UNIVERSIDAD RICARDO PALMA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

Transformacin gentica en Morus nigra Mora negra mediada por Agrobacterium tumefaciens

Curso: Taller de Biotecnologa Vegetal

Integrantes:
Custodio Zegarra, David. Dvila Burga, Nicholas. Rivera Charun, Maria Lucia. 33 % 32 % 35 %

Profesor: Dr. Quiones, Mauro

Lima Peru 2012

INTRODUCCION La transformacin gentica es la alteracin de una clula que resulta de la introduccin y expresin de material gentico externo (DNA). La tecnologa de la transformacin gentica o transferencia de genes especficos permite introducir caractersticas nuevas en cultivos tradicionales sin alterar drsticamente el acervo gentico propio de la especie, haciendo posible introducir genes provenientes no slo de especies vegetales muy alejadas desde el punto de vista evolutivo sino, incluso de hongos, virus, bacterias y animales. Tambin es posible introducir genes cuyos productos se expresen slo en rganos especficos de la planta o en un determinado momento de su desarrollo. De los mtodos de transformacin gentica existentes, la transferencia de genes mediada por Agrobacterium es la ms ventajosa (Lpez, 2004). Agrobacterium tumefaciens bacteria causante de la agalla en corona penetra por los tejidos lesionados y causa una proliferacin celular en el punto de la lesin formndose una agalla o tumor. Durante el contacto con las clulas vegetales lesionadas, se transfiere un segmento del DNA del plsmido Ti de A. tumefaciens desde la bacteria a la clula vegetal, donde se integra en uno o ms de sus cromosomas. Este DNA transferido o T-DNA da como resultado la expresin de un mayor nivel endgeno de los reguladores de crecimiento. Clonando genes extraos en el T-DNA del plsmido Ti se puede aprovechar la capacidad de A. tumefaciens para transferir nuevo DNA al genoma de la planta, como la introduccin de un gen resistente a antibiticos en la que las clulas transformadas se pueden seleccionar por su capacidad para crecer en un medio que contenga el antibitico selectivo, mientras que las clulas no transformadas no crecern. El objetivo del presente trabajo ser transformar genticamente a Morus nigra por medio de Agrobacterium tumefaciens.

II. ANTECEDENTES

1. De Faria et al. (1997) optimizaron los protocolos de regeneracin y transformacin en frambuesa, con la finalidad de lograr un sistema efectivo para la transferencia de genes mediada por Agrobacterium, obteniendo que en un medio que contiene 300 mg/ml de kanamicina el desarrollo de las races y la deteccin de los genes GUS mediante Southernblot son indicadores de la transformacin gentica.

2. Zhong et al. (1999) Varios factores afectan a la transformacin gentica mediada por Agrobacterium tumefaciens en Morera. Explantes como hojas, brotes y callos,

mostraron frecuencia de transformacin de 8,7%, 5,6% y 2,8% respectivamente. La consistencia de agrobacterias, el tiempo de inmersin de los discos de hojas de morera en agrobacterium y el tiempo de co-cultivo tiene efectos directos en la frecuencia de transformacion. AgNO3 tiene importancia en la estimulacin de transformacin gentica en Morera.

3. Gonzles et al. (2000). Evaluaron la capacidad de A. rhizogenes en la transformacin gentica de las clulas de tejidos de diferente edad y regeneraron races transformadas utilizando tres genotipos de Lima cida. Como resultado, los explantes de tejidos maduros regeneraron el mayor nmero de races y lo contrario ocurri con los explantes de tejidos jvenes (control).

4. Valderra et al. (2000). Dieron a conocer a Agrobacterium tumefaciens y sus especies relacionadas como A. rhizogenes y A. vitis como patgenos reconocidos de plantas, capaces de introducir parte de su material gentico dentro del genoma de la planta. Por esta razn, proponen su uso como herramienta de la ingeniera gentica.

5. Garcia et al. (2000) El mtodo de transformacin ms utilizado hasta la fecha es el basado en la Agrobacterium tumefaciens para transferir e integrar ADN propio - un tramo concreto, denominado T-ADN - en la clula vegetal a la que infecta. Si introducimos genes ajenos entre los bordes del T-ADN, la bacteria introducir estos genes en la clula vegetal y los integrar en un cromosoma de sta. Una vez integrados, los genes se expresarn y se transmitirn a la descendencia del mismo modo que lo hacen los que componen el genoma original.

