Sistemas de clonagem em eucariotos e procariotos

Profa. Dra. Irene Soares (isoares@usp.br)

FCF/USP - 2010

 Isolamento de DNA Clonagem de DNA Transformao pelo DNA Seleo e anlise de recombinantes Expresso de protenas recombinantes Purificao de protenas recombinantes Aplicaes da tecnologia do DNA recombinante

Ferramentas bsicas
Gene de interesse Clula hospedeira (bactrias) Vetores de clonagem e expresso DNA ligases Enzimas de restrio Aparato de eletroforese de DNA Sondas de DNA, Primers

Isolamento de DNA

DNA genmico
cDNA Produto de PCR Gene sinttico

Podem ser utilizados para construo de Bibliotecas de DNA

Vetores de clonagem
Plasmdios: fragmentos de at 10 Kb Fago lambda: fragmentos de 5-20 Kb Cosmdios: fragmentos de 20-50 Kb BAC (Bacterial Artificial Chromosomes): 100-500 Kb YAC (Yeast Artificial Chromosomes): 100 Kb 1Mb

Componentes de um plasmdio
Regio promotora
Plasmdios comerciais pUC pGEM pMOS

DNA exgeno
Stio de Clonagem

DNA genmico, cDNA, Produto de PCR, Gene sinttico

De 1.000 at 20.000 pares de bases

Origem de replicao

Gene que codifica resistncia a antibitico

Plasmdio para clonagem de produtos de PCR

Stio de Clonagem (polilinker)

Ligao

Plasmdio linearizado

Gene a se clonado DNA ligase

Transferncia do plasmdio para uma linhagem de bactria

DNA cromossmico

Plasmdios recombinantes

Mtodos de Transformao pelo DNA

Bactrias (Escherichia coli)

Tratamento com Cloreto ou Fosfato de Clcio E.

coli competente

+ DNA plasmidial

Incubao no gelo

Transformao direta por eletroporao

Choque trmico (42C)

Mtodos de seleo de recombinantes (bactrias transformadas)

Bactrias: Baseado na resistncia a antibitico

Bactria SEM DNA plasmidial

Bactria COM DNA plasmidial

Plasmdio religado (sem inserto)

Plasmdio com inserto

Seleo azul e branca Gene lacZ Gene lacZ

Inserto
IPTG + X-gal Expresso da -galactosidase No h expresso da -galactosidase

Colnias azuis

Colnias brancas

Seleo com sondas de DNA

Obteno de DNA plasmidial

Cultura bacteriana: E. coli contendo o plasmdio
Fase estacionria (overnight)

Lise alcalina:

Anlise de restrio Enzima

EcoRI

Stio de restrio
G AATT C C TTAA G C CATG G G GTAC C T CTAG A AGATC T CCC GGG GGG CCC

Fonte
Escherichia coli RY13

NcoI

Nocardia corallina

XbaI

Xantomonas badrii

SmaI

Serratia marcescens

5 - fosfato 3 - OH

5 - fosfato 3 - OH

Gel de agarose

Eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etdeo

(exposto a luz UV)

Eletroforese em gel de agarose HindIII (-)

Plasmdio Inserto

Plasmdio no digerido

Mapeamento de restrio
BseMII MnlI AvaII EcoO109I BstYI PpuMI Sau3AI Sau96I DpnI NlaIV BsmFI Bsu36I Hpy188I DdeI AlwI 90

BstF5I

SfaNI

BbvI

HpyCH4III TseI Fnu4HI

ATGAGGGCATCCATCTTTCTCGCTCTTGCCATTCTCGTTATTACCGTTGTCGCTGCCCCTACCGATGATAAGGGACCTGAGGATCTGAAG TACTCCCGTAGGTAGAAAGAGCGAGAACGGTAAGAGCAATAATGGCAACAGCGACGGGGATGGCTACTATTCCCTGGACTCCTAGACTTC

Sequenciamento do DNA

T G G G G G T A C A T G C T C T C A C G T G T T G CT GCA G T C A T G G C A T C C C G C A A A C A C A 40 50 60 70 80 90

Expresso de protenas recombinantes

Transformao
Produo do antgeno in vitro Bactrias, leveduras ou baculovirus

Purificao

Sistemas heterlogos de expresso

Bactrias: Escherichia coli Leveduras: Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris Clulas de inseto (infectadas com baculovirus) Clulas de mamferos Plantas Animais

