Introduccin a los medios de cultivo

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 45C. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas). Condiciones generales para el cultivo de microorganismos El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. 1- disponibilidad de nutrientes adecuados Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaban la prdida de los factores nutritivos lbiles. Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y

sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica. Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. 2- consistencia adecuada del medio Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio. 3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. 4- condiciones adecuadas de humedad Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio. 5- Luz ambiental La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos. 6- pH La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales. 7- Temperatura Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms amplios. 8- Esterilidad del medio Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante)

La evolucin de los medios de cultivo

Podemos decir que la microbiologa empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observacin de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilizacin del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexin en su evolucin. La primera noticia de la utilizacin de medios de cultivo nos llega del miclogo Brefeld, que consigui aislar y cultivar esporas de hongos en medios slidos realizados a base de gelatina. Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamao) y no fue hasta el ao 1878 cuando Lister populariz un mtodo enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio lquido. Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo slido, pero no tard en recurrir al caldo de carne lquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un medio slido transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las colonias microbianas. En el ao 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiologa en relacin con los medios de cultivo: el mdico alemn Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacrido extrado de algas rojas) como solidificante. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces. Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioauttrofas (utilizacin de nitrgeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Disearon este tipo de medios de tal forma que su especial composicin qumica favoreca el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en funcin de sus procesos metablicos, eran los nicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio. En 1892 Wrtz impuls el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composicin de ciertos medios con lo cual se poda observar la produccin de cidos en la fermentacin en ciertos microorganismos.

Tipos bsicos de medios de cultivo

atendiendo a su estado fsico: lquidos (tambin llamados caldos (broth en ingls) semislidos (contienen agar en proporcin menor del 10 g/L) slidos (contienen agar como agente gelificante en una proporcin en general de 15 g/L) atendiendo a su utilidad prctica: Medios para aislamientos primarios: Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc) selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia aadidas, se vara el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, KanamicinaVancomicina)

 enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K). Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos especficos de bacterias, ayudando a su identificacin (Lowenstein). Medios para identificacin: diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiolgicas (nutricin y respiracin sobre todo) especficas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificacin de casi cualquier bacteria (Oxidacin-Fermentacin) -o

Preparacin de Material y Medios de Cultivo

Apartados de este ejercicio

A. Finalidad de este ejercicio B. Esterilizacin C. Preparacin de material D. Preparacin de medios de cultivo.

A. Finalidad de este ejercicio

El objetivo de este ejercicio tambin es muy simple: Adquirir una idea aproximada de como se efecta, en un laboratorio real, la preparacin de material y medios de cultivo para su esterilizacin y el mantenimiento de los mismos hasta su utilizacin. Para ello, se describen algunos mtodos de esterilizacin y algunos ejemplos de preparacin. La preparacin de material y medios de cultivo as como la esterilizacin, es una actividad tpica y peculiar de un laboratorio de Microbiologa.

B. Esterilizacin
Esterilizacin Es la principal finalidad de la preparacin de material en Microbiologa. En Microbiologa se define esterilizacin como la destruccin o eliminacin total de todos los microorganismos vivos en un objeto o material, incluidas las endosporas bacterianas. La esterilidad es un estado absoluto, no hay grados de esterilidad. El material que se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se conserve sin contaminar una vez esterilizado Mtodos de esterilizacin Existen varios mtodos para llevar a cabo el proceso de esterilizacin y la eleccin de uno determinado viene condicionado por el tipo de material que se quiere esterilizar.

El mtodo ms comnmente empleado para destruir los microorganismos es el calor, entre otras razones porque es el ms econmico y el ms fcil de controlar. El calor utilizado con este fin puede aplicarse en forma de calor seco o de calor hmedo. El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidacin y se requieren temperaturas muy elevadas. El calor hmedo elimina los microorganismos a temperaturas menores, ya que la presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrgeno responsables de la estructura tridimensional de las protenas, haciendo que stas se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad. Calor seco El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidacin y se requieren temperaturas muy elevadas. La esterilizacin por calor seco puede hacerse por flameado o mediante estufas de aire caliente.

- Flameado

Se emplea para esterilizar asas e hilos de siembra, pinzas, esptulas, etc. Consiste en someter directamente a la accin de la llama de un mechero Bunsen los utensilios que se vayan a esterilizar. Este mtodo es rpido y su eficacia es altsima, sin embargo no se puede aplicar a objetos termolbiles.