6. Hoekema et al., 1983 citado por Lpez, M. et al; (2001)

La bacteria

Agrobacterium tumefaciens contiene un plsmido inductor de tumores (Ti), parte del cual el ADN-T (transferred DNA) se transfiere al ncleo de las clulas vegetales heridas de plantas dicotiledneas. Agrobacterium es usualmente utilizado para producir plantas transgnicas que expresen genes de inters. 7. Chen et al. (2002) La expresin transitoria de glucuronidasa (GUS) fue utilizada para optimizar las condiciones biolgicas mediadas por Agrobacterium tumefaciens para la capa de clulas transversal delgada (tTCL) del fruto de platano (Musa spp.). Se demostr que la generacin de plntulas in vitro tuvieron una mayor regeneracin de brotes y una mayor expresin del gen GUS en la capa de clulas transversal delgada (tTCL). Cefotaxima y carbenicilina mostraron poca sensibilidad, mientras que higromicina fue bastante sensible l Platano (Musa spp). El pretratamiento de Agrobacterium fue uno de los factores ms importantes en la transformacin gentica del banano, este inclua una concentracin importante de sacarosa.

8. Blanco et al. (2003). Optimizaron la eficiencia en la transformacin gentica con Agrobacterium rhizogenes, inoculando secciones de zanahoria con la cepa de A. rhizongenes A4TC. stas fueron co-cultivadas con acetosiringona, floroglucinol y una combinacin de ambos. La mayor eficiencia de transformacin se obtuvo con acetosiringona (100 mM) en combinacin con floroglucinol (25 mg l-1); la inclusin de kanamicida result un mecanismo eficiente para discriminar entre races transformadas y no transformadas. La bacteria fue eliminada completamente en 48 horas con Cefatoxime en dosis de 500 mg l-1.

9. Chavez et al. (2003). Regeneraron plantas transgnicas de Naranjo agrio (Citrus aurntium L.) a partir de races transformadas con Agrobacterium rhizogenes. Para ello cultivaron por 96 horas segmentos internodales de tallo de plantas germinadas in vitro con A. rhizogenes cepa A4 con el plsmido ESC4. Para la regeneracin de los segmentos de las races transformadas stas se transfirieron a medios MS con tres combinaciones de reguladores de crecimiento: a) 2.5 mg/L de BA con 0.5 mg/L de ANA; b) 5.0 mg/L de BA con 1.0 mg/L de ANA; c) 10 mg/L de BA con 2. 0 mg/L de ANA.

10. Daz M. et al (2003) La ingeniera gentica o transformacin gentica, tcnica conocida como del ADN recombinante, permite introducir en plantas genes provenientes no slo de otras especies vegetales muy alejadas desde el punto de vista evolutivo sino incluso de hongos, virus, bacterias y animales.

11. Daz et al. (2004). Realizaron un estudio a 4 especies fitopatgenas comprendidas dentro del gnero Agrobacterium, centrndose en A. tumefaciens y A. rhizogenes. Demostraron que ambas bacterias son capaces de infectar una amplia variedad de especies de dicotiledneas a partir de la infeccin de las heridas, atacando clulas individuales y provocando su proliferacin. Concluyendo que la capacidad patognica de estas bacterias se debe a la presencia de megaplsmidos (150-200 Kb) llamados Ti (tumor inducing o inductor de tumores) o Ri (por root inducing o inductor de races).

12. Valdez et al. (2004). Desarrollaron un mtodo para la transformacin gentica de dos variedades costarricenses de Maz: CR-7 y Diamantes 8843, con el objetivo de permitir una posterior transferencia de genes de origen viral a su genoma, y conferirles adems, resistencia a la enfermedad ocasionada por el virus del rayado fino del maz. Utilizaron el mtodo de bombardeo de microproyectiles, en callos organognicos derivados de pices jvenes.

13. Bhatnagar et al. (2004) El precultivo de explantes sobre medio de regeneracin durante 5 das y co-cultivo durante 3 das se encontr ptimo. Con el ensayo histoqumico GUS hasta un 40% hipocotilo, 50% cotiledn, 50% de la hoja y 54% explantes de hoja de callos dieron positivo a Agrobacterium. Agrobacterium cepa LBA4404 fue ms infecciosa que GV2260 y A281 y entre los plsmidos ensayados, pBI121 transformado con xito el 100% de los explantes seguido por p35SGUSINT (90100%). Aproximadamente, 50% de los explantes sobrevivi a la seleccin.

14. Valderrama et al. (2005) Se describen los procesos por los cuales Agrobacterium realiza la transferencia de ADN a la planta, puntualizando que son 7 eventos los fundamentales para la interaccin A. tumefaciens-planta: (i) reconocimiento y adherencia; (ii) identificacin de seales de la planta; (iii) activacin de genes vir; (iv) generacin del ADN-T; (v) exportacin del ADN-T hacia la planta; (vi) importacin del

ADN-T dentro del ncleo de la planta; (vii) integracin del ADN-T dentro del genoma del hospedero.

