Permite diferenierea unor tulpini din cadrul aceleeai specii (subdivizarea speciei n lizotipuri/fagovaruri). Este utilizat pentru tulpini de Staphylococcus aureus, Salmonella Typhi, .a. Lizotipul reprezint un marker epidemiologic. Fagii reprezint un model de studiu pentru geneticieni, fagii temperai se utilizeaz n ingineria genetic (ei pot asigura transferul de material genetic prin transducie).

Genetica bacterian. Variabilitatea genetic la bacterii Materialul genetic al celulei bacteriene: 1. Cromosomul 2. Plasmidele Modificarea patrimoniului genetic al bacteriilor are importan major n bacteriologia medical, deoarece ea poate cauza modificri n potenialul patogen al bacteriilor sau sensibilitatea lor la antibiotice.

2/15/2010

Mecanismele variabilitii genetice la bacterii:

I. MUTAII 1. Substituia unei nucleotide cu alta n timpul replicrii ADN 2. Deleia, inseria sau inversarea unor nucleotide ntr-o gen Frecvena mutaiilor 10-6 10-10 pentru un caracter anumit. Modificrile determinate de mutaii (ex.: rezistena la AB) se transmit la descendeni (transmitere vertical). Unele mutaii pot fi reversibile

II. RECOMBINAREA 1. Recombinarea generalizat (schimb de ADN ntre 2 secvene corespunztoare) 2. Recombinarea specific (integrarea sau excizia unei secvene de ADN, ex: plasmid, bacteriofag) 3. Transpoziia Elementele transpozabile reprezint secvene de ADN cu lungime variabil, flancate de secvene repetate inversate. mperecherea acestor secvene permite excizia lor i renserarea n alt loc al cromosomului sau plasmidei. Unele elemente, numite transpozoni, conin gene suplimentare (frecvent gene de rezisten la AB) Transpoziia duce la rearanjamente genomice. Unii transpozoni, numii conjugativi, au capacitatea de a trece de la o bacterie la alta. Importana practic: numeroase gene de rezisten la AB sunt situate pe transpozoni, ce perimite rspndirea lor. Transpozonii pot trece de la cromosom la plasmid i ulterior la alte bacterii prin conjugare. Transpozonii conjugativi pot trece direct la alt bacterie

III. TRANSFERUL DE MATERIAL GENETIC Materialul genetic poate fi transferat de la o bacterie la alta (transmitere orizontal). Trei mecanisme de transfer sunt posibile: A. Transformarea Fragmente de ADN (eliberate n urma lizei bacteriene) pot penetra n alte bacterii i se pot integra prin recombinare n ADN-ul lor. Este necesar ca bacteria care accept materialul genetic s se afle ntr-o stare particular, de competen. Transformarea se poate realiza doar n cadrul bacteriilor de aceeai specie sau din specii nrudite

2/15/2010

B. Transducia Transferul de material genetic se realizeaz prin intermediul bacteriofagilor moderai. n momentul exciziei profagului din cromosomul bacterian el devine virulent, multiplicndu-se i liznd bacteria gazd. n cursul acestui proces fragmente de ADN bacterian pot fi ntroduse din eroare n particulele virale, care la rndul lor se pot integra prin recombinare n cromosomul altei bacterii acest proces reprezint transducia. Transducia poate fi specializat i generalizat

C. Conjugarea Mecanismul cel mai frecvent n natur. Este un transfer de ADN (plasmide conjugative) de la o bacterie donor ctre o bacterie receptor. Bacteria donor exprim pe suprafaa sa structuri ce permit contactul dintre celule (pili F). n timpul conjugrii plasmida se replic i o copie trece prin intermediului pilului F n bacteria receptor. Transferul se efectueaz ntre bacteriile de aceeai specie, dar i ntre specii diferite. Multiple gene de rezisten la AB sunt localizate n plasmide i prin conjugare se asigur caracterul epidemic al rezistenei la AB. Plasmida conjugativ poate asigura transferul unei plasmide neconjugative sau al unor gene cromosomale (prin integrarea plasmidei n cromosom)

10