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Apuntes Cromatografia IA 2012B 16

III. MTODOS DE IDENTIFICACION Y CUANTIFICACIN



Anlisis cualitativo

Es importante apreciar que la cromatografa no identifica en forma automtica los diversos picos que se obtienen en
una curva de elucin. El mtodo ms simple para identificar un pico cromatogrfico consiste en comparar su tiempo
de retencin con el de una muestra conocida del compuesto cuya presencia se sospecha. Para un conjunto de
condiciones experimentales fijas, si un compuesto tiene el mismo tiempo de retencin que el estndar, entonces
ambos son el mismo compuesto.
Los procedimientos para identificacin de los picos cromatogrficos podemos dividirlos en dos categoras:
Identificacin Cromatogrfica
o Por Datos de Retencin
o Por Serie Homlogas (ndices de Retencin de Kovats)

Identificacin No Cromatogrfica
o Identificacin por:
Adicin de Estndar
Formacin de Derivados
Sustraccin de un Componente
Identificacin con Tcnicas Auxiliares: UV, IR, MS, RMN

ndice de retencin de Kovats.
El ndice de Kovats relaciona el volumen de retencin Vr ( el tiempo de retencin tr) de un compuesto desconocido
con otro que contiene n-hidrocarburos y que eluye antes y despus que l. Para cada serie de parafinas existe un
ndice dado por:
I = 100 n
n = nmero de moles de tomos de carbono de una parafina dada.
El ndice de retencin de un compuesto desconocido es calculado de:

x = nmero de carbonos del compuesto eluido antes que el desconocido;
Vn
u
= volumen de retencin corregido del desconocido (u);
Vn
x
= volumen de retencin corregido del hidrocarburo eludo antes del desconocido;
Vn
x+1
= volumen de retencin corregido del hidrocarburo eludo despus del desconocido;
x + 1 = nmero de carbonos del compuesto eludo despus que el desconocido;



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EJEMPLO
Una serie de alcoholes de cadena recta se aliment a una columna de carbowax. Se encontraron los siguientes
tiempos de retencin:
Substancia tr, segundos
butanol 42
hexanol 73
octanol 135
decanol 250

Una substancia desconocida que se sabe es un alcohol de cadena recta se inyecta en la misma columna en
condiciones idnticas a los estndares. Su tiempo de retencin es de 100 s. Qu es la muestra desconocida?

SOLUCION
Se construye una grfica de log(tr) vs. Nmero de tomos de carbono en el alcohol. En la grfica se observa que la
muestra desconocida es heptanol.


Anlisis Cuantitativo
Los mtodos cuantitativos en cromatografa se basan en el hecho de que, manteniendo constantes las
condiciones del experimento, el rea bajo un pico cromatogrfico es proporcional a la concentracin del componente
que representa. Nosotros discutiremos 4 mtodos, en orden creciente de complejidad y exactitud:

Normalizacin de rea
Normalizacin de rea con Factores de Respuesta
Estandarizacin Externa
Estandarizacin Interna

La aplicacin de estos mtodos es indistinta para cromatografa de lquidos o de gases. Para la cuantificacin de
compuestos en un cromatograma, se considera de forma general que el rea de bajo de un pico es proporcional a su
concentracin. Existen varias tcnicas para la determinacin del rea de un Pico Cromatogrfico:


1.6
1.7
1.8
1.9
2.0
2.1
2.2
2.3
2.4
3 4 5 6 7 8 9 10 11
Alcoholes de cadena recta
l
o
g
(
t
r
)
No. tomos C
La muestra desconocida
es heptanol
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INTEGRACIN MANUAL
A) Mtodos Geomtricos
Triangulacin: En esta tcnica se trazan lneas tangentes a cada lado del pico. La altura se mide desde la
lnea base hasta la interseccin de las dos tangentes. El ancho se mide tomando la interseccin de las dos
lneas tangentes con la lnea base. Luego se utiliza la frmula A=1/2*Altura del Pico* Base del Pico. Las
limitaciones de esta tcnica estn en el trazado de las lneas tangentes, un pequeo error al trazar las
tangentes puede afectar la medida de la altura.

Altura por ancho a la mitad de la Altura:

B) Mtodos Mecnicos
Planimtricos
o Corte y Pesada: Esta tcnica requiere recortar el pico del cromatograma, luego pesarlo en una
balanza analtica. El recorte y pesada depende mucho de la habilidad del operdor. Pueden
introducirse errores por cambios en la humedad del papel, la grasa de las manos del operador,
homogeneidad del papel. Generalmente se recomienda utilizar una fotocopia del cromatograma
para no destruir el original.

