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Dispense di Biofisica

8.5.

La spettroscopia NMR applicata allo studio delle cellule

Il maggiore vantaggio dell'impiego della spettroscopia di risonanza magnetica nucleare NMR nello studio delle cellule la non invasivit e non perturbazione; questa tecnica permette infatti di compiere sofisticati studi nei sistemi cellulari in condizioni simili a quelle naturali. La spettroscopia NMR appare inoltre particolarmente indicata nello studio delle reazioni che avvengono all'interno delle cellule viventi. Anche se, a grandi linee, le reazioni fondamentali sono state descritte (soprattutto mediante l'impiego di tecniche perturbative ed invasive) e/o ipotizzate, ed il loro insieme appare interpretare la complessit delle cellule, molti aspetti rimangono ancora sconosciuti. Infatti ancora oggi ci sono molte domande su cosa avviene nella realt all'interno della cellula sia isolata sia facente parte dei tessuti. La spettroscopia NMR particolarmente indicata a rispondere a queste domande per le sue caratteristiche di non invasivit e non perturbativit.

Nuclei particolarmente interessanti nello studio delle cellule sono 13C, 31P in quanto, oltre a presentare degli spettri particolarmente semplici, sono fondamentali nello studio del metabolismo. Il 13C, la cui abbondanza isotopica 1,1 %, presenta degli spettri caratterizzati da chemical shifts che si estendono in un intervallo di 200 ppm, cio molto maggiore dei 10 ppm, del 1H. Anche nel caso del 13C, atomi di carbonio differenti di una biomolecola assorbono in posizioni diverse (vedi ad esempio la Fig. 8.46. dove riportato lo spettro). L'introduzione di una molecola marcata con questo isotopo in una particolare posizione, permette di seguire il destino di tale atomo nei suoi passaggi in differenti molecole nel corso delle varie reazioni cellulari. In modo analogo possono essere impiegati il 2H o il 19F. L'effetto isotopico praticamente insignificante nel caso del 13C, mentre l'impiego del 2H pu portare a perturbazioni non trascurabili Nel caso del 1H del 31P a causa dell'abbondanza isotopica, non c' la necessit di marcare con questi nuclei le biomolecole da studiare. In particolare, il 31P, presente in un numero relativamente ristretto di composti importanti per il metabolismo della cellula, quali ATP, ADP, fosfocreatina, esteri fosforici (ad esempio fruttosio 1-fosfato), fosfato inorganico, d origine a segnali notevolmente intensi, che permettono di seguire la concentrazione di questi composti in cellule viventi nonch in tessuti ed in vivo (vedi, ad esempio, lo spettro dei composti del fosforo, particolarmente quelli ad alta energia, presenti nel tessuto cerebrale, Fig. 8.47.). La presenza di fosfato inorganico, formato per idrolisi dei composti fosforati ad alta energia, fonte, inoltre, di interessanti informazioni. Infatti lo ione PO3-4 protonato in modo diverso in funzione del pH. Ai valori di pH normalmente caratterizzanti la cellula predominano le specie H2PO-4 e HPO=4 (pKa dello ione H2PO-4 7,21). Poich tali specie sono caratterizzate da un diverso chemical shift, esse, a causa del rapido scambio dei protone, presentano una unica banda il cui chemical shift una funzione del pH (vedi Fig. 8.48.). Perci una semplice misura del chemical shift del fosfato inorganico fornisce una accurata misura del pH; inoltre, a causa della diversa suscettivit magnetica dell'ambiente intra ed Biofisica e Tecnologie Biomediche: Capitolo 8 Caratterizzazione biofisica di singole cellule 1

Dispense di Biofisica extracellulare, il chemical shift di nuclei come il 31P ed il 19F nei due diversi ambienti apprezzabilmente diverso e ci permette di calcolare in una unica misura NMR il pH sia intra che extracellulare.

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In particolare, la spettroscopia NMR utile nello studio della glicolisi e del ciclo di Krebs all'interno delle cellule, utilizzando biomolecole marcate con 13C e seguendo sia la comparsa del tracciante nei composti intermedi e sia, soprattutto, misurando la velocit delle reazioni a cui partecipano questi composti. E possibile eseguire questo tipo di misura in modo corretto solo mediante la spettroscopia NMR che permette di misurare in tempo reale, e in modo non

perturbativo, il decorso di queste reazioni. Altri metodi, infatti, di qualsiasi natura, che prevedono l'estrazione di questi composti dalle cellule, e che necessariamente richiedono tempi superiori al secondo, portano a risultati non affidabili. In particolare, ci sono tecniche NMR, come il trasferimento della magnetizzazione, che possono permettere di misurare in vivo reazioni che avvengono con costanti di tempo dell'ordine di tempi di frazioni di secondo o secondi. Il ruolo dei NMR nello studio del metabolismo appare chiaramente dalla Fig. 8.49., dove riportato lo spettro del 31P presente nelle cellule dei tessuti di un braccio prima e dopo un intenso esercizio fisico. Gli spettri (a) e (b) indicano chiaramente che, al termine dell'esercizio fisico, la fosfocreatina notevolmente diminuita, lo ione fosfato aumentato, mentre l'ATP rimane praticamente costante. In parallelo, il pH scende da 7,0 a 6,4 durante l'esercizio fisico. Infatti, nel corso di questo esperimento la formazione di ATP attraverso la glicolisi, con la conseguente formazione di acido lattico, insufficiente e vengono intaccate le riserve di fosfocreatina presenti nel muscolo utilizzato per convertire l'ADP in ATP. Negli spettri (c)-(e) Biofisica e Tecnologie Biomediche: Capitolo 8 Caratterizzazione biofisica di singole cellule 3

Dispense di Biofisica si pu notare il lento restaurarsi delle condizioni iniziali durante il periodo di riposo successivo all'esercizio fisico. Nel caso di pazienti con la sindrome di McArdle, caratterizzata da una notevole diminuzione dell'attivit fosforilasica, il consumo di fosfocreatina aumenta notevolmente e quindi, a causa dell'assenza del processo glicolitico, il pH rimane praticamente costante al termine dell'esercizio fisico. In generale, la spettroscopia NMR appare particolarmente adatta a studiare il metabolismo nel corpo e determinare come diete, ormoni e differenti stati fisiopatologici lo influenzino. Letture consigliate ANDREWS, H., (1972), Introduction to mathematical techniques in pattern recognition, Wiley Interscience, New York. BRADBURY, E. M. e NICOLINI, C., (curatori), (1986), NMR in the Life Sciences, Plenuni Press, New York. CHIABRERA, A., NiCOLINI, C. C SCHWAN, H. P., (curatori), (1985), Interaetions between Electromagnetic Fields and Cells, Plenuni Press, New York. EVERSON PEARse, A.G., (1986), Histochemistry Theoretical and Applied, Vol. 1,Churchill Livingstone, London. GRAHAM, R. M., (1972), The Cytology Diagnosis of Cancer, W. B. Saunders Co., London. HOLUBAR, K., KNAPP, N. e WICK, G., (curatori), (1979), Immunofluorescence and related staining tecniques, Elsevier, Anisterdarn. MALAMED, M. R., MENDELSOTIN, M. L. e MULLANEY, P. F., (curatori), (1979), Flow cytometry and sorting. J. Wiley and Sons, New York. NICOLINI, C., (curatore), (1985), Nobel Symposium, Bioscience of the Physical Science Frontiers, Humana Press, New Jersey. NICOLINI, C., KENDALL, F., BASERGA, R., DESAIVE, C., CLARKSON, B. e FRiED, J., (1977), Exp. Cell Res., 106, p. 111. NiCOLINI, C., LINDEN, W. A., ZIETZ, S. e Wu, C. T., (1977), Nature, 270, p. 607. NICOLINI, C., TREFILETTI, V., CAVAZZA, B., CUNIBERTI, C., PATRONE, E., CARLO, P. e BRAMBILLA, C., (1983), Science, 219, p. 176. NICOLINI, C., MIRO, K., BoRuN, T. e BASERGA, R., (1975), J. Biol. Chem., 250, p. 3381. OPPENIIEIM, A. V. e SHAFER, R. W., (1975), Digital signal processing, Prentice-Hall, Englewood Cliffs, New York. RIBEIRO, M. A. V., DA SILVA, S., (curatori), (1985), Thermochemistry and its Applications to Chemical and Biochemical Systems, D. Reidel Publishing Co., Holland. SERNETZ, M. e THAER, A. A., (1973), Fluorescenee techniques in cell biology, Springer-Verlag, Berlin. VAN DE HULST, H. C., (1957), Light scattering by small particles, J. Wiley, New York. WIED, G. L. e BAHR, G. F., (curatori), (1966), Introduction to Quantitative Cytochemistry, Academic Press, New York. WOLF, E. L., (1985), Principles of Electron Tunneling Spectroscopy, Oxford University Press, London.

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Capitolo 13: Strumentazioni biomediche Il progresso della medicina sia a livello di base che clinico stato possibile grazie allintroduzione e al successivo sviluppo di sofisticate strumentazioni biomediche, in gran parte mutuate dalla fisica e dallingegneria, ma in parte introdotte ex novo nellambito di ricerche di natura strettamente biofisica (su strutture e meccanismi molecolari e cellulari) e quindi trasferite alla comunit scientifica nel suo insieme, inclusa quella fisica. In altre parole, lo sviluppo della strumentazione biomedica un esempio concreto della mutua interazione che avviene nellambito della biofisica fra il mondo della fisica, della chimica, dellingegneria, della biologia e della medicina, tesa a caratterizzare come sempre maggiore risoluzione biostrutture presenti a livello della singola cellula del tessuto o delluomo stesso. Le strumentazioni biomediche rilevanti in questo studio si possono suddividere in due classi, una proiettata verso la risoluzione di problemi diagnostici e terapeutici in ambito strettamente clinico (vedi tomografia ad ultrasuoni e a risonanza magnetica nucleare e, in parte, gli stessi laser), e laltra proiettata verso la risoluzione di quesiti ancora aperti sulle strutture ed i meccanismi molecolari che controllano la funzione della stessa cellula (vedi spettrometri e rifrattometri). Entrambi questi tipi di strumentazione elettronica trovano la loro cittadinanza in questo capitolo, anche se il loro collegamento di natura biunivoca, da un lato verso argomenti trattati in diversi capitoli di questo libro, e dallaltro verso corsi clinici del curriculum di studi medici. 13.1 LASER Il LASER (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation) una sorgente luminosa, con caratteristiche uniche, capace di emettere un fascio di luce di elevata direzionalit, monocromaticit, coerenza e brillanza. Queste propriet fanno si che il laser abbia, da un lato, rivoluzionato tutte le tecniche di indagine basate sull'interazione lucemateria, aumentandone enormemente la sensibilit e il campo di applicabilit, dall'altro abbia permesso nuove applicazioni sia nel campo delle scienze fondamentali che della biomedicina. Per comprenderne a fondo le potenzialit applicative opportuno premettere una discussione approfondita delle peculiari propriet del laser in confronto a quelle delle convenzionali sorgenti luminose (descritte nei Capitoli 2, 3 e 5). 13.1.1. Sorgenti convenzionali La luce reale, quella emessa dal Sole, da una fiamma, da una lampada ad incandescenza non schematizzabile come un'onda piana monocromatica, ma come una sovrapposizione di tali onde; si pu dire che la luce proveniente da vari atomi della sostanza radiante costituita da fotoni di differente energia, quantit di moto e polarizzazione. La radiazione emessa da emettitori casuali (i vari atomi di una sostanza quando emettono spontaneamente, in maniera indipendente l'uno dall'altro) costituita da fotoni distribuiti su vari stati energetici e pu essere considerata una radiazione con un certo grado di disordine; la radiazione disordinata spesso descrivibile come un insieme di pacchetti o treni d'onda. Immaginiamo che i fotoni, che costituiscono la radiazione, siano costituiti da gruppetti pi o meno numerosi di fotoni nello stesso stato, o che la radiazione possa essere decomposta in gruppi pi o meno lunghi di onde monocromatiche, piane ecc. Questi gruppetti ordinati sono chiamati treni d'onda. Pi disordinata la radiazione, meno adatta a produrre interferenza, come avviene, per esempio, nel classico esperimento di Young con due fenditure. E importante saper quantificare il grado di disordine di un'onda. La capacit di un'onda di produrre interferenza pu essere misurata dal contrasto tra le varie frange, che chiamato anche visibilit, ed definito da V=(Imax-Imin)/Imax+Imin)
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Per misurare la capacit delle onde luminose a produrre interferenza stato introdotto un concetto importante: il grado di coerenza di un'onda luminosa. Pi alto il grado di coerenza, pi facilmente l'onda crea un sistema di frange con alto contrasto. L'onda piana, monocromatica, polarizzata, l'onda col pi alto grado di coerenza, mentre una diminuzione del grado di coerenza corrisponde ad un aumento del disordine dell'onda. All'altro estremo, in questa scala di disordine, potrebbe stare un'onda del tutto incoerente, assolutamente incapace di produrre interferenza in un esperimento di Young; nella realt, quel che si realizza una variet di situazioni intermedie, associate con vari gradi di coerenza. In senso stretto, non esistono n onde totalmente coerenti n onde totalmente incoerenti ma piuttosto la radiazione realmente emessa da sorgenti naturali. Il grado di coerenza di un'onda luminosa determinato dalla distribuzione dei fotoni nei vari stati energetici; la coerenza totale di un'onda piana monocromatica e polarizzata corrisponde a fotoni tutti nello stesso stato (con la stessa energia, con la stessa direzione della quantit di moto e con lo stesso stato di polarizzazione). In un'onda reale i fotoni occupano differenti stati, alcuni pi popolati, altri meno; pi alta la omogeneit nella distribuzione dei fotoni nei vari stati, pi alto il grado di coerenza della radiazione. Per un fascio di luce emesso da una sorgente questo significa che pi alto il grado di coerenza, pi alta la monocromaticit, pi bassa la divergenza del fascio e pi alto il grado di polarizzazione. D'altra parte, tutti questi parametri possono essere misurati e alterati indipendentemente; usando metodi adatti si pu aumentare la monocromaticit (per esempio filtrando), o la polarizzazione o la direzionalit dell'onda, naturalmente a spese dell'energia iniziale. Il grado di non monocromaticit dell'onda pu essere definito dalla larghezza di banda relativa

= v / v0
dove v0 la frequenza centrale dell'onda e v l'intervallo di frequenze in cui la radiazione analizzata ha componenti (v associata alla distribuzione delle energie dei fotoni = hv). E' da notare che un'onda di durata finita ha comunque una certa non definizione infrequenza; chiamando la sua durata si pu dimostrare infatti che vale la relazione v 1/ (13.1.1.)

partendo dal principio di indeterminazione (vedi Capitolo 2). Il grado di divergenza dell'onda misurato come l'angolo del cono in cui l'onda confinata; pi il fronte d'onda confondibile con un piano e pi piccolo l'angolo di divergenza. Il grado di polarizzazione determinato sperimentalmente mediante un polarizzatore, cio un cristallo speciale che lascia passare solo le vibrazioni in un dato piano. L'ottica pre-laser viene spesso chiamata ottica incoerente e le sorgenti non laser, spesso indicate come termiche o naturali, vengono dette incoerenti; ma questo solo un modo di dire per indicare un piccolo grado di coerenza, che comunque sufficiente a produrre interferenza. Riferiamoci alla rappresentazione delle onde luminose come un susseguirsi di vari treni
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d'onda. Vari treni emessi da una sorgente non possono interferire l'uno con l'altro e produrre un sistema di frange stabile e visibile. Tuttavia si pu produrre una interferenza costruttiva facendo interferire porzioni dello stesso treno con se stesso; facendo riferimento alla Fig. 13.1. si ha che possibile l'interferenza quando la differenza L dei cammini ottici minore di c essendo la durata di un treno coerente. Negli interferometri di Michelson, quando si realizza l'interferenza con luce ordinaria, L sempre molto piccolo, dell'ordine di 1 mm al massimo, il che implica che la lunghezza di coerenza c in luce ordinaria dell'ordine di un centimetro. La scoperta dei laser port una rivoluzione nell'ottica; l'angolo di divergenza di un fascio laser pu essere di un grado ed il tempo di coerenza della radiazione laser dell'ordine di 10-3 s. Questo vuol dire che la lunghezza di coerenza della luce laser dell'ordine di 105 m, sette ordini di grandezza sopra la luce ordinaria. Vedremo ora come questo pu essere ottenuto. 13.1.2. Principi di funzionamento del laser Il funzionamento dei laser pu essere capito solo ricordando i processi basilari di interazione tra la radiazione e gli atomi o le molecole precedentemente descritti nei Capitoli 2 e 3. L'energia di un atomo o di una molecola pu assumere solo certi valori discreti. Le transizioni di un atomo o di una molecola da uno stato all'altro avvengono per salti quantici, il che vuol dire che l'energia viene assorbita per quanti e non in quantit arbitraria, e secondo certe regole di selezione (certi salti energetici sono ammessi, altri proibiti). Gli atomi di ogni elemento hanno il loro proprio sistema di livelli energetici, che determina le transizioni che quell'atomo pu compiere. L'unit comunemente usata per misurare la separazione tra i livelli l'elettronvolt, cio l'energia che un elettrone acquista se supera il dislivello di 1 volt. E utile tener presente che 1 eV = 1,6 - 10-19 J per cui, essendo = hv = h - c/ si ha che fotoni con l'energia di 1 eV hanno lunghezze d'onda di 1,24 m. La struttura dei livelli energetici di una molecola riflette tre tipi di moto che possono avvenire al suo interno: moti degli elettroni, vibrazioni degli atomi nella molecola e rotazioni della molecola su se stessa. Cosi in una molecola troviamo, oltre ai livelli associati coi moti degli elettroni, livelli vibrazionali (che hanno separazioni dell'ordine di 0,1 eV) e livelli rotazionali (che hanno separazioni che al massimo raggiungono 0,1 eV). Focalizziamo ora la nostra attenzione su due livelli ad energia E1 ed E2 di un singolo atomo. Se l'atomo sul livello pi basso, diciamo E1, pu assorbire un fotone di energia 12 = E1 E2 e salire cosi al livello E2. La frequenza con cui questo processo avviene proporzionale al numero di fotoni con l'energia giusta presenti nella radiazione che investe il mezzo ed al numero di atomi che sono nello stato E1. Consideriamo ora invece un atomo che sia al livello superiore E2; questo pu decadere verso lo stato pi stabile E1 spontaneamente, emettendo un fotone di energia 12 =E1 E2. Solo l'energia del fotone determinata, mentre la sua quantit di moto e la sua polarizzazione possono avere qualunque valore. Esiste tuttavia un altro modo con cui un atomo eccitato pu decadere verso il suo stato fondamentale: un fotone con l'energia giusta (12 =E1 E2) Pu stimolare la transizione dal livello ad energia E2 allo stato fondamentale (energia E1) con la stessa probabilit con cui pu essere assorbito da atomi che sono nello stato fondamentale. Anche in questo caso, l'atomo decadendo emette un fotone di energia 12 ma, a differenza della situazione precedente, la quantit di moto e la polarizzazione sono uguali a quelle del fotone primario. Questa una differenza molto importante tra l'emissione spontanea e l'emissione indotta. Assumiamo ora che ci siano molti atomi sul livello E2. Un'onda elettromagnetica (e.m.) di frequenza compatibile con e,, capace di indurre la transizione E2E1 in molti atomi, cio pu dar luogo ad una valanga di fotoni secondari tutti nello stesso stato del fotone primario. Perci, se il livello E2 seguita ad essere pi popolato di E1 il processo si pu autoamplificare, ed il fotone primario pu dar luogo alla emissione di radiazione coerente di lunghezza che non ha limiti a priori.
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E' ora chiaro, anche se solo ad un livello descrittivo, che per produrre radiazione coerente occorre che l'emissione stimolata sia dominante rispetto a quella spontanea e rispetto all'assorbimento. D'altra parte, un fotone di energia 12 pu dar luogo, con uguali probabilit, alla transizione E2E1 o alla sua inversa E1E2. Quale delle due sia dominante dipende da quale stato pi popolato; se lo quello ad energia pi bassa dominer il processo di assorbimento, mentre se lo quello ad energia pi alta allora sar dominante l'emissione indotta. Nelle normali condizioni di equilibrio termodinamico la popolazione nei vari livelli di energia diminuisce al crescere dell'energia del livello, cosicch, di solito, dominante l'assorbimento.

Per creare una inversione nelle popolazioni occorre fare in modo che il livello pi alto venga riempito pi velocemente dei livello basso; in questa situazione si potr avere radiazione coerente. 1 meccanismi fisici per popolare o depopolare i livelli energetici sono parecchi; noi descriveremo qui, giusto per fissare le idee, uno schema di principio che non certo il migliore ma il pi semplice. Consideriamo lo schema di Fig. 13.2. Con un pompaggio ottico, cio inviando radiazione opportuna, viene popolato lo stato l; da qui gli atomi decadono verso lo stato metastabile 2 (il tempo di vita dello stato 1 dell'ordine di 10-8 s) con una transizione non radioattiva che d energia al reticolo cristallino se il mezzo considerato un solido. Se il tempo di vita dello stato 2 di 10-4 o 10-2 s lo stato 2 si riempie e l'inversione delle popolazioni assicurata. Tutto questo rende chiaro come la radiazione laser abbia caratteristiche peculiari rispetto alla luce ordinaria. Infatti, l'emissione indotta, che il processo reso dominante nella emissione laser, assicura che la radiazione emessa sar direzionale, monocromatica, coerente. 13.1.3. Sorgenti laser Le sorgenti laser sono attualmente molte, diverse tra loro, utilizzano sostanze diverse e ottengono l'emissione stimolata attraverso differenti meccanismi atomici o molecolari. Sono possibili classificazioni quindi in base a differenti caratteristiche: l'emissione pulsata, o continua, che pu avvenire nello stesso materiale attivo, il materiale attivo, i meccanismi dell'emissione laser, o, infine, la lunghezza d'onda della luce emessa. Per quanto riguarda
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quest'ultimo parametro, esistono sorgenti laser in un intervallo spettrale che va dall'ultravioletto (160 nm) al lontano infrarosso (700 m) ma lo spettro non ricoperto con continuit, se si eccettua il range visibile, che pu essere ricoperto con continuit, da sorgenti laser che utilizzano come materiale attivo diversi coloranti. Di seguito sono descritte le caratteristiche principali delle sorgenti pi comuni raggruppate in base ai materiali attivi utilizzati per l'emissione laser. 1) Laser a cristalli ionici che utilizzano come materiale attivo ioni inseriti in un reticolo cristallino; a questa categoria appartiene il primo laser fatto funzionare nel 1960, il laser a rubino, ora sostituito nell'uso dai laser a neodimio che utilizzano: a) cristalli di Y3Al2O15 (chiamati comunemente YAG) nei quali lo ione Nd3+ sostituisce lo ione Y3+; sono usati generalmente in continua, con potenze luminose che raggiungono i 700W; b) alternativamente vetro che ingloba lo ione Nd3+ viene usato per funzionamento impulsato, a causa della sua bassa conducibilit termica che non ne permette l'utilizzo in continua. Il pompaggio (cio l'inversione di popolazione del livello eccitato coinvolto nell'emissione stimolata) ottenuto con lampade flash allo xenon e l'emissione avviene nel vicino infrarosso (1,06 m). Il laser impulsato (con vetro drogato come materiale attivo) in grado di produrre in particolari condizioni di funzionamento impulsi minori di 10-12 s e potenze di picco dell'ordine di 1012 W. Questo tipo di laser si rivelato utilissimo per misure spettroscopiche ultraveloci in un ampio intervallo spettrale, poich, data l'enorme potenza disponibile, possibile, mediante cristalli con propriet ottiche non lineari, moltiplicare fino a quattro la frequenza di emissione passando cosi dall'infrarosso all'ultravioletto (2650 ), ottenendo sempre emissioni laser con sufficiente potenza. 2) Laser a gas. In questa categoria sono raccolte le sorgenti laser pi comunemente usate sia funzionanti in continuo che impulsate che vanno dal laser He-Ne - con emissioni in continuo di media potenza (50 mW) nel rosso (6328 ), pi deboli (1 mW) nel verde (5430 ), nel giallo (5940 ), nell'arancione (6040 ) - al laser ad Ar+ - che emette in continuo molte linee nel blu e nel verde con potenze che arrivano ai 25 W - al laser a CO2 continuo o pulsato, che emette nell'infrarosso (10,6 m) con potenze molto elevate fino a 25 kW, al laser ad N2 - che emette impulsi di 10-9 s nell'ultravioletto (337 nm) con potenze medie fino a 140 mW - ai laser ad eccimeri - XeCI o ArF o XeF o KrF, che emettono impulsi della durata di qualche nanosecondo nell'ultravioletto da 1570 a 3510 a seconda del gas attivo con potenze medie fino a 250 W. L'eccitazione nei laser a gas avviene elettricamente, facendo passare nel gas una corrente elettrica, continua od alternata, di opportuno valore. Questa corrente ionizza il gas e gli urti degli elettroni liberi accelerati dal campo elettrico con altri atomi producono l'eccitazione di questi. Senza entrare nei dettagli, data la complessit e il numero di livelli eccitati coinvolti, si pu creare una situazione di equilibrio in cui qualche livello ha subito una inversione di popolazione in grado di permettere una emissione stimolata. 3) Laser a coloranti. Il materiale attivo composto da soluzioni di coloranti organici (di solito sono xanteni o cumarine) (Fig. 13.1) in liquidi (alcoli od acqua). Il colorante viene pompato otticamente ed ha una emissione laser alla frequenza di fluorescenza, quindi a una frequenza minore di quelle della luce di pompaggio. Cambiando il tipo di colorante si pu quindi coprire con continuit tutto lo spettro dall'ultravioletto all'infrarosso utilizzandolo come pompa laser nell'ultravioletto e nel visibile; in pratica, la situazione si presenta diversa per emissione continua o pulsata. Infatti essendo possibile ottenere impulsi sufficientemente intensi nell'ultravioletto con i laser ad eccimeri o YAG, la lunghezza d'onda dell'emissione di un laser a coloranti pu essere selezionata con continuit da 205 nm a 1 mm mentre non esistono nell'ultravioletto laser continui con sufficiente intensit di pompaggio, per cui si
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usano laser ad Ar+ o ad Kr+ la cui lunghezza d'onda di emissione pi corta nel blu (400 nm); l'intervallo copribile con continuit dal laser a coloranti si riduce, quindi, da 400 nm a 1 m Infine, tra le caratteristiche importanti vi quella di produrre in particolari condizioni sperimentali impulsi molto brevi (intorno al picosecondo).

