Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light

N de cat. 84-0150 20 pruebas en las que se usan cubreobjetos de 24 x 30 mm

Uso previsto
Para uso diagnstico in vitro El Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light ha sido concebido para la determinacin cuantitativa de la amplificacin del gen HER2 en cortes de tejido de carcinoma mamario fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE) mediante hibridacin in situ cromognica (CISH) y microscopa de campo claro. Esta prueba deber efectuarse en un laboratorio de anatoma patolgica. El Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light est indicado como apoyo en la valoracin de pacientes en los que se est considerando la posibilidad de tratamiento con Herceptin (trastuzumab). Los resultados del ensayo se usan conjuntamente con los datos clinicopatolgicos que se utilizan actualmente como parte del control de las pacientes con cncer de mama. La interpretacin de los resultados de la prueba debe efectuarla un patlogo acreditado teniendo en cuenta el contexto de la historia clnica de la paciente.

Resumen y explicacin
El gen humano HER2, o c-erbB-2, y el gen equivalente en la rata, neu, han sido identificados como protooncogenes(1-3) que comparten homologas con el estrechamente relacionado v-erbB.(1) El gen HER2 est ubicado en el cromosoma 17 (17q11.2-21) y codifica una protena de tipo receptor de membrana de 185 kDa. La protena HER2 tiene actividad tirosina-quinasa y comparte homologas, pero es distinta del receptor del factor de crecimiento epidrmico (conocido como EGFr, HER1, o c-erbB-1).(2) Se ha identificado la amplificacin del gen HER2 o la sobreexpresin de la protena HER2 en el 1830% de los casos de cncer de mama en humanos.(8-9) La identificacin del estado de amplificacin del gen HER2 es importante para determinar el pronstico de pacientes diagnosticadas de cncer de mama invasivo, as como para seleccionar pacientes para someterlas a terapia con trastuzumab (Herceptin, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Suiza y Genentech, Inc., South San Francisco, CA).(4-6) Trastuzumab es un anticuerpo monoclonal especfico de la protena HER2. Trastuzumab ha demostrado ser una terapia eficaz slo en pacientes cuyos tumores muestran amplificacin del gen HER2 y/o sobreexpresin de la protena HER2.(7,11) En el cncer de mama en estadio inicial, un ciclo corto de trastuzumab administrado simultneamente con docetaxel o vinorelbina demostr ser eficaz en mujeres con cncer de mama que presentaban amplificacin del gen HER2/neu.(12) Otros estudios tambin han demostrado que el estado del HER2 permita predecir la sensibilidad o la resistencia a ciertos regmenes de quimioterapia.(13) Por ello, se ha hecho cada vez ms necesario el desarrollo de mtodos precisos, coherentes y directos para la evaluacin del estado del gen HER2 y de la protena HER2.

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Principios de la tcnica
La tcnica CISH utiliza sondas de ADN marcadas con digoxigenina especficas para el locus del gen HER2 en el cromosoma 17q11.2-21 para hibridarla con los cidos nucleicos complementarios presentes en la muestra de cncer de mama. La sonda marcada con HER2 se elabora usando la Subtraction Probe Technology (SPT, Tecnologa de sonda por sustraccin), una tcnica patentada y registrada que crea sondas especficas, eliminando significativamente las secuencias repetitivas (p. ej., elementos Alu y LINE) que se encuentran en los cidos nucleicos humanos. Se ha demostrado que la sonda contiene el gen HER2 por PCR y que se une especficamente al locus del gen HER2 en el cromosoma 17q11.2-21 por FISH en metafase en linfocitos normales. En consecuencia, las sondas SPT de Invitrogen son inherentemente especficas y no precisan el bloqueo de la secuencia repetitiva, como se requiere en las sondas de ADN citogenticas tradicionales. La tcnica CISH permite evaluar aberraciones genticas bajo un microscopio de campo claro mediante deteccin cromognica. Los resultados de tincin por CISH pueden verse claramente con un microscopio de campo claro estndar y una lente seca de 40X. El estado de amplificacin del gen HER2 puede visualizarse en el contexto de la morfologa del tejido circundante. Tras la desparafinacin, las muestras son pretratadas mediante un paso de recuperacin con calor seguido de digestin enzimtica. A continuacin, las muestras se deshidratan y se secan al aire antes de aadir la sonda de HER2. Tras aadir la sonda y el cubreobjetos a la muestra, la combinacin se desnaturaliza y se hibrida durante ms de 10 horas o durante la noche. A continuacin, se lava la muestra para eliminar la sonda no hibridada, detectndose la seal cromognicamente mediante la adicin secuencial de anticuerpo al conjugado de digoxigenina y polmero de peroxidasa del rbano picante (HRP). El color aparece por reaccin del HRP fijado con el sustrato de cromgeno DAB y H2O2. Finalmente, se lleva a cabo la contratincin de la muestra con hematoxilina de Mayer para identificar la morfologa tisular y se tapa con un cubreobjetos. La seal del gen HER2 se identifica por un nico punto marrn oscuro cuando se presenta en un nmero escaso de copias, o por grupos de color marrn cuando la seal se presenta en muchas copias. Las reas de clulas tumorales se identifican fcilmente mediante un objetivo de poca potencia al microscopio de campo claro, y las copias del gen HER2 se cuantifican mediante el objetivo de 40X. Con el microscopio de campo claro con objetivo de 40X se localizan las clulas tumorales y se cuantifican las copias del gen HER2. El DAB forma un precipitado coloreado de forma que los resultados pueden guardarse y examinarse en fechas posteriores. El Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light contiene todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la prueba CISH en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. El material que se enumera a continuacin es suficiente para realizar un total de 20 pruebas y hasta dos ciclos con los dos portaobjetos de control, usando muestras de tejido tapadas con cubreobjetos de 24 x 30 mm. Si se usan cubreobjetos ms pequeos, podrn realizarse ms pruebas. El Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light se suministra en bolsas refrigeradas acolchadas. Las bolsas refrigeradas acolchadas debern estar fras en el momento de su recepcin para asegurarse de que el paquete no ha sido expuesto a altas temperaturas. Sin embargo, algunos componentes pueden estar descongelados, lo que no afectar al comportamiento del kit. Consulte la seccin Almacenamiento de los reactivos para su almacenamiento inmediato tras la recepcin de los componentes. Reactivo A. Solucin de pretratamiento por calor 1 l, con tampn tris-EDTA (listo para su uso) Reactivo B. Reactivo para pretratamiento enzimtico 5 ml, con solucin de pepsina con 0,05% de azida sdica y detergente (listo para su uso) ATENCIN: Nocivo Reactivo C. Sonda de HER2 0,4 ml de sonda SPOT-Light HER2 marcada con digoxigenina en tampn de hibridacin con formamida (lista para su uso) ATENCIN: Nocivo Reactivo D. Tampn SSC 500 ml, con solucin salina de citrato sdico (SSC) (listo para su uso) Reactivo E1. PBS en polvo 3 paquetes, cada uno suficiente para preparar 1 l de PBS
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Material suministrado

