Recuento de Aerobios Mesofilos Esporulados 1.

INTRODUCION Los recuentos de bacterias viables se basan comnmente en el nmero de colonias que se desarrollan en placas de agar nutritivo que han sido previamente inoculadas con cantidades conocidas del alimento diluido e incubadas en condiciones ambientales predeterminadas. Tales recuentos se denominan, en algunos casos con evidente error, recuentos totales en placa, cuando en realidad nicamente pueden contarse aquellas bacterias que pueden crecer en las condiciones ambientales elegidas. En efecto, se obtiene una amplia variedad de condiciones cambiando la composicin del medio slido de cultivo, los gases del ambiente, el tiempo y la temperatura de incubacin. As, por ejemplo, la incubacin a temperaturas entre 0 y 7C favorece el crecimiento de las bacterias psicrotrficas. Muchos de estos organismos no pueden crecer a 30-37 C, temperaturas estas las ms adecuadas para la incubacin de los organismos mesfilos tanto patgenos como saprofitos. La incubacin a temperaturas an ms elevadas (50-60C) permite el desarrollo de organismos termfilos, pero inhibe a los mesfilos y a los psicrotrficos. Pueden seleccionarse tambin otros grupos para hacer posible su enumeracin o recuento aadiendo al agar nutritivo inhibidores selectivos, tales como cloruro sdico, agente con actividad de superficie o colorante, o modificando la composicin de la atmsfera del incubador, por ejemplo eliminando el oxgeno. Cada tipo de recuento de grmenes viables es potencialmente til para fines especficos, pero el recuento de bacterias aerobias mesfilas es el ms comnmente utilizado para indicar la calidad sanitaria de los alimentos. 2. OBJETIVOS 3. MATERIALES Y METODOS Azcar PLATE COUNT AGAR CROMOGNICO Recuento total en alimentos con distincin de colonias sobre el medio y las partculas (FIL, IDF, AOAC, APHA, ICMSF) CONTENIDO: 500 g CDIGO: BCD510 COMPOSICIN Triptona 5.0 g Extracto de levadura 2.5 g Glucosa 1.0 g Agar-agar 10.5 g Mezcla cromognica c.s. (Frmula por litro) pH final: 7.0 0.2

Metodologa Pesar 1 g de azcar y colocar en 9 ml de agua Luego mezclar bien y procedes a realizar un choque trmico donde el tubo de ensayo se somete a calentamiento 80 C por 1 min, luego se lo somete a un bao helado por 3 min.

10 -1
1g

10 -2

10 -3

10 -4

80 x1 min

Bao helado x 3 min

1 ml 1 ml

4. RESULTADOS Y DISCUCIONES

5. CONCLUSIONES 6. BIBLIOGRAFIA

Recuento de Entero Bacterias

7. 8. 9. 10. 11.

INTRODUCION OBJETIVOS MATERIALES Y METODOS RESULTADOS Y DISCUCIONES CONCLUSIONES

12. BIBLIOGRAFIA

AccionesdeDocumento 3.4 MICROORGANISMOS MARCADORES: RECUENTO TOTAL (en placa) DE MICROORGANISMOS EN LOS ALIMENTOS

3.4.1 MICROORGANISMOS VIABLES MESFILOS Y PSICRFILOS 3.4.1.1 Fundamento En general los recuentos bacterianos bajos estn asociados con alimentos seguros. La mayora de los alimentos industrializados (excepto, por ejemplo, los productos fermentados) deben ser considerados como inadecuados para el consumo cuando contienen un gran nmero de microorganismos aun cuando estos microorganismos no sean conocidos como patgenos y no hayan alterado de forma apreciable los caracteres organolpticos del alimento. Algunos microbilogos han estimado el recuento bacteriano como uno de los mejores indicadores del grado de alteracin de los alimentos.

3.4.1.2 Material

El necesario para hacer disoluciones de la muestra (ver protocolo de disoluciones). Placas de Petri y pipetas de 10 mL y 1 mL, estriles. Agar triptosa-glucosa-extracto de levadura (Plate count agar) fundido, en el bao termosttico a 45C, estril.

