COMUNICAO/COMMUNICATION

Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 40(4):482-483, jul-ago, 2007

Estudo de validao comparativo entre as tcnicas EliSa e RiFi para diagnosticar Leishmania sp em ces errantes apreendidos no municpio de Campos dos Goytacazes, Estado do Rio de Janeiro
Comparative validation study between the ELISA and RIFI techniques for diagnosing Leishmania sp in stray dogs caught in the municipality of Campos de Goytacazes, State of Rio de Janeiro
Mariane Pinto Fernandes Tvora1, Maria Anglica Vieira da Costa Pereira2, Valmir Laurentino Silva3 e Gilmar Ferreira Vita4

RESUMO Foi realizada uma pesquisa objetivando-se verificar a eficcia do teste ELISA, para deteco de anticorpos contra Leishmania sp em ces, comparando-o com o RIFI, padro em humanos, e investigar a situao sorolgica desta zoonose na microrregio. Os testes tiveram uma concordncia de 97,6%, classificada como forte. Palavras-chaves: Leishmaniose. Ces. Sorologia. Zoonose. RIFI. ELISA. aBSTRaCT A survey was carried out aiming to verify the ELISA test effectiveness for detecting antibodies against Leishmania sp in dogs, comparing with RIFI human pattern and for investigating sorological zoonosis situation in the microregion. An accordance about 97.6% considered strong was reported. Key-words: Leishmaniosis. Dogs. Serology. Zoonosis. RIFI. ELISA.

A leishmaniose uma doena causada por protozorio da ordem Kinetoplastida, famlia Trypanosomatidae e gnero Leishmania Ross, 19036. O teste padro ouro mundialmente indicado como comprovao final no diagnstico da ocorrncia ou no de anticorpos de Leishmania sp no homem a reao de imunofluorescncia indireta (RIFI). O ELISA (Enzyme Linked Immunossorbent Assay) utilizado principalmente para deteco de anticorpos, quando se deseja realizar um levantamento soroepidemiolgico prtico, menos oneroso e rpido. sabido que a RIFI apresenta maior grau de especificidade e que o ELISA apresenta maior grau de sensibilidade2. O objetivo deste trabalho foi verificar a eficcia do teste ELISA para deteco de anticorpos contra Leishmania sp em ces, comparandoo RIFI, padro em humanos, e investigar a situao sorolgica desta

zoonose no municpio de Campos dos Goytacazes, RJ, no perodo de dezembro de 2000 a dezembro de 2001. Foram selecionados 370 ces errantes, adultos, mestios, apreendidos no municpio. As amostras sangneas (5ml) foram obtidas sem anticoagulante e centrifugadas, separando-se o soro, que foi armazenado sob congelamento (-20C) em duas cotas (tubos de microcentrfuga estreis para cada amostra). O ELISA para leishmaniose canina (complexo Leishmania donovani), consiste em um teste elaborado por Avrameas e cols, em 1992, e modificado por Laurentino-Silva3 (kit Bio-Manguinhos/FIOCRUZ), onde o resultado obtido atravs da visualizao da alterao de cor sem o auxlio de equipamentos mensuradores de absorbncia. Neste teste utilizou-se uma titulao variando entre 1:40 a 1:807.

1. Fundao Estadual Norte Fluminense/Parque de Alta Tecnologia do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes, RJ. 2. Setor de Parasitologia, Hospital Veterinrio, Centro de Cincias e Tecnologias Agropecurias, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes, RJ. 3. Laboratrio de Imunodiagnstico, Departamento de Cincias Biolgicas, Escola Nacional de Sade Pblica, Fundao Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ. 4. Universidade Castelo Branco, Rio de Janeiro, RJ. Trabalho financiado pela Fundao Carlos Chagas Filho de Amparo Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro. Endereo para correspondncia: Dra. Maria Anglica Vieira da Costa Pereira. Setor de Parasitologia/Hospital Veterinrio/CCTA/UENF. Av. Alberto Lamego 2000, Parque Califrnia, 28013-600 Campos dos Goytacazes, RJ. Tel: 55 22 2726-1500 ramal 1701-1702 e-mail: angel@uenf.br Recebido em: 06/09/2006 Aceito em: 27/04/2007

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Tvora MPF cols

A reao de imunofluorescncia indireta para leishmaniose humana (complexo Leishmania major like), o teste padro ouro de referncia para diagnstico humano, segundo Coons e cols. (1941), citado por Laurentino-Silva3 (kit Bio-Manguinhos/FIOCRUZ), e tambm muito utilizado em Medicina Veterinria para diagnstico da leishmaniose canina. A titulao de 1:40 a 1:80 foi estabelecida como padro tambm para o diagnstico da RIFI7. Os resultados dos testes sorolgicos foram confrontados para a verificao da co-positividade, co-negatividade e concordncia bruta. Estes parmetros foram obtidos em funo da distribuio dos resultados dos testes sorolgicos3. A frmula equacional, utilizada para o clculo da co-positividade, co-negatividade e o ndice de concordncia bruta, encontra-se visualizada na Tabela 1.
Tabela 1 - Clculos de concordncia. Teste 2** Positivo Negativo Total Teste 1 (teste de referncia)* positivo A C a+c negativo B D b+d Total a+b c+d a+b+c+d

