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Fase Preanalitica

Errori di laboratori: scambio di provetta !!!!

Fase Preanalitica
Errori di laboratori: scambio di provetta !!!!

PROVETTE CON ANTICOAGULANTE SODIO CITRATO DA 0,4 E 0,5 ML.

Emostasi
Serie di reazioni biochimiche e cellulari, sequenziali e sinergiche, che hanno lo scopo di impedire la perdita di sangue dai vasi. un meccanismo di difesa, finalizzato al mantenimento dellintegrit dei vasi sanguigni e della fluidit del sangue ALTERAZIONI DELLEMOSTASI AUMENTO RIDUZIONE

TROMBOSI

EMORRAGIA

Emostasi: Vasocostrizione e formazione del tappo

Piastrine e aggregazione Fibrina


1 2

Processo di coagulazione
I meccanismi di protezione dal danno vascolare riguardano

Vasocostrizione

riflessi centrali e spasmi di muscolatura liscia

(serve per rallentare brevemente il flusso del sangue in vasi di piccole dimensioni)

Adesione e Aggregazione piastrinica

convergono verso la ferita

aderendo alle fibre del collagene del vaso lacerato

Coagulazione

in seguito alla Aggregazione Piastrinica il sangue

perde la sua fluidit e forma un coagulo gelatinoso cui seguono una serie di eventi meglio conosciuti come cascata coagulativa

Fasi del processo emostatico


1- Vascolare contrazione muscolatura vasale adesione risposta biochimica degranulazione aggregazione attivazione proteasi plasmatiche attivazione sistema fibrinolitico Riduzione lume vascolare Formazione tappa piastrinico

2- Piastrinica

3- Coagulativa

Formazione coagulo fibrina Dissoluzione Coagulo

4- Fibrinolitica

RIPARAZIONE LESIONE VASCOLARE

Fase vascolare- insulti emorragici


In seguito al danno vascolare si attiva immediatamente un segnale nervoso che evoca una reazione di vasocostrizione nella zona del vaso danneggiato. Anche i vasi adiacenti sono coinvolti nel meccanismo di vasocostrizione Il flusso del sangue viene rallentato determinando una conseguente minore quantit circolante Induce la produzione di fattori tissutali procoagulanti

Fase vascolare-

difesa antitrombotica

Volta a prevenire formazione eccessiva di trombina: coinvolgimento della parete endoteliale. Continuit dello stato cellulare Glicosaminoglicani impediscono ladesione piastrinica attraverso la repulsione elettrostatica Sintesi di sostanze vasodilatatrici (EDRF) antiaggreganti (PGI2) anti coagulanti (trombo modulina) e profibrino litiche (attivatori del plasminogeno t-PA)

Fase vascolare
Contrazione tunica media Stimolazione nervosa Rilascio endotelina Rilascio serotonina

PIASTRINE Derivano dai megacariociti

PIASTRINE
Membrana profondamente invaginata (sistema canalicolare aperto o di connessione superficiale) Sistema tubulare denso (STD) Microtubuli (shape-change) Filamenti contrattili Granuli alfa (PF4, BTG, FIBR.) Granuli densi (serotonina, ADP, ATP, Ca) Glicoproteine di membrana (recettori che mediano ladesione e laggregazione)

FASI DELLA RISPOSTA PIASTRINICA


1- Adesione al sottoendotelio 2- Attivazione piastrinica con innesco delle vie di trasduzione del segnale 3- Cambiamento di forma con emissione di propaggini (pseudopodi) 4- Secrezione piastrinica: rilascio del contenuto dei granuli piastrinici piastrinica: 5- Aggregazione piastrinica: piastrinica: Primaria (reversibile) Secondaria (irreversibile) Tappo emostatico primario Tappo emostatico secondario

Adesione piastrinica
Lendotelio integro e la superficie piastrinica si respingono in virt delle loro cariche negative. La perdita dellendotelio espone il collageno sottoendoteliale che lega il GpIa. La GpIb si lega al vWF a sua volta adeso al collageno.