INTEGRACIN AUTOMTICA
A) Electromecnica
B) Electrnica



1. NORMALIZACIN DE REAS

Este es un mtodo aproximado que debe usarse solo cuando no se requiera de mucha exactitud o cuando no sea
posible utilizar otro mtodo. El mtodo tiene las siguientes caractersticas:

a) Supone que el rea de un pico es proporcional a la concentracin del componente.
b) Supone que el detector responde por igual a todos los compuestos.
c) Todos los componentes deben eluir para tener una exactitud aceptable.
d) Se utiliza cuando no se tienen estndares o cuando la muestra es desconocida.

Si aceptamos que el rea de un pico es directamente proporcional a la concentracin del componente que produjo
ese pico, entonces estamos aceptando que el porcentaje de rea es tambin igual al porcentaje de concentracin:





EJEMPLO:

Una muestra que contena nicamente hexano, heptano, undecano y tetradecano fue inyectada a un cromatgrafo
obtenindose los resultados que se muestran en la tabla:

Sustancia Hexano heptano undecano tetradecano
Area del pico, cm
2
32.6 46.8 73.8 84.9

Calcule el % en peso para cada componente
% Componente i =
Arco

Arcos
1uu

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ACTIVIDAD 4.1.

SOLUCION
reas = 32.6 + 46.8 + 73.8 + 84.9 = 238.1
% hexano = (rea hexano/ reas)x100 = (32.6/238.1)x100 = 13.7
% heptano = 19.6
% undecano = 31.0
% tetradecano = 35.7




Una muestra se analiza por cromatografa de lquidos con la finalidad de cuantificar los componentes que la forman.
Despus de inyectar una serie de estndares se encontraron los siguientes compuestos en la muestra:

Pico Compuesto rea, u.a. %
1 cido lctico 654
2 cido actico 533
3 cido ctrico 205
4 cido fumrico 268
5 cido succnico 918
6 cido frmico 488


2. ESTNDAR EXTERNO

En este mtodo se inyecta primero un estndar conocido al cromatgrafo, para poder obtener el tiempo de retencin
de la sustancia que se desea identificar y el rea del estndar. Luego, en una segunda inyeccin se introduce la
muestra al cromatgrafo. Relacionando el rea del estndar (reaSTD) con el rea del problema (reaPROB) se puede
obtener la concentracin del problema (ConcPROB), no olvidando que la concentracin del estndar se conocer
desde el principio.

Primera inyeccin: Estndar puro. Sirve para obtener tr y el rea del estndar
Segunda inyeccin: Problema

El orden de las inyecciones no importa, simplemente se necesitan tener ambos cromatogramas, para el estndar y
para la muestra problema. Las caractersticas del mtodo son:

a) Es importante notar que el estndar y el problema deben ser la misma sustancia.
b) Para cada sustancia, se necesita inyectar un estndar diferente.
c) Se debe tomar en cuenta el volumen de inyeccin en cada corrida.

Para calcular la concentracin del problema, la cual siempre ser nuestra incgnita, partiremos del siguiente
principio:


STD
STD
PROB
PROB
rea
Conc
rea
Conc
=
a)

Definiendo el Factor de Respuesta Absoluto (FRA), se tiene:


b)

STD
STD
STD RA
rea
Conc
F =
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ACTIVIDAD 4.2.
Esta ecuacin est relacionada al estndar. Ahora relacionando la ecuacin a) y b) obtenemos la siguiente
ecuacin:





EJEMPLO:
Se inyectan 2 g de benceno puro en un cromatgrafo de gases, y se produce un pico de 25 cm
2
de rea. Cuando
se inyectan 1.36 g de muestra desconocida al mismo cromatgrafo en las mismas condiciones, el rea del pico de
benceno es 5 cm
2
. Cuntos g de benceno hay en la muestra? Qu porcentaje de benceno tiene?

SOLUCION
(STD)
RA
F =
estndar del o bencen rea
estndar la en benceno g


0.4 muestra) la de )(rea 08 0
cm 25
2
2
= =
RA
F ( .