Reactivo E2. Tween 20 (50%) 2 ml, Tween 20 en solucin al 50% Reactivo F. CAS-BlockTM 3 ml, con tampn, estabilizador y azida sdica al 0,1% (listo para su uso) ATENCIN: Nocivo Reactivo G. Anticuerpo antidigoxigenina de ratn 3 ml, con BSA, tampn y azida sdica al 0,1% (listo para su uso) ATENCIN: Nocivo Reactivo H. Conjugado de anticuerpo de cabra antirratn y polmero HRP 3 ml, con estabilizador, tampn, sulfato de gentamicina al 0,005% y Proclin 300 al 0,1% (listo para su uso) Reactivo I1. Tampn para sustrato de DAB (20x) 1 ml, concentrado con tampn Reactivo I2. Solucin DAB, (20x) 1 ml, concentrado con metanol al 85% p/v ATENCIN: Inflamable y txico Reactivo I3. Perxido de hidrgeno (20x) 1 ml, H2O2 al 0,6% Reactivo J. Hematoxilina Mayer 100 ml (lista para su uso) Reactivo K. Solucin de montaje HistomountTM 4 ml (lista para su uso) ATENCIN: Altamente inflamable y nocivo Portaobjetos de control L. Portaobjetos de clulas para el control de la tcnica 2 portaobjetos, cada uno con 2 lneas celulares fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE), colocadas una al lado de la otra: A) HER2 no amplificado (MCF-7), y B) HER2 amplificado (SK-OV-3) [Para un control ptimo del ensayo se recomienda el uso de una lnea celular no amplificada con resultados cuantificables].

REACTIVOS/MATERIAL Y EQUIPO NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO Reactivos/material auxiliar

1.

