Biologia Molecular e Noes de Biotecnologia

Licenciatura em Cincias Biolgicas

Hibridizao de cidos nuclicos Southern Blot (Edwin Mellor Southern)

Aula 09 Prof. Francisco Filho da Silva IFTO Campus Araguatins

Southern Blot
O Southern blot um mtodo da biologia molecular que serve para verificar se uma determinada sequncia de DNA est ou no presente em uma amostra de DNA analisada.

O mtodo foi batizado com o nome de seu inventor, o bilogo britnico Edwin Southern.

Southern Blot - Etapas

Extrao do DNA
Digesto do DNA com enzimas de restrio Preparo da Sonda

Transferncia Hibridizao
Deteco

Southern Blot
Suponha que haja em um tubo de ensaio,

molculas de DNA contendo um gene de resistncia a uma dada doena em abacaxizeiro (doena fngica).

Agora queremos saber se um feijoeiro qualquer tem uma sequncia parecida. Como proceder para saber?
Pega-se o tubo contendo o DNA do feijo, que neste caso ser todo o genoma, e aquecese a alta temperatura para promover a separao das fitas.

Southern Blot

Tubo 1 - Aquecimento

Tubo 1 sob baixa temperatura agitando por um bom tempo

Em temperatura ambiente h uma tendncia

de reassociao das molculas.

A no pareia com B, C e D. A e A so DNA simples fita

Southern Blot
Quero saber se no feijoeiro tem sequncia de

DNA (gene) homloga ao do abacaxi.

Ocorrer um pareamento entre homlogos,

formando molculas hbridas.

Southern Blot
Como visualizar se houve hibridizao ou

no? Ao invs de se trabalhar no tubo, separa-se o DNA em gel de agarose. DNA de milhares de clulas do feijo (mesmo DNA em todas as clulas.

Muitas bandas de DNA

Southern Blot
Depois de separado no se pode realizar o

processo de pareamento (est dupla fita). No se pode aquecer o gel...e agora, o que fazer? Utiliza-se reao qumica com soluo alcalina no gel aps eletroforese, de maneira que as ligaes se separam..
Desnaturao O gel onde foi feita a eletroforese de DNA tratado com uma soluo alcalina (tipicamente contendo hidrxido de sdio) para promover a desnaturao da dupla fita do DNA, separando-a em simples fitas. A desnaturao necessria porque o DNA nas etapas seguintes ir aderir membrana e ir parear com a sonda.

Southern Blot
Ainda no d para juntar com o DNA do

abacaxi. Transfere-se todas as bandas para uma membrana (bandas separadas. Realiza-se a transferncia por meio do fluxo de um tampo apropriado.
Transferncia do DNA para uma membrana Uma membrana de nitrocelulose (ou, alternativamente, nylon) posta sobre o gel. Uma presso aplicada uniformemente sobre o gel (tanto usando-se suco, ou pondo-se sobre a membrana uma pilha de toalhas de papel com um peso em cima). Isso faz com que o DNA passe do gel para a membrana, onde ele se adere.
Corte lateral do gel

Southern Blot
Coloca-se uma membrana especial sobre o

gel. Todas as molculas de cada banda migrar para a membrana.

Quando olhar para a membrana, teremos

uma rplica do que estava no gel. Uso o sistema de fluxo. Para tanto, coloca-se um papel poroso embebido em soluo.

Southern Blot

No dia seguinte, teremos uma membrana

contendo bandas com DNA simples fita. Fixa-se essas bandas na membrana por meio de tratamento trmico (80 oC por uma hora) ou uso UV. Este processo chamada de CROSS LINK. No vejo nada na membrana. O DNA, mesmo em temperatura ambiente, no se reassciam pois est preso membrana.

Southern Blot
Agora, pode se pegar o DNA do abacaxi

(sonda) e colocar dentro de um recipiente com uma soluo e a membrana.. Antes de adicionar a sonda, ela deve ser marcada de forma permitir a identificao de molculas hbridas posteriormente. Pode ser utilizado marcao radioativa (32P). Pode fazer marcao no radioativa tambm.
FEIJO
Membrana

Abacaxi

Southern Blot

Southern Blot
Posteriormente, quando lavar a membrana,

expe-se a um filme de raio X e obtm-se uma banda preta (radioativa).

Implica dizer que o DNA do abacaxi ligou-se

ao DNA do feijoeiro (h homologia).

Trabalhamos portanto com todo o genoma do

feijoeiro e apenas uma sequncia de DNA do abacaxi.

Southern Blot- Repetir Passos

1. Extrao do DNA
2. Digesto com enzimas de restrio 3. Separao do fragmentos por eletroforese 4. Desnaturao qumica do DNA 5. Transferncia do DNA para a membrana (precisa ter condies para manter o DNA simples fita soluo alcalina desnaturante). 6. Fixao do temperatura). DNA na membrana (alta

Southern Blot- Repetir Passos

7. Bloqueio da membrana com DNA inespecfico. OBS.: aps a transferncia, trato a membrana com DNA de esperma de salmo por exemplo (antes de colocar o DNA sonda). A esse processo de eliminao da demais cargas da superfcie da membrana dar-se o nome de BLOQUEAMENTO. 8. Marcar a sonda com radioatividade ou luminescncia.
9. Desnaturar a sonda termicamente.

Southern Blot- Repetir Passos

OBS.: Agora possvel dar incio ao processo de hibridizao (questo de minutos para se fazer esse procedimento).
10. Hibridizao

OBS.: necessrio diminuir a velocidade de reao para permitir que a sonda encontre o DNA na membrana. Para tanto, trabalha-se a 62 oC. Utiliza-se uma concentrao de sais para facilitar o pareamento (nessa concentrao de sais, qualquer homologia ser mantida a ligao).

Southern Blot- Repetir Passos

11. Lavagem da membrana (no simples)

Normalmente no se faz isso. Trabalha-se com a mesma soluo, s que com uma concentrao de sais menor. As ligaes que no so muito especficas no se mantero.

Southern Blot- Repetir Passos

Se o nvel de homologia baixo e lava-se

com uma concentrao de sais baixa, posso remover tudo. Assim, deve se fazer o ajuste dessa concentrao de sais.

A este processo de ajuste, chama-se ESTRINGNCIA. Alta estringncia alta exigncia de homologia - baixa concentrao de sais > Estringncia - maior concentrao de sais

Southern Blot

Southern Blot

Southern Blot

Northern Blot
Outro tipo de hibridizao entre DNA e

RNA.
Sabemos que existe homologia de genes do

abacaxi no feijo. Ser que este se expressa inibindo o fungo no feijoeiro?

Teremos bastante mRNA no citoplasma

(simples fita). Pode-se extrair estes RNAs e fazer eletroforese (no h necessidade de fazer desnaturao). Em seguida, transfere-se para membrana. O restante do trabalho o mesmo visto anteriormente.

Northern Blot
Forma-se portanto molculas hbridas de

DNA e RNA. Agora, podemos dizer que o gene do abacaxi se expressa no feijoeiro inibindo o fungo. OBS.: o DNA sempre ser a sonda.
Por meio desta tcnica, posso saber quanto,

quando e onde o gene se expressa.

Northern Blot

Northern Blot - resumo

O nome Northern vem pela similaridade com a tcnica proposta por Southern. Proposto por James Alwine 1977 Em vez de DNA, trabalha com RNA Atua no transcriptoma dependente do tecido da planta dependente da idade da planta A extrao de RNA bem mais trabalhosa Existe

RNAse em toda parte gua, mos..... Interessante para checar se um determinado gene est sendo expresso em um determinado tecido... Muito usado para estudo de expresso gnica