Membrana Basale

Lesione

Endotelio GpIb Piastrina

GpIa

Piastrina

Collageno

Fattore di von Willebrand (multimero)

Attivazione piastrinica

Attivazione piastrinica
Cambiamento forma

Degranulazione

In seguito alladesione le piastrine attivano meccanismi di trasduzione Che determinano il cambiamento di forma e la degranulazione

Aggregazione piastrinica

Laggregazione piastrinica si verifica perch il fibrinogeno si pone a ponte

Fibrinogeno GpIIbGpIIb-IIIa GpIIbGpIIb-IIIa

tra il GpIIb-IIIa di una piastrina e GpIIblaltra. Il fibrinogeno quindi, in questo caso, un collante dellaggregazione. Il cross-linking della trombospondina crossstabilizza il legame

Fase piastrinica -1
Le piastrine sono immediatemente mobilitate e con il coinvolgimento di numerose molecole (collageno sub-endoteliale, fibronectina, trombospondina, recettori delle piastrine, fattore di von Willebrand, fattore VII ) si aggregano dando inizio al primo passaggio della aggregazione.

Fase piastrinica -2
Le piastrine aggregate sono tenute insieme dal fibrinogeno Le piastrine producono una serie di sostanze con attivit vasocostrittrice e/o proaggregante (serotonina, trombassano A2), fattori della coagulazione (fattore di von Willebrand, fattore V) e inibitori della fibrinolisi (PAI-1 e 2- antiplasmina) Il tappo piastrinico contiene una striscia fosfolipidica ideale per lattivazione della coagulazione

RELEASE REACTION DELLE PLT

Fattore piastrinico 4 (PF4): proteina con affinit per


leparina di cui neutralizza lazione inibente sulla trombina

Beta-Tromboglobulina :proteina che si lega alle


cellule endoteliali esercitando unazione inibente sulla prostaciclina

Trombospondina: proteina che si lega al fibrinogeno


e ne stabilizza il legame con le piastrine

Platelet Activating Factor (PAF): fosfolipide di


membrana che stimola i movimenti intracellulari di Ca

Fattore di crescita di derivazione piastrinica (PGDF):


proteina che attiva la proteinchinasi C, la mobilizzazione di Ca e la proliferazione cellulare

Fase Coagulativa

Fase Coagulativa -1
I prodotti proteici coinvolti nellinnesco della fase plasmatica o coagulativa vengono prodotti inizialmente in forma inattiva Successivamente enzimi proteolitici (della classe serina) intervengono nel determinare un cambiamento a catena Lo scopo finale la formazione della trombina, una proteasi che modifica la molecola del fibrinogeno trasformandolo in fibrina.

Fase Coagulativa -2
Via intrinseca. Si attiva in seguito a esposizione fibre collagene o superficie estranee che scatena lattivazione del fattore XII. I fattori della fase di contatto hanno la capacit di legarsi. Via estrinseca. Ruolo del fattore tissutale che causa lattivazione del fattore VII Fattore VII. Fattore protrombinico permette il legame con il calcio e le superficie fosfolipidiche dove si svolge il processo coagulativo

Fase Coagulativa

Fattore Tissutale (TF)

Proteina transmembrana che serve come


recettore di superficie e cofattore essenziale per il FVIIa Legandosi il TF al FVIIa il complesso acquista attivit catalica e attiva i fattori X e IX Presente sulle membrane dei fibroblasti, cellule tumorali. In condizioni normali non presente nella membrana di monociti e cellule endoteliali, nelle quali per pu essere espresso a seguito di diversi stimoli

Agenti in grado di indurre lespressione di TF sulle cellule endoteliali

Virus, batteri Endotossine Complessi immuni Proteina C reattiva Interleuchine (IL-1, TNF) Trombina

Navigando sulle onde della cascata . coagulativa

ATTIVAZIONE DELLA VIA INTRINSECA

TUTTE LE SOSTANZE DI CARICA ELETTRICA NEGATIVA (materiali polianionici) Attivatori non biologici (vetro) Attivatori biologici (membrane basali, collagene)

FATTORI PLASMATICI DELLA COAGULAZIONE

Fatt. I Fatt.II Fatt.III Fatt.IV Fatt.V Fatt.VII Fatt.VIII Fatt.IX Fatt.X Fatt.XI Fatt.XII Fatt.XIII

Fibrinogeno Protrombina Tromboplastina tissutale* Calcio Proaccelerina* Proconvertina Fatt.antiemofilico A* Fatt. Christmas Fatt.Stuart-Prower Antecedente tromboplastinico plasmatico Fatt.Hageman Fatt.stabilizzante la fibrina o fatt. Laki-Lorand

FIBRINOLISI Plasminogeno
Fibrinogeno fibrina
Attivatori plasmatici o estrinseci (XII,precallicreina) Attivatori tissutali o estrinseci (t-PA,urochinasi,streptochinasi)

inibitori

attivatori

plasmina FDP/FSP I,V,VIII,protrombina

inibitori

Test di screening di I livello Conta piastrinica (Att.ne pseudopiatrinopenia) Tempo di sanguinamento (met.Mielke) vn fino a 9 min

Soltanto dopo: ANAMNESI FAMILIARE ANAMNESI PERSONALE

ANAMNESI FARMACOLOGICA
ESAME OBIETTIVO

Farmaci, cibi, spezie e vitamine che possono causare alterazioni funzionali piastriniche FANS Antibiotici -Lattamici Farmaci cardiovascolari Farmaci psicoattivi Antistaminici Mezzi di contrasto Cibi Acidi grassi polinsaturi omega 3,Vit C, E Spezie

Tempo di sanguinamento allungato

Piastrinopenia Piastrinopatia intrinseca estrinseca Malattia di Von Willebrand


Dosaggio fattore vW Test di aggregazione

Test di screening di I livello

Conta piastrinica Tempo di sanguinamento PT aPTT

Tempo di emorragia metodo Ivy


il tempo calcolato per larresto della emorragia praticato in un punto specifico. I valori sono anche variabili con let. 3-9 minuti nelle femmine 3-6 minuti nei maschi Tempi allungati indicano unalterata funzionalit piastrinica che si pu accertare con esami pi specifici (adesivit e aggregazione piastrinica)

Test di adesivit
Si determina la riduzione del numero di piastrine dopo passaggio di una quantit nota di sangue in una colonnina contente palline di vetro ad una velocit costante. Una scarsa riduzione ci indica la compromessa funzionalit piastrinica, tipica delle trombocitopatie congenite. Conteggio delle piastrine Il numero delle piastrine varia da 150,000 a 400,000 /mm3 nelle aumentate malattie mieloproliferative sono notevolmente

Test di aggregazione piastrinica


Il test viene eseguito utilizzando sostanze che stimolano o che inducono laggregazione. la variazione della densit ottica nel tempo consente la determinazione di indici di aggregazione

Tempo di reazione Massima variazione di densit ottica Tempo di latenza (tra laggiunta dellaggregante e linizio della variazione della densit ottica) Ampiezza o variazione della densit ottica iniziale

Test di aggregazione piastrinica

Tempo di tromboplastina parziale attivato (aPTT)


Indica il tempo medio di coagulazione del campione rispetto ad un campione di riferimento. Permette losservazione della progressione nel tempo del coagulo. Deficit in emopatie v.n. 28-35 secondi

Tempo di protrombina (PT) Indica la funzionalit del meccanismo estrinseco della coagulazione ed sensibile alla concentrazioni dei fattori coinvolti ( X, VII; V, protrombina e fibrinogeno) Deficit in malattie congenite v.n. 12-14 secondi

Tempo di tromboplastina parziale attivato (aPTT) XII XI IX - VIII


Via intrinseca Via comune X V II I Via estrinseca

FIBRINA Tempo trombina

VII Tempo di protrombina (PT)

Tempo di tromboplastina parziale (aPTT)

aPTT - Tempo necessario alla formazione del coagulo di fibrina quando il plasma viene ricalcificato in presenza di sostituti del fattore piastrinico 3 (cefalina) associati ad attivatori della fase di contatto (ac.ellagico, silice micronizzata, caolino) studia la via intrinseca e la via comune della coagulazione.

Tempo di tromboplastina parziale attivato (aPTT)

E sensibile allattivit dei fattori della fase


di contatto e via intrinseca (precallicreina, chininogeno, XII, XI, IX e VIII) e della via comune (II, V, X e fibrinogeno) Presenza eparina Presenza di anticorpi antifosfolipidi (LAC)

Tempo di tromboplastina parziale attivato (aPTT)


Lallungamento dellaPTT maggiore quanto pi a monte la carenza
Deficit FXII (< 1%) aPTT = 260-300 sec Deficit FVIII (< 1%) aPTT = 78-82 sec

Tempo di protrombina (PT)


Tempo in secondi non paragonabile in vari sistemi

Attivit percentuale:
Si preparano diluizioni 1:2, 1:4, 1:8 di un plasma normale (o pool di plasma normali) e si attribuisce unattivit di 50%, 25%, 12.5% Si riportano I dati su assi cartesiani costruendo una curva da usare per valutare I campioni

Tempo di protrombina (PT)

Tempo di coagulazione (secondi) Attivit (percentuale) PT ratio (paziente/normale) INR (paziente/normale)ISI

Tempo di trombina (TT)

TT - Tempo necessario alla formazione del coagulo di fibrina quando il plasma viene ricalcificato in presenza di concentrazioni ottimali di trombina studia la fibrino-formazione fibrino-

Misura il tempo di coagulazione dopo laggiunta di trombina. Evidenzia la presenza di deficit di fibrinogeno fino a 22 s

Test COAGULATIVI
Misurano il tempo necessario per ottenere la coagulazione di un campione di plasma citratato dopo aggiunta di opportuno reattivo. La presenza di eparina provocher un allungamento del tempo di coagulazione direttamente correlato alla concentrazione eparinica.

Interpretazione dati laboratori: Emostasi Test di monitoraggio anticoagulanti orali


Utilizzato per la valutazione della risposta anticoagulativa alluso di farmaci orali. Determinato in base a valori INR (International normalized ratio) p.es. il grado di anticoagulazione raggiunta con la terapia alla warfarina pu essere misurata, indifferentemente dalla tromboplastina usata.

INR Lutilizzo di un parametro riconosciuto internazionalmente permette la comparabilit dei risultati da laboratorio a laboratorio. p.es. In soggetto sotto trattamento con Coumadina il tempo di protrombina sar 2 o 3 volte pi veloce. La valutazione dovr dunque essere effettuata prima che il soggetto inizi un qualsiasi trattamento specialmente nei soggetti che hanno valvole cardiache.

Equazione INR
ISI

INR =

Patients PT in Seconds Mean Normal PT in Seconds

INR = International Normalized Ratio ISI = International Sensitivity Index

La Tromboplastina Influenza il PT Ratio e INR


Tromboplastina Reagente

Pazienti PT
(Secondi)

Media Normale
(Secondi)

PTR 1.3 1.5 1.6 2.2 2.6

ISI

INR

A B C D E

16 18 21 24 38

12 12 13 11 14.5

La Tromboplastina Influenza il PT Ratio e INR


Tromboplastina Reagente

Pazienti PT
(Secondi)

Media Normale
(Secondi)

PTR 1.3 1.5 1.6 2.2 2.6

ISI 3.2 2.4 2.0 1.2 1.0

INR 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6

A B C D E

16 18 21 24 38

12 12 13 11 14.5

Vantaggi dellINR
Univoca quantificazione del livello di anticoagulazione Normalizzazione della variabilit fra diversi lotti di tromboplastine Possibilit di movimento dei pazienti Possibilit di un linguaggio comune fra i Centri Definizione dei range terapeutici ottimali per le diverse patologie

Tempo di protrombina (PT)


INR
Sistema messo a punto solo per gli anticoagulati Non sarebbe da usare per gli altri pazienti perch pu dare false certezze e perch non sicuro che la correzione dellISI in realt non accentui lerrore invece di correggerlo nei pazienti non anticoagulati Meno problemi se la tromboplastina ha ISI vicino a 1 Un INR specifico per gli epatopatici non proponibile perch non si sa come impiegare epatopatici omogenei e confrontabili come si fa per gli anticoagulati quando si calcola lISI
NB Indice MELD per valutare indicazione a trapianto fegato usa INR!!! con possibile valutazione disomogenea dei pazienti a seconda del laboratorio che esegue PT

Controllo finale della coagulazione

FIBRINOLISI
XII, PK tPA uPA

plasminogeno fibrina

plasmina

DD

Degradazione Plasmina
Fibrinogeno D
E

Crosslinked fibrina D D
E

Cause di D-dimero elevato


Fibrinogeno Fibrina D-dimero

Aumentata formazione fibrina Aumentata fibrinolisi Diminuita clearance

Elevati livelli di D-dimero


Invecchiamento Gravidanza

Infiammazione Infezione Tumore Tromboembolia venosa Danno Cardiaco Congestizia Danno Coronarie Infarto miocardio Post-chirugico

