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Inhibicin de microorganismos y procesos mitticos por pesticidas y metales pesados mediante la preparacin de un cultivo de agar

Leonardo Morera Umaa Paolo Conejo Valverde Laboratorio de Procesos Qumico-Biolgicos, Ctedra de Qumica Orgnica y Bioqumica.

Resumen
Los medios de cultivo permiten describir el comportamiento de microorganismos y tejidos celulares antes factores externos que se desarrollan en la superficie del cultivo. Adems la exposicin de ellos prolongadamente en un medio natural muestra el efecto de la interaccin que se desarrolla durante ese lapso de tiempo. La preparacin de cultivos puros para diferentes especies de bacterias permiti esterilizar y desarrollar la siembra de las colonias bacterianas en el agar preparado. El proceso de autoclaveado fij y purific cada uno de los cultivos preparados con las colonias para determinar su resistencia ante agentes nocivos e inhibidores de crecimiento. La concentracin de diferentes muestras de metales pesados y pesticidas demostr la resistencia y los mecanismos que emplean ciertas clases de bacterias para neutralizar la toxicidad que emiten sobre ellos. En la mitosis de la cebolla, las races mostraron cierta inhibicin en procesos de divisin celular, disminuyendo en alguna medida su crecimiento en el lapso de tiempo en que estuvieron expuestas. Palabras clave: inhibidores, autoclaveado, metales pesados, medios de cultivo.

Introduccin
Los medios de cultivo forman parte de una herramienta muy importante en los anlisis de bacterias, tanto su composicin estructural y su funcionamiento en ambientes alternos (1). Un medio de cultivo se define como un sustrato o una solucin de nutrientes en donde se siembran colonias de bacterias que crecen y se multiplican en un laboratorio (1). Mediante estudios y anlisis complementarios es posible determinar en qu manera los sustratos energticos son capaces de metabolicen aminocidos, peptonas, derivados de celulosa, vitaminas y muchos compuestos de aprovechamiento energtico (1). Existen varios medios de cultivos, que cumplen una funcin especfica para cada medio de preparacin. Entre los existente se puede mencionar: medios enriquecidos, que facilitan el crecimientos de

microorganismos, especialmente patgenos (2). El cultivo diferencial describe el comportamiento de una colonia especfica. El cultivo selectivo promueve el crecimiento de una especie de bacterias, y el cultivo electivo permite clasificar y aislar una bacteria muy especfica (2). Un ejemplo de cultivo para la preparacin de agar se muestra a continuacin:

Fig. 1 Preparacin de un agar de sangre para muestreo de bacterias y metabolitos

Los agares, que son los medios de cultivo ms usados, tienen diferentes composiciones, para un anlisis qumico especfico (2). Muchos se componen de protenas completas, como el extracto de carne, protenas hidrolizadas, en las que se destacan la casena, levadura, soya y mezcla de peptonas (2). Tambin se componen de aminocidos, que ofrecen anlisis propiamente bioqumicos, como en la caracterizacin de hidratos de carbono (2). Un ejemplo de la composicin de los agares se muestra as:

Fig. 3 Medio de preparacin de un cultivo de agar con la siembra de bacterias. Las clase ms comunes de bacterias pueden analizarse para conocer su control biolgico en la contaminacin (1). Bacterias como el E. Coli, que residen en nuestro organismo, la Bacillus y Staphylococus, que son responsables de infecciones y varias enfermedades, tambin ejercen un poder biolgico que neutralizan agentes txicos y qumicos presentes en la naturaleza (2). Bsicamente lo que hacen es absorber los iones metlicos y no metlicos, que inhiben su accin toxica. El problema radica en cuanto a la cantidad del contaminante puedan tolerar y asimilar, pues altas concentraciones del mismo lo que hacen es eliminar las poblaciones de bacterias (2). Cuando se usan pesticidas, con altos porcentajes de metales pesados, suele darse no solo una alteracin en la existencia de las colonias bacterianas, parecer ser que tambin inhiben el crecimiento celular de las plantas, a lo que se refiere la mitosis (5). En campos de arroz, por ejemplo, el uso de herbicidas disminuye el crecimiento de los sembrados, aparte de la disminucin de las malezas (5). Los metales tienen la caracterstica de ser absorbido por las membranas celulares, adems de que pueden introducirse en el torrente sanguneo, para el caso de los humanos, y propagarse por todo el sistema (2). De manera similar ocurre con las plantas, que son absorbidos por la celulosa de las plantas, y estos se