El porcentaje de benceno en la muestra se calcula simplemente como:


%benceno =
gbenceno
g muestra
100 =
0.4
1.36
100 = 29 .41 %




Para determinar la cantidad de cocana presente en una grapa decomisada a un sujeto, se prepar primero un
estndar pesando 0.050g de cocana pura y diluyendo hasta 100 mL en un solvente apropiado (HCl diluido). Se
tomaron 5 mL de esta solucin, se diluyeron nuevamente hasta 50 mL y se inyectaron 20 L de esta ltima dilucin
al cromatgrafo, obtenindose un rea de 9705 UA. Posteriormente se prepar la muestra pesando 605 mg de
cocana decomisada y diluyendo a 100 mL. Se tomaron 10 mL de esta solucin y se llevaron a 100 mL, luego se
tomaron 10 mL de esta solucin y se llevaron nuevamente a 100 mL. Al inyectar 10 L de la ltima dilucin al
cromatgrafo se obtuvo un rea de 3065 UA para el pico de cocana. Cul es el porcentaje de pureza en la grapa
decomisada? R= 52.2 %



3. ESTNDAR INTERNO

Este mtodo es ms exacto que los anteriores, porque la muestra y el estndar se corren juntos en una sola
inyeccin. El rea de los picos desconocidos se compara con el rea del pico estndar y esto nos permite calcular la
composicin de la muestra desconocida.

Las caractersticas para ste mtodo son:

a) El estndar debe ser una sustancia distinta a la que se desea determinar.

Si los detectores empleados en cromatografa fueran igualmente sensibles a todos los solutos, las reas relativas de
los picos seran iguales a las concentraciones relativas de cada componente. Sin embargo, la sensibilidad del
Conc
piob
=(F
RA
)(Aiea
Piob
)
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detector difiere de un compuesto a otro. Una forma de expresar esto es utilizando un factor de respuesta relativo
(FRR).


(con los estndares
puros)




(con la muestra adicionada)



Notar que la ecuacin anterior es idntica a la empleada en el mtodo del estndar externo, solamente que ahora
aparece el factor FRR para compensar el hecho de que el detector no responde por igual a todos los componentes.

Para entender cmo funciona el factor de respuesta, supongamos que por el detector pasan dos solutos, A
y B, que estn presentes en la misma concentracin. Al soluto A le llamaremos estndar y el soluto B ser el
problema. Si el detector respondiera por igual tanto a A como a B, las dos reas deberan ser iguales. Sin embargo,
vamos a suponer que, por alguna razn, el detector es menos sensible para B que para A. Entonces, aunque pase
la misma cantidad de B por el detector, el rea del pico de B ser menor. Esto se ejemplifica en la figura 24. Si
nosotros no consideramos esta diferente sensibilidad del detector, vamos a incurrir en un error de clculo muy grave.




Figura 24. Cromatogramas de un estndar A y de un soluto problema B, presentes en la
misma concentracin. El cromatograma de la derecha muestra lo que ocurre cuando el
detector es menos sensible a B que a A.

Continuando con nuestro ejemplo, quiere decir que el cromatgrafo siempre reportar para B reas ms
pequeas de lo que realmente debera obtenerse. Para convertir esta rea pequea en un valor ms grande (el real)
necesitamos multiplicarla por un nmero mayor que la unidad. Este nmero es precisamente el factor de respuesta
FRR. Por el contrario, si el detector respondiera exageradamente a B, producira un rea que no corresponde al valor
real de B, sino que es demasiado grande. Entonces, tendramos que corregir esa desviacin multiplicando el rea
exagerada por un nmero ms pequeo que la unidad. Este nmero, otra vez, es FRR. En resumen:

Si FRR > 1 el detector responde ms al estndar que al problema
Si FRR < 1 el detector responde ms al problema que al estndar
b) En el mtodo del ESTANDAR INTERNO se requieren dos inyecciones:

Primera inyeccin: Estndares puros. Sirve para calcular el factor de respuesta FRR.
Segunda inyeccin: Problema + estndar (juntos!).