4) Diodi laser. Il materiale attivo un eterogiunzione di semiconduttori (tipicamente GaAlAs) che, opportunamente polarizzata con l'applicazione di una corrente elettrica, emette (in continuo o ad impulsi) nell'infrarosso da 0,8 a 1,55 m, a seconda del tipo di giunzione, con potenze che arrivano per alcuni modelli fino ad 1 W. L'elevata efficienza, la semplicit di pompaggio (basta una batteria da 1, 5 V e 10-100 ), la compattezza, la facilit di modulazione della luce emessa (basta modulare la corrente di polarizzazione) rendono interessanti questi laser a semiconduttori per molte applicazioni, soprattutto se si riuscir ad ottenere emissioni a lunghezze d'onda pi corte (gi esistono diodi laser che emettono a 680 nm) e/o ad aumentare la potenza emessa per poter ottenere armoniche di frequenze pi alte di sufficiente intensit, mediante l'uso di moltiplicatori di frequenza. 13.1.4. Spettroscopia Raman La scoperta del laser ha portato allo sviluppo di nuovi campi della spettroscopia oltre ad incrementare la sensibilit di metodi spettroscopici gi noti fino a farli diventare di routine. In particolare, per le spettroscopie di scattering si sfrutta l'elevata brillanza e direzionalit delle sorgenti laser mentre, per le spettroscopie di assorbimento ed emissione ad alta risoluzione temporale, risultata fondamentale anche la loro elevata monocromaticit e la possibilit di ottenere impulsi molto brevi e molto intensi. Se un fascio di luce nel visibile a frequenze v, illumina un campione, la maggior parte della luce diffusa elasticamente, cio senza assorbimento di energia e quindi senza spostamento in frequenza della luce diffusa. Tale scattering elastico (Rayleigh scattering), di uso abituale in biologia, diventato, con l'introduzione di sorgenti laser in continua, una tecnica pi maneggevole, per la maggior direzionalit ed anche pi sensibile per una maggiore brillanza rispetto alle sorgenti convenzionali. Un'analisi spettrale della luce diffusa mostra molte deboli bande (scattering anelastico, cio con assorbimento di energia), sia a frequenze pi alte sia pi basse della banda di Rayleigh centrale a frequenze vL Le bande Brillouin molto vicine (distanti in frequenza dalla banda Rayleigh tra 5 106 e 1010 Hz) sono dovute all'interazione della luce con fluttuazioni coerenti presenti nel mezzo del campione. In realt, prima dell'introduzione del laser, misure spettrali accurate delle bande Brillouin erano difficilmente ottenibili per mancanza di sorgenti monocromatiche sufficientemente intense e di spettrometri con sufficiente risoluzione. Inoltre appare una schiera di bande vibrazionali (spettro Raman), distanti in frequenza dalla banda centrale Rayleigh tra 1011 e 1014 Hz, dovute all'interazione della luce con il campo elettrico variabile delle nubi
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elettroniche, che seguono strettamente il moto degli atomi che oscillano dentro le molecole del campione. Anche la spettroscopia Raman diventata una tecnica di uso comune solo con lo sviluppo di laser con sufficiente potenza luminosa (> 100 mW). Alcune nuove spettroscopie non lineari basate sull'effetto Raman sono state sviluppate dopo l'avvento dei laser quali il CARS (Coberent Anti-Stokes Raman Scattering) o lo scattering Raman inverso. Infine, in realt, anche la banda centrale Rayleigh, se analizzata spettralmente con tecniche estremamente sensibili - rese praticabili dalla monocromaticit e coerenza della luce laser rivela la presenza di righe spettrali dovute ai moti di diffusione traslazionali e/o rotazionali di macromolecole in soluzione e, se le dimensioni di queste sono comparabili con la lunghezza d'onda, anche ai moti intermolecolari. Lo spostamento in frequenza di queste righe rispetto alla frequenza fissa estremamente piccolo (tra 1 e 106 Hz): il rapporto tra energia assorbita dal campione nello scattering ed energia incidente quindi compreso tra 10-15 e 10-9, tale cio da far considerare trascurabile l'assorbimento di energia nel processo di scattering (di qui il nome di scattering quasi-elastico dato a questo effetto). Mentre lo scattering Brillouin riveste scarsa importanza nello studio dei processi biologici, grande sviluppo hanno avuto lo scattering Raman e quello quasi-elastico nell'indagine sia della dinamica e della struttura di macromolecole biologiche in soluzione sia di processi cellulari. Mentre nel prossimo paragafo verr illustrato in dettaglio lo scattering quasi-elastico e ne verr discussa l'utilit in diverse applicazioni biologiche, di seguito sono mostrate le possibilit di applicazione della spettroscopia Raman.

Nell'effetto Raman (Fig. 13.4.) la molecola nello stato fondamentale interagisce con un fotone incidente di energia hv, passa attraverso uno stato virtuale (non stazionario) fino a uno stato intermedio creando un quanto vibrazionale hvL e poi, emettendo un fotone di energia h (vLvV), ritorna in tempi dell'ordine di 10-15 secondi allo stato fondamentale elettronico, ma al primo livello vibrazionale eccitato. Un fotone poi riemesso ad una frequenza molto vicina alla frequenza dei fotone incidente (quindi generalmente nel visibile) spostata della frequenza vibrazionale vV. L'interazione di molti fotoni con le molecole del campione produce il completo spettro Raman vibrazionale (che molto complesso) comprendendo un po' meno di 3N-6 righe per una molecola non lineare di N atomi, in base alle regole di selezione e alla minima intensit rivelabile delle righe permesse. L'effetto Raman sopra esemplificato conosciuto come scattering Raman Stokes: lo spettro consiste di bande spostate a frequenze pi basse di quelle della luce incidente. Con una luce incidente pi intensa, uno spettro antiStokes visto a frequenze pi alte che VL; questo spettro prodotto dall'interazione dei fotoni incidenti con le molecole che popolano i livelli vibrazionali eccitati in proporzione al
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fattore di Boltzmann, e(-hv/kT), cio in numero molto piccolo a temperatura ambiente. Di conseguenza, lo spettro troppo debole per estendersi oltre 1013 Hz di distanza da vL. Infine, se lo scattering Raman avviene con luce incidente vicino ad una banda di assorbimento molecolare, la molecola viene eccitata ad uno stato elettronico e allora insiemi di bande vibrazionali, aventi giuste simmetrie e sovrapposizioni rispetto alla transizione elettronica, possono essere amplificate per risonanza (scattering Raman risonante) (Fig. 13.4).

La forte dipendenza dello spettro Raman dai modi di vibrazione delle molecole indica che la spettroscopia vibrazionale Raman uno strumento molto utile nello studio della struttura delle molecole biologiche; infatti, la struttura tridimensionale e le interazioni sia intramolecolari sia intermolecolari di una molecola determinano le frequenze e le forme dei suoi modi normali di vibrazione. Nel caso di piccole molecole, la struttura e le forze possono spesso essere derivate direttamente dagli spettri vibrazionali (Raman o assorbimento nell'infrarosso), mentre nel caso di macromolecole dove, per problemi di complessit questo non pi possibile, l'approccio usato quello di trovare correlazioni tra le righe misurate e note strutture chimiche o fisiche di classi di molecole simili. Questo approccio funziona perch, sebbene tutti gli atomi di una molecola normalmente contribuiscano ad un modo vibrazionale, per certi gruppi chimici di atomi (CH, NH, C=0) il moto molecolare altamente concentrato nel gruppo e non cambia in modo essenziale da una molecola all'altra. In biologia, la spettroscopia vibrazionale delle molecole (bande nell'infrarosso) pu esser fatta praticamente solo con la spettroscopia Raman non risonante (luce incidente nel visibile), dato che il principale solvente, l'acqua, assorbe fortemente nell'infrarosso, rendendo impraticabile la spettroscopia IR (infrarossa). Dai lavori pionieristici dei primi anni '60 (1968), il maggiore obiettivo della ricerca stato quello di estrarre informazioni dagli spettri Raman circa lo stato conformazionale di macromolecole biologiche: proteine, acidi nucleici, tipidi, sia isolati, sia in insiemi biologicamente organizzati, quali membrane, virus ecc. Lo spettrometro Raman usa un laser continuo o pulsato nel visibile focalizzato sul campione; la luce diffusa ortogonalmente al fascio incidente viene raccolta e filtrata della componente diffusa elasticamente (non spostata in frequenza) mediante un doppio monocromatore (Fig. 13.5.). Se la proteina contiene un cromoforo (per esempio emoproteine), l'interazione di questo con gli atomi circostanti, pu essere rivelata dalla spettrometria Raman risonante, sia in condizioni statiche sia dinamiche. La sensibilit di questa spettroscopia a piccoli cambi strutturali intorno al gruppo eme superiore all'analisi a raggi X. Inoltre, la cinetica di eventi chimici e fisici
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fotoindotti nella scala dei tempi dei nanosecondi (fotociclo della batteriorodopsina ad esempio) pu essere studiata con la spettroscopia Raman risonante usando come sorgente un laser pulsato formato da un laser a coloranti pompato da un laser pulsato ad azoto. Infine, un significativo aumento di efficienza (104-106) rispetto al Raman scattering spontaneo ottenuto per mezzo della tecnica CARS, nella quale si ottiene un processo a quattro fotoni, mediante l'uso di due potenti laser pulsati (uno dei quali accordabile in frequenza per spazzare l'intero intervallo di frequenze vibrazionali) a frequenze v1 e v2,

Il segnale di scattering esce dal campione a una frequenza v3= 2v1 v2 cio si tratta di una riga anti-Stokes completamente separata sia in frequenza sia spazialmente dalla luce incidente, cosicch necessario un solo monocromatore per filtrare il segnale in uscita e basta una singola passata (senza ulteriori medie) per ottenere lo spettro Raman. La tecnica sembra quindi particolarmente adatta a studiare processi biologici, soprattutto quelli non stazionari (Fig. 13.6.).
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13.1.5. Scattering quasi-elastico La luce diffusa da una soluzione di molecole biologiche contiene oltre alla componente Raman (spostata in frequenza per valori compresi tra 1010 e 1014 Hz), una componente non spostata in frequenza (diffusione elastica) ed una componente spostata in frequenza per valori molto pi piccoli degli spostamenti Raman (tra 1 e 106 Hz) chiamata scattering quasi-elastico. Questa componente dovuta ai moti diffusivi, sia traslazionali sia rotazionali, delle molecole quando queste hanno dimensioni molto minori della lunghezza d'onda della luce incidente, e contiene anche informazioni dei moti interni nel caso di molecole di dimensioni comparabili con la lunghezza d'onda della luce incidente. Bench teoricamente prevista, questa componente non pot essere rivelata fino allo sviluppo dei laser, essendo gli spostamenti in frequenza pi piccoli della larghezza di riga della luce incidente nel caso di sorgenti convenzionali termiche (una sorgente monocromatica convenzionale ha larghezza di riga pi grande di 107 Hz) e quindi non apprezzabili.

Questa componente pu essere rivelata nel dominio del tempo attraverso l'autocorrelazione +1 / 2 1 / T i (t ) i (t + ) dt della fotocorrente i(t) prodotta dalla luce diffusa raccolta da un 1 / 2 fototubo (Fig. 13.7.) o nel dominio della frequenza attraverso lo spettro di potenza della stessa fotocorrente: i due metodi sono equivalenti, essendo una grandezza la trasformata di Fourier dell'altra. La rivelazione viene detta omodina quando la corrente del fotorivelatore proporzionale all'intensit della luce diffusa. Si dimostra che, per una soluzione diluita di molecole (quali quelle a concentrazioni di soluto fisiologiche) di dimensioni molto minori della lunghezza d'onda (quali la maggior parte delle molecole di interesse biologico) in modo che lo scattering sia isotropo, data da:

g1 =e(- q2Dt) dove q = ki k s , con ki e ks vettori d'onda della luce incidente e diffusa rispettivamente, dato dalla geometria dello scattering, D il coefficiente di diffusione traslazionale delle molecole legato al raggio delle molecole r, e al coefficiente di viscosit del solvente - dalla equazione di Stokes-Einstein - D = kT/6r dove k la costante di Boltzmann e T la temperatura assoluta della soluzione. Lo scattering quasi-elastico permette quindi di misurare in tempi molto brevi il raggio idrodinamico di macromolecole in soluzione e quindi, in combinazione con altri tipi di misura (quali la velocit di sedimentazione), di ottenere il loro peso molecolare; esso diventato uno strumento analitico di routine in biochimica.

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Se le macromolecole sono di sufficiente dimensione e di forma non sferica, in modo tale che lo scattering sia anisotropo, la funzione di autocorrelazione g, dipende anche dal coefficiente di diffusione rotazionale e nel caso di macromolecole flessibili dai moti intramolecolari. L'apparato sperimentale (Fig. 13.8.) formato da un laser, generalmente nel verde per aumentare l'efficienza dello scattering, da un fototubo che raccoglie la luce diffusa dalla soluzione di macromolecole sotto un certo angolo, da un correlatore digitale o da un analizzatore di spettro in tempo reale. Se si usa l'analisi nel dominio della frequenza lo spettro di potenza della fotocorrente sar la trasformata di Fourier della funzione di autocorrelazione esponenziale: sar quindi una lorentziana di semilarghezza Dq2.

Un'applicazione particolare, ma di grande importanza in biologia cellulare, dello scattering quasi-elastico lo studio del moto di particelle che si muovono con velocit costante (sia in modulo sia in direzione per un tempo uguale o maggiore del tempo di misura) a differenza di quanto succede nel moto browniano nel quale le particelle in soluzione cambiano continuamente modulo e direzione della velocit a causa degli urti con le molecole del solvente. In questo caso, ogni particella ha una velocit ben definita e la luce diffusa sottoposta ad effetto Doppler. t questo il caso di elettroforesi di macromolecole o cellule in soluzione o del moto proprio di microorganismi unicellulari ciliati o flagellati: in questo caso, si parla di velocimetria Doppler.
13.1.6. Velocimetria Doppler M La luce diffusa da particelle mobili porta informazioni sul loro moto e si pu sfruttare per ottenere una misura di velocit o di altri parametri di moto. Ci che va rivelato nella luce diffusa sono variazioni di frequenza o modulazioni di intensit dovute al moto dei diffusori. Variazioni di frequenza vengono prodotte quando la luce viene diffusa da particelle in modo. Consideriamo il caso semplice in cui un'onda piana monocromatica e linearmente polarizzata venga diffusa da una particella che si muove con velocit V; in questo caso, la frequenza dell'onda, dopo la diffusione, risulter spostata per effetto Doppler. Lo spostamento Doppler espresso da f = (2Veff / )sen( / 2) (13.1.2.)

dove l'angolo a cui la diffusione avviene e Veff la componente della velocit del diffusore in una certa direzione e la lunghezza d'onda (vedi Fig. 13.9.). Se la luce diffusa da un insieme di diffusori identici e piccoli, rispetto alla lunghezza d'onda della luce incidente (questo necessario per poter dire che la luce diffusa in modo isotropo), lo spettro della luce
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scatterata sar una banda centrata su V0, frequenza della luce incidente, ed omologa alla distribuzione di Veff nel campione. Va ancora sottolineato che l'ordine di grandezza della frequenza della luce visibile 1015 Hz, mentre gli spostamenti di frequenza dovuti all'effetto Doppler sono sui 100 Hz a valori ragionevoli dell'angolo di diffusione e per velocit di circa 100 m/s. Un'analisi spettrale diretta della luce diffusa non pu quindi rivelare questi spostamenti di frequenza che si possono osservare solamente ricorrendo a metodi interferometrici o di battimento e, in pratica, solo usando luce laser.

Per rivelare piccoli spostamenti Doppler sono stati usati due differenti metodi di rivelazione, la rivelazione omodina e la rivelazione eterodina. Nella rivelazione eterodina la luce diffusa dal campione viene raccolta da un fotorivelatore insieme con una parte del fascio imperturbato e vengono analizzate le fluttuazioni della fotocorrente dovute ai battimenti di due segnali periodici con frequenze assai vicine. Come vedremo meglio tra poco lo spettro di potenza della fotocorrente semplicemente la traslazione in bassa frequenza dello spettro ottico, almeno se questo simmetrico intorno alla frequenza del fascio imperturbato.

Nel caso della rivelazione omodina, invece, solo la luce diffusa viene raccolta dal fotorivelatore; le sue fluttuazioni, dovute ai battimenti tra i differenti contributi dovuti ai vari diffusori con differenti velocit, danno ancora informazioni sulla distribuzione delle velocit nel campione che ha diffuso la luce, ma in una maniera pi indiretta rispetto alla rivelazione
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eterodina. Infatti, in questo caso, lo spettro della fotocorrente rappresenta la convoluzione dello spettro ottico con se stesso e sorgono parecchie difficolt di interpretazione se i diffusori non sono puntiformi o, peggio ancora, se non sono sferici. Malgrado la difficolt di interpretazione dei risultati, questo metodo stato quello pi usato, probabilmente a causa della sua semplicit sperimentale. Vediamo ora qualcosa in dettaglio sulla rivelazione eterodina. Questa tecnica richiede un buon allineamento del fascio diffuso e della parte di fascio imperturbato (detto anche fascio eterodinante o, con terminologia che viene dalla radiotecnica, oscillatore locale) che viene raccolto dal fotorivelatore; infatti, se le superfici d'onda dei due fasci non sono parallele si formano delle frange d'interferenza sulla superficie del fotorivelatore e questo riduce il rapporto segnale-rumore. L'apparato sperimentale (Fig. 13.10.) perci molto sensibile alle vibrazioni ed necessario controllare l'allineamento dei due fasci. Scriviamo ora le espressioni del campo elettrico E(t) e della fotocorrente i(t) nel caso della rivelazione eterodina. Se E0 ed E1 indicano i campi elettrici e f0, fi le frequenze ottiche della luce eterodinante e della luce diffusa dall'i-esimo centro diffusore, il campo elettrico sul rivelatore potr essere scritto come
E (t ) = E0 sen(2f 0t ) + Ei sen(2f i t + i )
i =1 N

sen lo spostamento 2 Doppler che dipende dalla componente efficace della velocit dell'i-esimo diffusore. Dato che il rivelatore misura l'intensit della luce che lo colpisce sopra, i (t) potr essere ottenuta calcolando il valore quadratico medio (medio sul tempo di misura) del campo elettrico, e sar quindi dato da:
Ni 1 1 N i (t ) = K E02 + Ei2 + E0 Ei sen2f i t 2 2 i =1 i =1 dove K proporzionale alla efficienza quantica del rivelatore.

dove i la fase dell'onda diffusa dall'i-esimo diffusore e f i t =

2Veff

(13.1.3.)

Nell'ipotesi che i diffusori siano identici e sferici, Ei non dipende dal diffusore considerato n dalla sua orientazione. Quando un campione contenente particelle di questo tipo (macromolecole o cellule mobili) posto sul cammino di un fascetto laser, la fotocorrente rivelata in eterodina data dalla somma di molti contributi sinusoidali indipendenti, con pesi uguali e con frequenze legate dalla espressione (13.1.2.), alla componente efficace della
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velocit delle particelle diffondenti. Cosi lo spettro di potenza della fotocorrente riproduce a bassa frequenza lo spettro ottico, se questo simmetrico intorno ad f0 Se questa simmetria non esiste, lo spettro della fotocorrente sovrappone e media il lato destro e quello sinistro dello spettro ottico; per evitare questo (cio per misurare anche il segno della velocit dei diffusori) occorrono artifici sperimentali particolari (per esempio usare come fascio eterodinante un fascio spostato in frequenza rispetto al fascio incidente sul campione, come mostrato schematicamente in Fig. 13.11.). Misurare il segno delle velocit pu essere interessante se si tenta di misurare, per esempio, la capacit di chemiotassi degli spermatozoi. A parte la questione del segno, lo spettro di potenza della fotocorrente omologo alla distribuzione della componente efficace della velocit nel campione esaminato. Va notato che lo spostamento Doppler dipende dall'angolo di osservazione tramite sen (/2): se i risultati che si ottengono non scalano con sen (/2), l'effetto misurato non effetto Doppler, o almeno non soltanto effetto Doppler. L'applicazione della spettroscopia a battimento di fotoni allo studio quantitativo del moto di microorganismi (protozoi, batteri, spermatozoi) ha incontrato alcune difficolt per due ordini di motivi: 1) le dimensioni dei microorganismi e il loro non essere otticamente omogenei; 2) l'interpretazione dei risultati sperimentali diviene molto mediata se non si usa la rivelazione eterodina che, sperimentalmente, presenta qualche difficolt. Consideriamo le difficolt derivanti dalle dimensioni dei microorganismi e dal fatto che essi non sono diffusori sferici. Quando la luce diffusa da microorganismi non sferici, e con dimensioni non trascurabili rispetto alla lunghezza d'onda della luce, l'intensit della luce diffusa in una data direzione dipende dall'orientamento della cellula (Fig. 13.12.) rispetto al fascio incidente. Questo porta a fluttuazioni della fotocorrente che non sono da attribuire ad effetto Doppler ma a modulazioni di intensit della luce diffusa. Infatti, il moto di cellule che nuotano nel loro mezzo non un semplice moto rettilineo; l'orientamento del corpo cellulare cambia con regolarit (per esempio alla frequenza del battito flagellare) e l'analisi della luce diffusa pu permettere di misurare non solo la velocit ma anche altri parametri di moto. La frequenza di battito flagellare appare negli spettri eterodina come bande laterali della banda dovuta alle velocit di traslazione, mentre appare negli spettri omodina come una banda fissa, indipendente, come frequenza, dall'angolo di osservazione. E necessario, quindi, per una interpretazione quantitativa dei risultati (cio per usare gli spettri come misura di un parametro di moto e non come un indice generico di motilit) separare tra loro i vari effetti, il che pu essere fatto usando artifici sperimentali. Per quanto riguarda la rivelazione omodina va tenuto presente che se usata su cellule che diffondono in modo anisotropo essa rende estremamente difficile linterpretazione dei risultati. Un ultimo fatto da notare riguardo alla misura di parametri di moto cellulare attraverso l'analisi della luce diffusa che mentre la misura della velocit e delle loro distribuzioni richiede l'uso della rivelazione eterodina (che sperimentalmente non semplice), la misura del
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battito flagellare pu essere eseguita addirittura usando luce ordinaria. Infatti, la rivelazione delle fluttuazioni di intensit della luce diffusa non presenta nessuna difficolt e non richiede un alto grado di coerenza della luce usata pur permettendo di misurare un parametro di interesse biologico come la frequenza del battito flagellare, per esempio degli spermatozoi.
13.1.7. Spettroscopie ultraveloci Lo sviluppo delle sorgenti laser pulsate con impulsi molto brevi ha permesso di studiare l'andamento temporale di eventi primari estremamente veloci (tra 10-13 e 10-9 s) di molteplici processi biologici, quali la fotosintesi, la visione, la dinamica di biomolecole (emoproteine, DNA) e la fotodissociazione di biomolecole (DNA e complessi di DNA). Mentre nei primi tre processi citati la spettroscopia ultraveloce usata per rivelare il rilassamento di un sistema eccitato, nell'ultimo caso gli impulsi laser estremamente brevi ( 10-12 s) ed estremamente intensi sono usati per alterare od anche distruggere in modo selettivo una molecola complessa e seguirne la successiva dissociazione. Le tecniche utilizzabili sono spettroscopie, risolte in tempo, di assorbimento, di fluorescenza, di scattering.