Fig. 2 Preparacin inoculada de diferentes agares de extracto de carne. Las colonias bacterianas generalmente necesita de ste tipo de cultivos para poder crecer (3). El aislamiento de estos cultivos selecciona los agentes etiolgicos y siembran los inculos puros sobre la preparacin, con un patrn estndar que permite separarlas semicuantitativamente (3). Cuando el anlisis es cualitativo, se busca identificar la morfologa de las colonias, basndose en la forma de crecimiento, tamao, color, olor que permitan compararlas con las caractersticas observadas respectos a otras colonias y el estudio de las mismas (3). La siembra se realiza siempre a travs de la preparacin, tratando de formar estras a lo largo del cultivo, para que sta se distribuya sobre la superficie y crezca de mejor manera (4). Por lo general, una siembra se observa as:

introducen en la membrana, desplazando la materia gentica e impidiendo que estos se reproduzcan (3). La siguiente imagen muestra la mitosis en la raz de cebolla, sin embargo slo muestra una fase mittica, producto de la exposicin a un metal pesado:

se efectu sobre la preparacin, usando una aza para aplicarla, en forma de zigzag a lo largo del agar, para una mejor distribucin de las colonias. Una vez realizada la siembra se taparon las placas de petri con aluminio y se guard en un lugar estril. Inhibicin de metales pesados y pesticidas en las colonias bacterianas Se tomaron tres placas de petri con el cultivo de agar y se le dibuj en la parte de abajo divisiones con las concentraciones en las que se trabaj las muestras: 0,1 %, 1% y 5%. Posteriormente se prepararon disoluciones de , , cobre cido y neutro, adems de yodo en medio cido y bsico en las concentraciones descritas anteriormente. Despus se tom el cultivo de las colonias de las bacterias, y se realiz siembras en cada seccin marcada de la placa, para aadir una gota de los reactivos preparados en las diferentes concentraciones en el lugar respectivo demarcado. Se dej la preparacin actuar una semana para observar el desarrollo de las colonias. Mitosis en raz de cebolla Inicialmente las races de cebolla se sumergieron en agua residual, para observar despus el avance de la mitosis en el microscopio. Despus se realiz el mismo proceso, slo que esta vez las races se sumergieron en la solucin del metal pesado, para observar su inhibicin mittica a travs del microscopio.

Fig. 4 Mitosis observada en raz de cebolla expuesta a un metal pesado. La anterior imagen muestra que slo en ciertas secciones del tejido analizado, se ven ciertas divisiones, mientras que el resto de clulas parece no mostrar indicios de separacin mittica (5).

Procedimiento
Preparacin del Agar Se prepararon 250 mL de la solucin del agar, disolviendo 2,5 g de la casena de la leche, 0,75 g de extracto de carne, 3,75 de agar y 1,25 g de sal. La solucin se calent con agitacin en una plantilla, hasta disolver todo el slido remanente. Una vez realizado esto, se tap hermticamente con papel aluminio para colocarlo en la autoclave. Autoclavado y Preparacin del medio de cultivo La solucin del agar se coloc en el autoclave, y se esteriliz la muestra durante una hora, procurando que el nivel de los vapores y la presin no aumentaran. Despus de que se enfri la solucin de agar, el contenido se verti sobre placas de Petri, trabajando el equipo en la capilla de flujo laminar, para mantener las condiciones estriles. Siembra de las colonias de bacterias Una vez que se haya secado el agar de las placas, se procedi a realizar siembras con las bacterias Bacillus, Pseudomona, E.coli y Staphylococus sobre la preparacin. El proceso se realiz en la capilla de flujo laminar, para mantener las condiciones estriles, y la siembra

Resultados Obtenidos
Cuadro 1. Inhibicin de microorganismos por exposicin a pesticidas Bacteria Comportamiento Staphylococus Crecieron en las tres concentraciones, se afect ms en el 5% E.Coli Creci mayormente en concentracin al 1%. Medio opaco y reseco Bacillus Todos crecieron. El medio se observa reseco sobre la zona de la gota. Pseudomona Creci las tres, pero inhibi crecimiento en 1% y 5%. Los resultados obtenidos muestran como la inhibicin del pesticida afecta de manera distinta en cada concentracin con la que se trabaj.