- Aire caliente

Se lleva a cabo en estufas de aire caliente (horno Pasteur) y consiste en colocar los objetos que se van a esterilizar, debidamente protegidos para que no se contaminen una vez esterilizados, en el interior de una estufa. Este procedimiento se utiliza para esterilizar material de vidrio: pipetas, matraces, tubos, etc. u otros materiales termorresistentes. Las temperaturas a las que se someten estos materiales son muy elevadas (160- 180C durante cerca de 2 horas). Estas temperaturas no pueden utilizarse para esterilizar lquidos.

El calor hmedo elimina los microorganismos a temperaturas menores, ya que la presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrgeno responsables de la estructura tridimensional de las protenas, haciendo que stas se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad. Calor hmedo El calor hmedo tambin se utiliza para la destruccin de los microorganismos siendo, como ya se ha comentado, a igual temperatura, mucho ms eficaz que el calor seco; con este tratamiento las enzimas se desnaturalizan rpidamente, al igual que las membranas celulares. Adems, el vapor de agua, especialmente si se genera a sobrepresin, es un eficaz transmisor de calor al interior de la clula microbiana. Se puede aplicar utilizando varios mtodos: ebullicin, vapor fluente y vapor saturado a presin:

- Ebullicin

El agua hirviendo (100C) tiene accin limitada, ya que aplicada durante 10 minutos va a destruir las formas vegetativas de los microorganismos, pero las endosporas bacterianas pueden sobrevivir incluso a tratamientos prolongados.

- Vapor fluente

Esta tcnica se emplea con frecuencia para esterilizar medios de cultivo que no se puedan someter a una temperatura superior a 100C sin que pierdan alguna de sus propiedades, como leche, azcares, suero, etc. Se utiliza un autoclave a presin atmosfrica, con la espita abierta, donde nunca se superan los 100C, y se realiza el proceso durante tres das consecutivos, dejndose a temperatura ambiente en los intervalos entre dos tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (100C) durante 30-45 minutos destruyndose en este proceso las formas vegetativas pero no las endosporas termorresistentes.

- Vapor saturado a presin

La esterilizacin por esta tcnica utiliza vapor de agua saturado que se somete a una atmsfera extra de presin sobre la presin atmosfrica normal, elevndose con ello el punto de ebullicin del agua de 100C a 121C y consiguindose la destruccin de todos los microorganismos (salvo los termfilos extremos) en un tiempo de 15 a 20 minutos. Esta tcnica de esterilizacin requiere el uso del autoclave.

Filtracin

La filtracin es el paso de un lquido o gas a travs de un material filtrante, con poros lo suficientemente pequeos como para retener clulas microbianas. Los filtros que se utilizan en la actualidad son, generalmente, los denominados filtros de membrana y estn integrados por pequeas piezas de material sinttico, generalmente acetato de celulosa o policarbonato, que pueden tener poros con tamaos de 0,22 y 0,45 m, diseados para retener bacterias. Los fluidos que se van a filtrar pasan a travs de la membrana con la ayuda del vaco generado, por ejemplo, con una bomba de vaco. Tanto los filtros de membrana como los equipos de filtracin con los que stos se usan deben ser esterilizados por otros mtodos, generalmente el autoclave. Los virus y algunas bacterias de tamao muy pequeo como, por ejemplo, los micoplasmas, no son retenidos por los filtros habituales.

Irradiacin con luz U.V

La esterilizacin por irradiacin con luz uv es muy til cuando se trata de esterilizar objetos de plstico o de otros materiales no autoclavables ni susceptibles de esterilizacin por calor seco en horno Pasteur, con la salvedad de que slo se esteriliza la superficie que recibe la luz y no el interior de los objetos. Las campanas de siembra suelen llevar un dispositivo de iluminacin de luz uv que irradie toda la zona de trabajo. La campana debe estar cerrada mientras la luz uv est encendida para proteger a los individuos que se encuentren cerca. Independientemente de la esterilizacin de materiales, la luz uv de las campanas de siembra se utiliza para esterilizar el ambiente de trabajo de la propia campana. En este caso basta con encederla una media hora al da. Cuando se utiliza para la esterilizacin de material el tiempo requerido es al menos de 2 horas.

C. Preparacin de material
Preparacin de material El material que se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se conserve sin contaminar una vez esterilizado hasta el momento de usarlo. Material de vidrio Todo el material de vidrio se suele esteriliza con calor seco, generalmente en un horno Pasteur, aunque tambien puede utilizarse el autoclave.