Conc
piob
=(F
RR
)(Aiea
Piob
) I
Conc
STB
A
STB
]
F
RR
=
F
RA
Pioblema
F
RA
Estnuai
=
Conc
piob
A
piob
Conc
STB
A
STB

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ACTIVIDAD 4.3.
El mtodo se llama as porque en la segunda inyeccin se inyectan juntos tanto el estndar como el
problema. Por cierto, el estndar debe ser una sustancia diferente a la que se desea cuantificar en el problema. El
mtodo quedar ms claro resolviendo un ejemplo.

c) El volumen entre ambas inyecciones no es importante (pues se cancelan)

EJEMPLO:
Un estndar que contiene yoduro 8x10
-8
M y p-diclorobenceno 6.4x10
-8
M se introduce a un cromatgrafo. Se
encuentra que la respuesta del detector es la siguiente:

Componente Concentracin, mol/lt Area
I
-
8x10
-8
1065
p-DB 6.4x10
-8
1500

Luego, se inyecta una muestra problema que se sabe contiene yoduro. Junto con la muestra se inyecta una
cantidad conocida de p-DB (9.3X10
-7
M) y se corre el cromatograma. Se obtienen los siguientes datos:

Componente Concentracin, mol/lt Area
I
-
? 3181.09
p-DB 9.3x10
-7
2629

Calcular la concentracin de yoduro en el problema.
SOLUCIN
Observamos que hay dos inyecciones, y que en la segunda de ellas se introdujo el problema junto con un estndar.
Esto nos da la pista de que se trata de un problema de estndar interno.
El primer paso es calcular el factor de respuesta FRR con los datos de la primera inyeccin:

DB - p
DB - p
RR
I
I
rea
Conc
) (F =
rea
Conc

1500
10 6.4
) (F =
1065
10 8
-8
RR
-8


Resolviendo FRR = 1.76

Obsrvese que el detector responde 1.76 veces ms al p-DB que al yoduro.

El segundo paso es simplemente calcular la concentracin del problema, con los datos de la segunda inyeccin, por
supuesto:

El p diclorobenceno es el estndar interno

2629
10 9.3
(1.76) =
3181.09
Conc
-7
I
-


Resolviendo, Conc. I
-
= 1.98 x 10
-6
M




La determinacin de herbicidas e insecticidas clorados en alimentos, agua potable, suelo, etc. pueden ser
determinados empleando cromatografa de gases con un detector de captura de electrones. El 4,4-DDT fue
determinado en una muestra de 5.0 gr del suelo de una granja donde se empleo el insecticida, la muestra se coloca
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dentro de un extractor y se reflujarn 50 ml de hexano para extraer el plaguicida durante 1 hr. A 1.0 mL del
extracto se le aade 1.0 ml de una solucin de Adrin (0.001g/ml), de esta solucin se inyecta 1.0 L en el
cromatgrafo y las reas resultantes para cada insecticida fueron de: 4,4-DDT= 13454 y Adrin= 2335682 U.A. Una
mezcla estndar comercial que contiene 100 pg/ml de Adrin y 400 pg/mL de 4,4'-DDT fue inyectada en el mismo
cromatgrafo empleando las mismas condiciones que para la extraccin, para esta solucin se reporta una rea de
1273 para el Aldrin y 23455 U.A. para el 4,4'-DDT. Calcule la concentracin del 4,4'-DDT en la muestra de suelo (en
pg/gr de suelo) R= 12.5 pg/g





































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IV. INSTRUMENTACIN EN CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFA DE LQUIDOS

En la cromatografa de lquidos, los componentes de una mezcla se separan debido a que existen
equilibrios lquido-lquido (equilibrios de reparto) para cada soluto. La fase mvil es un lquido, mientras que la fase
estacionaria es un lquido fijado sobre un soporte slido. Se acostumbra distinguir dos tipos de cromatografa
lquido-lquido:

Cromatografa de fase normal Fase mvil orgnica (no polar), fase estacionaria acuosa (polar)
Cromatografa de fase inversa Fase mvil acuosa (polar), fase estacionaria orgnica. Es la ms empleada.

Cromatografa de lquidos clsica

En esta tcnica el analito y el eluyente se alimentan a la parte superior de una columna que funciona por
gravedad. La columna es simplemente un tubo de vidrio de 10-30 cm de longitud y 1 cm o ms de dimetro,
empacado con la fase estacionaria. Un tapn de lana de vidrio evita que el empaque caiga, mientras que una llave
regula el flujo de eluyente. Generalmente los solutos se recogen en forma manual al salir de la columna, o por medio
de un colector automtico de fracciones. La cantidad de soluto en cada fraccin se determina por titulacin,
espectrofotometra o algn mtodo de anlisis. La tcnica es apropiada para separar grandes cantidades de
muestra (mg o g) y es muy importante porque permite separar compuestos que no son voltiles (no podra usarse
GC) o que se destruyen fcilmente con el calor.

Cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC)

Es la tcnica cromatogrfica ms empleada actualmente en la que la fase mvil es un lquido. Las siglas en
ingls provienen de high performance liquid chromatography. En HPLC, el eluyente se hace pasar a gran velocidad
a travs de una columna empacada utilizando una bomba. La figura 16 es un diagrama esquemtico de las partes
que componen a un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin.




Figura 16. Esquema de un aparato de HPLC.
La bomba

Las bombas impulsan la fase mvil hacia el inyector. Es el mdulo que entrega el solvente de una manera
exacta (0.5%a 1.0%) y precisa (0.075%a 0.3%) al resto del cromatgrafo. La calidad de las bombas empleadas
en HPLC es muy importante para garantizar la estabilidad en el flujo de eluyente. Generalmente se utilizan bombas
de pistn, que producen un flujo constante (0.01 a 0.5 mL/min, 0.1 mL/min y mayores) y presiones muy elevadas, de
hasta 400 atm (aproximadamente 6000 psi). Es comn trabajar con dos bombas reciprocantes, lo que mejora la
estabilidad del flujo. Su funcionamiento se basa en que mediante el movimiento de un pistn y un sistema de
vlvulas que alternativamente se abren y se cierran, es posible enviar al sistema cromatogrfico de forma continua
un determinado volumen de lquido. Ajustando la distancia de desplazamiento del pistn, se puede ajustar a voluntad
el volumen de lquido que enva la bomba. Son hechas de: Acero Inoxidable, Titanio, Zafiro, rub y Tefln.
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Figura 17. Esquema de una y dos bombas reciprocantes

El inyector

Es el dispositivo que permite introducir la muestra en solucin sin interrumpir el flujo de solvente a travs del sistema:

Debe ser fcil de operar.
Inerte al ataque qumico y soportar altas presiones.
Preciso en cuanto a la cantidad de muestra introducida en el sistema.
No debe provocar dilucin importante de la solucin inyectada.
En casos especiales operar con altas temperaturas y ser biocompatible.

La muestra debe inyectarse con una jeringa dentro de una vlvula sin derramar lquido. Antes de entrar a la columna,
la muestra pasa por un filtro muy fino para remover el polvo y las partculas que podran contaminar a la columna o
daar la bomba.

Las vlvulas de inyeccin generalmente se disean de modo que entreguen un volumen constante de muestra (20-
50 L) independientemente de la cantidad inyectada. La vlvula tiene un bucle o lazo de volumen conocido, que al
llenarse de muestra proporciona la cantidad deseada al cromatgrafo.




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Figura 18. Vlvula de inyeccin

Los inyectores automticos tienen como caractersticas principales:

Volumen de Inyeccin 1 L a 2000 L.
No existe contaminacin cruzada con muestras inyectadas anteriormente.
Capaz de soportar altas presiones y en ocasiones temperatura.
Baja dispersin de la muestra.
Inyecciones programadas en secuencia.
Fcil de operar.
Inerte.
Preciso.
No provoca dilucin de muestra.

Fases mviles
El orden de elucin de los solutos en HPLC depende de la polaridad. En una separacin de fase normal el soluto
menos polar pasa proporcionalmente menos tiempo en la fase estacionaria polar y es el primero que eluye de la
columna. En una separacin de fase inversa, el orden de elucin es el inverso, y e soluto que primero sale es el mas
polar. Una caracterstica importante de los aparatos HPLC es la presencia de varios depsitos de disolvente, lo cual
permite variar de forma rpida y fcil la composicin y la polaridad de la fase mvil.

Elucin en gradiente: Uso de una fase mvil cuya composicin cambia de forma sistemtica de un disolvente ms
dbil a otro ms fuerte durante la separacin.
Elucin isocrtica: Uso de una fase mvil cuya composicin permanece constante durante la separacin.


Figura 19. Tipos de elucin en CL.

El reservorio de fase mvil (depsito del disolvente) es un frasco de laboratorio de buena calidad. Est hecho de
vidrio o un polmero resistente con tapa y un filtro de acero de 2 a 10 m de porosidad.

Propiedades de los Solventes:
Solvente apropiado para HPLC:
Alto poder de solubilizacin de las muestras.
No usar solventes con alto grado de reactividad.
Compatibilidad con el Detector Utilizado.
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Libre de Impurezas.
Se prefieren solventes de punto de ebullicin intermedio.
Evitar solventes que por sus caractersticas representen un riesgo para el operador.
Depender de lo siguiente:
El mtodo cromatogrfico.
Longitud de onda seleccionada para los componentes en la mezcla.
La longitud de onda de corte.