Cuadro 2. Inhibicin observada la bacteria Staphylococus a diferentes concentraciones de metales pesados Metales Staphylococus Hay crecimiento en las tres, pero crecieron mejor en 1% y 0,1%. Medio reseco, se inhibi el crecimiento de las colonias.

Esta bacteria demostr su baja resistencia al exponerlo en estos metales seleccionados para el anlisis. Cuadro 3. Inhibicin observada de la bacteria E. Coli para diferentes concentraciones de metales pesados. E. Coli Hubo inhibicin, no creci ninguna colonia. Creci con mayor efecto en la concentracin al 1% Cobre neutro Las colonias formadas son resecas. Cobre cido Crecieron bien las tres concentraciones. Cuadro 4. Inhibicin observada por parte de la bacteria Bacillus por la exposicin a metales pesados. Metal Bacillus Las colonias crecieron bien, se observan brillantes. Crecieron las tres a colonias, el medio se observ brilloso. El anlisis demostr que esta especie de bacteria es bastante resistente y dio mejores resultados respecto al crecimiento de las colonias. Metales

Cuadro 5. Inhibicin observada por parte de la bacteria Pseudomona en la exposicin de sta ante metales pesados. Metales Pseudomona Crecieron las tres, el medio se puso amarillo y reseco. Creci, el medio se torn ms amarillo. Cobre Neutro Crecieron, pero el medio cambio de color. El color del medio esta Cobre cido mas marcado (liberacin de metabolitos) Yodo cido Cambi de color, medio ms reseco. Yodo Bsico Crecieron las tres colonias, el medio es ms brillantes Ante esta bacteria se observ que en todos los medios sometidos a los metales, ste cambio su coloracin en diferentes intensidades. Cuadro 6. Inhibicin de la mitosis en la raz de cebolla al exponerse a una solucin con metales pesados. Metales Observaciones Slo se observ la profase. Cobre neutro Se vieron ncleos rotos Cobre cido Se observa profase y telofase. Yodo cido Se observa profase y metafase. Yodo bsico Se observa profase y telofase. Los metales mostraron que una prolongada exposicin de las races a estos inhibe ciertas fases de la mitosis.

Discusin de Resultados
El proceso de mitosis en tejidos vegetales por lo general se lleva a cabo en condiciones suaves, es decir, a un buen ambiente, con temperatura regulada y pH ptimos. Pero al momento se someterlos a condiciones ms severas, la mitosis se perjudica proporcionalmente al grado de contaminacin o condicin en el que se encuentra. En aguas residuales, hay cualquier cantidad de desechos y contaminantes, entre ellos varios metales pesados, sustancias orgnicas e inorgnicas, y varias clases de bacterias, con el potencial para desintegrar e inhibir los procesos mitticos de la raz de cebolla. La exposicin a un metal pesado especfico slo mostr el grado de peligrosidad que tiene efecto sobre ese tejido de raz que se analiz. La exposicin a diferentes metales pudo identificar cules son potencialmente peligrosos tanto para la vida vegetal, como para la vida humana. El manganeso demostr ser el ms txico, pues inhibi con mayor intensidad la mitosis de la raz de cebolla, reduciendo las fases iniciales de profase y metafase a slo profase. El cromo +3 mostr una toxicidad parecida, slo que si se oxida a cromo +6, el nivel de toxicidad aumenta considerablemente. Por eso resultara lgico pensar que si la solucin de cobre expuesta a oxigeno y dixido de carbono este puede sufrir esa oxidacin aumentando su peligrosidad. Los medios de cultivo que se preparan deben contener las caractersticas adecuadas para que las bacterias se nutran. El agar preparado con protena y extracto de carne asegura que el agar enriquecido pueda nutrir las colonias bacterianas, si lo que se busca es multiplicar la poblacin de ella. La relevancia que tiene este proceso radica en que un anlisis permite describir mejor el comportamiento de las bacterias si se trabajan en colonias y no separados individualmente. El proceso de autoclavado tambin supone una gran importancia en el anlisis de cultivos, pues en un ambiente contaminado las colonias bacterianas no pueden desarrollarse a su mxima capacidad, puesto que los diferentes agentes externos retrasan su reproduccin. El procedimiento fija y esteriliza adecuadamente la muestra para el estudio del cultivo bacteriano, sin olvidar que deben analizarse en un espacio que esterilice el medio de trabajo.