15. Valderrama et al (2005) destacan el uso de A. tumefaciens

en la expresin y

produccin de interleukina-2 y la produccin de vacunas en plantas, produccin de plantas utilizadas en procesos de y mejoramiento del contenido nutricional de algunos alimentos.

16. Broothaerts et al. (2005). Idearon un nuevo mtodo de transformacin gentica que consista en la utilizacin de otras especies bacterianas naturalmente simbiticas con plantas (distintas del gnero Agrobacterium) como Sinorhizobium meliloti,

Mesorhizobium y Rhizobium sp. Logrando transformar genticamente plantas de tabaco, arroz y Arabidopsis.

17. Celikkol (2009) Transformaron explantes de Lens culinaris lenteja por la inoculacin con la de Agrobacterium tumefaciens utilizando la tcnica de suspensin bacteriana en que los explantes fueron sujetos a una presin de 200 mmHg por 20 min. Los retoos de los transgnicos fueron transferidos a tierra con xito y cultivados a la madurez en el invernadero.

18. Hodson, E. (2006) el desarrollo de tcnicas de manipulacin gentica constituye un valioso apoyo a los sistemas de mejoramientos convencional, principalmente en aquellas situaciones en las cuales el acceso a genes de interes se encuentra limitado. 19. Jia et al. (2006) Se demostr que la cepa de Agrobacterium tumefaciens denominada LBA4404 fue ms eficiente que C58Cl en la frecuencia de transformacin de Morera Morus spp. 20. Lopez & Chaparro (2006) Se ha demostrado que la transformacin de papa (Solanum tuberosum) mediada por Agrobacterium tumefaciens es dependiente del genotipo y que la mayora de protocolos de transformacin reportados son ineficientes al aplicarlos en la subespecie andigena. Se transformaron explantes internodales mediante el vector pCambia2301 que posee un gen reportero de la E-glucoronidasa y un gen de resistencia a la kanamicina. Se obtuvo un porcentaje de transformacin

inicial de 31 2,5%, que se expres mediante formacin de callo sobre medios de seleccin y una frecuencia final con base en el ensayo GUS de 30%.

21. Betancourt B. (2007) desarroll una metodologa de transformacin gentica en variedades comerciales de Saccharum spp. caa de azcar usando Agrobacterium tumefaciens. La transformacin fue evaluada mediante la expresin transitoria del gen GUS. Se demostr que la expresin fue significativamente superior al usar explantes meristematicos con alta capacidad regenerativa.

22. Estrada et al. (2007). Reportaron un procedimiento rpido, reproductible y eficiente de transformacin de diversos cultivares comerciales silvestres y criollos de Phaseolus vulgaris ``Frejol``, empleando la cepa K599 de Agrobacterium rhizogenes. En este sistema produjeron plantas cuyas races son los nicos tejidos transformados, el resto de la planta no expresa ningn transgene.

23. Valerio R. & de Garca E. (2008) utilizaron el mtodo de balstica para transformar pices caulinares in vitro de plantas de pltano con micropartculas de tungsteno recubiertas con ADN de plsmido plsmido CAMBIA3201 portador de los genes GUS y bar. La transformacin de los pices se logr a una distancia tejido-can de 9,5cm, presin de He de 150psi y concentracin de ADN de 2g/disparo. Se obtuvo un total de 22 plantas transformadas con los genes gus y bar, cuya presencia fue demostrada por la prueba histoqumica de GUS, y su insercin al ADN mediante la amplificacin (PCR) de fragmentos con iniciadores especficos.

24. Garrido, et al. (2009). Transformaron genticamente a Uncaria tomentosa Ua de gato con la finalidad de obtener alcaloides monoterpnicos que poseen propiedades citotxicas, inmunomoduladoras y antileucmicas. Utilizaron como explantes hojas, races y entrenudos de plntulas in vitro y eliminaron a la bacteria con claforan o vancomicina. Por ltimo, confirmaron la transformacin por PCR.

25. Mannan et al. (2009). Evaluaron mtodos para la transformacin gentica de Artemisia absinthium Hierba Santa mediada por Agrobacterium tumefaciens,

obteniendo un 100% de eficiencia al utilizar explantes de hojas y raz, inoculando la bacteria por 5 minutos e incubando por 3-4 das en un medio B5 con 0.5mg/L de 2, 4-D y un pH 5.8.

26. Zenita et al. (2009). Emplearon distintos tejidos como explantes y distintas concentraciones de Agrobacterium, logrando obtener expresin transitoria de Gus en explantes cocultivados. Las condiciones ptimas fueron en el cocultivo por 48 horas en medio MS, conteniendo una dilucin 1:100 de un cultivo bacteriano de la cepa C58C1 a 0.6 OD a 550 nm. Por otro realizaron los experimentos pertinentes para identificar el umbral de la expresin Gus basal en explantes no transformados de C. odorata mediante ensayos de fluorometra empleando el sustrato X-Gluc. Mediante la realizacin de este trabajo lograron obtener un nuevo mtodo de transformacin gentica mediada por Agrobacterium tumefaciens, y demuestraron la posibilidad de modificar genticamente al cedro rojo para evitar que plagas o herbicidas afecten su desarrollo.

