Faculdade de Cincias Sociais e Agrrias de Itapeva - FAIT

Mini curso Biotecnologia na Agricultura

MsC. Mrian Sber ESALQ/EMBRAPA Meio Ambiente miriansaber@yahoo.com.br

Agricultura antiga Agricultura moderna Modernizao agrcola; Culturas sustentveis; Rotaes LUCRO Objetivo: de culturas resistncia pragas e insetos, no utilizao de defensivos qumicos; Monocultura; Mnimo impacto ambiental Mecanizao; Pragas, defensivos qumicos.

BIOTECNOLOGIA
Impacto na comunidade global : Crise global de alimentos 7-10x maior produo Impacto positivo na sade humana : Menos gordura saturada Mais cidos graxos e mega 3 Impacto ambiental: Menor uso de pesticidas Reduo de emisso de carbono

Correo de solos
Enriquecimento do solo com micro-organismos benficos que estabelecem relaes simbiticas com as razes das plantas resultando em:
Proteo contra doenas Promoo do crescimento de razes Quebra de cadeias qumicas disponibilizando nutrientes para as plantas

Nutrio de plantas
Fixao de nitrognio em leguminosas e gramneas (inoculantes) Aumento de nutrientes em fertilizantes de origem vegetal Acelerao da decomposio de resduos vegetais

Preveno e Controle de Pragas e Doenas

Os defensivos biolgicos baseados em micro-organismos possibilitam o controle das seguintes pragas e doenas: Lagartas Colepteros Percevejos Mosca-branca Nematides Rhizoctonia solanii Phytium spp. Fusarium spp. Odio

Bioremediao
Eliminao de sais Reduo de metais pesados

Reduo de contaminaes por hidrocarbonetos

Revegetao

OGM

O melhoramento gentico de plantas constitui-se a maior aplicao da biotecnologia na agricultura. Em 2007 as culturas de milho, soja, canola, algodo e arroz geneticamente modificados ocuparam 114 milhes de hectares e envolveram 10 milhes de agricultores em 22 pases. Em 12 anos de existncia a biotecnologia OGM movimentou US$ 6 bilhes, com crescimento de 10 a 20% ao ano.

Plantas Sensveis ao Roundup

Shikimic acid + Phosphoenol pyruvate + Glyphosate Planta EPSP synthase

3-Enolpyruvyl shikimic acid-5-phosphate (EPSP)

Sem aminocidos, Plantas morrem

Aminoacidos aromticos

Plantas Resistntes ao Roundup

Shikimic acid + Phosphoenol pyruvate + Glyphosate Bacteria EPSP synthase

RoundUp no tem efeito; enzima resistente ao herbicida

3-enolpyruvyl shikimic acid-5-phosphate (EPSP)

Com aminocidos, planta vive

Aminocidos aromticos

Flavr Savr (Calgene)

Tomate transgnico Tomate tradicional

O tomate transgnico amadurece na planta, ficando com mais sabor. Mantm-se firme aps a colheita.

O tomate tradicional vaporizado com etileno para induzir a maturao.

O tomate tradicional tem de ser colhido verde, para no ser esmagado durante o transporte.

SUPERMERCADO

Etapas no laboratrio

O prximo teste no campo

Resistencia ao herbicida

No-transgenicos

Transgenicos

Teste final dos transgnicos

Aceitao do consumidor RoundUp Ready

Antes

Depois

CLONAGEM CELULAR

 Engenharia Gentica ou Tecnologia do DNA Recombinante

um conjunto de tcnicas que permite aos cientistas identificar, isolar e multiplicar genes de quaisquer organismos. Clonagem de genes de interesse para expresso e produo de protenas recombinantes: insulina, hormnio de crescimento genes de humanos clonados em bactrias; Plantas transgnicas; Animais transgnicos. Clonagem molecular; Vetores; PCR; Bibliotecas genmicas; Sequenciamento de DNA; Hibridizao; Eletroforese.

Tecnologia do DNA recombinante: construo de uma molcula de DNA recombinante

DNA quimera Fragmentos de DNA ligados a um vetor de clonagem (DNA recombinante)

ENZIMAS DE RESTRIO
Protenas que reconhecem e clivam o DNA em pontos especficos, geralmente em sequncias de 4, 6 e 8 bases palndromas

Vetores de clonagem
Plasmdeos podem ser modificados para carregar novos genes

devem apresentar origem de replicao; devem apresentar um gene para seleo (gene para resistncia a antibitico); devem apresentar mltiplos stios de clonagem (poli-linker)

PLASMDIOS E VETOR DE CLONAGEM

cromossomo plasmdeos

Diviso celular cromossomo plasmdeos

ocorrem naturalmente em algumas bactrias; so molculas de DNA dupla fita e circular; muitas vezes carregam genes para resistncia a antibiticos; replicao independente da replicao cromossmica (apresentam uma origem de replicao independente).

 Origem de replicao Genes para resistncia a antibiticos

Permite que a clula hospedeira cresa em meio seletivo

Mltiplos stios de clonagem

Permite a insero de DNA exgeno

Insero do DNA dentro da clula bacteriana

Transformao qumica Eletroporao

Introduzir o gene na Planta

Cassetes de transformao so produzidos nos laboratrios Eles so introduzidos dentro das plantas

Dois mtodos principais:

Agrobacterium

Gene Gun

Cultura de tecido, deve Regenerar a planta trangnica

Clonagem
Gene alvo

DNA cromossmico

Enzima de restrio

Enzima de restrio

DNA Recombinante

Recombinao com o gene alvo

Transformao
Clula hospedeira

Transformao plasmdeo recombinante

1 plasmdeo 1 clula

Juang RH (2004) BCbasics

Amplificao e Seleo

1
Plaquear

1 clula, 1 colnia
Duplicao bactria

X100

Duplicao plasmdeo

X1,000
Isolar a colnia com o gene de interesse
Juang RH (2004) BCbasics

=100,000

A ESTRUTURA DO DNA
1.Estrutura primria estrutura de nucleotdeos. -Nucleotdeo = Acar + Fosfato + Base nitrogenada.

A ESTRUTURA DO DNA

1 componente - Acar

A ESTRUTURA DO DNA

2 componente Base nitrogenada

A ESTRUTURA DO DNA

3 componente Grupamento Fosfato.

A ESTRUTURA DO DNA

Estrutura secundria configurao tridimensional.

-Estrutura em dupla hlice. -Ligaes fosfodister. -Pontes de Hidrognio.

-Complementariedade de bases:
A -T G -C

Dogma Central da Biologia Molecular

DNA Duplicao Genoma

Transcriptase Reversa

Transcrio

RNA

Transcriptoma

Traduo Proteoma Protena

Extrao de DNA
No geral, toda extrao de DNA se baseia em 4 etapas bsicas: 1. Lise das membranas lipdicas; 2. Purificao do DNA ; 3. Precipitao do DNA; 4. Reidratao do DNA.

PCR: Polymerase Chain Reaction (Reao em cadeia da polimerase)

O processo de PCR foi inventado por Kary Mullis no incio da dcada de 80 atribudo o Premio Nobel da Qumica pelo seu trabalho. um mtodo de amplificao (de criao de mltiplas cpias) de DNA sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactria) ou leveduras.

PCR: Polymerase Chain Reaction

1. Desnaturao (94-96C, 30-600 segundos). Durante a desnaturao, a cadeia dupla do DNA separada em duas cadeias simples. A DNA polimerase estvel a altas temperaturas pois obtida de organismos que vivem em ambientes extremos (extremfilos). A DNA polimerase mais usada a Taq polimerase (obtida de Thermus aquaticus). 2. Annealing (emparelhamento, pareamento, hibridizao) (45-80 C, 30-120 segundos). Durante o emparelhamento, os iniciadores (primers) ligam-se ao DNA de cadeia simples e a DNA polimerase liga-se aos iniciadores emparelhados. 3. Alongamento (polimerizao) (65-80 C, 30-120 segundos). Durante o alongamento, a DNA polimerase cria a cadeia de DNA complementar medida que percorre o DNA de cadeia simples, incorporando desoxirribonucletideos presentes na reao. Aps cada ciclo, a quantidade de DNA duplica. Assim, aps mltiplas ciclos, o aumento da quantidade de DNA exponencial de base 2.

Reao em cadeia da polimerase (PCR)

PCR amplifica DNA

1 ciclo
2 ciclo 3 ciclo 4 ciclo

5 ciclo

6 ciclo

Que regentes so necessrios para uma reao de PCR? REAGENTES: 1. 2. 3. 4. 5. 6. DNA polimerase; Buffers (Soluo-Tampo) MgCl2 Primers DNA Molde dNTPs

Como eu visualizo o material amplificado?

Eletroforese

Eletroforese de DNA

5ul

Anlise da Sequncia de DNA

acar

nucleotdeo

base

fosfato

G C A T

ABI 3700 Applied Biosystems

Deteco a laser

Aula prtica: Extrao de DNA

1. Utilizar 400 L de TEM soluo de homogeinizao, 40 L de 10% SDS e 8 L de proteinase-K 2. Incubar 55C por 1h 3. Adicionar 300 L de NaCl (soluo saturada) 4. Vortex por 30 segundos 5. Centrifugar por 30 min 14.000 g 6. Transferir o sobrenadante para um tubo novo 7. Precipitar o DNA utilizando um volume de isopropanol e manter a -20C por 2h 8. Centrifugar por 15 min 14.000 g (4C) 9. Lavar o pellet de DNA com etanol 100% (1 mL) e centrifugar por 5 min (14.000 g) 10.Lavar o pellet de DNA com etanol 70% (1 mL) e centrifugar por 5 min (14.000 g) 11.Secar a temperatura ambiente 12.Ressuspender o DNA em 20 L de H2O milli-Q autoclavada 13.Armazenar a -20C