La manera de la siembra debe realizarse de un modo que las bacterias se puedan distribuir por todo el cultivo, a razn que estn puedan aprovechar mejor todos los nutrientes que ofrece la preparacin. Realizar la siembra amotinada sobre un solo lugar no slo afecta la forma de crecimiento de las bacterias, sino que slo usaran la parte en las que estn colocadas para alimentarse, y como se prepar todo un medio para el anlisis, no resulta prctico desaprovechar todo el espacio de cultivo. De la inhibicin de microorganismos por metales pesados y pesticidas, se concluye que stos crecen mejor en concentraciones ms bajas de la sustancia empleada. Tanto con el pesticida como para los diferentes metales pesados se observ que en concentracin de 0,1%, las colonias crecan mejor, al no haber tanto material que los pudiera inhibir, contrario a lo que pasaba con las dos concentraciones mayores, en donde se notaba mayor inhibicin. Es interesante destacar que para el caso de la bacteria Pseudomona, en cada uno de los cultivos con la siembra de los metales y el pesticida, hubo un cambio de color en el medio, pues pas de un color amarillo opaco que tena inicialmente, a un color amarillo plido mas demarcado. Incluso, cuando se someti a cobre, estos cambiaron a un color rojizo, mostrando una diferencia ms marcada respecto a los otros anlisis con otros metales pesados. Por su parte, se demostr que la bacteria Bacillus era la ms resistente de las cuatro bacterias analizadas, pues en todas las concentraciones a las que se someti las colonias, estas crecieron bastante bien. En los dos casos, metales pesados y pesticidas, no se pudo distinguir una diferencia clara entre cada una de las concentraciones usadas, lo que explicara que indiferentemente de esas concentraciones, la resistencia de esta bacteria es la misma. Y esto se notaba por el color de medio, que era ms brillante y no presentaban mucha resequedad sobre el punto de aplicacin de la muestra. El metal pesado que mostr mayor inhibicin de bacterias fue el cromo +3, puesto que en varias colonias mostr una inhibicin completa, o al menos una inhibicin muy significativa que se observ en menor intensidad en las concentraciones de 0,1% del metal. Esto quiere decir que en organismos vivos, o al menos en donde algn organismo realice un proceso metablico, el cobre acta nocivamente sobre los tejidos que estn expuestos a l.

Conclusiones Los medios de cultivos ofrecen mejores condiciones para el crecimiento de colonias bacterianas. El proceso de autoclavado purifica adecuadamente los medios de cultivo analizados. La exposicin a pesticidas y metales pesados inhiben marcadamente el proceso de mitosis en tejidos vegetales. El manganeso es ms txico si entra en contacto con tejidos animales y vegetales respecto a los otros metales trabajados en la prctica. El cobre inhibe significativamente sobre el crecimiento de las colonias de bacterias en el medio de cultivo. Las aguas residuales se componen principalmente de metales pesados que estn disueltos en ellas. La preparacin de agar permite enriquecer medios de cultivo en donde se enfatiza la multiplicacin de bacterias.

Bibliografa
(1) Montoya, H. Microbiologa para el rea de salud y afines, 2da Edicin, Universidad de Antioqua, Colombia, 2008. pp 73,74 (2) Bermejo, J. Manual auxiliar de laboratorio, 2da edicin, editorial MAD S.T, 2003. pp 428,429,431 (3) Forbes, B. A. Diagnstico microbiolgico, 12va edicin, Editorial mdica panamericana, 2007. pp 103,104 (4) Garca V. Introduccin a la Microbiologa, EUNED, 2008. pp 60,61 (5) Degiovanni, B. & colaboradores. Produccin eco-eficiente de arroz en Amrica latina, 464,465