PROBLEMTICA

En los ltimos aos, Morus nigra Mora negra se ha visto como una alternativa a los cultivo de Coca, por ser el alimento del gusano de seda y por ende una actividad rentable dentro del marco legal. Sin embargo, Morus nigra, presenta un largo periodo vegetativo y es menos apetecible por Bombix moris a comparacin de Morus alba, adems esta planta se ve afectada por virus (Carlavirus, Tsuchizaki, 1976) y nematodos como Meloidogyne incognita.

Por estas razones es necesario el fitomejoramiento de los cultivos de Morus nigra Mora negra a travs de la introduccin de genes mediada por Agrobacterium tumefasciens, con la finalidad de acortar el periodo de su ciclo vegetativo y aumentar la resistencia a virus y hacerla mas apetecible al gusano de seda.

HIPOTESIS

La transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefsciens producir el mejoramiento gentico en plantas de Morus nigra.

OBJETIVOS

Objetivo general

Obtener plantas de Morus nigra mejoradas genticamente por Agrobacterium tumefaciens.

Objetivos especficos

Cultivar cepa de A. tumefaciens. Inocular el cultivo bacteriano al explante e incubar Eliminar el vector con bactericida (claforan) y Trasferenir los explantes a un medio sin antibitico. Determinar la expresin gentica de la transformacin mediante la observacin del crecimiento celular.

MATERIALES Y EQUIPOS

1. Material biolgico: Vitroplantas de Morus nigra Cepas de Agrobacterium tumefacien

2. Cmara de flujo laminar 3. Autoclave 4. Shaker horizontal u orbital 5. Incubadora 6. Macro y microelementos 7. Vitaminas, fitohormonas 8. Carbohidratos y agentes gelificantes 9. Material de vidrio. 10. Antibitico (clarofn) 11. Componentes del medio de cultivo para A. tumefaciens.

METODOLOGIA

Cultivo de cepas de Agrobacterium tumefaciens Se cultivar Agrobacterium tumefaciens en el medio LB lquido durante 12 horas a temperatura ambiente, esperando que etapa de crecimiento exponencial suceda.

Inoculacin e incubacin de Agrobacterium tumefaciens. Las plntulas in vitro y las cepas de Agrobacterium tumefaciens se llevan a la cmara de flujo laminar. Se abrir y flamear el frasco que contiene la plntula, y con ayuda de una pinza se remueve la plntula. Esta es colocada en una placa Petri previamente esterilizada. Se realizaran cortes en sos entrenudos de las plntulas con un bistur esterilizado y se introducirn a un Erlennmeyer con medio de cultivo lquido. Una vez sembrado se sellar con papel platino evitando la contaminacin con otras bacterias del aire. Finalmente se incubar en un shaker a 125 rpm entre 24 y 72 horas a 22C 25C.

Eliminacin del vector en los explantes con bactericida (claforan) y Trasferencia a medio de cultivo sin antibitico.

Pasado el tiempo de incubacin, se transferirn los explantes a un envase con medio de cultivo con antibitico (Claforan) y se dejar en incubar en un shaker a 125 rpm a 22C 25C durante 24 horas. Este procedimiento se repetira 3 a 6 veces hasta eliminar totalmente la bacteria. Los explantes obtenidos se transferirn a un medio de cultivo sin antibiticos.

Determinar la expresin gentica de la transformacin mediante la observacin del crecimiento celular.

Transcurridas 2 o 3 semanas se observar el desarrollo de organos transgnicos en la planta tratada.

CRONOGRAMA

DURACIN DEL PROYECTO ACTIVIDADES Semana 1 Semana 2 Semana 3

Recopilacin de Informacin Adquirir Material biolgico A. tumefaciens Preparacin del vector A. tumefaciens Realizar el co-cultivo de Morus nigra y A. tumefaciens Eliminar las bacterias del medio de cultivo. Determinar la expresin gentica de la transformacin Redaccin del informe final de la investigacin y Sustentacin de la Investigacin

X X

X X

V. PRESUPUESTO:

MATERIALES Alcohol etlico al 96% (3L) Algodn (500gr) Azcar Papel platino (16m) Mascarillas Detergente Leja (500ml) TOTAL

PRESUPUESTO S/.16.00 S/.12.00 S/. 2.50 S/.12.00 S/. 3.00 S/. 3.50 S/. 3.50 S/. 50.50

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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