Bio-Manguinhos/FIOCRUZ3, que vem a ser um ELISA modificado em que os resultados so obtidos sem haver necessidade da leitura em espectofotmetro, e a simples alterao de cor indica a positividade (amarelo) ou negatividade (incolor) da amostra a ser testada. Os resultados obtidos desta forma diminuem os custos operacionais do diagnstico e por apresentar esta praticidade pode ser utilizado a campo5. A reao de imunofluorescncia indireta diagnstico padro para leishmaniose tegumentar americana em humanos e foi tambm utilizada como tcnica de diagnstico sorolgico em ces de reas endmicas do Rio de Janeiro7. At ento, no se utilizava o teste sorolgico em ces, sendo o diagnstico realizado por intradermorreao. A reao de imunofluorescncia indireta um bom teste confirmatrio, podendo ser utilizado como contraprova do ELISA e este um bom teste para triagem (screening-test). Nos casos de sorologia positiva, indicado o sacrifcio do animal4. Recomenda-se a associao dos dois testes em casos positivos no ELISA. Os dois testes apresentam fundamentos distintos e neste trabalho um excelente ndice de co-positividade. O teste sorolgico ELISA para leishmaniose canina um bom teste para ser utilizado a campo em triagens soroepidemiolgicas (campanhas de vacinao anti-rbica), devido sua praticidade e baixo custo, o que preconizado pela Organizao Internacional de Epizootias (OIE5). A eficcia do teste ELISA comprovada atravs da concordncia encontrada no valor de 97,6%, conceituando o resultado como excelente. O teste sorolgico RIFI padro para humanos, como j foi descrito na literatura, apropriado para confirmao sorolgica, em casos de dvida, ou como contraprova de casos positivos, em que, segundo o Ministrio da Sade, necessrio o sacrifcio do animal.

* Reao de Imunofluorescncia Indireta (RIFI). ** Enzyme Linked Immunossorbent Assay (ELISA). Calcula-se para RIFI/ELISA: co-positividade = a (a + c); co-negatividade = d (b + d) e concordncia bruta = (a + d) (a + b + c + d). Calcula-se para ELISA/RIFI: co-positividade = a (a + b); co-negatividade = d (c + d) e concordncia bruta = (a + d) (a + b + c + d).

Utilizou-se o seguinte critrio para conceituar os resultados do controle de qualidade em relao concordncia: valores 40% so considerados pobres, de 40,1 at 79,9% regulares, de 80 a 89,9% so considerados bons e 90% consideram-se como excelentes3. A anlise dos resultados obtidos nas duas tcnicas de diagnstico foi realizada pelo teste de coeficiente de Kappa (k)1. Das 370 amostras de soros coletadas, 6 (1,6%) foram positivas e 355 (95,9%) negativas para ambos os testes, 2 (0,5%) obtiveram positividade para RIFI e negatividade para ELISA e 7 (1,9%) negatividade para RIFI e positividade para ELISA. A relao de co-positividade ELISA/RIFI foi de 46,2%, e a de conegatividade ELISA/RIFI foi de 99,4%; a co-positividade RIFI/ELISA foi de 75% e a co-negatividade RIFI/ELISA foi de 98,1%. Atravs destes resultados pode-se realizar o teste estatstico do coeficiente de Kappa, para avaliar a concordncia entre as duas tcnicas diagnsticas, onde se verificou uma concordncia observada de 97,6% e esperada 94,5%, altamente significativa (p < 0,01) entre os resultados positivos e negativos, sendo esta concordncia classificada como forte (0,8 k < 1). A associao dos dois testes fez-se necessria no presente trabalho para testar a eficcia do ELISA para leishmaniose canina, kit

REFERNCiaS
1. 2. 3. Arango HG. Bioestatstica Terica e Computacional. Guanabara Koogan SA, Rio de Janeiro, 2001. Fundao Nacional de Sade. Manual de Leishmaniose. Doenas Parasitrias. Ministrio da Sade, Rio de Janeiro, 2002. Laurentino-Silva V. Imunologia aviria e aplicao da imunoglobulina (Ig) na soroepidemiologia das leishmanioses caninas. Tese de Doutorado, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropdica, RJ, 1999. Ministrio da Sade. Controle, Diagnstico e Tratamento da Leishmaniose Visceral. Fundao Nacional de Sade, Braslia, 1994. Organizao Internacional de Epizootias. Leishmaniosis in orld. OIE, Paris, 2003. Rey L. Parasitologia. Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1991. Tvora MPF. Inqurito sorolgico para Leishmania sp em ces de rua apreendidos no municpio de Campos dos Goytacazes, estado do Rio de Janeiro. Tese de Mestrado, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes, RJ, 2004.

4. 5. 6. 7.

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