Una cosi elevata risoluzione temporale, peraltro richiesta per studiare molti processi biologici (in Fig. 13.13. sono riportate ad esempio la sequenza temporale della fotodissociazione della rodopsina e il fotociclo della batteriorodopsina) richiede un apparato sperimentale con caratteristiche molto particolari; la sorgente laser in generale un laser a Nd3+ nella configurazione mode locked che genera un treno di impulsi molto brevi (Fig. 13.14.), dal quale viene selezionato un singolo impulso onde evitare eccitazioni multiple nel preparato. La lunghezza d'onda del laser, pu essere variata con una certa continuit usando ottiche non lineari quali generatori di armoniche o pompando la fluorescenza di un laser a coloranti. La durata temporale dell'impulso laser generato < 10-12 s) non pu essere misurata direttamente con apparati elettronici, che non hanno un adeguato tempo di risposta. misure indirette possono essere per eseguite, per esempio misurando lo spazio percorso dall'impulso in aria alla velocit della luce (infatti la luce percorre in 10-12 s 0,3 mm in aria e questo spazio misurabile con un micrometro). In Fig. 13.15. mostrato uno spettrometro ultraveloce per
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misure di fluorescenza e in Fig. 13.16. una applicazione a pigmenti fotosintetici, mentre in Fig. 13.17. mostrato un apparato per misure di assorbimento, nel quale si usano due impulsi laser con ritardo variabile tra di loro: il primo eccita il campione. il secondo funziona da sonda. In Fig. 13.18. si riporta l'assorbirmento indotto in batteriorodopsina adattata alla luce: il ritardo che si ha tra l'eccitazione e l'assorbimento (1 picosecondo) dovrebbe corrispondere al tempo di formazione di un pigmento intermedio: infine. un altro esempio di assorbimento transiente a tempi dell'ordine del picosecondo mostrato in Fig. 13.19.

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13.1.8. Applicazioni clinico-chirurgiche Il laser sempre pi di uso comune nella pratica medica anche se alcune sue applicazioni terapeutiche, empiricamente definite, restano senza un modello esplicativo accettabile. In realt, l'uso del laser in medicina una branca della fotomedicina, definita in senso lato come l'applicazione della fotobiologia (cio dell'interazione della radiazione elettromagnetica non ionizzante con biomolecole e dei suoi effetti) alla diagnosi e al trattamento delle malattie. La fotobiologia riguarda essenzialmente gli effetti sui materiali biologici della radiazione elettromagnetica nell'intervallo dall'ultravioletto al vicino infrarosso. I principali effetti della luce sono: 1) modificazioni fotochimiche di biomolecole con conseguenti eventuali alterazioni della loro funzione biologica; 2) effetti termici non specifici e simili a quelli ottenibili con il riscaldamento. Le caratteristiche del laser, coerenza spaziale e temporale, che permettono di concentrare alte intensit luminose su dimensioni microscopiche e di trasportarla senza perdite su lunghe distanze, anche all'interno del corpo umano guidate attraverso fibre ottiche, hanno ampliato le possibilit della fotomedicina, rispetto a quella praticata con sorgenti di luce convenzionali. In generale si pu sostenere che se non sono richieste altissime intensit luminose o la focalizzazione della luce su dimensioni del o minori, l'uso del laser non aggiunge nulla ai risultati ottenuti con sorgenti luminose convenzionali, anche se tende a sostituirle ovunque per motivi di maneggevolezza, direzionalit e trasportabilit anche in parti del corpo poco accessibili. Le applicazioni del laser sono quelle gi note da tempo nella letteratura medica sulle propriet terapeutiche della luce.

1) Fototerapia dell'iperbilirubinemia (ittero neonatale) che causa una ridotta attivit enzimatica, nei neonati immaturi, nel convertire la bilirubina in una forma coniugata, solubile in acqua, in grado di essere eliminata attraverso l'intestino. L'alta concentrazione di bilirubina nel sangue e nei tessuti porta a irreversibili danni del sistema nervoso centrale. La luce blu sembra in grado di fotodegradare la bilirubina nella forma solubile in acqua mediante un processo rapido di fotoisomerizzazione. 2) Trattamento di alcune malattie della pelle (quali psoriasis, vitiligo, micosis fungoides) ed alcune forme di eczema usando luce ultravioletta da sola o in congiunzione con un fotosensibilizzante (psoralene) assunto dal paziente. 1. Fototerapia dei tumori in congiunzione con un derivato dell'ematoporfirina che, assunto per via endovena, ha la propriet di legarsi in modo specifico a tumori dei bronchi, dell'esofago e cervicali; la sua fluorescenza permette la localizzazione del tumore e l'irraggiamento con luce rossa determina in modo selettivo la necrosi del tumore. Il meccanismo citotossico sembra essere la produzione di ossigeno atomico ottenuto per trasferimento di energia dagli stati eccitati dalla porfirina. l evidente, data la localizzazione di tumori, il vantaggio dei laser rispetto alle lampade ad arco; infatti, per il trattamento, si usa un laser a coloranti a 630 nm focalizzato su una fibra ottica di 200 m di diametro che pu essere agevolmente inserita nella massa tumorale e permette quindi un trasporto controllato e in profondit della luce. 2. L'avvento dei laser sembra aver aperto un nuovo campo di applicazione, in particolare lo stimolo delle propriet vitali delle cellule, quali la sintesi del DNA, l'aumento della velocit di divisione delle cellule e la rigenerazione accelerata dei tessuti feriti o piagati; anche se esistevano gi in letteratura esperimenti positivi della cosiddetta biostimolazione con sorgenti convenzionali (incoerenti), si ipotizzato che questa capacit sia dovuta ad una interazione coerente radiazione-materia. t semplice invece far vedere che per avere un'interazione coerente tra radiazione e materia non sufficiente avere una radiazione coerente ma bisogna tener conto delle propriet di coerenza della materia. Si pu calcolare che, a temperatura ambiente, l'intensit di
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soglia per assorbimenti coerenti in composti che assorbono luce rossa (laser He-Ne a 632,8 nm) dell'ordine di 1011 W/cm2 mentre le intensit usate nella biostimolazione sono nell'intervallo 10-4-10-2 W/cm-2 . Questo significa che in condizioni fisiologiche l'assorbimento di luce di debole intensit da parte di sistemi biologici totalmente incoerente. Purtuttavia, effetti di biostimolazione sono stati osservati ripetutamente sia su colture cellulari sia in vivo. 1 meccanismi sono in gran parte sconosciuti e diversi in batteri, in singole cellule eucariote o in tessuti, ma sembra che la luce, attraverso fotoaccettori sconosciuti, interferisca sulla catena respiratoria delle cellule.

La possibilit di raggiungere intensit elevatissime, inaccessibili alle sorgenti convenzionali e di poter collimare il fascio fino a dimensioni dell'ordine della lunghezza d'onda, ha reso il laser uno strumento unico per uso chirurgico. I meccanismi, attraverso i quali viene asportata la parte interessata, dipendono dal tipo di tessuto, dalla lunghezza d'onda del laser, dal tipo di stimolazione, continua od impulsata e, in questo caso, dalla durata dell'impulso. Anche se nel caso di ablazione di tessuti con laser ad eccimeri nell'ultravioletto, si ipotizzato (ma la questione controversa) un processo di fotodecomposizione (cio un processo fotochimico, innescato dalla rottura dei legami chimici), in generale l'asportazione avviene per effetto termico, ed il tipo di risultato (vaporizzazione del tessuto, coagulazione dei vasi sanguigni, disidratazione del tessuto) dipende dalla lunghezza d'onda e dal tipo di tessuto da asportare. 1 vantaggi del laser rispetto ad altri tipi di strumenti chirurgici, quali bisturi o elettro-coagulazione sono indicati di seguito: 1) Il laser pu tagliare, vaporizzare e coagulare tessuti senza alcun contatto meccanico; ci particolarmente importante nel maneggiare tessuti delicati come in neurochirurgia e/o oftalmologia. 2) E' possibile la micromanipolazione del bisturi sotto microscopio, senza intervento delle mani del chirurgo. 3) L'accuratezza del taglio e la dimensione del fascio laser sono rispettivamente superiore ed inferiore a quelle ottenibili con altri strumenti chirurgici.
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4) E possibile l'emostasi, usando un laser ausiliario per la coagulazione dei vasi sanguigni coinvolti nell'operazione. 5) t possibile la sterilizzazione dell'ambiente, poich anche i batteri sono vaporizzati insieme al tessuto.

Il laser viene ad esempio comunemente usato in dermatologia, in oftalmologia per operazioni sia a livello di retina che di cornea, in neurochirurgia per asportazioni di tumori, nelle cure dentarie; un nuovo campo si aperto negli ultimi anni nella cura delle malattie cardiovascolari. In particolare, con la cosiddetta laser angioplastica si riesce a ricanalizzare arterie, ostruite per ateriosclerosi, mediante la luce laser trasportata all'interno del cuore mediante catetere (Fig. 13.20.). Molti problemi comunque debbono ancora essere risolti per ottimizzare l'intensit, la lunghezza d'onda e la durata dell'impulso laser e per evitare la necrosi di tessuti diversi dalle placche che si vogliono asportare.
13.2. Tomografia Le tecniche ottiche convenzionali forniscono immagini bidimensionali di una struttura tridimensionale: l'informazione in profondit persa come integrazione di piani sovrapposti. t al fine di ottenere immagini di uno specifico piano, che sono state sviluppate tecniche tomografiche (dal greco tomos = sezione). Un vasto spettro di applicazioni risultano possibili dalla ricostruzione tridimensionale, utilizzando opportuni algoritmi, (tomograria) di immagini del corpo umano esposto alle pi diverse radiazioni e, in particolare: 1) la tomografia assiale computerizzata a raggi X (TAC); la prima tomografia introdotta e utilizza radiazioni altamente ionizzanti (Fig. 13.21.); 2) la tomografia a emissione di positroni (PET); si basa sull'impiego di radionuclidi capaci di emettere positroni. Alcuni risultati relativi alla visualizzazione dell'attivit cerebrale correlata a stimolazioni acustiche e visive hanno suscitato notevole interesse nella comunit scientifica; 3) la tomografia ad emissione di fotone singolo (SPECT) e la tomografia Compton, esempi del recupero di noti principi fisici, hanno trovato nelle tecniche di tomografia via calcolatore inimmaginabili sviluppi applicativi;
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4) la tomografia ad ultrasuoni; un esempio di tecnica diagnostica non invasiva con crescente uso nella pratica medica; 5) la termografia; una tecnica in cui immagini vengono correlate alla distribuzione di temperatura nella superficie cutanea, come espressione dell'attivit termica locale delle strutture cellulari; 6) la tomografia a risonanza magnetica nucleare (NMR); l'ultima apparsa in ordine temporale, e basata sull'uso di radiazioni non ionizzanti e di un campo magnetico, ha rivoluzionato la diagnostica clinica. Tali tecniche hanno dato origine ai tomografi, strumentazioni biomediche di sicuro impatto diagnostico; in particolare il tomografo assiale computerizzato a raggi X (TAC), il tomografo ad emissione di protoni (PET) e, pi recentemente, la risonanza magnetica nucleare (NMR) noti anche al pubblico, per i loro successi in alcune applicazioni mediche. Le tre tecniche sono applicazioni di un unico problema matematico, il problema di Radon (Fig. 13.22.), ossia della ricostruzione tridimensionale di immagini (nella fattispecie il corpo umano od uno dei suoi organi) da numerose proiezioni dell'interazione oggetto-radiazioni. Mentre per la TAC e il PET emettono radiazioni molto dannose per l'uomo (specie in seguito a ripetute esposizioni, che, se pure a dosi bassissime, possono sommarsi pericolosamente nel corso di una esistenza ed indurre mutazioni e trasformazioni cellulari) la tomografia ad NMR usa campi magnetici e radiazioni non ionizzanti a radiofrequenze di nessuna comprovata pericolosit. La tomografia a livello di singole cellule e tessuti, discussa precedentemente nel Capitolo 8, non appartiene a questo capitolo pur permettendo il riconoscimento di patologie ed anomalie attraverso la ricostruzione tridimensionale delle stesse cellule.
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13.2.1. Tomografia assiale computerizzata a raggi X La tomografia assiale computerizzata a raggi X (TAC), attraverso una ricostruzione tridimensionale del corpo o tessuto umano da una serie di immagini radiografiche acquisite a diverse angolazioni su tutto l'angolo solido, fornisce un prodotto fruibile direttamente dal clinico, ossia una precisa correlazione dell'indagine tridimensionale con la struttura anatomo-funzionale del paziente. Mediante la TAC (Fig. 13.23) si ottiene una matrice di numeri che rappresentano le densit radiologiche relative a un definito <VOXEL (elemento di volume) in una certa fetta del segmento biologico esaminato. Mediante tecniche di elaborazione e visualizzazione di immagine, tali matrici di numeri possono venire rappresentate pixel per pixel (ossia punto per punto dell'immagine) mediante opportune distribuzioni di tonalit di grigio e/o di colore.

La TAC cosi in grado di offrire all'operatore medico una immagine atta a sfruttare l'enorme capacit di analisi del sistema visivo umano. L'immissione sul mercato della TAC ha sollecitato laboratori e ricercatori a sfruttare le potenzialit teoriche di vari sistemi di indagine, al fine di ottenere immagini articolate e pronte alla utilizzazione clinica, quali: 1) il ricostruttore spaziale dinamico, che consente l'analisi dinamica di certi segmenti corporei, in modo particolare il muscolo cardiaco; 2) la radiografia digitale, attraverso la quale, utilizzando la stessa tecnologia dei rilevatori di raggi X impiegata nella TAC, si ottengono le informazioni radiologiche direttamente in forma numerica; 3) la radioscopia digitale, nella quale l'immagine, proveniente dall'intensificatore di luminosit, viene convertita in forma numerica, previa trasformazione in un segnale video, da parte di una telecamera ad elevata risoluzione, a sua volta controllata ed elaborata da microprocessore. L'introduzione di tali nuove apparecchiature e la diffusione dell'uso di immagini digitali, ha indotto alla ricerca di un rinnovamento anche nelle tecniche chirurgiche. Tra le specializzazioni chirurgiche, la neurochirurgia per prima si prestata ad un trasferimento delle innovazioni apportate dalle nuove tecnologie, in quanto chirurgia di uno spazio chiuso, il cui contenuto praticamente insensibile alle fasi respiratorie ed alle pulsazioni cardiache.
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Tipico scopo in neurochirurgia quello di raggiungere qualunque regione cerebrale con il minimo traumatismo al parenchima sano; la tecnica che attualmente lo permette quella denominata stereotassica. Questa tecnica consiste nel fissare al capo del malato un casco (che costituisce un sistema di riferimento solidale con il cranio) che serve da guida per una sottile sonda che viene avanzata, attraverso un piccolo foro nella testa, con movimento micrometrico verso la zona bersaglio con un margine di errore di un millimetro. Il sistema attuale di localizzazione del bersaglio rappresentato dalla coppia ortogonale di radiografie di proiezione (antero-posteriore e laterale), dalle quali si ricavano le coordinate del bersaglio, oppure da una serie parallela di un esame TAC o NMR eseguito in condizioni stereotassiche. In entrambi i casi, le immagini mostrano la posizione di strutture endocraniche e, contemporaneamente, punti di riferimento del casco stereotassico, consentendo quindi il calcolo delle coordinate del bersaglio relativamente al sistema di riferimento del casco. In generale, la TAC viene preferita nel caso di bersaglio visibile (una lesione espansiva cerebrale, per esempio), eventualit che si presenta di frequente nelle biopsie cerebrali. Nei casi per in cui l'anatomia cerebrale sia normale, e la malattia per la quale si esegue l'intervento consista nella disfunzione di un limitato gruppo cellulare (che sostiene disturbi del movimento, del tono muscolare, tremori, sindromi dolorose croniche, o certi tipi di epilessie) la TAC non riesce a dare sufficienti elementi per localizzare queste strutture. La procedura contempla in questo caso la consultazione di mappe cerebrali (gli atlanti stereotassici), che indicano - su sezioni anatomiche colorate con tecniche istologiche - la posizione dei gruppi cellulari a diversa funzione. La conferma della corretta localizzazione del bersaglio avviene, di volta in volta, con tecniche neurofisiologiche. In quest'ambito apparsa rilevante l'acquisizione dell'atlante, una sorta di modello cerebrale normale tridimensionale in forma numerica, dal quale possibile ricavare informazioni anatomiche adatte al caso individuale, dopo un procedimento di scaling tridimensionaIe operato tenendo conto del maggior numero possibile di punti anatomici di riferimento situati attorno alla struttura scelta come bersaglio, ed individuati con adeguati esami neuroradiologici. L'importanza di un simile atlante consiste, oltre che nella semplice visualizzazione anatomica, nella possibilit di utilizzarlo come serbatoio di dati neurofisiologici, rilevati nel corso di successivi interventi, in modo che anch'essi possano costituire un importante elemento decisionale nella scelta della traiettoria della sonda e nella localizzazione del bersaglio. L'utilit dell'atlante, ottenuto attraverso la ricostruzione tridimensionale (3D) di sezioni fisiche opportunamente colorate del cervello umano, si estende ad altre applicazioni. Sempre in neurochirurgia la disponibilit di strumenti di ablazione e coagulazione di nuovo tipo (laser veicolato da fibre ottiche, aspiratori ad ultrasuoni) pu, se combinato ad apparecchi di controllo - on line - delle fasi operatorie (quali tomografi NMR dedicati del tipo descritto in Fig. 13.30.), permettere l'applicazione dei principi della neurochirurgia stereotassica anche a procedure ablative (ora dominio esclusivo della neurochirurgia tradizionale ) con sicuro risparmio del tessuto cerebrale normale. Piccole neoplasie situate profondamente nel parenchima cerebrale, ora diagnosticate precocemente da NMR e TAC, o malformazioni vascolari situate nella profondit del tessuto funzionalmente importante (centri della parola, regioni motorie) saranno raggiunti e coagulati - o asportati tramite sottili sonde, senza necessit di sacrificio del tessuto circostante. E' chiaro quindi che, allo stato attuale della tecnologia, il potere discriminatorio ottimale si ha dall'utilizza di pi tomografi (ivi inclusa la TAC) utilizzanti le pi diverse sorgenti di radiazioni, per la valutazione anche delle pi complesse lesioni (siano esse vascolari, infiltranti o benigne).

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13.2.2. Tomografia ad ultrasuoni La tomografia ad ultrasuoni applicata alla diagnostica medica , negli ultimi anni, cresciuta per importanza a un ritmo notevole, e viene oggi spesso usata in sostituzione della tomografia assiale computerizzata a raggi X. Le tecniche diagnostiche tramite ultrasuoni sono ormai entrate nella routine ospedaliera (Fig. 13.24.).

Tale successo da attribuirsi al fatto che gli ultrasuoni rappresentano uno strumento ideale di indagine; la metodica non invasiva, di semplice e rapido impiego, facilmente ripetibile e sicura, e non richiede grandi investimenti economici. Oltre venti anni fa vennero poste le fondamenta dei moderni sistemi ad ultrasuoni applicati alla diagnostica medica. Risalgono infatti a questo periodo le prime apparecchiature per indagini monodimensionali e la ricerca di base per applicazioni bidimensionali.

Tipicamente gli ultrasuoni sono prodotti da un oggetto vibrante e consistono di onde meccaniche in grado di propagarsi con una serie di compressioni e rarefazioni attraverso i tessuti del corpo umano. La velocit (V) con cui tali onde viaggiano di 1540 m/s-1, corrispondente ad una lunghezza d'onda (A) eguale a 0,44 mm se si tiene conto che la frequenza di oscillazione tipicamente usata nella tomografia ad ultrasuoni v = 3,5 MHz, ossia 3,5 x 106 cicli/s, ove = V/v rappresenta la massima risoluzione ottenibile in una immagine ad ultrasuoni.
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La tomografia ad ultrasuoni si basa appunto sulla propagazione di tali onde longitudinali (nome derivante dall'oscillazione in avanti e indietro delle particelle del mezzo attraversato dagli ultrasuoni lungo il loro cammino lineare) e sulla conseguente produzione e rivelazione (Fig. 13.25.) dell'eco risultante dall'impatto di tale onda con le zone di discontinuit eventualmente presenti nel tessuto attraversato; qualsiasi disomogeneit causa infatti la riflessione sotto forma di eco di una frazione degli ultrasuoni, che viagger quindi all'indietro per essere rivelata da un opportuno trasduttore. La tensione prodotta dal trasduttore viene amplificata e rivelata dall'apparenza di uno spike sull'oscilloscopio (Fig. 13.25.). Tenuto conto che l'ultrasuono impiega un millesimo di secondo ad attraversare 72 cm di tessuto in ambo le direzioni, l'impulso pu essere trasmesso oltre 1000 volte per secondo in modo da dare l'impressione di un'immagine continua sullo schermo (Fig. 13.24.). Le metodiche di analisi e le applicazioni cliniche si sono sempre pi sviluppate, richiedendo via via strumenti pi sofisticati: sono infatti praticamente scomparse dal mercato le apparecchiature per la sola rappresentazione degli echi lungo una sola linea di vista (A mode, amplitude mode) e per la sola rappresentazione degli echi lungo una sola linea di vista al variare del tempo (M mode), motion mode; tali funzioni sono diventate entrambe normale corredo delle apparecchiature bidimensionali.