N de cat. Invitrogen
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Portaobjetos SuperFrost Plus, O Portaobjetos adhesivo HistogripTM 2. Control positivo de tejido: seccin de tejido procedente de carcinoma de mama (ductal, tubular, lobular o de tipo mixto) FFPE con amplificacin del gen HER2, previamente confirmada mediante CISH o FISH 3. Control negativo de tejido: seccin de tejido procedente de carcinoma de mama (ductal, tubular, lobular o de tipo mixto) FFPE sin amplificacin del gen HER2, previamente confirmada mediante CISH o FISH 4. Agua desionizada o destilada (dH2O) 5. Xileno 6. Al 70%, 85%, 95%, y etanol al 100% (EtOH) 7. Cubreobjetos, cemento de goma, aguja 18G " y jeringuilla de 5 ml, O 8. Cubreobjetos UnderCoverTM (18 x 18 mm) 9. Cubreobjetos UnderCoverTM (22 x 22 mm) 10. Perxido de hidrgeno al 30% (H2O2) 11. Metanol al 100%
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Equipo
Temporizador Pipeta (20 l, 1000 l) Puntas de pipeta Gradilla para portaobjetos Calientaplacas, papel de aluminio y vaso de precipitados de 1 l Calentador de portaobjetos Incubadora de 37 C Ciclador trmico PCR con un bloque de portaobjetos, O Bloque trmico con termmetro digital e incubadora de 37 C ( 1 C) y contenedor de humidificacin de portaobjetos 9. Baera de agua (capaz de mantener un rango de temperatura entre 7080 C) con termmetro graduado 10. Jarras Coplin y jarras de tincin 11. Microscopio de campo claro con objetivos de 20X y 40X 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Precauciones
Para uso diagnstico in vitro. Para usuarios profesionales acreditados. No utilice el kit despus de la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. Si el producto se almacena en condiciones distintas a las especificadas en el prospecto del paquete, dichas condiciones de almacenamiento deben ser verificadas por el usuario. No ingiera, beba, fume ni aplique ningn tipo de cosmtico donde se haya manipulado algn material procedente del kit. Se debern cumplir las buenas prcticas de laboratorio universales. No existe ningn mtodo analtico que pueda ofrecer una garanta absoluta de ausencia de posibles riesgos biolgicos. Manipule todo el material segn el nivel 2 de bioseguridad, como se recomienda para cualquier material humano potencialmente infeccioso en los manuales de los centros para el control de enfermedades/institutos nacionales de salud. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4. edicin, abril 1999. No pipetee los reactivos con la boca y evite el contacto de la piel y las mucosas con cualquier muestra o reactivo. Si los reactivos entran en contacto con la piel o con las membranas mucosas, enjuague las zonas afectadas con gran cantidad de agua. Los reactivos B, F y G contienen un 0,1% de azida sdica, el reactivo H contiene sulfato de gentamicina al 0,005% y Proclin al 0,1%, el reactivo I2 contiene metanol al 85% p/v y el reactivo I3 contiene perxido de hidrgeno al 0,6%. A las concentraciones de estos productos no es necesario utilizar etiquetas de advertencia de peligro. Consulte la hoja HDSM especfica del componente para obtener ms informacin. El reactivo B contiene pepsina y esta enzima puede causar reacciones alrgicas en contacto con la piel. Use un bao de agua con calibrador de temperatura, un bloque trmico y una estufa de hibridacin para obtener unos resultados ptimos. Algunos de los reactivos de este kit contienen azida sdica como conservante. La azida sdica puede reaccionar con el plomo y el cobre de las caeras, formando azidas metlicas explosivas, especialmente si se acumulan. Al eliminar los reactivos que contienen azida sdica, lave con agua abundante para evitar la acumulacin de riesgos qumicos en las tuberas. Algunos de los reactivos de este kit contienen Proclin, azida sdica o perxido de hidrgeno. Dichos reactivos estn clasificados como dainos, ya que son irritantes para la piel y las mucosas. Estas sustancias se suministran en forma diluida como componentes del kit, lo que puede reducir de forma notable los riesgos de exposicin, aunque no del todo. Deber evitar el contacto con la piel, los ojos o la ropa. Consulte la hoja HDSM especfica del componente para obtener ms informacin. El tetracloruro de 3,3-diaminobenzidina (DAB) puede ser daino si se ingiere, se inhala o se absorbe a travs de la piel, y puede causar irritacin ocular, cutnea, de las membranas mucosas y en las vas respiratorias superiores. Se sospecha que DAB es un carcingeno; consulte las normas nacionales, regionales y/o locales para conocer las recomendaciones acerca de su eliminacin. Evite la evaporacin del reactivo I2. El metanol se evapora con facilidad. Siga los pasos necesarios para evitar la evaporacin, como sellar el envase contenedor y cerrar la tapa inmediatamente despus de usarlo. La evaporacin del metanol puede dar lugar a la precipitacin del DAB, lo que puede afectar a los resultados de la tincin. Evite la evaporacin durante la hibridacin asegurndose de que los portaobjetos estn correctamente sellados y de que la humedad es la adecuada en la cmara de hibridacin. El pretratamiento enzimtico puede variar en funcin de la fijacin y del grosor del tejido. Para la mayora de los cortes de tejido (45 m) fijados en formol tamponado neutro al 10% se considera ptimo un
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periodo de 5 minutos de pretratamiento enzimtico. Para los tejidos cuya fijacin es desconocida, deber efectuarse una titulacin enzimtica (por ejemplo, 2 min, 5 min y 10 min) con un tiempo de digestin ptimo ajustado en funcin de los resultados iniciales. Reactivo C La sonda de HER2 marcada contiene formol, de carcter nocivo. R21 Nocivo en contacto con la piel R22 Nocivo por ingestin R61 Puede ser nocivo para el feto S24 Evitar el contacto con la piel S36 Llevar ropa protectora adecuada S37 Llevar guantes adecuados S39 Llevar proteccin ocular/facial Reactivo I2 La solucin DAB contiene metanol, que es inflamable y txico. Consulte la hoja HDSM para obtener ms informacin. R10 Inflamable R23/24/25 Txico por inhalacin, en contacto con la piel y por ingestin S45 En caso de accidente o si no se encuentra bien, procurar asistencia mdica de inmediato S36 Llevar ropa protectora adecuada S37 Llevar guantes adecuados Reactivo K La solucin de montaje Histomount contiene tolueno, que es altamente inflamable y nocivo por inhalacin. Consulte la hoja HDSM para obtener ms informacin. R11 Altamente inflamable R20 Nocivo por inhalacin S2 Mantngase fuera del alcance de los nios. S16 Mantngase alejado de fuentes de ignicin No fumar S25 Evitar el contacto con los ojos S29 No verter por las tuberas S33 Tomar medidas de precaucin contra posibles descargas estticas Todos los reactivos designados como listos para su uso han sido diluidos de forma ptima. Una nueva dilucin podr afectar negativamente a los resultados del ensayo. Tanto los tiempos de incubacin, como los reactivos y las temperaturas han sido optimizados. El uso de tiempos de incubacin, reactivos o temperaturas diferentes puede afectar negativamente a los resultados del ensayo. El uso de diferentes fijadores tisulares y grosores de tejido no est recomendado, y podr afectar negativamente a los resultados del ensayo. Consulte la normativa local para la eliminacin de componentes potencialmente txicos. Reduzca al mnimo la contaminacin microbiana para evitar tinciones no especficas. Tome todas las medidas de precaucin al manipular los reactivos. Use guantes desechables, bata y gafas de seguridad cuando manipule materiales que se sospecha son carcingenos.

Almacenamiento de los reactivos

Almacene el Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light a 28 C. Almacene el reactivo J a temperatura ambiente (1530 C). Nota: El reactivo B puede verse afectado negativamente si se expone a altas temperaturas. Almacene este reactivo a 28 C inmediatamente despus de usarlo. No almacene este reactivo a temperatura ambiente. Almacene el tampn PBS con Tween 20 de trabajo a temperatura ambiente (1530 C) durante un mximo de una semana. No utilice el kit despus de la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. Si el producto se almacena en condiciones distintas a las especificadas en el prospecto del paquete, dichas condiciones de almacenamiento debern ser verificadas por el usuario. No hay signos visibles que indiquen la inestabilidad de este producto; por lo tanto, es importante evaluar los portaobjetos de control. Pngase en contacto con el servicio de asistencia tcnica si sospecha que el kit presenta algn problema.

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Instrucciones de uso A. Preparacin de la muestra

Cortes tisulares incluidos en parafina: Los tejidos fijados en formol tamponado neutro durante 648 horas antes de incluirlos en parafina son aptos para su uso. Los fijadores distintos al formol tamponado neutro al 10% no han sido optimizados para este protocolo y no se consideran aptos para su uso. Los cortes tisulares (45 m de grosor) deben montarse en portaobjetos de microscopa tratados con HistoGrip o con Superfrost Plus. Cuando sea posible, use cortes de tejido de grosor estandarizado para garantizar la tincin uniforme para la deteccin por CISH y de los reactivos para contratincin.28 Secar los portaobjetos al aire o secarlos a 37 C, y calentarlos a continuacin entre 24 horas a 60 C. Los tejidos correctamente fijados e incluidos se conservarn indefinidamente antes de preparar y montar los cortes si se almacenaron en un lugar fro y seco (1530 C).26,27 Los cortes de tejido de 23 m de grosor pueden dar resultados de copias de genes falsamente bajos.