Elementos genticos essenciais em um vetor de expresso

Vetores indutveis por IPTG (Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside) Operon Lac

Na ausncia de IPTG

Na presena de IPTG

Subclonagem de genes em vetor para expresso de protenas recombinantes em fuso com GST

Promotor Lac: Expresso em bactria na presena de IPTG

Subclonagem de genes em vetor para expresso de protenas recombinantes em fuso com His-tag

Expresso de protenas recombinantes em bactrias Consideraes gerais: Bactria: Escherichia coli (diversas linhagens) Vantagens: fcil manipulao, rpido crescimento, alto rendimento de protenas e baixo custo Otimizao da expresso: - Curva dose-resposta do indutor, tempo e temperatura de induo - Utilizao de cepas de bactrias cdon plus

Expresso de protenas recombinantes em bactrias

Consideraes gerais: Desvantagens: Formao de corpos de incluso protenas insolveis e no funcionais - Solubilizao - Refolding de protenas Protenas de fuso - Melhoram a solubilidade - Facilitam a purificao Corpos de incluso Protenas solveis

Cultura de bactrias (E. coli)

Induo com IPTG
Fase log: DO=0,4-0,6nm

Padronizar: Tempo, temperatura, curva-dose resposta de IPTG

Expresso da Protena recombinante

Lise
(cong./descong., sonicao, French press)

Avaliar em SDS-PAGE:

extrato total, precipitado e sobrenadante

Purificao

Eletroforese de protenas em gel de poliacrilamida

Anlise da expresso da protena recombinante em SDS-PAGE PM 1

116,0 66,2

45,0 35,0

25,0

18,4

1. Extrato total (lisado bacteriano) 2. Sobrenadante 3. Precipitado (corpos de incluso)

Mtodos de deteco de clones recombinantes

Reconhecimento por anticorpos especficos (ou anti-GST, anti-His) Funo da protena (ensaio enzimtico) Seleo por PCR

Mtodos de purificao de protenas recombinantes

Afinidade Troca inica Fase reversa Gel filtrao

Etapas de purificao de protenas recombinantes

Extrato bacteriano

Etapa final de purificao

1. Etapa de purificao

Subclonagem de genes em vetor para expresso de protenas recombinantes em leveduras (Pichia pastoris)

Expresso de protenas recombinantes em leveduras

Consideraes gerais: Leveduras: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris Otimizao da expresso: - Curva dose-resposta do indutor, tempo e temperatura de induo - Otimizao do cdon: mutagnese Vantagens (Pichia pastoris): altos nveis de expresso, modificaes ps-traducionais (glicosilao, pontes dissulfeto), secreo da protena

Aplicaes da tecnologia do DNA recombinante: teraputica

- Hormnio de crescimento humano e bovino (somatotrofina); - Insulina humana; - Calcitonina; - LH-RH - Somatostatina; - Gonadotrofina corinica (HCG) e srica (PMSG); - LH - Hormnio luteinizante bovino e suno; - FSH Hormnio folculo estimulante humano e bovino; - IGF-I (Fator de crescimento insulina dependente); - Interferon alfa, Interferon beta e Interferon gama -Toxina Botulinica; - Eritropoietina; - Glucagon - Fatores de coagulao: VIII e IX

Aplicaes da tecnologia do DNA recombinante: diagnstico laboratorial

- HIV, HCV, HBV, HEV, HTLV, EBV, CMV, Rubola

- H. pylori, Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, Chlamydia - Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi

Aplicaes da tecnologia do DNA recombinante: vacinas

Hepatite B
Purificao
Gene Ag S Vetor

Vacina
Protena

Antgeno S Levedura
Pichia pastoris ou Hansenula polymorpha

Aplicaes da tecnologia do DNA recombinante: vacinas

Engerix-B Recombivax HB GenHevac B

SmithKline Beecham/US Merck/USA Pasteur/France Instituto Butantan

Aplicaes da tecnologia do DNA recombinante: vacinas

HPV

HPV

Os subtipos 16 e 18 esto implicados como causa de 70% dos cnceres de colo de tero

Dept. of Immunology Walter Reed Army Institute of Research Washington, DC