La strumentazione ad ultrasuoni oggi disponibile pu essere classificata in vario modo; il criterio pi ricorrente comunque quello di classificare le apparecchiature in accordo con il formato dell'immagine presentata e con le caratteristiche dinamiche dell'immagine. La strumentazione per la rappresentazione di immagini bidimensionali (B mode) comprende le seguenti apparecchiature: 1) apparecchiature lineari in tempo reale, ossia apparecchiature con trasduttori a cortina, in grado di fornire immagini bidimensionali in tempo reale, in cui le linee di vista sono parallele (Fig. 13.26.); tali apparecchiature sono in genere specializzate per usi in internistica, ostetricia e ginecologia; 2) apparecchiature settoriali in tempo reale, ossia apparecchiature con trasduttori meccanici con cristallo oscillante, capaci di fornire immagini bidimensionali in tempo reale, in cui le linee di vista si aprono a ventaglio formando un settore circolare. I settoriali, essendo le dimensioni dei trasduttore tali da consentire il posizionamento tra gli spazi intercostali, sono in genere gli unici strumenti adoperati per uso cardiologico; spesso, per vengono utilizzati con successo anche in internistica, ostetricia e ginecologia;
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3) apparecchiature per immagini bidimensionali (B mode) statiche con braccio meccanico, ossia apparecchiature con trasduttori a cristallo singolo montato su un braccio meccanico asservito; le immagini bidimensionali fornite sono di tipo statico. Le apparecchiature a braccio meccanico presentano in genere una buona qualit di immagine, ma hanno lo svantaggio di non fornire immagini in tempo reale, di essere molto ingombranti, costose e difficili da usare. Prima che le immagini fornite dalle apparecchiature in tempo reale raggiungessero lo standard qualitativo attuale, le apparecchiature a braccio meccanico erano le uniche capaci di produrre immagini bidimensionali soddisfacenti: oggi per questi sistemi hanno ormai ceduto il passo alle apparecchiature bidimensionali in tempo reale.

4) apparecchiature con trasduttore a cortina sagomato in modo convesso, convex real time, in grado di fornire immagini bidimensionali in tempo reale simili ai B mode statici. Queste apparecchiature sono apparse in tempi pi recenti (dal 1983); il loro impiego ideale in internistica, ostetricia e ginecologia. I convex associano all'ampio campo di vista, tipico dei B mode statici, il tempo reale delle apparecchiature lineari; 5) sistemi composti, apparecchiature che, in genere, comprendono le funzioni lineare e settoriale e, in alcuni casi, anche la funzione convex. 1 sistemi composti sono anch'essi una novit degli ultimi anni e sono destinati ad un sicuro successo, data la loro molteplicit di impiego. La strumentazione ad ultrasuoni comprende inoltre un'estesa gamma di apparecchiature per impieghi specifici; tra queste, le pi diffuse sono le apparecchiature per oculistica, per l'esame della tiroide, del seno, ed il Doppler (basato sull'omonimo principio dello spostamento in frequenza subito da un'onda sonora riflessa da un corpo in moto), L'effetto Doppler, discusso in dettaglio nel paragrafo 13.1.6., sulla strumentazione biomedica dei laser, ed utilizzato anche per il controllo del flusso ematico, ha compiuto un notevole salto di qualit con l'avvento del

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Doppler pulsato e delle tecniche multigate; per quanto riguarda il Doppler sono stati compiuti, di recente, sviluppi interessanti anche nel campo della tomografia. Da questa rapida analisi traspare l'evoluzione che le apparecchiature ad ultrasuoni hanno avuto negli ultimi anni: si passati dal monodimensionale al bidimensionale, dalle immagini bidimensionali statiche alle immagini bidimensionali in tempo reale. Inoltre, con l'evoluzione delle tecniche di signal processing, l'introduzione di componenti ad alta scala di integrazione e lo sviluppo della tecnologia dei computer, la strumentazione degli anni '80 si trasformata da apparecchiature di analisi tramite ultrasuoni ad una vera e propria tomografia tramite ultrasuoni. Le moderne apparecchiature ad ultrasuoni prevedono infatti procedure di funzionamento di tipo interattivo, ampia capacit di calcolo, software di routine per la generazione di istogrammi e per l'estrazione di parametri quantitativi del segnale ultrasonoro. Per l'immediato futuro risulta di grande interesse la possibilit di estrarre dall'eco riflesso informazioni correlabili alle caratteristiche dei tessuti visualizzati.
Apparecchiature B mode in tempo reale

Come spiegato in precedenza, i dispositivi ecografici sono basati sul principio del radar/sonar che correla l'ampiezza dell'eco riflesso alla profondit, mediante la misura del tempo di volo del segnale: infatti possibile determinare la profondit delle strutture riflettenti, conoscendo la velocit di propagazione del suono nel tessuto umano. In Fig. 13.27. riportato lo schema di un trasduttore settoriale meccanico. Il trasduttore pu essere: 1) a cortina, ossia formato da un gran numero di elementi piezoelettrici (anche pi di 400) (Fig. 13.28.); 2) convesso, la cui ceramica (con intagliati gli elementi attivi) sagomata in modo convesso: il fascio ultrasonoro viene emesso radialmente e diviene possibile formare un settore senza le complicazioni circuitali presenti nelle apparecchiature settoriali che impiegano trasduttori a cortina con superficie lineare;
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3) meccanico settoriale, costituito da uno o pi cristalli mossi da un piccolo motore elettrico; l'angolo di acquisizione dell'ordine di 90 gradi. Le frequenze tipiche dei trasduttori sono comprese tra 2 e 10 MHz; all'aumentare della frequenza migliora la risoluzione, ma cresce anche l'attenuazione. In genere, i trasduttori a frequenza maggiore di 5 MHz vengono impiegati per l'analisi di organi superficiali e per usi speciali. L'architettura del modulo di trasmissione/ricezione diversa a seconda del tipo di trasduttore utilizzato. Le modalit di presentazione delle immagini bidimensionali dipendono sempre dal tipo di trascluttore utilizzato: in Fig. 13.29. riportata una immagine con trasduttore convesso.

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13.2.3. Tomografia NMR Poter vedere l'interno del corpo umano in vivo, senza danneggiarlo come pu accadere con la tomografia assiale computerizzata a raggi X, offre al medico enormi possibilit diagnostiche (e di riflesso terapeutiche) difficilmente ottenibili in altri modi. Una sonda di questo genere, in grado di far vedere le strutture interne del corpo fin nelle sue parti pi microscopiche (in linea di principio fino alla scala molecolare) la tomografia a risonanza magnetica nucleare (NMR); con questa tecnica, in un futuro non molto lontano, sar possibile poter comprendere la radice molecolare dei fenomeni macroscopici osservati. La cultura diagnostica dominante ha sinora associato il concetto di vedere alla formazione di immagini che riproducano nel maggior dettaglio possibile l'anatomia del corpo umano; di qui la vasta diffusione della TAC e la presente popolare sottoutilizzazione da parte dei radiologi di nuovi tomografi NMR in ambito puramente morfologico. La tomografia a risonanza magnetica nucleare (Fig. 13.30.), ad esempio quella all'idrogeno, una nuova tecnica, o meglio un insieme di nuove tecniche, che permette di rappresentare la struttura interna del corpo umano attraverso la diversa concentrazione d'acqua fra i tessuti, usando come sonda radiazioni elettromagnetiche a bassissima frequenza, simile a quelle delle onde usate per le trasmissioni radio in modulazione di ampiezza (AM). L'uso di frequenze cosi basse reso possibile dal diverso comportamento che i tessuti biologici hanno nell'interagire con queste radiazioni I raggi X, come noto, attraversano con parziale attenuazione il corpo umano, mentre alle frequenze inferiori (e cio l'ultravioletto, il visibile, l'infrarosso e le microonde) la radiazione praticamente tutta riflessa o assorbita e il corpo appare opaco. Solo scendendo ancora in frequenza, alle radiofrequenze (RF) appunto, i tessuti diventano nuovamente trasparenti. In particolare questo avviene a frequenze dell'ordine della decina di MHz cio, a lunghezze d'onda di parecchi metri, ben lontane, quindi, da quelle dei raggi X, che sono dell'ordine di decimi di nanometro (10-10 m). Dato che le onde elettromagnetiche trasportano energia in modo direttamente proporzionale alla loro frequenza - mentre i raggi X aventi frequenza molto alta hanno un'energia sufficiente a produrre la ionizzazione nelle molecole costituenti le strutture biologiche -, le radiofrequenze aventi frequenza molto bassa non sono invece ionizzanti (uno dei maggiori vantaggi oggi del loro impiego). E grazie a tali basse frequenze ed all'uso di appropriati campi magnetici (circa 0,15 tesla nei primi tomografi introdotti nella realt clinica) che diventa possibile far interagire l'onda radio con i protoni delle molecole d'acqua a elevata mobilit e ricavare, quindi, la distribuzione di densit dei protoni negli organi. Dato che tessuti diversi hanno contenuti d'acqua diversi, l'interazione produrr delle mappe di densit protonica praticamente corrispondenti alla distribuzione nei vari tessuti. La tomografia NMR , comunque, capace non solo di formare immagini della distribuzione della densit dei protoni nei tessuti umani ma, in teoria, anche di altri nuclei come per esempio il fosforo 31, il sodio 23, il carbonio 13 ed altri. Per di pi, essa sensibile, con particolari accorgimenti, a parametri temporali (come per esempio il tempo di rilassamento spin-reticolo descritto nel paragrafo 13.3. 1.) che assumono valori diversi tra tessuti diversi e tra parte sana e parte tumorale di uno stesso organo. E possibile, quindi, ottenere immagini anche dalla variazione dei parametri temporali che, assai spesso, forniscono mappe molto pi definite e contrastate di quelle di densit protonica, soprattutto nell'individuare neoplasie e displasie. Come ampiamente discusso nel Capitolo 3, il requisito fondamentale che una molecola deve possedere per poter essere osservata con la risonanza magnetica nucleare che sia dotata di momento magnetico nucleare associato al momento angolare nucleare (spin). Lo spin nucleare, in assenza di un campo magnetico esterno, orientato a caso cosi che un qualsiasi insieme di molecole non mostra alcuna particolare attivit magnetica a causa del valor medio nullo della magnetizzazione macroscopica (Fig. 13.31.). Non appena, per, vengono sottoposti
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all'azione di un campo magnetico esterno, B0, omogeneo e costante nel tempo, gli spin si orientano, disponendosi ordinatamente nello stesso verso oppure nel verso opposto. A seconda poi del modulo del vettore di spin, i nuclei si distribuiscono sui differenti livelli energetici, con uno schema quantisticamente determinabile. Per esempio, il nucleo dell'atomo di idrogeno (protone) che l'elemento di gran lunga pi diffuso nelle strutture biologiche ed l'elemento pi studiato nei tomografi NMR di prima generazione, ha spin 1/2; il che significa che i livelli energetici quantisticamente permessi sono due, corrispondenti alle componenti di spin 1/2. Di conseguenza, le due orientazioni del momento magnetico del protone non sono ugualmente probabili, ma favorito quello a energia pi bassa, secondo la distribuzione statistica di Boltzmann, producendo quindi all'equilibrio un momento magnetico macroscopico o magnetizzazione M. Vedremo nel seguito che l'utilizzazione delle alterazioni nel vettore M in risposta a sollecitazioni esterne costituisce il fondamento fenomenologico della tomografia a risonanza magnetica nucleare. Quando gli spin vengono irraggiati con fotoni di energia pari a quella che passa tra le due configurazioni di spin, ovvero se la frequenza (v) dell'onda elettromagnetica con cui si perturba il sistema tale da ubbidire alla relazione fondamentale v0 = yB0/2 allora l'energia viene assorbita e si ha il fenomeno della risonanza: il numero di protoni con spin antiparallelo aumenter a spese di quelli con spin parallelo fino a un valore che, se il numero di fotoni a disposizione scelto opportunamente, rende uguali le popolazioni dei due livelli. In quest'ultimo caso ovviamente, la magnetizzazione macroscopica scompare. Con i campi B0 normalmente usati (qualche migliaia di gauss; circa 0,5 gauss il campo magnetico medio terrestre), la frequenza dell'onda elettromagnetica cade nella regione delle radiofrequenze (pochi MHz). Come precedentemente discusso (Capitolo 3), cessata la perturbazione, si ristabilir il primitivo equilibrio tra gli spin e il campo magnetico statico, con modalit temporali misurabili che coinvolgono essenzialmente due parametri. Il primo parametro, il tempo di rilassamento spinreticolo (T1), una misura della efficienza con cui gli spin, eccitati dalla perturbazione, scambiano l'energia eccedente con l'ambiente molecolare circostante (nel caso dell'idrogeno, una misura dello stato fisico dell'acqua, libera contro legata).

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Il secondo importante parametro temporale il tempo di rilassamento spin-spin (T2) invece, non coinvolto in scambi energetici, ma d indicazioni sulla distribuzione dei campi magnetici effettivi, sperimentati localmente dallo spin. Il campo effettivamente sentito dallo spin prodotto dalla sovrapposizione del campo magnetico esterno pi un campo magnetico interno, causato dalla vicinanza degli altri momenti magnetici con cui interagisce (tipo di legame molecolare o gruppo funzionale). Questa informazione, associata all'ampiezza del segnale di rilassamento (proporzionale al numero di spin che partecipano al fenomeno), fornisce la cosiddetta distribuzione delle frequenze di risonanza o spettro di risonanza del sistema. Quando al sistema viene applicato il campo magnetico perturbativo B1 associato a un'onda elettromagnetica di frequenza eguale a quella di Larmor v0 (yB0/2) e perpendicolare a B0 la magnetizzazione M preceder intorno alla direzione di B1 oltre che a quella del campo esterno. In pratica, la precessione della magnetizzazione intorno alla direzione del campo magnetico esterno ricorda quello che succede a una trottola che, oltre a girare su se stessa (spin), ruota
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intorno alla direzione della forza di gravit (precessione). Se la perturbazione durer un tempo t, M si trover ruotato di un certo angolo dalla direzione di B0 proporzionale a t. In termini tecnici si parler allora di impulsi a 45 gradi, a 90 gradi e cosi via. Finita l'azione di B1 il ritorno all'equilibrio della magnetizzazione macroscopica (detto anche precessione libera o FID dalle iniziali di free induction decay) pu essere facilmente seguito usando una bobina a induzione elettromagnetica come antenna per captare le variazioni di M nel tempo (Fig. 13.32.). Infatti, durante il suo riallineamento nella direzione di B0 la magnetizzazione macroscopica produce una variazione di flusso coricatenato alla bobina, osservabile sotto forma di tensione elettrica ai capi della bobina stessa. Cosi, dalla forma e dall'ampiezza della tensione nel tempo, possibile misurare sia T1 sia T2 valutando rispettivamente il tempo di riallineamento di M con il campo magnetico esterno e il tempo di coerenza del segnale nucleare nel piano perpendicolare a B0 (Fig. 13.33.). Da quest'ultimo, che di fatto l'unico segnale sperimentalmente prelevabile dagli spin che si rilassano (la misura di T1 ottenuta con una particolare combinazione di questo), attraverso l'operazione matematica di trasformazione di Fourier, si ottiene lo spettro di risonanza del sistema (Fig.

13.34.). Da tutte queste considerazioni deriva il funzionamento della tomografia a risonanza magnetica nucleare. Le prime immagini NMR riguardanti due tubi capillari riempiti d'acqua furono pubblicate dall'americano Lauterbur agli inizi degli anni '70. I metodi per creare tali immagini NMR ricorrono ad una decodificazione spaziale del segnale NMR. Un gradiente lineare di campo magnetico aggiunto all'originale campo statico tradizionalmente presente nella spettroscopia NMR d origine per ogni sezione, dopo la trasformata di Fourier, ad una immagine che rappresentativa della forma dell'oggetto (vedi anche Fig. 13.34.); la trasformata di Fourier un'operazione matematica (che trasforma una curva, rappresentante l'intensit del segnale in funzione del tempo, in un'altra rappresentante l'intensit del segnale in funzione della frequenza). L'area della curva risultante dalla trasformata di Fourier corrisponde al numero totale di nuclei presenti nel campione (per esempio il numero totale di protoni qualora si irradi con la radiofrequenza a cui risuona l'idrogeno).
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Obbligando infatti il campo magnetico esterno a una certa variazione nello spazio (B = B0 + GxX, ove Gx, il gradiente lungo l'asse x), imporremo, tramite la relazione fondamentale della risonanza, una identica variazione alle frequenze di risonanza in funzione di x, cui possono quindi essere assegnate precise coordinate spaziali (Fig. 13.34.). La distribuzione delle frequenze di risonanza diventa la distribuzione della posizione degli spin risonanti nello spazio. Naturalmente, per far ci, bisogna che la variazione imposta a B0 sia talmente intensa da rendere trascurabile la differenza naturale tra i campi magnetici locali sperimentati normalmente dagli spin (tipicamente un gauss per centimetro). Tutto ci realizzabile con un gradiente costante di campo magnetico, sovrapponendo cio al campo magnetico omogeneo B0 un debole campo (debole rispetto a B0) che varia linearmente nello spazio.

Figura 13.34. (c) Con i profili di densit protonica ottenuti al variare della direzione del gradiente (mantenendone costante l'intensit) si ricostruisce al calcolatore la mappa protonica con un metodo mutuato dalla TAC. Questa particolare tecnica chiamata, per ovvi motivi, di proiezione-ricostruzione e si basa sull'assegnare ad una matrice (un reticolo numerabile) le ampiezze dei segnale NMR relative a determinate frequenze centrate intorno ad un comune punto di simmetria, come il punto di inversione dei gradienti (G). Il sovrapporsi del segnale nei vari elementi della matrice produce una distribuzione di livelli di intensit, ai quali sono assegnate diverse tonalit di grigio, visualizzano la distribuzione dell'acqua nel piano. Molto spesso, piuttosto che tonalit si usa assegnare arbitrariamente dei colori alle diverse intensit per meglio evidenziarle. La definizione della figura cosi ottenuta aumenta naturalmente con l'aumentare del numero di proiezioni con cui si ricostruisce l'immagine. Nella parte (c) sotto al disegno mostrata l'immagine tomografica reale ottenuta dalle otto provette, il cui diametro di circa 2 mm. (Fonte: modificato da MERAVIGLIA, B., Le Scienze, Milano, giugno 1982.) Nella parte (b), due pannelli illustrano come stato possibile ottenere il profilo di densit protonica dell'oggetto lungo una sua qualsiasi direzione. Utilizziamo per questo un sistema eterogeneo molto schematico e asimmetrico, una formata da otto provette piene d'acqua. Quando al modellino si applica un campo B0 omogeneo e costante, parte (a), ogni spin di ogni provetta sperimenta la stessa intensit di campo magnetico (tranne che per le piccole differenze dovute alle interazioni interne al sistema di spin, che qui trascuriamo), cosi che la frequenza di risonanza per tutti v0= B0, Lo spettro di risonanza del sistema infatti formato da un unico ed intenso picco centrato alla frequenza vo. Se, invece, si applica al campione un gradiente lineare di campo magnetico (b) in modo che il campo sperimentato dagli spin varia linearmente al variare della loro posizione lungo una direzione dello spazio (l'asse maggiore della F in figura), allora anche la frequenza di risonanza varier allo stesso modo, permettendo di associare alle frequenze dello spettro NMR delle coordinate spaziali. Nella figura si numerato il campo delle varie provette per mostrarne i corrispondenti picchi nello spettro. In realt, il campo varia in modo continuo e la risoluzione infrequenza dipender, a parit di condizione, dalla intensit del gradiente e dalla omogeneit del campo magnetico esterno.

Variando poi la direzione del gradiente, in modo da avere il profilo di densit protonica a vari angoli, e ricombinando i diversi profili con l'aiuto di un calcolatore, si pu ottenere la mappa della distribuzione degli spin risonanti sul piano di rotazione del gradiente, come mostrato in
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Fig. 13.34. Infatti, sfruttando le sue propriet vettoriali, il gradiente pu essere orientato in ogni direzione dello spazio ottenendo cosi i profili di densit protonica nelle tre dimensioni. Dopo lunghe elaborazioni al calcolatore si arriva alla mappa tridimensionale della distribuzione degli spin. La ricostruzione ottenuta al calcolatore viene comunemente visualizzata su uno schermo e pu essere stampata su carta. Il procedimento appena descritto, per ovvie ragioni, viene chiamato di proiezione-ricostruzione. Ricorrendo quindi ai ben noti metodi di ricostruzione geometrica dalla combinazione di numerose proiezioni (tipici anche della tomografia a raggi X), il segnale NMR viene codificato in corrispondenza di un grosso numero di rotazioni del campo magnetico che coprono tutto l'angolo solido 4. Ogni spettro NMR corrisponde direttamente alla singola proiezione per il medesimo oggetto, ad esempio l'insieme di otto provette a forma di F mostrate in Fig. 13.34.; dall'insieme di tali spettri viene quindi ricostruita col computer l'immagine tridimensionale finale. Vi sono numerosi altri algoritmi per ricostruire via NMR, in modo efficiente, immagini mediche 3D che mostrano una qualit ed una capacit diagnostiche molto superiori alla tradizionale tomografia a raggi X; tra questi, vanno segnalati la trasformazione bidimensionale di Fourier (Fig. 13.35.), il metodo a punto sensibile, l'irraggiamento selettivo, il fonar, l'irraggiamento eco planare, tutti utilizzanti gradienti di grandezza variabile per decodificare i segnali ottenuti e fornire cosi informazioni spaziali. La tecnica pi rapida quella ad irraggiamento selettivo, dell'ordine di secondi (contro le altre dell'ordine di minuti) a spese, per, della risoluzione spaziale e del rapporto segnale/rumore. Le diverse strategie implementate per ottenere immagini 3D NMR cercano di ottimizzare a fini diagnostici il contrasto tra i tessuti normali e quelli patologici; questo contrasto, a sua volta, dipende dal tipo di frequenza temporale usata per generare l'impulso a radiofrequenza. Per esempio, mentre la sequenza tipica dell'impulso della procedura che va sotto il nome di spin-echo (vedi Fig. 13.36.) importantissima per determinare il contrasto

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ottimale tra tessuti con differente T1, sequenze di altro tipo, quale l'inversion recovery (Fig. 13.37.), sono utilizzate per aumentare le differenze in T2 Una particolare attenzione richiede il metodo a punto sensibile, per la sua vasta diffusione; esso si basa su una peculiarit geometrica dei gradienti lineari quando vengono realizzati praticamente in coppie di bobine, ognuna capace di generare un campo magnetico linearmente variabile lungo un'identica direzione dello spazio. Per assicurarsi la linearit del gradiente su di una regione (la pi ampia possibile) i campi generati dalle due bobine vengono sovrapposti invertendo il loro segno (ad esempio invertendo il verso della corrente che circola nei rispettivi conduttori). In questo modo, il campo tra le bobine sar positivo decrescente in una met, nullo nel centro e negativo decrescente nell'altra met. Ci sar un punto in cui il campo magnetico si inverte e avr quindi un'intensit nulla. In questo modo, quando il gradiente sar sovrapposto al campo principale B0, l'intensit del campo magnetico nel punto di inversione sar indipendente sia dall'ampiezza, sia dall'evoluzione temporale del gradiente. In realt, tutto il piano perpendicolare alla direzione del gradiente e passante per il punto di inversione sar a campo costante B0. Usando due di questi gradienti perpendicolari tra loro si otterr una linea a campo statico, frutto dell'intersezione dei due piani dei rispettivi punti d'inversione. L'aggiunta di un terzo gradiente oscillante, perpendicolare ai primi due, selezioner solo un punto a campo statico, il punto sensibile, risultante dall'intersezione tra la precedente linea e il terzo piano statico. Il punto sensibile, in pratica, sar un piccolo volume che definisce il potere risolutivo della tecnica. Se questi gradienti vengono usati su un campione (come ad esempio l'insieme di provette a forma di F gi discusso) al posto dei gradienti statici, il segnale nucleare proveniente dai vari tubicini avr una modulazione supplementare alla frequenza di

inversione dei gradienti (molto minore della frequenza di risonanza dei protoni, in genere qualche decina di Hz). Solo la parte di segnale proveniente dal punto sensibile non sar modulata a bassa frequenza e quindi sar facilmente isolabile dal segnale proveniente da tutto il campione, ad esempio con un filtro analogico passa alto. Selezionato il segnale del punto sensibile se ne misura l'ampiezza (proporzionale alla densit dei protoni in quel punto) a cui sar assegnato un livello di grigio o un colore, assumendo che in tutto il volumetto la densit protonica sia costante (in questo senso le dimensioni del volumetto determinano il potere risolutivo della tecnica). Poich si conoscono le coordinate spaziali che localizzano il volumetto sul campione, si assegna, di fatto, un valore numerico di densit di spin a un punto del campione stesso. Cambiando opportunamente il rapporto tra le correnti nelle bobine dei gradienti possibile muovere il punto sensibile tanto da poter esplorare un piano o, volendo, un volume macroscopico. Si ottiene cosi un'immagine tomografica senza ricorrere n alla trasformata di Fourier della precessione libera n a complicate ricostruzioni al calcolatore, ma semplicemente montando come in un mosaico i livelli di grigio assegnati ai vari volumetti a campo statico.
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Il potere risolutivo della tomografia NMR oggi approssimativamente di uno-due millimetri, limitando il tempo di esposizione del paziente a circa due minuti. Questi risultati sono gi paragonabili a quelli dei primi tomografi a raggi X. La tomografia NMR intrinsecamente tridimensionale, nel senso che il segnale viene prelevato da un volume e poi eventualmente ridotto a quello proveniente da un piano, soprattutto ai fini di diminuire i tempi di misurazione. Un'alternativa comunque percorsa nella tomografia NMR tridimensionale (3D) di immagazzinare nel calcolatore l'informazione proveniente da tutto il volume e successivamente scandire le sezioni volute. Il tempo attualmente richiesto via tomografia 3D) per immagazzinare tutti i dati provenienti dalla sola testa di un uomo di quasi 20 minuti, per cui la rapidit della misura ottenibile con la tomografia bidimensionale (2D) pu essere un fattore critico a seconda delle parti anatomiche da studiare.
Spettroscopia NMR in vivo Una delle tecnologie pi promettenti per il futuro la spettroscopia NMR in vivo, il cui obiettivo di ottenere informazioni circa il funzionamento di organi vitali in situ dalla misura delle modificazioni fisicochimiche che avvengono all'interno del corpo umano da parte di nuclei aventi spin nonzero (Tabella 13. 1.). Studi sul metabolismo sono attualmente in corso per mezzo di alcuni di tali nuclei sufficientemente abbondanti nel corpo umano. Tabella 13.1. Propriet di risonanza di qualche nucleo rilevante dal punto di vista diagnostico a campo costante per uguale numero di nuclei.