B. Tcnica CISH estndar para cortes de tejido FFPE

Notas tcnicas Todos los reactivos excepto el reactivo C (sonda de HER2) debern equilibrarse a temperatura ambiente (1530 C) antes de su uso. La sonda de HER2 puede usarse fra y sin necesidad de equilibrarla a la temperatura ambiente. Todas las incubaciones debern efectuarse a temperatura ambiente (1530 C), a menos que se indique lo contrario. Es importante que, entre paso y paso, no se seque el corte de tejido durante todo el proceso, a menos que se indique lo contrario. A lo largo del proceso ser necesario efectuar varios lavados. En cada lavado deber usarse solucin fresca. Los portaobjetos de control se debern procesar simultneamente junto con los portaobjetos de muestras de la paciente y se deben tratar en todos los pasos de la misma manera que las muestras de prueba. A menos que se especifique lo contrario, todos los pasos se efectuarn a temperatura ambiente (1530 C). Esta tcnica tarda ms de ocho horas en completarse: a continuacin, se expone una divisin que puede resultar cmoda, comenzando el da 1 con la desparafinacin hasta la desnaturalizacin y la hibridacin (durante la noche), y continuando el da 2 con el lavado exhaustivo hasta la microscopa de campo claro. Los reactivos de Invitrogen que se suministran con el kit son necesarios para la prueba CISH. El uso de otros reactivos puede dar lugar a un exceso de ruido de fondo, o a una disminucin o prdida de la seal CISH. La sustitucin de cualquier reactivo suministrado como uno de los componentes del kit puede anular los resultados del ensayo.

Procedimiento para el da 1
1. Preparacin del reactivo Xileno (recipientes de 2 portaobjetos), EtOH al 100% (recipientes de 3 portaobjetos) o Cubra totalmente y almacene hasta 1 semana a temperatura ambiente (1530 C) o hasta que se hayan procesado 100 portaobjetos. Serie de alcohol etlico (EtOH) o Prepare recipientes separados con EtOH al 70%, 85%, 95% y 100%. o Cubra totalmente y almacene hasta 1 semana a temperatura ambiente (1530 C) o hasta que se hayan procesado 100 portaobjetos.
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Etiquete cada reactivo de lavado segn corresponda y anote el orden de utilizacin durante el procedimiento, siguiendo dicho orden.

2. Desparafinacin

Nota: Prepare reactivo suficiente para cada uno de los recipientes de portaobjetos necesarios segn el nmero de portaobjetos procesados. Cada lavado requiere un volumen diferente de reactivo. Si el paso siguiente no se puede realizar de forma inmediata, secar los portaobjetos al aire tras baarlos en EtOH al 100% tres veces en lugar de lavar los portaobjetos en dH2O tres veces. a) Sumergir en xileno b) Sumergir en EtOH al 100% c) Lavar en dH2O 2 veces, 5 min cada uno 3 veces, 3 min cada uno 3 veces, 2 min cada uno

La desparafinacin completa es necesaria para obtener unos resultados ptimos y reproducibles.

3. Pretratamiento con calor

Nota: Los portaobjetos se deben hervir o calentar a una temperatura 98 C durante 15 min en la solucin de pretratamiento por calor (reactivo A). Los portaobjetos no debern calentarse en exceso, debiendo asegurarse de que la temperatura permanece entre 98 C y 100 C. Recomendamos que se use el calientaplacas para este paso. (Para protocolos que usen una olla de presin con un calibrador de presin y temperatura o un horno microondas con un calibrador de temperatura, pngase en contacto con el Servicio tcnico de Invitrogen escribiendo a techsupport@invitrogen.com). La solucin de pretratamiento por calor (reactivo A) se puede usar hasta en dos ocasiones antes de desecharla. a) Coloque los portaobjetos en la gradilla para portaobjetos. b) Caliente la solucin de pretratamiento por calor (reactivo A) en un vaso de precipitados sobre un calientaplacas hasta que hierva de forma continua a una temperatura 98 C. Para evitar que se evapore el tampn, el vaso de precipitado deber cubrirse con una tapa de vidrio o con papel de aluminio. c) Coloque los portaobjetos en la solucin que est hirviendo, cubra el vaso de precipitados, comience a contar el tiempo cuando la temperatura alcance los 98 C o cuando vuelvan a aparecer burbujas, y hirvalos durante 15 min. Asegrese de que la temperatura se mantenga a entre 98 C y 100 C. d) Transfiera los portaobjetos de inmediato a dH2O a temperatura ambiente (1530 C). e) Lave tres veces en dH2O, 2 min cada uno.

4. Digestin enzimtica

Nota: Para la mayora de los tejidos mamarios, 5 min de digestin enzimtica a temperatura ambiente (1530 C) producirn los mejores resultados de CISH. Los tiempos de digestin debern ajustarse en funcin de los resultados iniciales con un tiempo de digestin de 5 min. Pueden ser necesarios distintos tiempos de incubacin enzimtica dependiendo del grosor del tejido y del mtodo de fijacin. Un estudio de digestin enzimtica indic que el tiempo de digestin enzimtica puede oscilar entre 2 y 20 min y se obtendr una seal CISH adecuada para la evaluacin de HER2 en un conjunto de muestras de tejido mamario archivadas. En un estudio de concordancia para apoyar el uso de CISH frente a FISH en el que se usaron muestras de tejido de cncer de mama que haban sido procesadas en un plazo de 12 meses antes de la fecha de realizacin del estudio, un tiempo de digestin enzimtica de 5 min permiti obtener seales CISH ptimas para la evaluacin del gen HER2.(28) a) Equilibre el reactivo para pretratamiento enzimtico (reactivo B) a temperatura ambiente (1530 C). b) Aada suficiente reactivo B para cubrir el corte de tejido e incube durante 5 min a temperatura ambiente (1530 C). c) Lave tres veces en dH2O, 2 min cada uno.