Tubos Matraces Frascos

Se cierran con algodn graso o tapones metlicos para evitar la entrada o salida de los microorganismos. Adems, cuando se usa algodn, ha de cubrirse ste con un papel impermeabilizado.

Pipetas

Se les coloca en la boquilla un trocito de algodn que actuar como filtro, evitando la contaminacin del operario con los microorganismos de la muestra y que ste a su vez contamine la muestra. Una vez preparadas, se introducen en estuches o cajas metlicas, o bien se envuelven individualmente en papel satinado para ser posteriormente esterilizadas.

Material de plstico

El material de plstico desechable ya se suministra estril y listo para su uso. Por ejemplo, las placas de Petri se introducen en bolsas de plstico selladas y se esterilizan con xido de etileno o radiaciones.

Soluciones y medios de cultivo

Las soluciones y medios de cultivo lquidos se introducenoiod en matraces o tubos y se esterilizan, generalmente, en autoclave.

D. Preparacin de medios de cultivo.

Medios de cultivo Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes, preparados en el laboratorio, que suministran los compuestos necesarios para el desarrollo de los microorganismos. Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras bacterias necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios desarrollados hasta ahora. Los distintos tipos de medios de cultivo varan segn las necesidades de los microorganismos objeto de estudio, pero todos han de cumplir los siguientes requisitos: - Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del microorganismo que se siembra. - Han de mantenerse estriles hasta el momento de la siembra. Preparacin de medios de cultivo La preparacin de medios de cultivo se ha simplificado en gran medida por la comercializacin de medios deshidratados, en los que los diferentes nutrientes se encuentran ya mezclados en las debidas proporciones, siendo slo necesario la adicin de la cantidad correcta de agua destilada para disolver sus componentes. Rehidratacin

En la actualidad, la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. Los fabricantes indican en el envase tanto la forma de preparar el medio como la composicin del mismo. En general, la preparacin de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolbiles se esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los componentes previamente esterilizados en autoclave.

MEDIOS DE CULTIVO COMERCIALES

Una vez rehidratado y antes de su esterilizacin, los medios lquidos en caldo se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos o matraces). En ningn caso la altura del lquido en el recipiente debe exceder un tercio del volumen total de ste. Si es un medio slido, habitualmente se procede a hervir el agar en un bao Maria antes de distribuirlo. Una vez hervido, se distribuye en caliente en tubos o matraces (no en placas de Petri), se tapa y se esteriliza.

Esterilizacin Deben seguirse las indicaciones de la etiqueta teniendo en cuenta que se especifican para pequeos volmenes, nunca superiores a un litro. Para volmenes mayores se tienen que tener en cuenta las condiciones del autoclave y de penetracin del calor en el medio.

Generalmente se utiliza el autoclave a 121C durante un periodo de 20 minutos, aunque tambin puede utilizarse una olla a presin (30 minutos a 100 C).

Finalizada la esterilizacin en el autoclave: - Los medios lquidos se dejarn enfriar a temperatura ambiente. - Los medios slidos contenidos en tubos deben inclinarse para que al solidificarse, adopten la forma de agar inclinado (slant) si tal es su finalidad.

Las placas de Petri pueden tambin ser preparadas ahora, vertiendo el medio an fundido y estril dentro de ellas en un ambiente asptico (p. ej., en la proximidad de la llama de un mechero Bunsen). Es posible asimismo conservar el medio destinado a placas solidificado y estril en tubos, que se fundirn al bao Mara en el momento de prepararlas.

Almacenamiento Aunque lo ms adecuado es preparar los medos a medida que son necesarios, es frecuente que se almacenen ya preparados y estriles para ahorrar as tiempo de preparacin. En estas circunstancias el mayor peligro es la deshidratacin y cualquier precaucin que la evite prolongar la vida del medio, que en ningun caso ser superior a 4-6 semanas. En este sentido los recipientes con tapn roscado hermtico (tubos y frascos) son mas aconsejables que las torundas de algodn. Caldos y medios slidos pueden conservarse, una vez esterilizados, a temperatura ambiente. Sin embargo, para reducir su deshidratacin y el consiguiente cambio de las concentraciones de los componentes es preferible conservarlos a 4C

1.- FINALIDAD DE USO:

Los medios de cultivo permiten el crecimiento de microorganismos, para su reconocimiento, diferenciacin y/o recuento.