Nucleo

H H 13 O 19 F 23 Na 31 P 39 K
2

Abbondanza relativa (%) M 99,98 0,015 1,11 100,00 100,00 100,00 93,10

Sensitivit relativa (%) M 10000 0,96 1,60 83,00 9,30 6,60 0,05

Per un dato nucleo, il prodotto della sua concentrazione nel tessuto, circa 90 m per 'H, per la sua sensitivit NMR a campo costante d una misura della possibilit di rivelazione dello stesso. Numerosi fattori, comunque, limitano il presente progresso nella spettroscopia NMR in vivo, quali l'eccessivo tempo necessario per acquisire i dati, la ridotta risoluzione in termini di volume (da 5 a 9 cm3), la necessit sia di una pi grande intensit nel campo magnetico (oltre 3 tesla) sia di una sua migliore omogeneit sull'intero volume e la limitata penetrazione delle onde radio nel corpo umano. Attualmente, alla luce di queste limitazioni tecnologiche, appare affidabile e relativamente meno costoso per una routine clinica l'uso della tomografia NMR non invasiva pi tradizionale, specie quella all'idrogeno con bassi campi magnetici; infatti, a 0,3-0,5 tesla si ottiene un eccellente rapporto segnale/rumore con contrasto e sensitivit superiore (per molti organi) a quanto ottenibile con i tomografi TAC a raggi X. Inoltre, tanto pi alto il campo (oltre 4-6 tesla appaiono essere richiesti per una vera spettroscopia NMR in vivo), tanto pi alte sono le frequenze radio richieste e tanto pi alto il rischio di possibili effetti dannosi in termini di aumento della temperatura corporea, di ionizzazioni o di altre alterazioni strutturali a livello dei tessuti analizzati.
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E quindi necessaria un'ulteriore ricerca nel settore della biofisica, sia a livello molecolare sia strumentale, per fare della spettroscopia NMR una realt clinica con sicuro ed effettivo impatto diagnostico; in grado, cio, di rivelare malattie ad uno stadio estremamente precoce (molto spesso l'unico ancora curabile). Ad esempio, la scoperta di un cancro ad uno stadio preneoplastico e quindi ancora localizzato nel sito primario, consentirebbe di uccidere, rimuovere chirurgicamente o trasformare a rovescio le cellule tumorali prima che le stesse metastatizzino in siti lontani. Dalla tecnica fonar, basata sulla generazione di un campo magnetico fortemente disomogeneo in tutto il corpo, eccetto un piccolo volume in cui omogeneo (una delle prime tecniche NMR, seppure poco utilizzata per il basso segnale/rumore e la eccessiva macchinosit che richiede di spostare il paziente sul punto messo a fuoco), derivata una tecnica molto utile che conosciuta con il nome di Topical NMR o TMR. fi TMR non una tecnica per produrre immagini, bensi sfrutta la possibilit di isolare un volumetto attraverso la focalizzazione dei campo magnetico, per poter operare su questo una spettroscopia NMR a risonanza magnetica nucleare in vivo. Il TMR gi prodotto industrialmente e fa uso di elettromagneti superconduttori a elevata intensit di campo magnetico con cui si migliora notevolmente il rapporto segnale/rumore per ogni tipo di nucleo al quale si voglia applicare. Fino a oggi gli studi sono stati effettuati su arti umani allo scopo di determinare lo spettro in frequenza associato al nucleo del 31P (Fig. 13.38.).

Infatti, purch il campo magnetico nel volumetto focalizzato sia sufficientemente omogeneo, possibile discriminare il segnale del fosforo a seconda del tipo di molecola a cui legato nel volumetto stesso. Il tipo di intorno chimico del fosforo produce uno spostamento particolare della sua frequenza di risonanza tale da permettere l'individuazione della molecola cui associato. Per di pi, dall'intensit dello spettro si pu risalire al numero di nuclei che hanno prodotto il segnale e, quindi, alla concentrazione di queste molecole all'interno del tessuto. Come si sa, fra le molecole che contengono il fosforo vi sono sostanze quali l'ATP (adenosintrifosfato) e la fosfocreatina che partecipano alla produzione dell'energia necessaria alla vita. L'ATP e la fosfocreatina hanno segnali NMR distinti e misurabili; di conseguenza, con il TMR possibile vedere se la produzione di energia nei tessuti avviene regolarmente, o se, a causa di mancato apporto di ossigeno (ad esempio per occlusione di vasi sanguigni), la situazione alterata. Sono quindi identificabili i tessuti ischemici e ci potr aiutare la prevenzione di serie complicazioni quali linfarto. Appare chiaro che il TMR e tecniche simili di spettroscopia in vivo di pi diretto dominio della biofisica, si avviano a diventare di notevole importanza complementare (se non superiore) alle tecniche tomografiche NMR.
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Infatti con queste tecniche, che permettono di studiare le modificazioni a livello molecolare (che ovviamente precedono di anni quelle a livello del tessuto rivelabili via tomografi tradizionali attuali) viene rivoluzionata la diagnostica tradizionale.
13.2.4. Tomografia ad emissione (ECT) La tomografia computerizzata ad emissione (ECT) sviluppatasi nell'ambito della Medicina Nucleare consente di ottenere immagini di sezioni dell'organismo. Un primo approccio alle tecniche scintigrafiche tomografiche risale agli anni '60, basato sul principio di estrarre l'informazione tridimensionale, focalizzando il piano tomografico in interesse. Il piano focale selezionato con l'uso di un collimatore focalizzante accoppiato ad un rivelatore esteso (gamma camera) e l'immagine ottenuta muovendo il rivelatore in diversi punti dell'area di interesse. Limite principale di questa tecnica tuttavia la presenza di piani non desiderati nell'immagine finale, risultando in una perdita di risoluzione e di contrasto. Contrariamente alla tomografia focale, nella ECT le radiazioni sono rivelate unicamente dalla sezione in interesse. La distribuzione della radioattivit nella sezione viene campionata muovendo il sistema di rivelazione in diverse posizioni e a diversi angoli, ottenendo dei profili di attivit (proiezioni). A partire da tali proiezioni l'immagine di distribuzione del radiotracciante nella sezione ottenuta mediante algoritmi di ricostruzione, in genere basati sul principio della retroproiezione, simili a quelli impiegati in altre tecniche tomografiche, quali la TAC. Esistono due tecniche ECT: la tomografia ad emissione di fotone singolo (SPECT) e la tomografia ad emissione di positroni (PET). La SPECT impiega traccianti marcati con isotopi radioattivi emittenti fotoni singoli (Tabella 13.1). La PET impiega traccianti marcati con isotopi radioattivi emittenti positroni (Tabella 13.1). 1 radionuclidi elencati in Tabella 13.3. hanno due caratteristiche fondamentali:

1) i tempi di dimezzamento sono brevi (dell'ordine dei minuti). Questo comporta che la produzione di radionuclidi, mediante ciclotrone, debba avvenire nelle strette vicinanze del tomografo ad emissione di positroni. La necessit di un ciclotrone limita notevolmente la diffusione della PET; 2) i radionuclidi considerati sono isotopi di elementi principali costituenti la materia biologica (carbonio, ossigeno, azoto, fluoro che chimicamente sostituibile all'idrogeno). t pertanto possibile marcare con tali radionuclidi molecole biologicamente importanti, senza alterarne il comportamento nell'organismo, disponendo quindi di traccianti fisiologici. Questo rappresenta uno dei principali vantaggi rispetto alla SPECT.
Tabella 13.2. Isotopi radioattivi emittenti fotone singolo impiegati in tomografia ad emissione di fotone singolo Isotopo Energia(keV) T1/2 99m Tc 141 6,02 h 123 I 159 13,30 h 201 Tl 167 74,00 h 81m Kr 190 13,00 s Tabella 13.3. Isotopi radioattivi emittenti positroni(+) impiegati in tomografia ad emissione di positroni T1/2 Isotopi . (+) Energia max (MeV) 11 C 0,96 20,38 m 13 N 1,19 9,96 m 15 O 1,72 122,10s 18 F 0,63 109,77 m

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Tomografia ad emissione di fotone singolo (SPECT)

Il pi semplice tomografo ad emissione di fotone singolo pu essere pensato come uno scanner che si muove lungo una linea a diversi angoli, campionando la radioattivit nella sezione in interesse. 1 rivelatori impiegati sono cristalli scintillatori, generalmente cristalli di ioduro di sodio Nal(TI), le cui prestazioni sono ottimali per radiazioni gamma di energia nell'intervallo 100-300 keV, quali quelle in interesse (Tabella 13.2.). I tomografi SPECT commercialmente disponibili sono sistemi pi complessi di un semplice scanner e possono essere considerati in due categorie: i sistemi a gamma camera rotante e i sistemi dedicati. I sistemi a gamma camera rotante consistono di una gamma camera in grado di ruotare intorno al paziente. Lo studio tomografico consiste nella rotazione della gamma camera su 360 gradi, rotazione che avviene con moto discreto, in step successivi, nelle diverse posizioni angolari. In un unico studio, cio in ununica rotazione, grazie all'estensione del rivelatore, si ottengono le proiezioni relative a numerose sezioni tomografiche dell'organo in esame (informazione volumetrica). 1 sistemi a gamma camera rotante non sono sistemi dedicati, nel senso che consentono di eseguire studi tomografici di ogni parte del corpo e possono essere impiegati non solo per studi tomografici, ma anche per imaging bidimensionale (scintigrafie). Limiti principali di questi sistemi sono la lentezza e la povera sensibilit. 1) Lentezza: il tempo minimo richiesto per una rotazione completa dell'ordine del minuto; per acquisire una statistica di conteggi adeguata, il tempo richiesto per uno studio di circa 20-30 minuti. Questo comporta la necessit di utilizzare traccianti radioattivi tipo microsfera (si veda MI che non presentano fenomeni di wash out e ridistribuzione e che garantiscono pertanto una condizione di stato stazionario durante l'intera durata dell'esame. 2) Sensibilit per sezione tomografica: la sensibilit per sezione tomografica limitata dalla ridotta superficie di rivelazione (il rivelatore non circonda l'organo in esame). Tuttavia la sensibilit totale del sistema aumentata dal fatto che dati relativi a pi sezioni tomografiche sono simultaneamente registrati in uno studio. I tomografi dedicati sono sistemi dedicati a studi tomografici. Consistono di una distribuzione di cristalli rivelatori intorno all'organo in esame, in forma di n banchi di rivelatori con distribuzione poligonale o come un unico anello di rivelazione. Un singolo anello consente la registrazione di una sola sezione tomografica. 1 tomografi dedicati di disegno pi recente consistono di pi anelli di rivelazione accostati consentendo quindi la registrazione simultanea di pi sezioni tomografiche. I vantaggi di questi sistemi rispetto ai tomografi a gamma camera rotante sono i seguenti. 1) Velocit: i sistemi dedicati consentono studi dinamici, cio consentono di studiare la cinetica di un tracciante radioattivo e quindi di utilizzare non solo traccianti tipo microsfera. 2) Sensibilit per sezione tomografica: poich il rivelatore circonda l'organo in esame, la sensibilit per sezione tomografica superiore a quella dei sistemi a gamma camera rotante. La sensibilit totale dipende dal numero di anelli di rivelazione e dallo spessore della sezione tomografica. La diffusione di sistemi dedicati limitata dal costo superiore rispetto ai sistemi a gamma camera rotante e all'impiego limitato a studi tomografici.
Tomografia ad emissione di positroni (PET)

La tomografia ad emissione di positroni impiega isotopi radioattivi emittenti positroni (+). I positroni sono particelle che hanno la stessa massa e carica degli elettroni, ma segno opposto. Un positrone emesso durante un decadimento radioattivo percorre pochi millimetri nel tessuto e interagisce con un elettrone della materia. Nel processo di interazione le masse delle due particelle si convertono in energia (evento di annichilazione) con la generazione di due radiazioni gamma di 511 keV ciascuna, emesse a 180 gradi l'una rispetto all'altra. Sono queste radiazioni che vengono rivelate dal tomografo ad emissione di positroni. Analogamente alla SPECT, un tomografo PET pu essere semplicemente pensato come una coppia di rivelatori
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in posizioni opposte rispetto all'organo in esame e collegati in un circuito di coincidenza, -atti a rivelare le due radiazioni gamma di annichilazione: un evento rivelato quando le due radiazioni gamma sono rivelate simultaneamente (entro un intervallo di tempo molto piccolo, dell'ordine dei nanosecondi). I rivelatori sono, come per la SPECT, cristalli scintillatori, ma, data la pi alta energia delle radiazioni gamma da rivelare (511 keV), sono necessari cristalli a pi alta densit rispetto allo NaI(Tl), quali il germanato di bismuto (BGO). Anche i tomografi PET sono pi complessi di una semplice coppia di rivelatori in coincidenza, consistendo, in generale, in una distribuzione di cristalli attorno a una circonferenza. Ogni cristallo nell'anello collegato in coincidenza con un banco di cristalli in posizione opposta. Un anello di rivelatori consente di ottenere immagini di una sezione tomografica; accostando pi anelli uno accanto all'altro si ottengono immagini di pi sezioni tomografiche. Gli eventi in coincidenza vengono distinti in: 1) coincidenze vere: coincidenze derivanti dalla rivelazione di radiazioni gamma, generate nello stesso evento di annichilazione; 2) coincidenze casuali: coincidenze derivanti dalla rivelazione di radiazioni gamma, generate in eventi di annichilazione diversi; 3) coincidenze scatterate: coincidenze derivanti dalla rivelazione di radiazioni che hanno subito un effetto Compton, e quindi deviato dalla traiettoria originale. Le coincidenze casuali e scatterate risultano in errori di posizionamento, generando rumore e perdita di risoluzione nell'immagine. E necessario ridurre la rivelazione di coincidenze casuali e scatterate (ottimizzando il disegno del tomografo e l'elettronica di rivelazione) e impiegare tecniche di correzione.
Tomografia ad emissione di positroni a tempo di volo (TOF)

L'utilizzo di BGO come cristallo scintillatore ad alta densit consente di ottimizzare l'efficienza di rivelazione di un tomografo PET, di impiegare cristalli di piccole dimensioni e di ottimizzare pertanto la risoluzione spaziale. Un approccio alternativo quello della tecnica PET a tempo di volo (time offlight, TOF), in cui si ottimizza il rapporto segnale/rumore nelle immagini PET, come descritto qui di seguito. Poich i due fotoni gamma di annichilazione si propagano con la velocit della luce (300000 km/s), se il tempo di arrivo ai due rivelatori in coincidenza noto con sufficiente accuratezza, possibile localizzare la posizione del punto di annichilazione lungo la linea congiungente i due rivelatori. Tuttavia una incertezza temporale di un nanosecondo, risulta in una incertezza di posizione di circa 15 cm. Anche utilizzando cristalli veloci, quali il fluoruro di cesio (CsF) o il fluoruro di bario (BaF2), l'incertezza nella localizzazione dell'ordine di qualche cm, inadeguata quindi all'ottenimento di immagini di distribuzione di radioattivit. L'informazione di tempo di volo pu essere tuttavia impiegata allo scopo di ridurre il rumore nell'immagine nell'ambito degli algoritmi di ricostruzione. La cinetica di un tracciante radioattivo indicativa di un determinato processo fisiologico e la concentrazione regionale di radioattivit risulta correlata al valore del parametro funzionale studiato. La misura regionale di parametri fisiologici quali flusso e metabolismo si ottiene sviluppando modelli matematici che descrivono la cinetica dei tracciante radioattivo: questi risultano in una equazione operazionale, in cui il parametro funzionale in interesse espresso in funzione della concentrazione regionale di radioattivit, ottenuta con tomografia ad emissione, e della funzione di ingresso del tracciante radioattivo, studiata mediante prelievi di sangue arterioso seriati durante l'esame.

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13.2.5. Limiti e vantaggi delle varie tomografie e loro applicazioni cliniche La tomografia computerizzata, utilizzando radiazioni elettromagnetiche, onde meccaniche o particelle elementari ha reso possibile ottenere immagini dei vari organi presenti all'interno del corpo umano altrettanto funzionali quanto quelle ottiche ottenibili per visione diretta degli stessi sul banco di dissezione di un anatomo-patologo od in sala operatoria. Una operazione del genere dilata la nostra percezione naturale oltre i limiti imposti dalla fisiologia (per cui non possibile andare oltre la superficie dei corpi in quanto la radiazione visibile non attraversa il corpo umano) e richiede, parallelamente, una estensione culturale tale da permettere l'interpretazione delle nuove informazioni ottenute. In quest'ambito, vedere significa fare interagire delle radiazioni elettromagnetiche (TAC e NMR), delle onde meccaniche di densit (ultrasuoni), oppure particelle elementari (PET), con il sistema da studiare e, dai cambiamenti intervenuti sulla frequenza e sull'intensit della radiazione (in situazioni fisiche diverse), risalire alla distribuzione delle variabili fisiche responsabili dell'interazione. In questo modo stato precedentemente dimostrato come le mappe di grandezze fisiche quali la densit elettronica, la temperatura, la densit protonica, i tempi di rilassamento ecc. diventino delle immagini sostitutive di quelle ottiche, quando ne venga visualizzata (in senso letterale) la loro variazione nei tessuti biologici. Le rappresentazioni anatomiche ottenute con queste tecniche sono state quindi interpretate attraverso il loro confronto con le relative topografie ottiche. Grazie anche all'aver stabilito tutte le correlazioni possibili con l'anatomia e la patologia conosciute (eventualmente fino a comprendere aspetti sconosciuti della patologia), l'interpretazione delle nuove immagini attraverso tomografia oramai un fatto di routine clinica. Gli ultrasuoni e soprattutto i raggi X ne sono l'esempio pi diffuso: con questi ultimi, i radiologi evidenziano un organo da un altro attraverso la loro differente densit elettronica e chiunque oramai sa come l'apparire o meno di opacit sulle radiografie possa significare l'esistenza di certe malattie. Ma anche le onde radio stanno rapidamente diventando una routine (almeno per quanto concerne la tomografia NMR a 0,15-0,35 tesla, utilizzante 1H come sonda). Le onde elettromagnetiche usate nell'NMR per sintonizzarsi a specifiche specie nucleari sono infatti nell'intervallo delle onde radio (45,27 MHz per l'idrogeno, 17,24 MHz per il fosforo e 11,26 MHz per il sodio, in presenza di un campo magnetico di 10 kgauss), il che equivale ad un'energia che molto al di sotto di quella a raggi X o addirittura a quella della luce visibile che, perci, non disgrega e non rompe le molecole che formano i sistemi cellulari. Tale fenomeno, inoltre, rende possibile, con molta precisione, la misura del campo magnetico all'interno della materia sotto forma di piccole modifiche nella frequenza dei segnali radio emessi dal dato nucleo atomico. Se l'intensit del campo magnetico applicato non distribuita uniformemente, le frequenze del segnale codificano l'informazione spaziale, cio permettono la formazione di immagini di organi umani che rappresentano le concentrazioni nucleari, gli effetti delle strutture, dell'ambiente e dei moti molecolari sul segnale NMR. In questo modo, si possono tradurre in dettagliate immagini tridimensionali (all'idrogeno, al fosforo o al sodio giocando su frequenza ed intensit del campo magnetico) modificazioni a livello molecolare, indici di alterazioni nel metabolismo e nelle propriet biofisico-chimiche dei tessuti, e non soltanto delle loro caratteristiche morfologiche; il che, nel tempo, render sicuramente obsolete le tecniche radiologiche in molte diagnosi cliniche. Ad esempio, nelle diagnosi precoci del cancro, il tomografo NMR potrebbe consentire in tempi non lontani la rivelazione della fase preneoplastica, che corrisponde allo stadio cellulare in cui la trasformazione irreversibile ma ancora locale e quindi sradicabile; il contrario avviene oggi con la TAC a raggi X che, nelle migliori condizioni, rivela un tumore quando ha raggiunto dimensioni che lo rendono intrattabile.