5. Deshidratacin en la serie graduada de etanol:

a) b) c) d) e) EtOH al 70% EtOH al 85% EtOH al 95% EtOH al 100% EtOH al 100% 2 min 2 min 2 min 2 min 2 min

6. Seque los portaobjetos al aire 20 min o hasta que estn secos. Marque los portaobjetos con lpiz si es
necesario.
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7. Desnaturalizacin e hibridacin

Nota: Use un ciclador trmico PCR con bloque de portaobjetos o un bloque trmico con pantalla de temperatura digital y cmara de humidificacin de portaobjetos con incubadora de 37 C, o un equipo similar. Asegrese de que la humedad en las cmaras se mantiene de forma correcta. Si la hibridacin se efecta durante periodos ms cortos de tiempo, puede dar lugar a una seal ms dbil. La desnaturalizacin de la sonda a una temperatura inferior a la recomendada por el protocolo puede dar lugar a una seal CISH dbil o ausente. La modificacin de los tiempos de incubacin puede dar lugar a una seal dbil o a una tincin con ruido de fondo. a) Aada 15 l de sonda de HER2 (reactivo C) al centro del cubreobjetos de 22 x 22 mm. Dependiendo del tamao del tejido, puede ser necesaria una mayor o menor cantidad de sonda. Use los siguientes volmenes de sonda en funcin del tamao del cubreobjetos: 18 mm x 18 mm 10 l 22 mm x 22 mm 15 l 24 mm x 30 mm 20 l

b) Coloque el cubreobjetos, con el lado de la sonda hacia abajo, sobre la zona apropiada de la muestra de tejido en el porta. Se pueden usar cubreobjetos UnderCover para CISH de Invitrogen en lugar de los cubreobjetos estndar. Cuando utilice cubreobjetos UnderCover para CISH, despegue el papel situado al dorso y coloque el lado del cubreobjetos que ha quedado expuesto (de donde acaba de despegar el papel) sobre la zona correspondiente del porta para cubrir la muestra de tejido. Deber presionar los bordes de la cinta para sellar el cubreobjetos y evitar la evaporacin. NO PRESIONE SOBRE LA ZONA CENTRAL DEL CUBREOBJETOS. c) Cuando utilice un cubreobjetos estndar deber sellarlo para evitar la evaporacin durante el periodo de incubacin. El sellado podr efectuarse con una jeringa de 5 ml y una aguja de 18G . Llene la jeringa con cemento de goma y aplique una delgada capa a los bordes del cubreobjetos, solapndola ligeramente sobre el portaobjetos. d) Deje que el cemento de goma se seque (aproximadamente 10 min) para evitar que el cubreobjetos se desplace fuera del porta. e) La desnaturalizacin y la hibridacin pueden llevarse a cabo usando un ciclador trmico PCR con bloque de portaobjetos o un bloque trmico con pantalla de temperatura digital y cmara de humidificacin de portaobjetos e incubadora de 37 C. 1) Si utiliza un ciclador trmico PCR con un bloque de portaobjetos: desnaturalice a 95 C ( 1 C) durante 5 min, seguido de incubacin durante la noche (1018 horas) a 37 C ( 1 C). 2) Si utiliza un bloque trmico y cmara de humidificacin con incubadora de 37 C: desnaturalice a 95 C ( 1 C) durante 5 min, seguido de incubacin durante la noche (1018 horas) a 37 C ( 1 C) en cmara de humidificacin.

Procedimiento para el da 2 8. Preparacin del reactivo

PBS (solucin salina de tampn fosfato) o Aada 1 paquete de PBS en polvo (reactivo E1) a 1 l de dH2O. Mezcle. Tampn PBS/Tween 20 (Tween al 0,01%) o Aada 10 gotas de Tween 20 al 50% (reactivo E2) a 1 l de PBS (antes citado). Mezcle. o Almacene a temperatura ambiente (1530 C) hasta 1 semana. Solucin sustrato-cromgeno (DAB) o Prepare esta solucin inmediatamente antes de usarla. o Aada 1 gota de cada reactivo (I1, I2, I3) a 1 ml de dH2O. Mezcle bien. H2O2 al 3% en metanol absoluto o Aada 1 parte de H2O2 al 30% a 9 partes de metanol. o Cubra totalmente y almacene hasta 1 semana a temperatura ambiente (1530 C) o hasta que se hayan procesado 100 portaobjetos. Xileno (gradillas de portaobjetos: 2) o Cubra totalmente y guarde hasta 1 semana a temperatura ambiente (1530 C) o hasta que se hayan procesado 100 portaobjetos.

9. Lavado exhaustivo
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Nota: El uso de temperaturas ms altas de las recomendadas por el procedimiento puede dar lugar a una disminucin o una prdida completa de la seal de CISH. Los lavados a temperaturas demasiado bajas pueden
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dar lugar a un aumento del ruido de fondo. Para asegurarse de que se alcance y se mantenga la temperatura exacta de la baera de agua, deber usarse un termmetro graduado. a) Encienda la baera de agua ajustndola a 70 C (1 C) y espere a que alcance dicha temperatura. b) Prepare dos jarras Coplin que contengan tampn SSC (reactivo D), una de ellas a temperatura ambiente y la otra calentada a 70 C. c) Despegue el cemento de goma o el cubreobjetos UnderCover. No deje que se seque el corte de tejido. d) Para retirar el cubreobjetos sin desprender el tejido: bae previamente los cubreobjetos en SSC a temperatura ambiente durante unos 23 min, hasta que los cubreobjetos puedan retirarse con facilidad. A continuacin, proceda con el siguiente paso. e) Enjuague los portaobjetos en el frasco con SSC a temperatura ambiente (1530 C) y, a continuacin, bae los portaobjetos durante 5 min en la jarra de Coplin que contiene el SSC en la baera de agua a 70 C (1 C). f) Lave los portaobjetos tres veces en dH2O, 2 min cada uno.

10. Inmunodeteccin
a) Sumerja los portaobjetos en H2O2 al 3% en metanol al 100% durante 10 min. b) Lave en PBS/Tween 20 (0,01%) 3 veces, 2 min cada uno. c) Aada CAS-BlockTM (reactivo F): 23 gotas/portaobjetos o en cantidad suficiente para cubrir el tejido e incube durante 10 min a temperatura ambiente (1530 C). d) Seque el reactivo F con una toallita de laboratorio. No enjuague. e) Aada anticuerpo antidigoxigenina de ratn (reactivo G): 23 gotas/portaobjetos o en cantidad suficiente para cubrir el tejido e incube durante 30 min a temperatura ambiente (1530 C). f) Lave en PBS/Tween 20 (0,01%) 3 veces, 2 min cada uno. g) Aada el conjugado de anticuerpo de cabra antirratn y polmero HRP (reactivo H): 23 gotas/portaobjetos o en cantidad suficiente para cubrir el tejido e incube durante 30 min a temperatura ambiente (1530 C) en una cmara hmeda. h) Lave en PBS/Tween 20 (0,01%) 3 veces, 2 min cada uno. i) Durante el lavado, prepare solucin sustrato-cromgeno DAB: aada una gota de cada reactivo (reactivos I1, I2, I3) a 1 ml de dH2O. j) Aada solucin sustrato-cromgeno (DAB): 23 gotas/portaobjetos o en cantidad suficiente para cubrir el tejido e incube durante 30 min a temperatura ambiente (1530 C) en una cmara hmeda. k) Coloque los portaobjetos en la gradilla para portaobjetos. l) Lave con agua del grifo durante 2 min.