Disolvente
Longitud de onda de corte,
nm
Uso
Tolueno 285 No se emplean en HPLC con
detector UV Acetona 330
Acetonitrilo 210 Altamente utilizados en HPLC
con detector UV Metanol 210

Preparacin de Fase mvil:
Empleo de materiales volumtricos limpios.
Tener en cuenta la posible contraccin de volmen al mezclar agua y solvente orgnico (no es correcto aforar).
Ajuste de pH, parmetro crtico en la retencin de solutos ionizables (medir antes de adicionar modificador
orgnico):
o El pH de la solucin aumenta con la incorporacin de un modificador orgnico
o A valores de pH > de 7.5 disolucin de slice base de columnas
o A pH menor de 2 se hidroliza la unin entre la slice y la fase enlazada
Filtracin: filtros de 0.45 o 0.22 micras.
o Las partculas presentes pueden ocasionar:
Filtros y tuberas del instrumento.
Acelerar desgaste de sellos y rotores del inyector.
Afectar el movimiento normal de vlvulas de entrada y salida de bombas.
Material de relleno de columnas (entre 3 y 10 micras) filtro perfecto para todo material introducido en
suspensin.
La seleccin de la membrana depende de su compatibilidad con el solvente.
Se recomienda al filtrar, descartar los primeros mL que suelen arrastrar componentes de las membranas
(plastificantes y antioxidantes).
Soluciones a inyectar tambin deben filtrarse:
Debe considerarse posible contaminacin debida a componentes del filtro.
Posible prdida de analito por adsorcin.
Si la cantidad es muy pequea puede reemplazarse filtracin por centrifugacin en tubos adecuados.

Membrana
Tipo de disolvente
Acuoso Acuoso/Orgnico Orgnico
Celulosa regenerada R
ster de celulosa R NR NR
Nitrato de celulosa R * NR
Floururo de polivilideno R R R
Nylon R R R
PTFE NR NR R
Tefln NR NR R
NR = No recomendable R = Recomendable
* Usar como mximo con 30 % de solvente orgnico


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Antes de ser utilizados, los disolventes de la fase mvil deben ser tratados para eliminar los gases disueltos, tales
como N2 y O2, y las pequeas partculas de polvo, ya que estos producen burbujas cuando la fase mvil penetra en
el detector, distorsionando la seal de este. Una de las formas ms frecuentes para desgasificar es burbujeando un
gas inerte, como He, de baja solubilidad en la fase mvil.

Los gases disueltos en la fase mvil pueden provocar inconvenientes:
Liberacin de burbujas en el cabezal de la bomba, caudal irregular, si es muy grave, al trabajar en vaco la
bomba, pueden daarse sellos y pistones
Liberacin y formacin de burbujas en la celda del detector, por descompresin de la fase mvil, provocan
oscilacin en la lnea base y aparicin de picos fantasma. Precaucin: Usar restrictores que evitan la cada
de presin y evitan formacin de burbujas a la salida del detector
Oxgeno disuelto puede provocar:
Prdida de sensibilidad en los detectores de fluorescencia, el oxgeno contribuye con el proceso de
decaimiento de la eficiencia fluorescente de la molcula por colisin con las molculas excitadas del analito.
Este efecto vara con el tipo de compuesto.
Alta corriente residual en detectores electroqumicos, trabajando en forma reductiva el oxgeno consume
parte del potencial aplicado incrementando el rudo de lnea base.
Oxidacin de analitos.
Aumento en la lnea base de los detectores UV. El incremento es notorio a bajas longitudes de onda y
prcticamente deja de tener importancia a longitudes de onda mayores a 250 nm.
Este incremento de absorcin depende del tipo de solvente:
El oxgeno interacta de dos modos:
Por absorcin de oxgeno molecular.
Por formacin de complejos inestables con el solvente.
La cantidad de gas disuelto depende de:
Temperatura, presin y Afinidad, por tanto, se puede desgasificar por:
Temperatura.
Burbujeo de un gas inerte.
Ultrasonido.
Vaco.