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Le prime pagine del pi recente capitolo sulla diagnosi precoce del cancro non invasivo sono state gi scritte dalla tomografia NMR. Gi allo stato attuale essa appare in grado di superare i limiti della TAC, legata alla necessit di un assorbimento differenziale della radiazione a raggi X da parte delle lesioni patologiche rispetto ai tessuti normali circostanti. Tale assorbimento differenziale manca negli stadi preneoplastici o anche nello stato iniziale del processo neoplastico, per cui la TAC d un qualche risultato solo quando la lesione grande abbastanza da indurre cambiamenti anatomici nel tessuto. Contrariamente i segnali NMR sono sensibili non solo ai pi sottili dettagli anatomici che, per inciso, sono visti a risoluzione ben pi alta ma, anche, alle modificazioni tipiche della trasformazione neoplastica, sia al livello della struttura delle principali macromolecole biologiche sia al livello di modeste alterazioni metaboliche o di mutamenti nello stato fisico dell'acqua (costituente fondamentale del corpo umano, ove raggiunge il 70 % per peso nei tessuti). A causa di tale sua capacit di trasformare informazioni spettroscopiche tradizionali (per esempio tempi di rilassamento e shift, spostamenti chimici) in immagini tridimensionali, la NMR appare in grado di fornire agli oncologi un nuovo e potente strumento per la diagnosi precoce del cancro. Attraverso il nucleo di fosforo, costituente fondamentale sia di molecole che mediano il trasferimento di energia nelle cellule umane (vedi ATP e fosfocreatina) sia di enzimi e proteine la cui fosforilazione associata al controllo dell'espressione genica, potrebbe essere possibile in un prossimo futuro determinare via tomografia NMR lo stato metabolico di ogni organo a livello delle singole cellule con un grosso impatto sulla pratica clinica (da quella oncologica sino a quella cardiovascolare). Comunque, la maggior parte delle immagini mediche sono state ottenute finora attraverso la risonanza di nuclei di idrogeno, anche perch molte patologie sono associate a cambiamenti sia nello stato fisico sia nella quantit dell'acqua. Un cambiamento nello stato fisico dell'acqua, in particolare una diminuzione di quella legata a favore di quella libera, tipicamente associato all'iniziazione del processo neoplastico, mentre di segno opposto un aumento nella proliferazione cellulare. Tale cambiamento nello stato fisico dell'acqua, originariamente osservato in vitro attraverso la spettroscopia NMR, e pi tardi confermato da misure indipendenti di impedenza complessa, rilevabile con la tomografia NMR da misure del tempo di rilassamento T1 del protone - che riflette il tempo necessario al sistema di protoni per riacquistare l'equilibrio termico con il circostante reticolo dopo la fine dell'impulso a radiofrequenza.
Tabella 13.4. Parametri NMR per vari tessuti a 0,15 T Densit T1 T2 T1 /T2 Protonica (ms) (ms) relativa Adulto, materia bianca 0,9 380 85 4,5 Adulto, materia grigia 1 520 95 5,5 Cervello di neonato, materia grigia, 1,1 1100 250 4,4 materia bianca 1,2 1300 250 5,2 Infarto 1,2 1400 250 5,6 Grassi 0,8 170 80 1,4 Cervello, infarto/edema 1 650 120-180 3,6-5,4* Tumore cerebrale 1 700-1200 120-130 3,33,5,0** CSF (liquido cerebrospinale) 1,2 1500 1000 1,5 Meningioma 1 600 100 5,0 Fegato 1 250 50 5,6 Muscoli 1 250 50 5,0 Milza 1 600 100 4,0 *T1 650 ms, T2 150 ms. **T1 800 ms, T2 200 ms Tessuto Biofisica e Tecnologie Biomediche: Capitolo 13: Strumentazione Biomediche 42

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Il procedimento produce immagini pesate in T1, facendo corrispondere il valore di T1 a ciascun pixel (uno dei singoli elementi in cui divisa l'immagine). La mappa derivante estremamente utile nel visualizzare le differenze tra i vari tessuti, in quanto, negli stessi, le variazioni in T1 sono ben pi grandi delle corrispondenti variazioni nella semplice densit protonica (acqua libera). Tale dipendenza del valore di T1 dal tessuto osservato (Tabella 13.4.

compatibile con il fatto che la differenziazione cellulare appare funzione dello stato fisico dell'acqua, piuttosto che della sua quantit. Una esemplificazione del potere diagnostico possibile con la tomografia NMR data nelle Figg. 13.39. e 13.40. In Fig. 13.40., nel cervello umano di un paziente un tumore chiaramente visibile via NMR come una macchia circolare scura. In conclusione, il rapido sviluppo e l'enorme potenzialit della tomografia a risonanza magnetica nucleare rendono difficile e azzardato ogni confronto con le altre tecniche diagnostiche quali la tomografia assiale computerizzata a raggi X, l'ecografia ecc. Sicuramente, se solo anni fa pochi avrebbero scommesso sulla sua applicabilit futura, oggi
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certo che la tomografia NMR rappresenta un fatto rivoluzionario nell'ambito della diagnostica e quindi della terapia. Essa fornisce senza alcun rischio per il paziente, mappe tridimensionali (Fig. 13.22.) di parametri che, oltre a dare un'immagine anatomica, permettono di risalire alla struttura ed alla dinamica dei processi molecolari in vivo. Considerato che non esistono tessuti opachi alle radiofrequenze si ottengono ottime immagini di organi quali la tiroide ed i reni che fino ad oggi avevano richiesto metodi invasivi e rischiosi. 1 tessuti ischemici, ad esempio, possiedono T1 diversi dai tessuti sani e quindi le parti candidate a produrre infarto sono evidenziabili all'interno degli organi. Un'altra applicazione della risonanza magnetica nucleare, che potr avere notevole importanza, la misurazione della portata di fluidi entro i vasi; pi in generale, sar possibile ottenere delle mappe che forniscono la velocit di scorrimento e la portata di tali fluidi. In tutto quanto discusso fin qui abbiamo enfatizzato la tomografia NMR in quanto metodo non invasivo che vede propriet di nuclei naturalmente esistenti nei tessuti. E' conveniente per accennare anche ad un suo uso in un contesto invasivo, quale quello legato alle tante possibilit che l'introduzione nell'organismo di sostanze esterne pu offrire per l'indagine biomedica. Ad esempio, l'introduzione di sali di manganese (MnCl2) accorcia in modo apprezzabile il T1 e ci permette di aumentare il contrasto ove fosse necessario. Un simile effetto si pu ottenere anche aumentando il contenuto di ossigeno molecolare in un certo organo (la molecola O2 paramagnetica). Infine, la possibile introduzione di traccianti non radioattivi quali 2H, 15N, 19F ecc. potr permettere di effettuare una spettroscopia molecolare in situ ed in vivo con sviluppi per la biochimica oggi ancora impensabili.
Applicazioni cliniche della tomografia ad emissione

Recentemente sono stati introdotti nella pratica clinica nuovi traccianti di perfusione marcati con 99mTc; il vantaggio di questi traccianti consiste essenzialmente nella migliore energia per l'imaging con gamma camera, la miglior dosimetria, le migliori statistiche di conteggio, la pronta reperibilit del tracciante e l'assenza del fenomeno di ridistribuzione. Proprio in virt della migliore energia di emissione, tali traccianti si prestano molto favorevolmente per studi di tomografia ad emissione di fotone singolo (SPECT). Il meccanismo di intrappolamento di tali traccianti all'interno della cellula miocardica ancora controverso. Sembra tuttavia che la molecola isonitrilica marcata con tecnezio venga a legarsi ad una proteina citoplasmatica e venga trasportata all'interno della cellula senza procedere ulteriormente a scambi con l'ambiente extracellulare. Proprio per queste caratteristiche tali traccianti vengono anche chiamati microsfere chimiche. Infatti la distribuzione del tracciante rispecchia esattamente la situazione perfusionale del miocardio al momento dell'iniezione, anche se l'imaging viene eseguito dopo circa un'ora e mezza. Il protocollo clinico che si segue pressoch sovrapponibile a quello del tallio, tranne per il fatto che le acquisizioni a riposo vengono eseguite in un giorno differente da quelle dello sforzo. Ci proprio a causa della mancanza di ridistribuzione del tracciante. La quantit usualmente somministrata di circa 740 MBq sia dopo lo sforzo che a riposo. Per completezza, vanno ricordati i radiotraccianti positivi per ricerca di necrosi. Il composto pi comunemente usato il pirofosfato di tecnezio 99m, ma sono stati usati anche il glucoeptonato, tetracicline ed altre sostanze marcate con tecnezio. In pazienti con infarto miocardico di 24-48 ore tali sostanze si concentrano a livello della lesione. Non ancora chiaro quale sia il meccanismo di captazione; sembra comunque che possa essere correlato ad una deposizione microscopica di calcio all'interno delle cellule miocardiche irreversibilmente danneggiate. Nell'infarto si vede un'intensa captazione focale, mentre un accumulo di grado lieve non specifico. La limitazione di tale tecnica sta nel ritardo. di positivizzazione del test e nel fatto che la captazione pu realizzarsi in molte condizioni quali cardiopatie, traumi, pericarditi e molti altri casi. Comunque rimane utile per far luce su molte situazioni diagnostiche difficili e nel valutare un possibile reinfarto o l'estensione di un infarto.
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La SPECT cerebrale stata applicata principalmente alla valutazione del flusso ematico regionale cerebrale (rCBF) mediante luso di traccianti che hanno la caratteristica di distribuirsi in maniera proporzionale al flusso. La misurazione del rCBF permette di valutare alterazioni funzionali che si verificano in seguito a condizioni patologiche senza che vi sia necessariamente la presenza di un'alterazione anatomo-strutturale. In questo senso la SPECT si pone nell'ambito della diagnosi neurologica, come complementare alle tecniche tomografiche di studio dell'anatomia cerebrale quali la tomografia computerizzata (TAC) e la risonanza magnetica nucleare (NMR). La SPECT cerebrale stata utilizzata in numerose patologie neurologiche e principalmente nelle patologie cerebrovascolari, nelle malattie degenerative e nelle epilessie. Nelle patologie cerebrovascolari la SPECT in grado di fornire informazioni sulle alterazioni funzionali che intervengono nel caso di ischemia. Quando si riduce l'apporto sanguigno in un territorio vascolare (in seguito a trombosi o embolia) si innescano meccanismi fisiologici di compenso: inizialmente il paziente ha quindi una riduzione di flusso che viene compensata da una vasodilatazione con un aumento di estrazione di ossigeno; la TAC e la SPECT saranno qui negative ed il paziente non presenta sintomi. Quando la pressione di perfusione continua a diminuire, i meccanismi di compenso non sono pi in grado di mantenere il flusso nella norma ed il paziente incomincia a presentare sintomi; in questa fase la TAC anche negativa poich non c' alterazione strutturale, ma solo funzionale (di flusso), mentre la SPECT presenta una zona di ridotta perfusione che, in genere, correla con la manifestazione clinica presentata dal paziente (per esempio, ipoperfusione frontale sinistra in paziente afasico). Questa pu essere ancora transitoria. Quando entro 24 ore si ha riduzione dei sintomi, si parla di attacco di ischemia transitorio (TIA). Pazienti con ripetuti TIA sono spesso pazienti con stenosi a placche a livello dell'arteria carotidea, sintomi che vengono valutati per eventuale intervento di tromboendoarteriectomia (TIA cardiaco). In questi casi la SPECT pu dare utili informazioni che riguardano lo stato funzionale dei tessuto nervoso tributario del vaso stenotico e quindi valutare gli effetti dell'intervento. Quando la fase ischemica, ossia la riduzione di flusso, non viene pi compensata e la pressione di perfusione continua a diminuire, si arriva al vero e proprio ictus in cui il paziente presenta sintomi conclamati, la TAC pu ancora essere negativa mentre la SPECT sempre positiva. Quando anche la TAC si positivizza (in genere in 3a giornata) il deficit perfusorio osservato alla SPECT rimane spesso pi esteso dell'alterazione strutturale. In fase subacuta (dopo 1-2 ore), si osserva di frequente un transitorio quadro di iperemia nell'area precedentemente ipocaptante; questo fenomeno denominato perfusione di lusso avviene in un'area funzionalmente compromessa e sembra dovuto alla lisi spontanea dell'ocelusione embolica con transitoria riperfusione vasoparalitica dell'infarto. In questo caso la SPECT dimostra un aumento di perfusione. Sono state evidenziate anche aree di ipoperfusione lontane dalla regione ischemica, come ad esempio nell'emisfero cerebellare controlaterale ad una lesione sovratentoriale o nella corteccia omolaterale ad una lesione sottocorticale. Queste alterazioni a distanza sono espressione di ridotta attivit funzionale per fenomeni di disconnessione neuronale (diaschisi cerebellare crociata e diaschisi corticale). La SPECT si rivelata particolarmente sensibile nell'evidenziare pattern di ipoperfusione caratteristici della demenza di Alzheimer. Nei pazienti affetti da questa patologia, si ha una netta ipocaptazione bilaterale della corteccia temporoparietale. Questa anche la zona in cui sono maggiormente presenti le tipiche placche osservate in autopsia ed anche la zona (zona temporale mesiale) responsabile dei processi di memoria, tipicamente danneggiati nella malattia di Alzheimer. Inoltre la SPECT utile nella diagnostica differenziale con la demenza pluriinfartuale, dove si osservano aree di ipoperfusione multiple e asimmetriche, in corrispondenza delle aree anatomicamente lese.

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Per quanto riguarda il morbo di Parkinson, le alterazioni prevalenti sono state descritte a livello dei gangli della base, verosimilmente in rapporto al deficit della neurotrasmissione dopaminergica nigro-striatale. Esistono tuttavia malati di Parkinson in cui si associa demenza. In questi casi il pattern di perfusione simile a quello dell'Alzheimer. Nell'epilessie la SPECT sta sempre pi assumendo importanza diagnostica. t utile studiare epilessie parziali semplici o complesse farmacoresistenti. In questi casi, infatti, spesso difficile dare una localizzazione alla sede del focolaio epilettogeno, in quanto l'EEG d alterazioni grossolane e variabili (migrazione del focolaio) o la TAC o NMR non sono sempre positive. Lo studio di perfusione con SPECT permette di evidenziare in una buona percentuale di pazienti con epilessia farmacoresistente la zona epilettogena, che risulta ipoperfusa durante la fase interictale (ossia in assenza di sintomi clinici o comunque di attivazione EEGgrafica) e iperperfusa durante la fase ictale (crisi) e immediatamente postictale (fino a 15 minuti dopo l'esordio della crisi). Questo dato pu essere utile al neurochirurgo nel caso il paziente debba subire la rimozione chirurgica del focolaio (in genere mediante coticectomia). Nelle forme di epilessia generalizzata la SPECT non ha particolare valore diagnostico principalmente a causa della limitazione nell'interpretazione delle immagini che pu essere solo semiquantitativa (ossia a rapporti) e non quantitativa. Molte applicazioni della SPECT sono in fase sperimentale, come nelle patologie neoplastiche, prima e dopo terapia, nelle emicranie e nelle malattie psicotiche. La SPECT in ambito neurologico presenta attualmente dei margini di miglioramento dal punto di vista tecnico soprattutto nella definizione dell'immagine, mediante sistemi dedicati e notevoli possibilit di sviluppo nell'ambito delle funzioni che possono essere studiate, oltre al rCBF, mediante l'uso di nuovi radiotraccianti (per esempio i neurorecettori). I sistemi dedicati per studi cerebrali presentano essenzialmente due vantaggi dal punto di vista clinico: 1. permettono la visualizzazione delle strutture cerebrali con una buona risoluzione spaziale che va da 7 mm a 10 mm contro i 15 mm della gamma camera rotante; 2. permettono anche una migliore risoluzione temporale, cosa molto importante per lo studio del comportamento di nuovi traccianti in cui bisogna seguire, il pi rapidamente possibile, la cinetica in vivo del tracciante. L'utilizzazione di nuovi farmaci che si legano elettivamente a specifici recettori cellulari ha consentito recentemente lo studio di alcuni sistemi neurorecettoriali del sistema nervoso centrale mediante SPECT. Attualmente sono stati sperimentati i seguenti traccianti, tutti marcati con 1-123: FISCH (recettori dopaminergici D 1), Lisuride e IBMZ (recettori dopaminergici D2), QNB (recettori muscarinici). Lo studio della perfusione regionale del cuore con Tl-201 o traccianti marcati con 99mTc pu mettere in evidenza aree di ridotta perfusione anche a riposo (i cosiddetti difetti di perfusione fissi al Tl-201); queste possono essere dovute: 1. alla presenza di miocardio necrotico; 2. alla presenza di miocardio ischemico ma ancora vitale (per esempio il miocardio definito stuporoso o ibernato). Lo studio PET con 18-FDG ffluorodeossiglucosio) l'unica indagine che consente di stabilire se l'area di miocardio ipoperfuso ancora vitale. Il principale substrato metabolico nel miocardio di un soggetto normale a digiuno rappresentato dagli acidi grassi, che il miocardio metabolizza (per produrre energia) mediante un processo biochimico che richiede ossigeno, e cio la beta-ossidazione. Esiste per nel miocardio anche un meccanismo di riserva, e cio la glicolisi anaerobia, che si attiva appunto quando manca l'ossigeno necessario alla beta-ossidazione degli acidi grassi, e cio in
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condizioni di ischemia. Il 18-FDG si accumula elettivamente nelle zone ischemiche ma ancora vitali, mentre (a digiuno) non si accumula n nel miocardio normale n, ovviamente, nel miocardio necrotico, dove il metabolismo assente. E stato dimostrato in pazienti con pregresso infarto che, circa il 50% dei difetti fissi al TI-201, mostra aumentato uptake all'esame con 18-FDG. Ci assai importante clinicamente perch stato pure dimostrato che la funzione regionale cardiaca migliora, dopo interventi di by pass coronarico, nell'85 % dei segmenti cardiaci identificati come vitali, mentre non migliora nel 96 % dei segmenti identificati come necrotici allo studio PET. Lo studio PET appare quindi estremamente utile, in generale, nella valutazione preoperatoria delle coronaropatie, ma si pu dire che quasi necessario: 1. in pazienti assai compromessi e con bassa frazione di ciezione (40 %), dove il rischio intraoperatorio assai alto, per decidere se intervenire e in caso affermativo su quali vasi coronarici intervenire; 2. in pazienti in cui si prevede di effettuare aneurismectomia; 3. in pazienti in cui si incerti tra by pass (con o senza aneurismectomia) e trapianto di cuore. E' stato recentemente dimostrato che esiste una certa corrispondenza tra il grado di concentrazione di 18-FDG ed il grado istologico di malignit dei tumori cerebrali. Questo metodo, pur non essendo molto accurato, tuttavia indicativo del grado di malignit di un tumore. Si , d'altra parte, dimostrato utilissimo per distinguere (in pazienti gi sottoposti ad intervento chirurgico o radioterapia per tumore al cervello) un danno aspecifico tissutale dovuto al trattamento (edema, necrosi) da una recidiva tumorale. Tale diagnosi differenziale non pu essere fatta, di norma, alla TAC o alla NMR, che non possono discriminare tra crescita tumorale e presenza postoperatoria (o postradioterapica) di tessuto necrotico. Questa distinzione invece relativamente semplice all'esame PET con 18-FDG, in quanto il tessuto necrotico non metabolizza glucosio, mentre le recidive tumorali mostrano un metabolismo glicidico estremamente attivo. Quindi gli studi PET con 18-FDG possono dare interessanti indicazioni sul grado di malignit di un glioma cerebrale ma, soprattutto, sono in grado di diagnosticare una recidiva tumorale dopo trattamento, laddove le altre indagini diagnostiche oggi disponibili (TAC, NMR) non sono in grado di operare la distinzione. Un'ultima applicazione del PET degna di nota quella relativa all'epilessia. Un numero elevato (20%) di pazienti con epilessia non riesce ad essere controllato con terapia farmacologica. In questi pazienti si considera oggi il trattamento chirurgico, se la sede e l'estensione del focus epilettogeno da resecare lo consentono. Nella grandissima maggioranza dei casi non vi sono tuttavia anomalie strutturali riconoscibili con tecniche radiologiche come la TAC e la NMR. Per valutare l'estensione dei foci epilettogeni sono dunque state sviluppate ed applicate particolari tecniche di localizzazione quali l'elettrocorticografia intraoperatoria e la registrazione diretta da elettrodi impiantati in profondit con metodo stereotassico. Tuttavia queste tecniche sono invasive e complesse. Studi PET con 18-FDG eseguiti durante il periodo interictale hanno mostrato, in questi pazienti, riduzione di metabolismo delle aree cerebrali interessate con una buona correlazione tra tecniche metaboliche (18-FDG) ed elettrofisiologiche per quanto riguarda la localizzazione del focus epilettogeno. L'esame PET si propone quindi come metodica accurata e non invasiva per definire le aree epilettogene nella valutazione prechirurgica di pazienti con epilessia temporale farmacoresistente. Occorre tuttavia segnalare che sono attualmente in corso studi comparativi per valutare con quale accuratezza l'informazione ottenibile con 18-FDG e PET in questi pazienti sia paragonabile a quella ottenibile con tecniche pi accessibili, in particolare la SPECT. Poich, infatti, in questi pazienti alla riduzione di metabolismo corrisponde anche una riduzione di flusso, lo studio di perfusione regionale con SPECT,
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particolarmente con strumenti SPECT dedicati ad alta risoluzione, potrebbe essere in futuro valida alternativa alla PET per questo tipo di diagnostica. Va infine ricordato che al di l delle applicazioni cliniche convalidate dalla metodica PET, esaminate nel paragrafo precedente, e che al momento attuale utilizzano principalmente 18FDG, la PET, per la sua versatilit e molteplicit di applicazioni, ha rappresentato e rappresenta uno strumento unico per studi di fisiopatologia clinica. La possibilit di studiare in vivo parametri funzionali quali il flusso ematico cerebrale (CBF) (con 15CO2), il consumo (CMRO2) e l'estrazione (OER) di ossigeno (con 15O2), il metabolismo glicidico (CMRglu) (con 18-FDG), e, come traguardo pi recente, il sistema di neurotrasmettitori cerebrali (marcando i neurotrasmettitori stessi con 11C o 18F), ha consentito notevoli progressi nella comprensione dei meccanismi fisiopatologici cerebrali, aprendo anche la possibilit di nuove procedure diagnostiche in neurologia.

13.3. Spettrometri 13.3. l. Spettrometri NMR La strumentazione per la spettroscopia NMR composta schematicamente nel seguente modo (vedi anche Fig. 13.41.):

1. un magnete in grado di produrre un intenso campo B0 (0,5-15 tesla) caratterizzato da una elevatissima omogeneit; 2. una bobina trasmittente, T, generante un campo magnetico B1, rotante alla frequenza di Larmor. Questo campo applicato in una direzione perpendicolare al campo principale B0; 3. una bobina ricevente, R, con l'asse normale ai campi B0 e B1 (possiamo immaginare T, R e B0 posti lungo gli assi x, y e z di un sistema cartesiano ortogonale di riferimento; 4. un sistema di amplificazione e registrazione del segnale. Nella descrizione del fenomeno NMR, cio del modo con cui il sistema di spin nucleari viene eccitato e successivamente rilassa, molto utile introdurre il concetto di coordinate rotanti (rotating frame). Supponiamo di osservare lo spin di un nucleo, avente I=1/2, immerso in un campo B, Dal laboratorio (sistema di riferimento fisso) un osservatore lo vedr precedere intorno all'asse z alla frequenza di Larmor. Se consideriamo ora un sistema cartesiano ortogonale x' y', z ruotante intorno all'asse z alla frequenza di Larmor e se, sul piano x', y' di questo nuovo sistema, si pone l'osservatore esso vedr lo spin immobile. Questo formalismo puramente matematico e presuppone che nessuna legge della fisica sia cambiata.
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Consideriamo un sistema di N spin, aventi I=1/2, immerso in un campo magnetico B, All'equilibrio termico ci sar una risultante netta M0 lungo l'asse z, le cui componenti nel piano xy sono nulle (vedi Fig. 13.42.). In realt, poich i nuclei esperimentano campi leggermente diversi, a causa della non perfetta omogeneit di B0 o della presenza nel campione di campi locali, essi precederanno lentamente in senso orario o antiorario intorno all'asse z a seconda che siano soggetti a campi leggermente superiori o inferiori a B0 La magnetizzazione risultante nel piano xy ancora nulla, in quanto i nuclei precedono intorno all'asse z con una distribuzione simmetrica e casuale. Se si applica ora, mediante una bobina, un impulso costituito da un debole campo elettromagnetico rotante alla frequenza di Larmor in modo che esso appaia, dalla rotating frame, come un campo magnetico stazionario diretto lungo l'asse x' l'effetto di questo nuovo campo sar quello di allontanare M0 dall'asse z, facendolo ruotare nel piano y'z, di un angolo = gnB1t dove t il tempo di applicazione del campo B1 (vedi Fig. 13.43.a), dove =/2. In questo modo M0 acquista, lungo l'asse in cui posta la bobina ricevente (y'), una componente My con la conseguente comparsa di un segnale (accoppiamento trasmittente-ricevente). Se dopo aver ruotato M0 di un angolo , ad esempio di /2 (Fig. 13.43.a), si annulla il campo B1 la magnetizzazione M0 torner in equilibrio con l'ambiente allineandosi lungo l'asse z, mediante i processi di rilassamento longitudinale (caratterizzati da una costante di tempo T1) con la conseguente scomparsa del segnale nella bobina ricevente. La scomparsa del segnale pu avvenire anche a causa di un processo in cui i nuclei si defasano nel piano orizzontale x, y mediante processi di rilassamento trasversale (caratterizzati dalla costante di tempo T2). In particolare il T2 pu essere visualizzato come il tempo necessario affinch i singoli nuclei perdano la fase uno fispetto all'altro nel piano xy (Fig. 13.43.b). Dal punto di vista dell'acquisizione del segnale, essendo la bobina ricevente posta lungo l'asse delle y', la scomparsa del segnale (componente My della magnetizzazione) al termine dellapplicazione del campo elettromagnetico B1, avverr secondo una legge cinetica del primo ordine con una costante di tempo data, in genere, da l/T2. Questo decadimento della magnetizzazione, registrata dallo strumento, viene chiamato free induction decay (FID) (Fig. 13.43.c). Per quanto riguarda i tempi di rilassamento ci possono essere due casi limite: 1) T1=T2. Nel caso in cui tutti i nuclei siano caratterizzati dalla stessa frequenza di precessione, dopo aver annullato B1, al tendere di M. a M0 la componente di M nel piano xy tende a zero, per cui ogni processo che determina il rilassamento longitudinale coinvolto anche nel rilassamento trasversale. Poich in genere oltre a questo meccanismo ci sono altri meccanismi attraverso i quali i singoli nuclei perdono la fase nel piano xy risulta T2 < T1

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2) T1T2. In questo caso, al cessare della perturbazione dovuta a B0 si ha una rapidissima perdita di fase nel piano xy, con una costante di tempo 1/T2 senza che praticamente vari la magnetizzazione lungo l'asse z che, successivamente, raggiunger la condizione di equilibrio con una costante di tempo l/T.