3.4.1.3 Preparacin del medio, incubacin y expresin de resultados

Hacer disoluciones de la muestra al 1/10. 1/100.etc, segn estime el grado de contaminacin. Poner 1mL de cada disolucin decimal en placas de Petri (por duplicado). Aadir 15 mL de medio de cultivo (fundido, a 45C en un bao termosttico) y dar movimientos circulares y de vaivn para que se distribuya la muestra uniformemente.

Incubar: una serie de placas a 20C/ 3 das (psicrfilos) y otra serie de placas a 35C/ 2 das (mesfilos). Para incubar las placas introducirlas invesrtidas en la estufa.

Pasado el perodo de incubacin contar las placas que tengan entre 30 y 300 colonias.

Expresar el resultado en ufc/g de alimento. Para ello se cuenta el duplicado y se halla la media, multiplicndose por la inversa del factor de dilucin en el que se realiz el recuento.

Tambin es adecuado expresar el resultado calculando el logaritmo del valor anterior log ufc/g.

Colonias tpicas de microorganismos mesficlos en medio PCA

3.4.2 RECUENTO TOTAL DE HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS 3.4.2.1 Fundamento Generalmente la presencia de mohos y levaduras est aumentada en los alimentos cuyo pH es de 4.5 o menos, tales como jugo de tomate, mahonesa, conservas de frutas, bebidas acidificadas, etc., y otros como helados, mantequilla, leche condensada, quesos, azcar, etc. 3.4.2.2 Material

-Placas dePetri. -Pipetas estriles de 1 y 10 mL. -Frasco de 100 mL de agua destilada estril. -Agar OGYE. -Suplemento antibitico: oxitetraciclina.

3.4.2.3 Preparacin de medios y suplementos

El medio:

-Disolver 32.5g en 500 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 1 L de capacidad. -Llevar a ebullicin mediante calentamiento en placa calefactora con agitacin. -Trasvasar la mezcla a un bote Pyrex de 1 L de capacidad e introducir en el autoclave a 121C durante 20 min.

-Atemperar el medio a 50 C en un bao termosttico.

El suplemento antibitico

-Se prepara aadiendo 10 mL de agua destilada estril al vial de antibitico. -Cuando el medio de cultivo se utiliza y se encuentra atemperado a 50C se disuelve en la proporcin de 10 mL del vial en 500 mL de medio o la proporcin adecuada.

-Repartir el medio en botes de Pyrex de 100 mL de capacidad previamente esterilizados.

3.4.2.3 Mtodo de siembra, incubacin y expresin de resultados

Poner 1 mL de la dilucin en la placa de Petri. Aadir 15-20 mL del medio previamente fundido. Homogenizar con movimientos giratorios y en cruz con cuidado de no manchar con el agar la tapa de la placa de Petri. Dejar solidificar.

Incubar a 25 C (temperatura ambiente) durante 5 das realizando lecturas a los 3 das para observar el crecimiento de las colonias y efectuar un primer contaje. A partir del segundo da seleccionar las placas que tengan entre 30 y 300 colonias.

Expresar el resultado como unidades formadoras de colonias (ufc)/g de alimento.

Crecimiento de colonias del Gnero Candida en agar OGYE

3.4.3. INVESTIGACION Y RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS Y VEGETATIVAS DE CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTORES 3.4.3.1 Fundamento Los microroganismso anaerobios obligados (Bacillus, Clostridium...) slo pueden crecer a bajos potenciales redox, y algunos nicamente crecern en ausencia de oxgeno. Suelen encontrarse en la parte interna de los alimentos no procesados y juntamente con los anaerobios facultativos constituyen los principales microorganismos de la alteracin. Su valoracin en los alimentos nos sirve como indicador de contaminacin telrica remota por la presencia de esporas resistentes. El nmero mximo de esporas, es decir, el "nmero total de esporos", se puede determinar usando tratamientos trmicos de la muestra del orden de los 70-80C durante 10-15 minutos, con lo que conseguimos destruir las formas vegetativas y revivificar tan solo los esporos. Al hacer recuento hay que partir del principio de que una espora da lugar a una colonia en el medo de cultivo.