11. Contratincin y montaje

Nota: Efecte una contratincin breve durante 35 s. y examine el tejido al microscopio sin colocar el cubreobjetos. Vuelva a efectuar una contratincin durante otros 35 s. si desea obtener una tincin nuclear ms fuerte. El tiempo de contratincin depende de los tejidos usados. No se recomienda la contratincin oscura, ya que puede oscurecer las seales de tincin positiva. a) Efecte una contratincin del tejido con hematoxilina (reactivo J): 35 s. b) Lave con agua del grifo durante 2 min. c) Deshidrate en la serie graduada de EtOH durante 2 min con cada grado. (70%, 85%, 95%, 100%, 100%, conservados desde el da 1 y utilizados en el mismo orden). d) Sumerja en xileno: 2 veces, 2 min cada uno. Este xileno para el lavado debe ser otro distinto al que se us el da 1. En este paso se puede reutilizar hasta 1 semana o hasta procesar 100 portaobjetos. e) Cubrir usando solucin de montaje Histomount (reactivo K). f) Conserve los portaobjetos a temperatura ambiente (1530 C) para analizar los resultados en el futuro.

Limitaciones del procedimiento

Es posible que el Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light no detecte el 5%(10) de los casos de cncer de mama comunicados que son positivos por inmunohistoqumica (IHC) pero negativos mediante la amplificacin del gen HER2. La CISH es un procedimiento en varias fases que requiere formacin especializada en el uso de los reactivos apropiados, seleccin de tejidos, fijacin, procesamiento, preparacin del portaobjetos para CISH e interpretacin de los resultados de la tincin. La tincin de los tejidos depende de la manipulacin y el procesamiento de la muestra de tejido antes de la tincin. La contratincin excesiva o incompleta puede comprometer la correcta interpretacin de los resultados.
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Cualquier desviacin de los procedimientos recomendados para la prueba puede invalidar resultados previstos declarados; debern usarse y documentarse los controles pertinentes. Los usuarios que se desven de los procedimientos recomendados para la prueba debern hacerse responsables de la interpretacin de los resultados de la muestra bajo tales circunstancias. El Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light ha sido optimizado exclusivamente para identificar y cuantificar el gen HER2/neu en los ncleos en interfase en muestras de tejido de cncer de mama de origen humano fijadas en formol e incluidas en parafina. No se ha validado ningn otro tipo de muestra o de fijadores. La interpretacin clnica de cualquier resultado de la prueba se deber evaluar teniendo en cuenta la historia clnica de la paciente y los resultados de las dems pruebas de laboratorio.

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Control de calidad
Controles positivos y negativos en un solo portaobjetos
Portaobjetos de control L

Imagen 1. El portaobjetos de control L contiene una lnea celular A no amplificada (MCF-7) y una lnea celular B amplificada (SK-OV-3). Nota: Las lneas celulares no estn dibujadas a escala y son ms pequeas de lo que indica el diagrama.

La seal CISH debe ser de color marrn, ntida y fcil de evaluar. Los portaobjetos de control incluidos (portaobjetos L) contienen dos secciones de 4 m cortadas de bloques de clulas FFPE preparados de dos lneas de clulas diferentes. Estos portaobjetos deberan usarse como controles del procedimiento. La lnea celular A (MCF-7) es una lnea no amplificada y presentar 5 seales o puntos por ncleo. La lnea celular B (SK-OV-3) est amplificada y se presentar en forma de grupos de DAB de tamao mediano a grande en el ncleo. El portaobjetos con la lnea celular de control se deber procesar simultneamente con los portaobjetos de muestras de la paciente y se deben tratar de la misma manera que los cortes de tejido. Si el portaobjetos de control (portaobjetos L) es negativo para ambas lneas celulares, A y B, dicho resultado indicar que se produjo un error durante la realizacin del CISH. La lnea celular del control positivo (B), que se sabe que presenta amplificacin del HER2, deber examinarse primero para asegurar que todos los reactivos funcionan adecuadamente. La presencia de grupos de genes o >5 seales individuales o puntos, dentro del ncleo de una nica clula es indicativa de la reactividad positiva esperada. Si el control positivo no logra demostrar la presencia de grupos o >5 seales por ncleo en una mayora (>50%) de las clulas tumorales, los resultados obtenidos con las muestras de la paciente debern considerarse invlidos. La lnea celular normal o control negativo (A), que se sabe que no presenta amplificacin del HER2, deber contener 5 puntos en el ncleo de cada clula. Si se produce la tincin inespecfica del ncleo en el control normal (A), los resultados obtenidos para las muestras de las pacientes debern considerarse no vlidos. Si se produce la tincin inespecfica, normalmente presentar un aspecto de tincin difusa. En ocasiones, puede observarse una tincin espordica de color marrn fuera de los ncleos en cortes tisulares que han sido excesivamente fijados en formol. En estos casos, los resultados debern ser interpretados con precaucin. La tincin inespecfica no debe confundirse con seales CISH positivas. Si se usa un control positivo de tejido a partir de un tejido procedente de un cncer de mama conocido para demostrar la amplificacin del HER2, deber poner de manifiesto la presencia de grupos de genes o >5 seales o puntos individuales por ncleo en una mayora (>50%) de las clulas cancerosas, indicativa de la reactividad positiva esperada. Si el control positivo de tejido no logra demostrar la presencia de grupos o >5 seales por ncleo en >50% de clulas tumorales, los resultados obtenidos para las muestras de la paciente debern considerarse invlidos. Si se usa un control de tejido negativo a partir de un tejido procedente de un cncer de mama conocido para demostrar la ausencia de amplificacin del HER2, deber contener <5 seales por ncleo en una mayora (>50%) de las clulas cancerosas. En general, la presencia de no ms de dos seales o puntos en los ncleos de la contrapartida de tejido normal (clulas epiteliales normales o clulas del estroma del tumor) del control tisular positivo confirma que la sonda y los reactivos para inmunodeteccin no presentan reacciones cruzadas con componentes celulares o tisulares. Si se produce una tincin inespecfica en los ncleos de la contrapartida de tejido normal del control de tejido positivo, los resultados obtenidos para las muestras de la paciente debern considerarse no vlidos. La variacin en el procesamiento del tejido y en los procedimientos tcnicos usados en el laboratorio debe estar validada, ya que puede producir variaciones significativas en los resultados, hacindose necesarios controles internos regulares del funcionamiento adems de los procedimientos siguientes.