Misura dei tempi di rilassamento

Le tecniche impulsate sono attualmente le pi efficienti e le pi utilizzate per la misura dei tempi di rilassamento in un ampio intervallo di lavoro. Per la misura del T1 il metodo pi comunemente utilizzato, il cosiddetto inversion recovery method, utilizza una sequenza di due impulsi ad alta potenza del trasmettitore (Fig. 13.44.a). Il primo impulso (un impulso 180 gradi) di durata tale da invertire la magnetizzazione lungo l'asse z' (siamo in sistema di riferimento rotante, rotating frame). Dopo questo impulso ha inizio il rilassamento per effetto del quale il valore della magnetizzazione, da -M0 ritorna passando attraverso lo zero alla sua posizione di equilibrio M0 Se, dopo un certo tempo t, si applica al nostro sistema un impulso di 90 gradi, la magnetizzazione presente in quel momento lungo l'asse z sar ruotata di 90 gradi e potr quindi essere misurata. Se si riporta in grafico il valore di My in funzione dell'intervallo di tempo t otteniamo il grafico di Fig. 13.44.b. Una misura quantitativa del fenomeno si pu fare partendo dall'equazione di Bloch (nel nostro caso MX = My = 0) avremo allora: M M0 dM z = z dt T1 Dopo integrazione avremo: Mz =-M0 per t = 0 si ottiene: Mz = M0 (1 - 2e-/T1) Questa equazione pu essere facilmente riscritta nella forma: = T1 In 2M0/(M0 Mz) Per cui riportando in diagramma i valori di In 2M0/(M0 Mz) in funzione di si ottiene una retta la cui pendenza T1
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La misura del T2, tempo di rilassamento trasversale un po' pi complessa, in quanto la disomogeneit di B0 contribuisce ad aumentare la velocit di rilassamento 1/T2 contributo che bisogna eliminare. Il problema fu risolto da Hahn, con il metodo spin-eco. Questo metodo si basa su una sequenza costituita da un primo impulso da 90 gradi, un tempo di attesa un secondo impulso di 180 gradi e l'osservazione dopo un tempo 2 di un eco (Fig. 13.45.). Infatti, il primo impulso ruota di 90 gradi la magnetizzazione M0 portandola nel piano xy. A questo punto, iniziano i fenomeni di rilassamento nel campione: i meccanismi di rilassamento longitudinale spin-reticolo tendono a riportare la magnetizzazione lungo l'asse z, mentre i meccanismi di rilassamento trasversale spin-spin tendono a defasare gli spin nel piano xy. In particolare, la disomogeneit di B0 fa si che parti del campione in posizioni differenti dello spazio vedano un campo magnetico statico leggermente diverso dai nuclei vicini ed abbiano quindi differenti frequenze di Larmor. L'effetto dell'impulso di 180 gradi quello di invertire gli spin nel piano xy, in modo che quelli che avevano frequenza di Larmor pi elevata della media si trovano indietro rispetto agli altri e quelli con frequenze di Larmor minori si trovano avanti agli altri. In questo modo, dopo un tempo 2 si ottiene un rifasamento degli spin e si pu quindi osservare il cosiddetto eco. Naturalmente, il rifasamento riguarda solamente quei nuclei che perdevano la coerenza di fase per effetto del cosiddetto campo statico B0, mentre il defasamento legato ai meccanismi di rilassamento propri del T2 non viene compensato: l'intensit dell'eco quindi una effettiva misura del tempo di rilassamento T2. Una valutazione quantitativa si ottiene al solito dalle equazioni di Bloch (in questo caso Mz = 0, Mx = 0). Avremo allora dM y = My (13.3.1.)

dt T2 Dopo l'integrazione ponendo My = M0 per - = 0 si ottiene

per cui riportando in diagramma i valori di ln M0/M contro si ottiene una retta la cui pendenza il T2. L'equazione (13.3.1.) pu essere scritta in forma esponenziale

= T2 ln M0/M

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M = M0e-/T2 Generalmente per la misura dei T2 la sequenza sin qui descritta non pu essere utilizzata in quanto all'aumentare di T nei liquidi si ha un notevole contributo al rilassamento trasversale dovuto alla diffusione. Per ovviare a questi inconvenienti, si utilizza normalmente la sequenza di impulsi proposta da Carr-Purcell 90 - - 180 2 - 180 2 - 180 -. con valori di T molto brevi che rendono l'effetto della diffusione trascurabile.
Acquisizione dello spettro NMR

Supponiamo di voler ottenere lo spettro di un campione costituito da atomi dello stesso tipo, ad esempio 1H, aventi intorno chimico diverso, ad esempio una soluzione acquosa di aldeide acetica (CH3CH0). Posto il campione in un campo magnetico costante le tre specie di protone, cio quello dell'acqua, del gruppo metilico e del gruppo aldeidico, saranno caratterizzate da frequenze di precessione leggermente diverse a causa del differente intorno chimico. Per acquisire lo spettro di questo sistema ci sono due modi diversi di operare. 1) In onda continua (CW, Continuous Wave). Il campione viene irradiato con un campo elettromagnetico B1 la cui frequenza v, cambia lentamente con il tempo (in realt per ragioni strumentali si preferisce tenere costante la frequenza e variare con continuit il campo B0 Ogni qual volta si raggiungono le condizioni di risonanza per una delle tre specie di protoni avremo un assorbimento di energia (la componente Mz di quel pacchetto di spin viene ruotata di un certo angolo con la conseguente comparsa di un segnale nella bobina ricevente). Lo spettro NMR risultante perci un diagramma dell'energia assorbita in funzione della frequenza. Lo svantaggio di questa tecnica il tempo necessario per la scansione dello spettro, tempo dell'ordine di minuti. Poich le *concentrazioni dei componenti i sistemi biologici sono, in genere, relativamente basse, per ottenere uno spettro finale soddisfacente bisogna compiere centinaia o migliaia di scansioni e sommarle tra loro per cui i tempi per ottenere uno spettro NMR possono diventare estremamente lunghi. 2) Mediante trasformata di Fourier (FT). In questo caso, mediante la bobina trasmittente viene irradiato per un breve tempo (ms) un campo elettromagnetico contenente tutte le frequenze nell'intervallo di interesse, cio in grado di eccitare i nuclei delle specie da studiare per cui le magnetizzazioni M, dei pacchetti di spin di queste specie vengono ruotate di un certo angolo. Il segnale che si ottiene nella bobina ricevente, magnetizzazione lungo l'asse delle y in funzione del tempo, la somma dei free induction decay dei nuclei eccitati e viene chiamato spettro nel dominio del tempo. Il tempo necessario per ottenere un singolo spettro di questo tipo perci dell'ordine del secondo o di frazione di secondo. I singoli spettri cosi ottenuti vengono sommati dal computer fino a raggiungere il rapporto (segnale/rumore) voluto. Al termine di questa operazione di somma, con una operazione matematica chiamata trasformata di Fourier, lo spettro nel dominio del tempo viene tramutato in uno spettro normale, cio in uno spettro nel dominio della frequenza, uno spettro in cui l'energia assorbita funzione della frequenza.
13.3.2. Spettrometri ESR Uno spettrometro ESR composto da (vedi schema di Fig. 13.46.):

1) un magnete generante il campo B0 che pu essere variato con continuit per realizzare le condizioni di risonanza in corrispondenza delle possibili transizioni; 2) una sorgente monocromatica di microonde ( = 0,1 - 10 cm); 3) una guida d'onda per condurre la radiazione nella cavit; 4) una cavit, in cui inserito il campione, immersa nel campo di B0 Le dimensioni della cavit sono tali da essere un multiplo della lunghezza d'onda delle microonde inviate
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in essa. In queste condizioni si ottiene un aumento dell'intensit della radiazione che investe il campione; un rivelatore (in genere un cristallo di silicio) in grado di convertire le microonde in un segnale elettrico, e quindi di misurare l'assorbimento della radiazione che avviene quando si raggiungono le condizioni di risonanza hv = qeffB0; bobine per la modulazione del campo magnetico a frequenze dell'ordine di 10-100 kHz per la rivelazione sensibile alla fase () (Fig. 13.47. e relativo sistema per la modulazione del campo magnetico); rivelatore della modulazione del campo magnetico; registratore dello spettro.

Il sistema di modulazione del campo magnetico applicato al campione permette una rivelazione sensibile alla fase. Esso consiste di un campo magnetico di piccola intensit (Bm = 0, 1 - 10 x 10- 4 T) oscillante con una frequenza dell'ordine di 10-100 kHz (vm) che si sovrappone al campo magnetico B0 ottenendo in questo modo la modulazione del segnale con

una frequenza vm. Se vm piccola rispetto alla larghezza di riga del segnale, il segnale modulato si pu considerare come la derivata prima del segnale di assorbimento, ottenendo in questo modo un notevole aumento della sensibilit (Fig. 13.47.). Da quest'ultima figura risulta che la massima ampiezza del segnale modulato si ottiene in corrispondenza del flesso della curva di assorbimento, mentre un segnale nullo si ha in corrispondenza dei massimo di assorbimento. Questo tipo di rivelazione permette di aumentare notevolmente la sensibilit dello strumento.
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Le sensibilit massime che si possono raggiungere con l'ESR sono di 1010-1011 spin/gauss a cui corrispondono, con i volumi di campione in genere utilizzabili (50-500 l), concentrazioni dell'ordine di 10-9 M.
13.3.3. Spettrofotometri in assorbimento
Rapporto segnale-rumore

Gli spettrometri moderni, come in genere tutta la strumentazione scientifica, amplificano elettronicamente il segnale generato dal rivelatore. Il processo di amplificazione non pu procedere tuttavia all'infinito a causa dei segnali spuri prodotti dal rivelatore o dallo stesso sistema elettronico di amplificazione che determinano una fluttuazione del segnale stesso. Queste fluttuazioni vengono definite con il nome di rumore (noise). Perci, per poter osservare un picco di assorbimento, esso deve avere una intensit circa 3-4 volte pi elevata di quella del rumore. Ci pone un limite all'intensit del segnale osservabile che attualmente, ad esempio, per i migliori spettrofotometri dell'ordine di 10-4 unit di assorbanza.
Potere risolutivo

Questo un concetto non molto facile da definire esattamente, , per, molto importante per valutare le caratteristiche dello strumento; esso legato alla larghezza della fenditura, cio all'intervallo di lunghezza d'onda dei fotoni che incidono sul campione (da 0,1 a 10 nm) e dal rapporto segnale-rumore. Innanzi tutto dobbiamo considerare che l'assorbimento della radiazione da parte di una molecola non avviene a una frequenza ben definita ma piuttosto in un intervallo pi o meno largo. Consideriamo perci in Fig. 13.48.a lo spettro di una molecola che presenti due bande di assorbimento contigue. Se la larghezza della fenditura superiore alla distanza, in nm, che separa i due massimi di assorbimento, lo spettro ottenuto in queste condizioni mostrer un unico picco di assorbimento (Fig. 13.48.b). Questa mancanza di potere risolutivo pu essere ovviata, almeno in parte, restringendo la fenditura; questa operazione, tuttavia, ha un limite nel rapporto segnale-rumore dello strumento. Infatti, restringendo la

fenditura diminuisce l'energia che arriva al rivelatore, rendendo cosi pi rumorosa la registrazione dello spettro (Fig. 13.48.c).

Biofisica e Tecnologie Biomediche: Capitolo 13: Strumentazione Biomediche

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Letture consigliate

BRADBURY, E. M. e NICOLINI, C., (curatori), (1985), NMR in the life sciences, Plenum Press, New York. CORMACK, A., (1986), Scanning in medicine,- in Bioscence of the Physical Science Frontier, in: NICOLINI, C., (curatore), A Nobel Symposium, Humana Press, New Jersey. KAUFMAN, L., MARGULIs, A. R. e CROOKS, L. E., (curatori), (1981), Nuclear magnetic resonance imaging in medicine, Igaku-Shoin, New York. KESSEL, D. e DOUGHERTY, T. J., (curatori), (1983), Porphyrin photosensitization, Plenum Press, New York. LAUTERBUR, P., (1973), Image formation by induced focal interactions: examples employing nuclear magnetic resonance, Nature, 242, p. 190. MOORE, C., (curatore), (1974), Chemical and biochemical applications of lasers, Academic Press, New York. SWARTZ, H. M., Bolton, J. R. e BORG, D. C., (curatori), (1972), Biological applications of electron spin resonance, Wiley & Sons, Inc., Nex York.

Biofisica e Tecnologie Biomediche: Capitolo 13: Strumentazione Biomediche

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14.4. Biosensori I biosensori sono una risposta alla richiesta crescente di informazioni di tipo analitico nei vari settori dell'attivit umana (industriale, clinico, agrario, ambientale ecc.). Si richiedono, in particolare, strumenti semplici, robusti, a rapida risposta, a basso costo, possibilmente portatili e facilmente interfacciabili con un calcolatore. I biosensori accoppiano due caratteristiche fondamentali: 1) la capacit di riconoscimento dei sistemi biologici; 2) un approccio strumentale particolarmente semplice. Infatti un biosensore pu essere definito come uno strumento analitico consistente di due parti: il sistema biologico, immobilizzato in vicinanza di un adatto trasduttore, e il trasduttore stesso che produce un segnale quantificabile, in genere elettrico, come risultato di uno stimolo del sistema biologico, vedi schema di Fig. 14.9.

Il componente biologico, cio l'elemento di riconoscimento molecolare, presenta le straordinarie caratteristiche di versatilit, sensibilit e selettivit delle strutture biologiche. Esso fornito dalla natura sotto forma di enzimi, anticorpi, antigeni, DNA, recettori, cellule, tessuti ecc.

Biofisica e Tecnologie Biomediche: Capitolo 14 Tecnologie Biomediche

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L'interazione dei componente biologico con l'analita pu determinare una modificazione della concentrazione del substrato, dei protoni, o il rilascio o l'assorbimento di gas, elettroni, fotoni, massa, calore. Il trasduttore risponde a queste modificazioni chimiche o fisiche, cio traduce la variazione di concentrazione dell'analita in un segnale, in genere elettrico, segnale che viene poi amplificato, elaborato, memorizzato, inviato al registratore o a un sistema di visualizzazione (display) digitalizzato. 14.4.1. Bioelementi Per avere una visione generale delle possibilit e delle caratteristiche dei biosensori bene analizzare in dettaglio le principali categorie in cui si possono classificare le componenti biologiche utilizzate nella costruzione di questi enzimi.

Enzimi

I sensori utilizzanti enzimi immobilizzati, che possono essere definiti anche sensori biocatalitici, sono attualmente quelli aventi la maggior diffusione. Essi consistono di un enzima immobilizzato sulla superficie del trasduttore, o nella sua prossimit, che usualmente genera un segnale a causa dellinterazione con l'enzima. Tuttavia l'enzima immobilizzato pu essere usato come sito di riconoscimento molecolare anche per inibitori od effettori dell'enzima stesso. Per aumentare il numero di analiti misurabili sono stati sviluppati sistemi enzimatici multipli. Un esempio il sensore per la misura delle poliammine. Esso utilizza l'ammino ossidasi e la perossidasi. Il primo enzima ossida le poliammine con la produzione simultanea dacqua ossigenata secondo la reazione: RCH2NH2 + O2 RCHO + H202

L'acqua ossigenata, in presenza della perossidasi e di un opportuno composto (ad esempio acido p-idrossifenilacetico) determina la formazione di una intensa colorazione o fluorescenza, e quindi la sua determinazione con elevata sensibilit. Sistemi multienzimatici sono inoltre utilizzati per ottenere l'amplificazione di una reazione. A questo riguardo un esempio classico l'ossidazione del glucosio da parte della glucosio ossidasi in presenza di glucosio reduttasi. Con questo sistema la reazione di ossidazione del glucosio a glucono lattone amplificata mediante il riciclo del lattone a glucosio da parte
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della glucosio reduttasi (vedi schema di Fig. 14.10.). Fattori di amplificazioni a uno o pi ordini di grandezza possono essere realizzati con sistemi di questo tipo. Biosensori utilizzanti enzimi sono in genere caratterizzati da una risposta lineare in un ampio intervallo di concentrazione del substrato, da un tempo di vita che dell'ordine di settimane o mesi mentre la loro sensibilit pu arrivare facilmente a concentrazioni micromolecolari. Tuttavia da notare che spesso gli enzimi necessari non sono disponibili nella forma purificata od il loro isolamento molto costoso.
Immunosistemi

Gli immunosistemi impiegano antigeni e anticorpi per misurare la concentrazione di biomolecole, farmaci, virus ecc. In questo modo, il numero degli analiti misurabili viene notevolmente allargato. Infatti praticamente ogni sostanza, antigene (Ag), in grado di stimolare la formazione di anticorpi (Ab) pu essere misurata. Differenti configurazioni di biosensori possono essere realizzate utilizzando sistemi Ag-Ab. Un esempio classico riportato in Fig. 14.11.: gli antigeni, sono marcati con una specie attiva, per esempio un enzima, una molecola fluorescente od elettroattiva, riconoscibile dal trasduttore in prossimit dei quale sono immobilizzati i corrispondenti anticorpi. Una parte degli antigeni cosi marcati (Ag*) sono mantenuti vicino al trasduttore a causa dell'interazione con i corrispondenti anticorpi immobilizzati sulla superficie del trasduttore stesso. Lo spostamento pi o meno parziale di Ag* per aggiunta di antigeni liberi rivelato dal trasduttore a causa dell'instaurarsi dell'equilibrio: Ag* - Abimm + Ag Ag - Abimm + Ag* In questo modo sensibilit dell'ordine di 10-6-10-9 M sono facilmente ottenibili. In un'altra configurazione, Ab o Ag sono immobilizzati sulla superficie di un elettrodo, il cui potenziale variato dal formarsi del legame con la molecola partner. Fra gli svantaggi offerti dai biosensori di tipo immunologico sono la risposta non lineare con il variare della concentrazione, ed il tempo di risposta, che in alcuni casi pu essere dell'ordine dell'ora.
Recettori

Le capacit sensoriali di sistemi viventi (batteri, piante, animali) in termini di sensibilit, selettivit e velocit di risposta sono molto elevate. Sia recettori isolati sia strutture chemorecettive intatte sono state utilizzate per la costruzione di una nuova classe di biosensori.

Nel caso di recettori isolati il principio operazionale simile a quello degli immunosensori. L'impiego di strutture chemorecettive intatte, in genere strutture olfattive ottenute da animali marini, strutture che spesso possono rivelare concentrazioni dell'ordine di 10-12-10-14 M, Molto promettente in quanto esse contengono sia il sito di riconoscimento molecolare, sia le funzioni di trasduzione e di conduzione (vedi Fig. 14.12). Queste strutture sono state accoppiate con elettrodi ottenendo sensori caratterizzati da un tempo di risposta e di recupero
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dell'ordine dei millisecondi. Attualmente, l'impiego di questo tipo di bioelementi limitato da problemi connessi con la loro fragilit e con il breve tempo di vita.
Tessuti o cellule

Queste strutture contengono enzimi e cofattori in un ambiente ottimale e perci possono essere utilizzate come catalizzatori nella produzione di biosensori quando l'enzima isolato non disponibile o quando sono richieste particolari sequenze di enzimi. Inoltre, l'uso di cellule intere o di sezioni di tessuti di piante o animali come biocatalizzatori permette la realizzazione di sensori autocontenuti caratterizzati da una lunga vita. Alcuni esempi ci offrono un'idea delle possibilit di applicazione. Biosensori ottenuti mediante l'immobilizzazione di cellule batteriche sulla superficie di elettrodi potenziometrici sono sistemi analitici molto efficaci per la misura di fenoli, nitrati, ammoniaca ecc. nelle acque reflue. Sottili fettine di banana sulla superficie di un elettrodo per ossigeno offrono un sistema molto semplice per la misura di catecolammine. Uno dei vantaggi di questo tipo di strutture il loro basso costo, se confrontato con quello degli enzimi purificati. Svantaggi sono in genere la bassa selettivit ed attivit.