2.-PRINCIPIOS:
Los medios suministran los elementos nutritivos necesarios para el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos. Adems pueden incluir inhibidores que permiten seleccionar el tipo de microorganismos que crecern impidiendo el desarrollo de otros. Otros componentes frecuentes son los indicadores de pH o diferentes sales que actan como reactivos evidenciando la produccin de otros compuestos

3.- PREPARACIN: MEDIOS LQUIDOS O CALDOS:

Se sirven siempre en tubos o matraces, pero nunca en placas-Petri. 1. Pesar la cantidad necesaria de caldo deshidratado. 2. Disolver perfectamente este caldo ya pesado en la cantidad adecuada de agua destilada. 3. Repartir x ml del medio deshidratado ya pesado en la cantidad adecuada de agua destilada. 4. Si los tubos van a llevar campana de Durham para detectar la liberacin de gas, se introduce en cada tubo una campana con la boca hacia abajo y se invierte el tubo para que

la campana se llene completamente de caldo de cultivo. 5. Ajustar el pH si fuera necesario. 6. Tapar los tubos dejando siempre comunicacin de aire con el exterior (no cerrar hermticamente) 7. Esterilizar en autoclave atendiendo las indicaciones del fabricante (normalmente a 121C durante 15minutos). 8. Enfriar a temperatura ambiente.

MEDIOS SLIDOS EN TUBO:

Se pueden preparar en agar recto o inclinado (slant). En agar recto se utilizan para determinar los requerimientos de oxgeno de cultivos puros, as como para observar la movilidad de los microorganismos. Los tubos en slant se utilizan comnmente para cultivar y almacenar cultivos puros ya que presentan una amplia superficie para ser inoculada con el asa curva. 1. Pesar la cantidad de caldo deshidratado y de agar (si no va incorporado en el medio). 2. Calentar la mezcla hasta ebullicin para que el agar aparezca en forma de sol fluido y transparente. 3. Distribuir esta mezcla en los tubos de ensayo y tapar los tubos (no hermticamente). 4. Ajustar el pH si fuera necesario. 5. Esterilizar en autoclave segn las indicaciones del fabricante (normalmente 121C durante 15 minutos). 6. Dejar enfriar a temperatura ambiente en posicin vertical si son tubos de agar recto o inclinado si son tubos en slant.

MEDIOS SLIDOS EN PLACA:

A ttulo indicativo, se puede preparar por cada 20ml de medio si son placas de 90mm de dimetro y 10ml de medio para las de 55mm. De este modo a cada placa le corresponder una altura de medio de cultivo de 3-4mm. 1. Pesar la cantidad necesaria de caldo deshidratado y de agar (si no incorporado). 2. Calentar la mezcla hasta ebullicin siguiendo las instrucciones del envase. La altura del lquido en el recipiente no debe de exceder en ningn caso un tercio del volumen total de ste. 3. Ajustar el pH si fuera necesario. 4. Tapar el matraz o vaso de precipitados con papel de aluminio. Si se usa frasco con tapn roscado, cerrarlo dejando comunicacin de aire entre interior y exterior (no cerrar hermticamente). 5. Esterilizar en autoclave siguiendo las instrucciones del fabricante (normalmente a 121C durante 15minutos). 6. Dejar enfriar a temperatura ambiente hasta que su temperatura sea de unos 50-55 C y se pueda coger el recipiente. No dejar enfriar demasiado porque empieza a solidificar por debajo de 50C. 7. Verter en las placas el medio fundido en condiciones aspticas, flameando el borde del matraz y abriendo la tapa de la placa slo lo estrictamente necesario. Es posible asimismo conservar el medio destinado a placas solidificado y estril en tubos o matraces, que se fundirn al bao mara en el momento de prepararlas. 8. Mover suavemente las placas hacia delante y hacia atrs, como si se trazara una cruz, para que el medio se distribuya por todo el fondo de las placas. Tanto este paso como el anterior se pueden realizar con grupos o pilas de 3 a 5 placas, empezando por llenar de medio siempre la de abajo, levantando la tapa con las restantes encima. Continuar hasta llenar la placa que est ms arriba. 9. Enfriar a temperatura ambiente y cuando el medio est completamente slido invertir las placas.

4.- CONSERVACIN:
Caldos y medios slidos pueden conservarse, una vez esterilizados, a temperatura ambientes. Sin embargo, para reducir su deshidratacin y el consiguiente cambio de las concentraciones de los componentes es preferible consrvalos a 4C.

5.- ESQUEMA:

1.- FINALIDAD DE USO:

Los medios de cultivo permiten el crecimiento de microorganismos, para su reconocimiento, diferenciacin y/o recuento.