3.4.3.2 Material

Pipetas de 1 mL. Placas de Petri estriles. Botes pyrex de 100 mL. Jarar de anaerobiosis. Kit de generacin de condiciones de anaerobiosis Anaerogen
TM

(Oxoid).

Jarra y kit para anaerobiosis

3.4.3.3 Preparacin del medio

Agar SPS ( Agar sulfito- polimixina - sulfadiazina). Se disuelven 20 g en 500 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 1L de capacidad y se hierve la mezcla hasta disolver el medio en placa calefactora con agitacin. Pasar a botes de Pyrex de 100 mL.

Esterilizar en autoclave a 121C durante 20 minutos. El medio resultante es de color claro y amarillento.

3.4.3.4 Mtodo

Sacar el medio del frigorfico y fundir mediante calentamiento en microondas. Atemperar a 45-50C en un bao termosttico.

Poner 1 mL. de cada dilucin en placa de Petri, estril. Aadir 10-15 mL. de agar SPS, y dar movimientos circulares y de vaivn para que el inculo se distribuya uniformemente. Dejar solidificar. Tambin se puede cultivar en agar en tubo.

Incubar a 46C durante 24-28 horas en anaerobiosis utilizando una jarra de anaerobiosi y un kit de generacin de condiciones de anaerobiosis.

Contar las colonias negras crecidas y expresar el resultado como ufc de colonias por gramo o mL de alimento.

3.4.3.5 Interpretacin. El medio utilizado es selectivo para grmenes sulfito- reductores. El sulfito sdico, por la accin sulfito reductora de la mayor parte de los Clostridium, se reduce a sulfuro. El sulfuro, al reaccionar con el citrato de hierro , da lugar a sulfuro de hierro, que se manifiesta formando un precipitado negro alrededor de las colonias. La sulfadiazina sdica es selectiva e inhibe el crecimiento de grmenes Gram negativos.

Crecimiento de colonias de Clostridium en agar SPS

3.4.4 INVESTIGACION Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS TOTALES Identificacin de colonias tpicas en medio slido

3.4.4.1 Preparacin del medio

VRBG: Agar biliado rojo violeta glucosa. -Se disuelven 19 g en 500 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 1L de capacidad y se hierve la mezcla hasta disolver el medio en placa calefactora con agitacin.

-No resulta necesario ni deseable una esterilizacin. -Trasvasar a botes de pyrex de 100 mL de capacidad previamente esterilizados. -Conservar en el frigorfico hasta el momento de su utilizacin.

3.4.4.2 Mtodo

Sacar el medio del frigorfico y fundir mediante calentamiento en microondas. Atemperar a 45-50C en un bao termosttico.

Poner 1 mL. de cada dilucin en placa de Petri, estril. Aadir 10-15 mL. de agar VRBG, y dar movimientos circulares y de vaivn para que el inculo se distribuya uniformemente. Dejar solidificar.

Aadir 4-5 mL. del mismo medio sobre la superficie solidificada, para evitar el crecimiento en superficie.

Incubar 18-24 horas a 37C. Contar las colonias tpicas y expresar el resultado como ufc de colonias por gramo o mL. de alimento.

3.4.4.3 Interpretacin. Las sales biliares y el cristal violeta que forman parte del medio inhiben el crecimiento de la flora competitiva. Todas las Enterobacteriaceae fermentan la glucosa con produccin de cido, lo que se pone de manifiesto por un viraje al rojo y la precipitacin de las sales biliares alrededor de las colonias. Las colonias de color rojo violeta rodeadas de un halo de precipitacin tambin violeta, se consideran Enterobacteriaceae.