La columna
Debe estar construida en acero inoxidable para resistir la presin. La columna es un tubo de acero de 10 a
30 cm de largo y 2 a 5 mm de dimetro interior, empacada con la fase estacionaria. Algunos cromatgrafos tienen la
columna en posicin vertical, otros horizontal, y generalmente se encuentra en el exterior del aparato, a temperatura
ambiente.



Figura 20. Ejemplos de columnas cromatogrficas para HPLC
Apuntes Cromatografia IA 2012B 29
Duracin de las columnas:
Muestras limpias: 1000 2000 inyecciones/columna
Muestras complejas, sucias: 200 500 inyecciones/columna
Muestras muy complejas: 50 200 inyecciones/columna
Cuidado de la columna:
Empleo de columnas bien empacadas.
Evitar variaciones sbitas de presin y temperatura.
Usar precolumnas y filtros en lnea.
Realizar pretratamiento de muestras.
Manejar temperaturas menores a 60C.
Usar pH de fase mvil 3-7 (slica).
Eliminar sales.
Almacenar con bajas concentraciones de solventes orgnicos (5-15%).
Fallas comunes en columnas:
Vaco, cuando la fase estacionaria con colapsos del lecho que forman espacios vacos dentro de la columna.
Esto resulta en coleo, un nmero de platos bajo y una resolucin pobre.
Presin elevada, cuando el flujo de lquido a travs de la columna es altamente restringido o detenido debido a
obstruccin de filtros y/o lecho empacado.


La fase estacionaria y el soporte slido

En la cromatografa lquido-lquido, la fase estacionaria es un lquido que se encuentra inmovilizado sobre
un soporte slido. Un soporte muy utilizado es la slice en forma de partculas microporosas irregulares o esfricas.
Las partculas deben ser muy finas (5-10 m de dametro) ya que la resolucin del equipo mejora al disminuir el
tamao de partcula. Tambin pueden usarse partculas de un material inerte (vidrio o plstico) recubiertas con
material adsorbente. Estas ltimas son llamadas partculas peliculares, ver figura 21



Figura 21. Tipos de partculas empleadas en HPLC como soporte slido.

Existen muchas combinaciones posibles entre la fase mvil y la fase estacionaria. Para ayudarnos a elegir
qu tipo de lquidos debemos utilizar, se sugiere consultar la bibliografa especializada.



El detector

Los detectores para HPLC normalmente se basan en alguna de las propiedades fsicas del lquido eluyente
(densidad, ndice de refraccin, etc.) o en alguna de las propiedades del analito (absorcin de luz UV, detector
electroqumico, etc.).


Apuntes Cromatografia IA 2012B 30

Caractersticas:
Fcil uso y mantenimiento y diagnsticos de arranque.
Amplio rango dinmico de respuesta.
Poseer una respuesta lineal y reproducible.
No contribuir a ensanchamiento de banda extracolumnar.
Responder a todos los solutos.
Tener la sensibilidad apropiada (alta).
Poseer una buena relacin seal rudo.
No destrur la muestra.
Tener una constante de tiempo baja.

El detector ms comnmente empleado es el detector de UV. La solucin que sale de la columna pasa por
una celda en forma de Z, donde un rayo de luz ultravioleta atraviesa 1 cm de solucin (figura 22). Muchos
compuestos orgnicos y algunos inorgnicos, as como todos los aromticos, absorben la radiacin UV. La
absorbancia del soluto se convierte en una seal elctrica que despus se grafica. Este tipo de detector es muy
sensible.



Figura 22. Detectores tpicos para HPLC. Izquierda: UV Derecha: Fluorescencia


Otros tipos de detectores empleados en cromatografa lquido-lquido son:

Detector de ndice de refraccin: poco sensible, pero puede emplearse para compuestos que no absorben luz
UV.

Detector electroqumico: muy sensible, solo puede emplearse para solutos que se pueden oxidar o reducir, por
lo que es muy selectivo. El solvente debe ser polar y contener electrolitos disueltos.

Detector de calor de adsorcin: Se basa en la deteccin de los cambios de temperatura que acompaan a la
interaccin de la muestra y la fase mvil con el medio de separacin de la columna. A medida que las molculas
de la muestra van sustituyendo a las del disolvente sobre la superficie del adsorbente, el intercambio va
acompaado de un cambio local de temperatura.

Apuntes Cromatografia IA 2012B 31


Figura 23. Detectores de ndice de refraccin y Electroqumico




TAREA (Moodle). Completar cuadros que aparecen en el link Tarea 7 en la plataforma Moodle.