2.-PRINCIPIOS:
Los medios suministran los elementos nutritivos necesarios para el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos. Adems pueden incluir inhibidores que permiten seleccionar el tipo de microorganismos que crecern impidiendo el desarrollo de otros. Otros componentes frecuentes son los indicadores de pH o diferentes sales que actan como reactivos evidenciando la produccin de otros compuestos

3.- PREPARACIN: MEDIOS LQUIDOS O CALDOS:

Se sirven siempre en tubos o matraces, pero nunca en placas-Petri. 9. Pesar la cantidad necesaria de caldo deshidratado. 10. Disolver perfectamente este caldo ya pesado en la cantidad adecuada de agua destilada. 11. Repartir x ml del medio deshidratado ya pesado en la cantidad adecuada de agua destilada. 12. Si los tubos van a llevar campana de Durham para detectar la liberacin de gas, se introduce en cada tubo una campana con la boca hacia abajo y se invierte el tubo para que la campana se llene completamente de caldo de cultivo. 13. Ajustar el pH si fuera necesario. 14. Tapar los tubos dejando siempre comunicacin de aire con el exterior (no cerrar hermticamente) 15. Esterilizar en autoclave atendiendo las indicaciones del fabricante (normalmente a 121C durante 15minutos). 16. Enfriar a temperatura ambiente.

MEDIOS SLIDOS EN TUBO:

Se pueden preparar en agar recto o inclinado (slant). En agar recto se utilizan para determinar los requerimientos de oxgeno de cultivos puros, as como para observar la movilidad de los microorganismos. Los tubos en slant se utilizan comnmente para cultivar y almacenar cultivos puros ya que presentan una amplia superficie para ser inoculada con el asa curva. 7. Pesar la cantidad de caldo deshidratado y de agar (si no va incorporado en el medio). 8. Calentar la mezcla hasta ebullicin para que el agar aparezca en forma de sol fluido y transparente. 9. Distribuir esta mezcla en los tubos de ensayo y tapar los tubos (no hermticamente). 10. Ajustar el pH si fuera necesario.

11. Esterilizar en autoclave segn las indicaciones del fabricante (normalmente 121C durante 15 minutos). 12. Dejar enfriar a temperatura ambiente en posicin vertical si son tubos de agar recto o inclinado si son tubos en slant.

MEDIOS SLIDOS EN PLACA:

A ttulo indicativo, se puede preparar por cada 20ml de medio si son placas de 90mm de dimetro y 10ml de medio para las de 55mm. De este modo a cada placa le corresponder una altura de medio de cultivo de 3-4mm. 10. Pesar la cantidad necesaria de caldo deshidratado y de agar (si no incorporado). 11. Calentar la mezcla hasta ebullicin siguiendo las instrucciones del envase. La altura del lquido en el recipiente no debe de exceder en ningn caso un tercio del volumen total de ste. 12. Ajustar el pH si fuera necesario. 13. Tapar el matraz o vaso de precipitados con papel de aluminio. Si se usa frasco con tapn roscado, cerrarlo dejando comunicacin de aire entre interior y exterior (no cerrar hermticamente). 14. Esterilizar en autoclave siguiendo las instrucciones del fabricante (normalmente a 121C durante 15minutos). 15. Dejar enfriar a temperatura ambiente hasta que su temperatura sea de unos 50-55 C y se pueda coger el recipiente. No dejar enfriar demasiado porque empieza a solidificar por debajo de 50C. 16. Verter en las placas el medio fundido en condiciones aspticas, flameando el borde del matraz y abriendo la tapa de la placa slo lo estrictamente necesario. Es posible asimismo conservar el medio destinado a placas solidificado y estril en tubos o matraces, que se fundirn al bao mara en el momento de prepararlas. 17. Mover suavemente las placas hacia delante y hacia atrs, como si se trazara una cruz, para que el medio se distribuya por todo el fondo de las placas. Tanto este paso como el anterior se pueden realizar con grupos o pilas de 3 a 5 placas, empezando por llenar de medio siempre la de abajo, levantando la tapa con las restantes encima. Continuar hasta llenar la placa que est ms arriba. 18. Enfriar a temperatura ambiente y cuando el medio est completamente slido invertir las placas.

4.- CONSERVACIN:
Caldos y medios slidos pueden conservarse, una vez esterilizados, a temperatura ambientes. Sin embargo, para reducir su deshidratacin y el consiguiente cambio de las concentraciones de los componentes es preferible consrvalos a 4C.

5.- ESQUEMA: