Microbilogia Aula Pratica - Ao de agentes qumicos e fsicos sobre o crescimento bacteriano Objetivos: 1. Definir esterilizao, desinfeco e anti-sepsia. 2.

Definir os agentes bactericida e bacteriosttico. 3. Verificar a diferena de ao sobre o microrganismo de agentes fsicos e qumicos 4. Discutir os mecanismos de ao de agentes fsicos e qumicos utilizados no experimento pratico. 5. Verificar a interferncia de fatores externos na ao dos agentes fsicos e qumicos. Introduo: Esterilizao: o processo de inativao total por meio de agentes fsicos e qumicos de todas as formas de vida quanto a capacidade reprodutiva, mas que no significa, necessariamente, destruio de todas as suas enzimas, produtos metablicos, toxinas, etc. Desinfeco: consiste na inativao ou reduo dos micro-organismos presentes no material inanimado. A desinfeco no implica a eliminao de todos os microorganismos viveis, porm elimina a potencialidade infecciosa do objeto, superfcie ou local tratado. Anti-sepsia: consiste no mesmo conceito dado desinfeco, s que est relacionada a substancias aplicadas ao organismo humano. Limpeza: o simples ato de lavar com gua e sabo pode por si s, resultar em efeito redutor dos micro-organismos patognicos e a nveis suportveis, tornando o local ou o alimento aceitvel. H certos princpios bsicos que devem ser lembrados e que so aplicveis a todos os mtodos de controle de micro-organismos. Em primeiro lugar o agente deve afetar diretamente os micro-organismos. Alm disso, o contato do agente com o microrganismo facilitado pela limpeza da superfcie local ou do objeto a ser tratado. Os processos de esterilizao, desinfeco e anti-sepsia no so instantneos, sendo necessrio permitir a ao do agente escolhido pelo tempo adequado. Influem no tempo de ao diversos fatores, tais como: o nmero e natureza dos micro-organismos presentes, o tipo de agente selecionado, a temperatura, etc. O controle da multiplicao bacteriana se d por duas maneiras: inibio e morte. No primeiro caso, a ao do agente utilizados tem a capacidade de inibir a multiplicao, determinando um bloqueio de uma (ou de um conjunto) funo fisiolgica. No segundo caso, a ao do agente determina a perda irreversvel da capacidade de reproduo. Esta , portanto, a diferena fundamental entre os mecanismos de ao microbiosttica e microbicida, respectivamente. A microbiostase pode ser definida como a condio na qual o microrganismo est vivo, mas no multiplica. O agente determina um bloqueio metablico suficiente para impedir a sua multiplicao, sem, contudo les-lo irreversivelmente. O efeito microbicida compreendido como a morte do organismo. Um fato importante que a microbiostase perfeitamente reversvel, desde que a inibio verificada no tenha sido prolongada a ponto de as clulas irem morrendo gradativamente. Podemos, ento, comparar, grosso modo, a microbiostase a morte lenta, enquanto que o efeito microbicida rpido.

Agentes fsicos: Efeito do calor sobre o crescimento bacteriano. a)Tcnica do experimento da ao de gua fervente: - inocular uma alquota de 0,1mL de uma suspenso de E. coli e outra de B. cereus pelo mtodo de superfcie em Agar EMB e MYP, respectivamente e identificar a placa como controle. - aps a inoculao das placas controle, colocar a suspenso de micro-organismos em banho de gua fervente e inocular por esgotamento decorridos os tempos de 5, 10 e 20 minutos em uma placa, pelo mtodo de esgotamento em Agar EMB e MYP, devidamente dividida e identificada. - Incubar em estufa por 24hs a 35-37C - Proceder contagem. Esquema da tcnica de analise:

0,1 mL

controle

Incubar por 24 hs a 3537C Ala de nquel cromo

Suspenso de E.coli

10
Banho de gua fervente

20

0,1 mL

controle

Incubar por 24 hs a 3537C Ala de nquel cromo

Suspenso de B. cereus

10
Banho de gua fervente

20

2 placas EMB

2 MYP 2

b) Tcnica do experimento da ao do calor mido em vapor sob presso - Inocular assepticamente uma suspenso de E. coli em caldo nutritivo e coloc-lo no interior de uma autoclave a temperatura de 121C por 15. - Inocular pelo mtodo de superfcie 0,1 mL da suspenso de E. coli em Agar EMB em uma placa de Petri. - Repetir o procedimento com B. cereus em Agar MYP - Incubar as placas por 24hs a 35-37C - Proceder contagem. Esquema de analise:

0,5 mL Autoclavar por 15 a 121C

Suspenso de E. coli ou Suspenso de B. cereus

Caldo nutriente

Inocular 0,1 mL

Incubar por 24 hs a 35-37C

Resultados Microorganismos E. coli B. cereus Sob a ao do calor mido em vapor sob presso (121C por 15) E. coli B. cereus Tempo de exposio em gua fervente controle 5 10 20

1 placa EMB

1 placa MYP 3

Agentes qumicos: Efeito da ao de anti-spticos sobre o crescimento bacteriano. a) Tcnica de experimento da ao do vinagre e hipoclorito de sdio (concentrao utilizada para desinfeco de frutas, verduras e legumes). - Colocar 1,0 mL de suspenso de E. coli em 100mL de soluo de vinagre a 2% por 15 e em soluo de hipoclorito de sdio a 200ppm, tambm por 15. - Decorrido o tempo, inocular 0,1mL das solues acima em Agar EMB pelo mtodo de superfcie. - Incubar em estufa por 24hs a 35-37C - Proceder leitura. - Repetir o procedimento com suspenso de B. cereus e inocular em Agar MYP. Esquema de analise:

1,0 mL Suspenso de E.coli ou Suspenso de B. cereus 1,0 mL

Vinagre 2% Aps 15

Hipoclorito de sdio a 200ppm

0,1 mL

0,1 mL

Incubar por 24 hs a 35-37C

2 placas EMB 2 placas MYP 4

b)

Tcnica do experimento da ao do lcool a 70% e lcool a 92,8% - Colocar 1,0 mL da suspenso de E. coli em 100 mL de soluo de lcool a 70% e soluo de lcool a 92,8%. - Aps 15, inocular 0,1 mL da soluo acima pelo mtodo de superfcie em placas de Petri em Agar EMB. - Incubar as placas por 24hs a 35-37C - Proceder leitura. - Repetir o procedimento com B. cereus e inocular em Agar MYP. Esquema de analise:

Suspenso de E.coli ou Suspenso de B. cereus

1,0 mL

1,0 mL

lcool 70% 0,1 mL

lcool 92,8% Aps 15 0,1 mL

Incubar por 24 hs a 35-37C

2 placas EMB 2 placas MYP

c)

Analise das eficcias do lcool a 70% na desinfeco e anti-sepsia.

Anti-sepsia - Umedecer um swab estril em meio liquido, esfregar na mo e semear em uma metade de placa com Agar BP. Umedecer um segundo swab em lcool 70%, passar na outra no e aguardar por 5, e semear em outra metade da placa. - Repetir o procedimento do experimento do lcool 70%, com o lcool 92,8% e com o detergente. - Incubar a 35-37C por 24hs - Proceder a leitura. Desinfeco - Umedecer um swab estril em meio liquido, esfregar na bancada do Laboratrio de Tecnologia de Carnes e semear em uma metade de placa com Agar BP. Fazer a desinfeco da bancada com lcool a 70%, esperar 5, umedecer um swab estril em meio liquido e semearem outra metade da placa. - Incubar a 35-37C por 24hs - Proceder leitura. Esquema de analise:

MO

Swab umedecido estril

Swab com lcool 70%

Swab com lcool 92,8%

Lavar com detergente Esfregar swab umedecido estril

Agar BP Incubar por 24 hs a 35-37C

Agar BP

2 placas Agar BP

BANCADA

Swab umedecido estril

Desinfeco com lcool 70%

Swab umedecido estril

Agar BP Incubar por 24 hs a 35-37C

Resultado: Construa uma tabela demonstrativa objetiva e clara da ao dos diferentes agentes fsicos e qumicos sobre crescimento bacteriano. Concluso: De acordo com os resultados acima, compare e discuta o melhor agente desinfetante e anti-sptico.

1 placa Agar BP

Tabela com resultados da ao de diferentes agentes fsicos e qumicos no crescimento bacteriano. Agentes Placa Controle gua fervente Autoclavagem Vinagre 2% Hipoclorito de sdio 200ppm lcool 70% lcool 92,8% Controle mos Mos - lcool 70% - lcool 92,8% - detergente Bancada controle Aps desinfeco com lcool 70% 7 placas EMB 7 placas MYP 3 placas Agar BP Tempo 5 10 20 15 15 15 15 15 5 5 5 B. cereus E. coli