Colonias rojo violeta tpicas del crecimiento de Enterobacterias en VRBG

3.4.5 INVESTIGACION Y RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS LACTOSA POSITIVA (COLIFORMES) 3.4.5.1 Fundamento Para la deteccin de Enterobacterias lactosa positivas (coliformes) se aprovechan ciertas caractersticas que las diferencian de otrasEnterobacteriaceae como, por ejemplo, su capacidad para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas en presencia de sales biliares.

3.4.5.2 Material

El necesario para hacer diluciones de la muestra. Pipetas de 1 y 10 mL, estriles. Tubos. Ser-O-Tap. Campanas Durham. Caldo lactosado con bilis y verde brillante (BBGB). Estufa a 37C Y A 45C

3.4.5.3 Preparacin del medio:

BGBL o BGVB: Caldo lactosado biliado verde brillante. Agregar 40 g a 1 litro de agua destilada en un Erlenmeyer de 1,5 L de capacidad. Se preparan tres series (una por cada dilucin decimal) de cinco tubos por cada alimento, aadiendo 10 mL del medio en cada tubo. Introducir una campana de Durham en cada tubo. Tapar con Ser-Otap.

Esterilizar en autoclave a 121C durante 20 min. Comprobar que ha desaparecido el gas de todas las campanas de Durham.

3.4.5.4 Mtodo e interpretacin

Seguir la tcnica del nmero ms probable (NMP) como se describe a continuacin: En cada uno de los tubos de la primera serie se vierte 1 mL de la dilucin de la muestra 1/10. En cada uno de los tubos de la segunda serie se vierte 1 mL de la dilucin de la muestra 1/100. En cada uno de los tubos de la tercera serie se vierte 1 mL de la dilucin de la muestra 1/1000. Incubar las tres series a una temperatura entre 30 y 37C haciendo lecturas a las 24 y 48h.

La reaccin es positiva cuando se produce desprendimiento de gas en la campana Durham, por lo menos en 1/10 parte de su volumen, como consecuencia de la fermentacin de la lactosa con formacin de cido y gas en presencia de sales biliares a la temperatura indicada.

Con el nmero de tubos positivos en cada serie, se recurre a la tabla del NMP donde se obtendr el recuento por gramo o mililitro de muestra.

Si la misma tcnica la realizamos en paralelo e incubamos posteriormente a 45C seleccionamos el grupo de Coliformes fecales, que contienen una alta proporcin de E. coli. Por lo que se pueden utilizar como indicadores de una contaminacin fecal del alimento.

Caldo Verde Brillante con reaccin negativa y positiva (presencia de gas en la campana Durham) al crecimiento de coliformes

3.4.6 RECUENTO DE ENTEROCOCOS 3.4.6.1 Fundamento Los Enterococos pueden tener un papel significativo como indicadores de prcticas de limpieza y desinfeccin deficientes en las industrias alimentarias, debido a su gran resistencia a ladesecacin, a las temperaturas elevadas y bajas y a los detergentes y desinfectantes.

3.4.6.2 Material

El necesario para realizar diluciones decimales. Pipetas de 1 mL. Placas de Petri estriles.

Botes pyrex de 100 mL.

3.4.6.3 Preparacin del medio

Agar KAA ( Agar Kanamacina Aesculina Azida) Se disuelven 24 g en 500 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 1L de capacidad y se hierve la mezcla hasta disolver el medio en placa calefactora con agitacin. Pasar a botes de pyrex de 100 mL.

Esterilizar en autoclave a 121C durante 20 minutos.

3.4.6.4 Mtodo

Atemperar el medio una vez fundido en un bao a 50C. Poner 1 mL de cada dilucin en una placa de Petri, estril. Aadir 15 a 20 mL de medio KAA Realizar movimientos rotatorios y homogenizar. Incubar 24 horas a 37C Contar las colonias tpicas (pequeas, de color gris oscuro con halo negro, como consecuencia de la hidrlisis de la esculina) y expresar el resultado como ufc de colonias por gramo o mL. de alimento.