EMOSTASI
Equilibrio coagulo litico

PROTEGGE TROMBOSI

PROTEGGE EMORRAGIA

Sangue Endotelio Tessuto Subendotelio

VALUTAZIONE DEGLI INIBITORI FISIOLOGICI DELLA COAGULAZIONE

Metodi immunologici e funzionali Variazione fisiologiche ( gravidanza) Influenze farmacologiche (es: estroprogestinici, antivitamine k)

I Fibrinolitici
Il coagulo una struttura stabile, la sua dissoluzione avviene attraverso lintervento di specifiche proteine. La plasmina viene attivata ad opera del fattore di

(tattivazione tissutale del plasminogeno (t-AP)

La plasmina dissolve la fibrina del coagulo e inattiva la conversione del fibrinogeno in fibrina Altre capacit comprendono uninibizione dei fattori VIII, V e XII Il t-AP non un unico fattore, sono piuttosto una tserie di proteasi liberate da elementi delle vie estrinseca, ma soprattutto intrinseca

Gli inibitori della coagulazione


Fisiologicamente tendono a prevalere sui sistemi coagulativi e li contrastano una volta innescati. Sono:

SISTEMA PROTEINA C
Agisce sul F. VIIIa -via intrinsecaintrinseca- e sul F.Va -che ampifica lattivit del F.XaF.Xa-

ANTITROMBINA III
Agisce inibendo i F. X, IX e XII liberi, non riuscendo ad arrivare agli stessi una volta complessati. Il suo ruolo quindi quello di limitare il processo coagulativo alla sede di danno. La sua attivit, di per s trascurabile, grandemente aumentata dall EPARINA

IL TFPI
tissue factor pathway inhibitor
Il TFPI in grado di regolare lattivazione della via intrinseca secondo una rezione di tipo s-no sIn caso di insufficiente FT la sua azione inibitoria sul complesso VIIaVIIa-TF evita la necessaria conversione di F.X affinch il meccanismo si autosostenga. Se gli stimoli attivatori sono oltre una carta soglia il TFPI non modifica o rallenta in alcun modo il processo

TROMBOFILIE EREDITARIE
La trombofilia identifica una tendenza a sviluppare trombosi conseguenti ad alterazioni del sistema coagulativo o fibrinolitico su base ereditaria o acquisita

TROMBOFILIE EREDITARIE
Riconoscono una modalit di trasmissione genetica di tipo autosomico dominante Si caratterizzano per episodi di trombosi prevalentemente venosi Assenza di fattori di rischio Esordio della trombosi in et giovanile (al di sotto di 40-50aa) 40-50aa) Gli episodi di trombosi tendono a recidivare E spesso presente una storia familiare Aborti ripetuti e/o feti nati morti

Fattore V di Leiden(G1691A)
(arginina 506 sostituita con ac.glutammico-cromosoma 1) ac.glutammico-

Presente solo negli individui caucasici Prevalenza del 2-15% (40% in pts con trombosi) 2Rischio di TVP 5-8% negli eterozigoti, 40-80 negli 540omozigoti Incidenza annua di TVP 0.19%-0.67% 0.19%Gravidanza, contraccettivi orali, chirurgia minore, viaggi prolungati, malattie intercorrenti Frequente esordio dopo i 45 aa

Via intrinseca Superficie di contatto XII XIIa XI XIa

Via estrinseca lesione IX IXa + VIII X Xa TF + VIIa

Membrana delle piastrine

Complesso protrombinasico

Membrana delle piastrine

Va Leiden

+ PS

+ PS

Proteina C Attivata

Va

Protrombina

Trombina

MANIFESTAZIONI CLINICHE
TVP degli arti inferiori con o senza embolia polmonare (circa 40% dei casi) Trombosi venose superficiali, del circolo splancnico e cerebrali sono pi rare Le trobofilie ereditare sono responsabili di circa il 40% delle TVP non provocate da fattori acquisiti Le trombosi arteriose possono associarsi a protrombina G20120A nei soggetti giovani e alliperomocisteinemia

ALTRI FATTORI DI RISCHIO


I difetti combinati (fattoreV+G20120A) duplicano il rischio di TVP (20 volte) Liperomocisteinemia lieve+ fattore V o G20120A aumentano il rischio di 20/50 volte Aplotipo HR2 omozigote del fattore V costituisce una causa di resistenza della proteina C attivata (rischio del 5%) Aumentati livelli di fibrinogeno fattore VIII fattore IX e fattore XI, inibitore della fibrinolisi trombino attivabile (TAF1)