Interpretacin
Valoracin de la idoneidad del portaobjetos Los puntos (seales) de HER2 mediante CISH debern ser pequeos aunque fcilmente distinguibles usando un objetivo 20X40X. Los puntos aparecern de color marrn contrastando con la contratincin. Si no hay puntos visibles en la muestra, habr que repetir el ensayo. Llame al equipo de asistencia tcnica de Invitrogen al 1-800-955-6288 (slo EE. UU.) para analizar cualquier posible causa del problema.
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Aspecto de la seal de CISH (consulte el apndice A, Gua para la interpretacin del anlisis del HER2 mediante CISH) Los puntos de HER2 mediante CISH se vern como: Un solo punto (figura G). Un solo punto tiene bordes lisos y redondeados en clulas normales o cancerosas. Un solo punto representa una copia nica del gen HER2. Un doblete (figura H). Los puntos se ven como parejas y no representan realmente un grupo pequeo. Si dos seales aparecen separadas por una distancia inferior al dimetro de una sola seal, ambas seales debern ser contabilizadas como un solo punto. El doblete es el resultado de los cromosomas dividindose, residiendo cada seal en la pareja de cromtidas hermanas.29 Un grupo pequeo (figura E). Un grupo pequeo es un grupo de seales de forma irregular, que tiene entre 3 y 5 veces el dimetro de un solo punto. Como referencia puede usarse un punto aislado de las clulas epiteliales cancerosas o normales del mismo portaobjetos. Un grupo grande (figura A). Un grupo grande es un grupo de seales de forma irregular, que es 5 veces superior al dimetro de un solo punto. Como referencia deber usarse un solo punto de las clulas epiteliales cancerosas o normales del mismo portaobjetos. Aumento 10X 20X 40X 60X o 100X Seal CISH Los puntos aislados son difciles de ver y se pasan fcilmente por alto. Los puntos aislados son pequeos pero claramente distinguibles. Los puntos aislados se identifican fcilmente. No es necesario.

Eleccin de los campos diana para contabilizar las seales HER2 mediante CISH: Usando objetivos de 4X20X, haga un barrido de la muestra teida mediante CISH para identificar las zonas histopatolgicamente ms representativas del carcinoma invasivo. Evite las reas de necrosis, las seales superpuestas por superposicin de los ncleos y los ncleos con una seal de escasa intensidad. Evite los elementos del carcinoma intraductal (DCIS) en los carcinomas invasivos. Valore cualquier posible situacin de heterogeneidad intratumoral del gen HER2 antes de la enumeracin de la CISH. Si la muestra es homognea, elija un rea de tejido con fuertes seales de CISH para la enumeracin de las seales. Proceda a la enumeracin de las seales. Si la muestra presenta una situacin de heterogeneidad intratumoral del gen HER2 en el componente del carcinoma invasivo, elija reas que representen cada estado del gen HER2 para la enumeracin de las seales. Una muestra de tejido es heterognea si el estado del gen HER2 (clulas amplificadas y no amplificadas) vara en diferentes reas del mismo corte de un cncer de mama primario. Habr que evaluar las clulas en las distintas reas de heterogeneidad para determinar cul es el estado del HER2 (amplificado o no amplificado) que predomina en ms del 50% del corte del tumor. Proceda a enumerar las seales del rea en que el estado del HER2 sea el que predomina en ese tumor. Enumeracin de las seales Use un objetivo de 40X. Podr usarse un objetivo ms potente si es necesario, pero no es necesario usar el objetivo de inmersin en aceite. Consulte el apndice A, Gua para la interpretacin del anlisis del HER2 mediante CISH. Un gen HER2 aislado se ve como un pequeo punto redondo individualizado (figura G). No cuente los ncleos que aparezcan superpuestos ni las reas en que no son visibles los ncleos. Cuente slo las seales CISH que se encuentran en el interior de los ncleos. Excluya las seales ocasionales espordicas que pueden ser debidas a restos de ADN de HER2 procedentes de las divisiones de las clulas cancerosas que han salido del ncleo. Sin amplificacin o Definida como 15 puntos aislados en la mayora (>50%) de las clulas cancerosas en las reas de tejido seleccionadas. o No es necesario contar los puntos en 30 clulas. Opcional: utilice la hoja de trabajo que se muestra en el apndice B, Hoja de puntuacin del HER2 mediante CISH para efectuar el recuento celular. Exprese los resultados como el promedio de un total de 30 clulas para obtener un diagnstico claro de no amplificacin. Amplificacin o Definida como:
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>5 puntos en la mayora (>50%) de las clulas cancerosas en las reas de tejido seleccionadas, o o Grandes grupos en la mayora (>50%) de las clulas cancerosas en las reas de tejido seleccionadas, o o Una mezcla de mltiples puntos y grandes grupos en la mayora (>50%) de las clulas cancerosas en las reas de tejido seleccionadas, o o Una mezcla de mltiples puntos y pequeos grupos en la mayora (>50%) de las clulas cancerosas en las reas de tejido seleccionadas, o o Pequeos grupos en la mayora (>50%) de las clulas cancerosas en las reas de tejido seleccionadas. En ninguno de los casos anteriores es necesario contar los puntos en 30 clulas. Opcional: utilice la hoja de trabajo que se muestra en el apndice B, Hoja de puntuacin del HER2 mediante CISH para efectuar el recuento celular. Exprese los resultados como el promedio del recuento de un total de 30 clulas para obtener un diagnstico claro de amplificacin. Para efectuar el recuento, considere un grupo pequeo equivalente a 5 puntos y un grupo grande como 10 puntos. o Fundamento: la asignacin de un nmero concreto de puntos a grupos pequeos o grandes es arbitraria y slo se hace para expresar la cuantificacin. Las clulas contienen normalmente dos copias del gen HER2. Las clulas cuyo ADN se ha replicado pero que an no se han dividido contienen 4 copias del gen. Por lo tanto, un grupo pequeo indica amplificacin y contendr como mnimo 5 copias del gen. Un grupo grande, con un tamao al menos doble que el de un grupo pequeo, contendr un mnimo de 10 copias del gen. o