14.4.2. Trasduttori

Per quanto riguarda i differenti tipi di trasduttore quelli maggiormente utilizzati nella realizzazione di biosensori sono i seguenti.
Trasduttori potenziometrici

Questo tipo di trasduttore opera a corrente zero, cio in condizioni di equilibrio. I trasduttori potenziometrici misurano la variazione della densit di carica sulla superficie dell'elettrodo
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dovuta ad un processo catalitico o ad una modificazione della superficie dovuta al legame selettivo di una molecola. Tre tipi di trasduttore potenziometrico sono impiegati nella costruzione dei biosensori: elettrodi selettivi agli ioni, elettrodi a gas e transistori ad effetto di campo (FET). Esempi classici dei primi due tipi di elettrodo sono l'elettrodo a vetro per la determinazione della concentrazione di H+ (elettrodo per pH) e l'elettrodo per la misura dell'ammoniaca. Quest'ultimo costituito da un elettrodo per pH e da una membrana idrofobica permeabile all'ammoniaca che, diffondendo attraverso di essa, varia il pH della soluzione che circonda l'elettrodo a vetro. Transistori ad effetto di campo (FET) opportunamente modificati vengono utilizzati per la realizzazione di biosensori potenziometrici. Fra di essi interessante citare i CHEMFET in cui il contatto metallico con il canale del FET tradizionale sostituito con un rivestimento chimico sensibile alla sostanza da misurare. Il rivestimento in contatto, mediante la soluzione contenente l'analita, con un elettrodo di riferimento. L'accumulo di cariche elettriche rispetto all'elettrodo di riferimento determina la generazione di un campo elettrico all'entrata del canale. Questo campo elettrico a sua volta controlla la corrente sorgente-coi lettore, che la misura della concentrazione dell'analita. Uno schema generale di un CHEMFET riportato in Fig. 14.13. I CHEMFET sono di notevole interesse per le piccole dimensioni, per la possibilit di misurare simultaneamente specie diverse e per il possibile basso costo di produzione. Uno dei vantaggi dei trasduttori potenziometrici il largo intervallo di risposta, mentre svantaggi sono la risposta logaritmica alla variazione lineare di concentrazione e la velocit di risposta. in genere relativamente lenta.
Trasduttori amperometrici

Questo tipo di trasduttore misura il flusso di elettroni che passa dal substrato, attraverso l'enzima, all'elettrodo. In questo tipo di sensore il potenziale imposto all'elettrodo mantenuto costante ad un valore tale che il trasferimento di elettroni fra l'elettrodo e l'analita possa avvenire. In queste condizioni la corrente linearmente dipendente dalla concentrazione dell'analita. Il miglioramento delle caratteristiche di questi biosensori passa attraverso l'aumento dell'efficienza del trasferimento di elettroni. Questo pu essere ottenuto sia mediante l'uso di molecole redox (mediatori) come il ferrocene, il tetratiofulvalene ecc. immobilizzati sulla superficie dell'elettrodo sia mediante l'introduzione di un sistema di conduzione degli elettroni nell'enzima stesso per facilitare il loro passaggio dall'enzima alla superficie dell'elettrodo. Uno dei vantaggi dell'uso di mediatori una minore possibilit di interferenze dovute all'ossido-riduzione di altri analiti. In particolare se la forma ridotta del mediatore non reagisce con l'ossigeno molecolare la risposta del biosensore completamente indipendente dalla pressione parziale dell'ossigeno. Ci particolarmente importante nel caso dell'impiego di ossidasi come bioelemento. Vantaggi generali dei trasduttori amperometrici sono la semplicit di costruzione ed il basso costo della strumentazione.
Trasduttori conduttometrici

Questi sensori, che misurano la conducibilit elettrica di una soluzione, mediante l'applicazione di un campo elettrico oscillante ad una frequenza dell'ordine di 1000 Hz a due elettrodi, permettono di seguire bioprocessi caratterizzati da una variazione della concentrazione di una specie ionica o della sua velocit di migrazione. Un esempio tipico di applicazione la misura dell'urea mediante l'enzima ureasi. Questo enzima decompone il substrato privo di carica in specie ioniche, aumentando cosi la conducibilit della soluzione: NH2CONH2 + O2 + H2O 2NH+4 CO3-Biofisica e Tecnologie Biomediche: Capitolo 14 Tecnologie Biomediche 5

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Uno dei vantaggi la notevole robustezza, mentre svantaggi sono il basso rapporto segnale/rumore (S/N) e la scarsa selettivit.
Trasduttori ottici

I trasduttori ottici sono basati sulla misura dell'emissione, assorbimento o scattering della luce. E' interessante sottolineare le elevate sensibilit raggiungibili usando metodi basati sulla chemoluminescenza o fluorescenza, sensibilit che in alcuni casi possono raggiungere valori

confrontabili con quelli dei metodi radioisotopici. Nella costruzione di questi biosensori sono largamente impiegate le fibre ottiche. In questo caso il campione posizionato, in genere, a una estremit della fibra mentre la sorgente ed il rivelatore sono collocati all'altra estremit (Fig. 14.14.). Fra le classi di biosensori basati sui diversi fenomeni ottici interessante considerare quelli ad onda evanescente. La luce condotta mediante riflessioni multiple lungo una fibra ottica ed a ciascuna riflessione si produce un'onda evanescente che si propaga nel mezzo che circonda la fibra ottica (Fig. 14.15.). Se si riduce lo spessore della guida d'onda in vetro che circonda la fibra ottica, l'onda evanescente diventa sensibile ai cambiamenti di indice di rifrazione che avvengono sulla superficie di separazione vetro-soluzione. Quindi se una biomolecola si lega su questa superficie, ad esempio a recettori immobilizzati, si ha un'alterazione dell'onda evanescente con la conseguente riduzione della luce emessa dalla fibra ottica. Questi trasduttori non elettrochimici presentano il vantaggio della sicurezza, e sono

paragonabili ai FET per le piccole dimensioni. A differenza dei trasduttori elettrochimici la strumentazione richiesta in genere relativamente costosa.
Trasduttori piezoelettrici

Questi sensori contengono un cristallo oscillante, la cui frequenza di vibrazione dipende dalla massa dei cristallo stesso. La formazione diretta od indiretta di legami, fisici o chimici, di una molecola con la superficie del cristallo, ad esempio a causa del suo adsorbimento o della sua interazione con anticorpi immobilizzati sulla superficie stessa, determina una variazione della
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massa e quindi della frequenza di risonanza del cristallo (Fig. 14.16.). Questo tipo di sensore pu trovare interessanti applicazioni nella misura di inquinanti gassosi a concentrazioni dell'ordine delle parti per miliardo (ppm), cio di una molecola su W. L'elevata sensibilit e la lenta risposta sono le caratteristiche tipiche dei biosensori utilizzanti questo tipo di trasduttore.

Termistori

I termistori sono dei semiconduttori in cui la conducibilit caratterizzata da un elevato coefficiente di temperatura che permette cosi di misurare variazioni di temperatura dell'ordine di 10-3C. Poich quasi ogni fenomeno biologico accompagnato da una variazione di entalpia, i termistori possono avere un largo impiego nella costruzione di biosensori. Essi appaiono particolarmente adatti per il monitoraggio dei processi di fermentazione e possono inoltre essere facilmente accoppiati ad enzimi, cellule, tessuti, immunoreagenti. La sensibilit, cio la concentrazione minima dell'analita misurabile generalmente nell'intorno di 10-3 M. Vantaggi sono la semplicit e la risposta lineare, svantaggi la bassa selettivit e la deriva del segnale nel tempo. 14.4.3. Configurazioni e applicazioni dei biosensori Le configurazioni pi usate dei biosensori sono le seguenti. 1) Dispositivi portatili progettati per l'uso da parte di persone non esperte. Il componente biologico in genere di tipo usa e getta. L'elettronica progettata per ottenere una risposta in qualche secondo ed il display normalmente digitalizzato. 2) Sistemi di analisi bench top. Esempi tipici sono gli strumenti per analisi cliniche automatiche. In questo tipo di configurazione il componente biologico, in genere un enzima, immobilizzato sulla superficie interna di una spirale attraverso cui passa la soluzione da analizzare. 3) 3) Sistemi a flusso per il monitoraggio on line di processi in continuo. Questi dispositivi possono essere considerati come piccoli bioreattori e possono essere utilizzati con successo nell'industria conserviera, delle fermentazioni, nella misura e nel controllo dell'inquinamento ambientale. 4) Dispositivi per l'uso in vivo, ad esempio biosensori impiantabili. Essi sono di particolare valore quando sono collegati con dispositivi per l'erogazione controllata di farmaci (ad esempio insulina nel caso di diabetici).

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Un quadro delle applicazioni pu essere ottenuto considerando, da un lato, i possibili analiti misurabili con i biosensori e, dall'altro, i settori in cui l'applicazione di questi dispositivi particolarmente promettente. Per quanto riguarda i possibili analiti essi possono essere classificati nel modo seguente: Gas: respirabili (O2, CO2, ecc.); tossici (Cl2, CO, NH3, HCN, ecc.); infiammabili CH4, idrocarburi, ecc.); anestetici (N2O, alotano, ecc.); inquinanti (SO2, NOx, mercaptani, ecc.). Ioni: cationi monovalenti (H+, Li+, Na+, K+, NH+, ecc.); cationi bivalenti (Ca++ Mg++ ecc.); ioni di metalli pesanti (Hg++ Cd++ Cu++ecc.); anioni (fosfati, solfati, cloruri, ecc.). Metaboliti e farmaci: ad elevate concentrazioni (glucosio, urea, colesterolo, ecc.) o a basse concentrazioni (ormoni, steroidi, farmaci, ecc.). Sostanze in traccia: odori, essenze, feromoni, esplosivi, vapori tossici, pesticidi, ecc. Forme viventi: virus, batteri, parassiti. Per quanto riguarda i settori in cui i biosensori possono trovare facile applicazione essi sono i seguenti. 1) Clinico-medico. La medicina diagnostica dipendente in modo critico dalla misura di metaboliti, ioni, gas, ormoni ecc. Biosensori impiantabili possono fornire misure in tempo reale in casi critici e per pilotare dispositivi di jeedback. Inoltre, biosensori affidabili, sono insostituibili nel monitoraggio dei paziente nel corso di importanti interventi chirurgici e nelle cure a domicilio. Il concetto di portare il laboratorio nel letto e/o a casa del paziente e non viceversa. Sono gi disponibili, a costi relativamente bassi, biosensori disposable per test rapidi di gravidanza, glucosio nelle urine e nel sangue. 2) Agricoltura (misura di fertilizzanti, di erbicidi nelle acque, ecc.). 3) Industria (particolarmente in quella conserviera e delle fermentazioni). 4) Inquinamento (misura e controllo di inquinanti sia nell'atmosfera (indoor, outdoor, inquinanti primari e secondari, vapori tossici ecc.) sia nelle acque (ioni di metalli pesanti, pesticidi, nutrienti). 5) Qualit dei cibi (presenza di ioni metallici pesanti, ad esempio Hg, stato conservazione ecc.). 6) Sicurezza e allarme (presenza di fumo e/o di particolari gas negli edifici). 7) Difesa (rivelazione di gas nervini, tracce di esplosivi ecc.). Riassumendo, le caratteristiche principali dei biosensori sono: assenza di reagenti, bassissimo consumo di energia, selettivit, rapidit di risposta, sensibilit, facilit d'uso, basso costo, scarso ingombro, miniaturizzabilit. In particolare, notevole la selettivit di questi dispositivi: infatti essa pu arrivare a discriminare una molecola su 1081010. 1 biosensori sono inoltre particolarmente adatti all'analisi on line ed alla elaborazione dei dati.
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Un punto debole dei biosensori la stabilit nel tempo del sistema biologico e, nel caso di sensori impieganti enzimi o immunosistemi, una certa lentezza nella risposta e nel tempo di recupero. L'aumento di stabilit dell'elemento biologico pu essere ottenuto mediante l'impiego di enzimi artificiali (sim-enzimi), di enzimi ingegnerizzati o mediante componenti biologici ottenuti a partire da sistemi biologici termofili. Per quanto riguarda il futuro, i biosensori appaiono particolarmente indicati a chiudere il gap tecnologico esistente in termini di dimensioni e prezzo fra computer e strumenti analitici da essi controllati. Inoltre, con le tecniche sviluppate per la moderna industria elettronica (ad esempio le tecniche litografiche per la realizzazione di microcircuiti hanno raggiunto una risoluzione di 0,1 mm) possibile pensare ad una versione integrata in cui la produzione e l'assemblaggio dei componenti avviene con le metodologie tipiche delle biotecnologie e dell'industria dei microchip.
14.5. Traccianti radioattivi

L'attivit e posizione metabolica di una molecola pu essere analizzata dentro una cellula intatta, un tessuto o persino nell'organismo vivente, marcando la molecola con un isotopo radioattivo e successivamente facendo una autoradiografia (sulla cellula marcata o sulla parte di tessuto coperta da una particolare emulsione), una scintillografia (su un insieme di cellule dissolte in un opportuno solvente) e una tomografia PET (nel caso dell'intero corpo umano). Per la maggior parte dei radionuclidi (Tabella 14.1.), la radiazione consiste di un fascio di elettroni (o positroni) che sono emessi isotropicamente nello spazio con una distribuzione continua di energia caratteristica di ciascun isotopo. Per esempio (Fig. 14.17.), l'isotopo radioattivo trizio (3H) emette particelle a energia relativamente debole (0-14 keV), mentre 14C emette particelle a energia pi forte (0-160 MeV). Dagli spettri di cui sopra, il massimo raggio d'azione nei tessuti varia rispettivamente tra circa 2 e 100 m (corrispondente ad un'energia massima tra 18 e 156 keV), creando una discriminazione immediata degli isotopi, anche in esperimenti con doppie marcature. Altri radionuclidi usati frequentemente nello studio delle cellule sono il fosforo 32P e lo iodio 125I. Il tasso a cui un isotopo radioattivo si disintegra, segue l'equazione dN (t ) = N (t ) dt dove la costante di disintegrazione e N(t) d il numero di nuclei radioattivi ad ogni tempo t dopo l'irradiazione o la formazione dei nuclei radioattivi. Integrando la precedente equazione tra il tempo t e l'inizio del processo di decadimento (t0) si ha: N (t ) = (t t0 ) ln Nt0 Questo processo pu essere portato a termine attraverso l'analisi di attivazione del neutrone in reattori nucleari ad alto flusso. Una quantit utile che ha lo scopo di definire un isotopo radioattivo la sua vita media. 1/2 = ln (2)/ corrispondente al tempo 1/2 richiesto per ridurre della met il numero totale dei radionuclidi presenti a t0:

N (t0)/2 = N (t0) e-t1/2 Come detto precedentemente, i traccianti radioattivi vengono rivelati con procedure diverse, a seconda del materiale biologico marcato. Nell'autoradiografia viene prodotta un'immagine latente (attraverso una serie di reazioni chimiche) grazie all'interazione delle particelle ionizzanti con i cristalli di bromuro d'argento contenuti nell'emulsione gelatinosa che copre il tessuto cellulare marcato. Un processo
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fotografico trasforma l'immagine latente in immagine visibile. Durante lo sviluppo con una soluzione acquosa l'emulsione si annerisce perch ogni cristallo colpito dalle radiazioni forma degli aggregati di atomi d'argento ridotti. Le autoradiografie delle cellule fissate con Carnoy sono preparate con un metodo dipcoating che utilizza emulsioni particolari (Fig. 14.17.). Il tempo di esposizione dipende dalla quantit di radioattivit usata (tipicamente una settimana per 1 Ci e per grammo di peso corporeo) e dal tipo e densit dell'emulsione. Seguendo lo sviluppo, le sezioni sono colorate con ematossilina ed cosina.
Tabella 14. 1. Isotopi * radioattivi usati come traccianti in biomedicina Energia massima Vita media (1/2) degli elettroni emessi (ke V) 3 H 12 anni 18,1 14 C 5770 anni 156 32 P 14 giorni 1710 35 S 87 giorni 167 36 Cl 300 anni 710 42 K 12,4 ore 3530 45 Ca 165 giorni 250 24 Na 15 ore 1390 59 Fe* 45 giorni 460 131 I* 8 giorni 610 *Questi isotopi emettono anche raggi gamma ().

Marcando con timidina triziata possibile identificare la locazione cosi come l'ampiezza delle sintesi del DNA nelle singole cellule. Proteine e altre biomolecole possono anche essere identificate usando un adatto precursore marcato (ad esempio, la lisina triziata nel caso di proteine cromosomiche).

14.6. Elettronica biomedicale Per elettronica biomedicale si intende in senso lato la vasta gamma di strumentazione elettronica di interesse clinico e sanitario, quali gli ultrasuoni ed i tomografi di corrente applicazione nella diagnostica ospedaliera, oppure gli organi artificiali (vedi pancreas artificiale) di uso tuttora incerto nella terapia clinica. Uno degli esempi pi eclatanti di elettronica biomedicale costituito dalla serie di strumentazioni biomediche che sfrutta fenomeni di scattering di luce polarizzata (Fig. 14.18.)
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per la caratterizzazione di popolazioni cellulari eterogenee (sia in ambito oncologico sia microbiologico). L'algebra dei vettori di Stokes e delle matrici di Muller, sviluppata tra la fine del secolo scorso e l'inizio di questo secolo, costituisce uno strumento formidabile che permette di caratterizzare le propriet di scattering di un qualsiasi materiale biologico (sia esso un biopolimero, un microorganismo o una cellula umana) illuminato con luce in un qualsiasi stato di polarizzazione. Strumenti di nuova concezione, basati su tale principio, sono oggi in grado di misurare tutti e sedici gli elementi della matrice di scattering di Mller. Tramite questa matrice possibile caratterizzare il comportamento di uno o pi oggetti interposti tra una sorgente ed un rivelatore di segnale nei termini della perturbazione sullo stato di polarizzazione della luce incidente. La luce incidente (I) espressa tramite un vettore ai cui elementi corrispondono nell'ordine: la quantit di luce totale (I1), di luce polarizzata verticalmente ed orizzontalmente (I2) di luce polarizzata a + 45 gradi (I3), di luce polarizzata circolarmente in modo destrorso o sinistrorso (I4). Nello stesso modo costruito il vettore della luce uscente catturata da un rivelatore (U). La matrice di MiilIer mette in:
I1 S11 I S 2 = 21 I 3 S 31 I 4 S 41 S12 S 22 S 32 S 42 S13 S 23 S 33 S 43 S14 U 1 S 24 U 2 S 34 U 3 S 44 U 4

In particolare alcuni elementi, quali S14 corrispondente allo scattering differenziale della luce polarizzata circolarmente a destra verso quella a sinistra, appaiono particolarmente sensibili a modificazioni anche piccole negli alti ordini di struttura del campione. La realizzazione di uno strumento in grado di misurare gli elementi della matrice di Mller ha consentito di seguire in tempo reale e persino in vivo fenomeni difficilmente osservabili con altre metodiche, come variazioni minime degli alti ordini di struttura della cromatina e della organizzazione del citoscheletro che intervengono in seguito ad una serie di eventi come, ad esempio, l'azione di un ormone o di un farmaco, l'integrazione nel genoma di un retrovirus e alcuni tipi di trasformazione neoplastica. La matrice di Muller rappresenta inoltre una sorta di impronta digitale del centro di scattering: una misura sufficientemente accurata di questa matrice appare quindi in grado di evidenziare modificazioni anche minime del campione in esame; infatti una caratterizzazione anche parziale della stessa matrice di scattering consente gi sin d'ora di riconoscere, e quindi identificare in tempo reale, microorganismi diversi e di rilevare in essi grosse modificazioni degli alti ordini di struttura di importanti macrostrutture. Lo strumento statico per misurare lo scattering multiplo, recentemente realizzato presso l'Istituto di Biofisica dell'Universit di Genova, consiste in un fascio di luce di 632,8 nm emesso da un laser HeNe che, una volta passato attraverso un polarizzatore orientato a -45 gradi rispetto all'asse perpendicolare a quello di lavoro, attraversa un modulo fotoelastico operante alla frequenza di 50 kHz (Fig. 14.18.). Il campione contenuto in una cuvetta cilindrica avente 25 mm di diametro e 60 mm di altezza in quarzo Heralux. Un secondo polarizzatore, incrociato rispetto al primo, e un tubo fotomoltiplicatore sono montati su un goniometro situato su un braccio rotante attorno al campione. La risoluzione angolare, , del sistema ottico data da: = 2 atan (a/d)
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dove a la semiapertura del primo otturatore di fronte al tubo fotomoltiplicatore e d la distanza di tale otturatore dal centro della cuvetta cilindrica. Tipicamente, essendo a=1 mm e d=60 mm, si ottiene alfa = 2 gradi. E segnale uscente dal tubo fotomoltiplicatore amplificato ed quindi demodulato da un lock in amplifier usando come frequenza di riferimento un segnale a 50 kHz; la componente in continua dei segnale viene direttamente acquisita, tramite banco di convertitori A/D, previa amplificazione di transimpedenza (ovvero, amplificazione del segnale e contemporanea trasduzione della corrente in tensione) da calcolatore. La strumentazione ovviamente interfacciata con opportuno minicalcolatore dedicato. Nella configurazione sperimentale descritta precedentemente, le matrici di Mller degli elementi utilizzati con il nostro assetto sperimentale sono
0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 PEM ( fast = 0 ) = 0 0 cos(d ) sen(d ) 0 0 sen(d ) cos(d ) con d=d0 cos (wt) dove w/2= 50 kHz e d0 il ritardo picco-picco da settare sul PEM (modulatore fotoelastico dello stato di polarizzazione) 1 0 POL( 45) = 1 0 S11 S CAMPIONE = 12 S13 S14 S12 S 22 S 23 S 24 S13 S 23 S33 S 34 S14 S 24 S34 S 44

Moltiplicando una ad una, le matrici rappresentative di ogni elemento (riga per colonna), nell'ordine in cui queste si trovano lungo il cammino ottico, si ottiene il seguente segnale in corrente sul tubo fotomoltiplicatore, utilizzato come rivelatore. IPMT = [S11 - S13]+ cos(d) (- S33 S13) + sen(d)(S14 + S34) I primi due elementi costituiscono la componente in continua del segnale, mentre gli altri, una volta espressi in termini di funzioni di Bessel: cos(d) = cos [d0 cos (wt)] = J0 (d0) 2J2 (d0) cos (2wt) sen(d) = sen [d0 cos (wt)] = 2J1 (d0) - cos (wt) 2J3 (d0) cos (3wt) danno il segnale scomposto nelle sue componenti armoniche. Le armoniche rilevanti e di interesse sono la prima (wt), estraibile demodulando a 50 kHz, e la seconda (2wt), demodulando a 100 kHz, nel caso specifico. Il termine di Bessel di ordine zero eliminabile dalla componente in continua regolando il PEM in modo da ottenere d0 = 2,408. L'uscita in corrente dal tubo fotomoltiplicatore, in termini di armoniche di interesse, risulta per l'analizzatore a + 450: IPMT = [S11 S13] + (S33 + S13) [2J2 (do) cos (2wt) + (S14 + S34) [2J1 (d0) cos (wt)] + ...

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Ponendo l'analizzatore a - 45 gradi si ottiene un set di equazioni complementari per l'isolamento dei singoli elementi e per l'analisi del loro peso sulle singole misure; si ottiene infatti: IPMT = DC+ (-S33 + S13) [2J2 (do) cos (2wt) + (S14 - S34) [2J1 (d0) cos (wt)] + ... Gli elementi della matrice di Miiller acquisibili mediante opportune combinazioni delle misure a + 45 e - 45 gradi dell'analizzatore demodulando alla frequenza opportuna sono altamente significativi per campioni biologici, in particolare:

1) la componente in continua fornisce, imponendo un particolare ritardo picco-picco del modulatore fotoelastico, una misura degli elementi S11 ed S31; 2) l'elemento S11 l'intensit totale di luce diffusa dal campione, mentre l'elemento S31

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rispecchia la capacit del campione di polarizzare a 45 gradi radiazione non polarizzata e viceversa; 3) la componente di prima armonica, 50 kHz, misura gli elementi S34 e S14. L'elemento S14, noto in letteratura come CIDS (Circular Intensity Differential Scattering), ha un significato biofisico interessantissimo avendo dimostrato la sua elevata capacit nella discriminazione di altri ordini di struttura della cromatina (Fig. 14.19.), di cellule e nuclei in differenti stati funzionali normali e non e di microorganismi (Fig. 14.21.).

Il significato attribuibile all'elemento S34 piuttosto complesso per campioni biologici, ma si rivela comunque sensibile a modificazioni nel campione, aggiungendo informazioni complementari che aumentano il potere discriminatorio. Nel caso di elementi ottici tradizionali l'elemento S34 ne misura l'abilit a comportarsi come lamine sfasatrici a quarto d'onda. Gli elementi S13 e S13 nel caso di elementi ottici tradizionali, misurano rispettivamente la capacit dei campione nel depolarizzare luce polarizzata a 45 gradi. I risultati ottenuti su microsfere di polistirene di dimensioni minori e prossime (0,091 m e 0,33 m alla lunghezza d'onda del fascio investigante hanno mostrato (vedi Fig. 14.20.): 1) ottima riproducibilit; 2) buona definizione della linea di base, pur non potendosi considerare piccole rispetto alla lunghezza d'onda. Valutando l'influenza dell'aggregazione del campione sulle misure, appare evidente come il segnale tenda a mantenere una forma (shape) caratteristica pur spostandosi di un offset (valutabile), rispetto al campione non aggregato. Il confronto tra i segnali ottenuti su campioni di un gran numero di batteriofagi (vedi T7, FR2, in Fig. 14.21.) e di virus (vedi MTLV III, in Fig. 14.22.) e quello dell'influenza (nel Capitolo 5) evidenzia la capacit discriminatoria dei segnale di CIDS. La discriminazione risulta gi evidente nella componente a 50 kHz, proporzionale agli elementi S14 e S34 della matrice di Mller.

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