Casos confusos de amplificacin o no amplificacin Interprete con cautela las muestras que no se encuadran con claridad en las categoras de amplificacin o no amplificacin. Estas muestras presentan 4-6 puntos en la mayora (>50%) de las clulas cancerosas en el campo diana seleccionado. Cuando el promedio de puntos es de 4 a 6 despus de haber contado 30 clulas cancerosas, debern contarse otras 30 clulas hasta un total de 60. Si contina habiendo duda, el anlisis deber repetirse en un portaobjetos con una nueva muestra. Anote los resultados en la hoja de trabajo que se muestra en el apndice B, Hoja de puntuacin del HER2 mediante CISH. 1. Cuente los puntos en 30 clulas tumorales en el rea de tejido seleccionada. Consulte ms adelante el epgrafe n 4 si es evidente la presencia de grupos pequeos. 2. Anote el total de puntos contenidos en 30 clulas y calcule el promedio. 3. Registre el resultado basndose en el promedio de 60 clulas 4. Si se observa una mezcla de puntos aislados y grupos pequeos (debido a la superposicin de varios puntos aislados), o si slo se observan grupos pequeos: Considere cada grupo pequeo equivalente a 5 puntos. Como referencia puede usarse un solo punto de las clulas epiteliales cancerosas o normales del mismo portaobjetos para determinar lo que representa un grupo pequeo. 5. Exprese los resultados como el promedio del recuento de un total de 60 clulas para obtener un diagnstico claro de amplificacin o de no amplificacin segn las recomendaciones de Invitrogen.

Informe de los resultados Los resultados pueden notificarse usando la hoja de trabajo que se muestra en el apndice B, Hoja de puntuacin del HER2 mediante CISH. El informe del estado respecto al HER2 debe registrarse de acuerdo con las recomendaciones de Invitrogen, especialmente en los casos en que no est claro si hay amplificacin o no amplificacin.

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Resumen de la interpretacin Amplificacin >5 puntos, o grupos grandes, o una mezcla de mltiples puntos y grupos grandes, o mezcla de puntos mltiples y grupos pequeos, o grupos pequeos del gen HER2 presentes por ncleo en la mayora (>50%) de las clulas cancerosas en el rea de tejido elegida para la enumeracin. Consulte las figuras A, B, C, D y E del apndice A, Gua para la interpretacin del anlisis del HER2 mediante CISH. Un grupo grande es un grupo de seales de forma irregular, que es 5 veces superior al dimetro de un solo punto. Como referencia deber usarse un solo punto de las clulas epiteliales cancerosas o normales del mismo portaobjetos. Consulte el apndice A, figura A. Un grupo pequeo es un grupo de seales de forma irregular, que tiene entre 3 y 5 veces el dimetro de un solo punto. Como referencia deber usarse un solo punto de las clulas epiteliales cancerosas o normales del mismo portaobjetos. Consulte el apndice A, figura E. Sin amplificacin De 1 a 5 puntos del gen HER2 presentes por ncleo en una mayora (>50%) de clulas cancerosas en el rea de tejido elegida para la enumeracin. Consulte el apndice A, figura F, figura G y figura H. Un solo punto tiene bordes lisos y redondeados, y se halla presente en clulas normales y cancerosas.

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Valores esperados

La prevalencia del gen HER2 amplificado en la poblacin general de mujeres con cncer de mama es del 1830%.(8, 9) Al comparar la amplificacin del gen HER2 con la sobreexpresin de la protena HER2, los estudios demostraron que hasta un 5% de casos de cncer de mama son positivos para la sobreexpresin de la protena cuando se analiza mediante inmunohistoqumica (IHC), pero negativos para la amplificacin del gen HER2.(10)

Caractersticas de rendimiento especficas

Rendimiento clnico La seguridad y la eficacia del Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light fueron evaluadas en un estudio comparativo que inclua tres pruebas: el Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light, FISH de PathVysion y HercepTest. El estudio incluy dos grupos de casos: 226 casos consecutivos y 60 casos adicionales. Los casos consecutivos fueron seleccionados a partir de casos consecutivos de cncer de mama invasivo examinados para tratar a las pacientes en dos centros de estudio distintos (centro A y B). Los casos adicionales haban sido puntuados como 2+ en inmunohistoqumica (IHC) (usando anticuerpo AB8) durante el tratamiento de la paciente en el centro A. A. Casos consecutivos La tabla siguiente resume la distribucin de los resultados de CISH y FISH respecto a la puntuacin del HercepTest. Cada prueba se consider vlida cuando el portaobjetos una vez teido fue considerado vlido para su evaluacin. Tabla 1: Resultados de IHC, FISH y CISH
Expresin de la protena, puntuacin del 0 1 2 HercepTest Casos segn IHC (N) 141 19 21 (%)1 63,8% 8,6% 9,5% Proporcin del gen con estado de HER2 segn FISH Nmero de casos vlidos segn FISH2 140 19 21 Amplificados (%)3 1 (0,5) 0 (0,0) 5 (2,3) No amplificados (%)3 139 (63,8) 19 (8,7) 16 (7,3) Copias del gen con estado de HER2 mediante CISH Nmero de casos vlidos segn CISH2 132 17 19 Amplificados (%)3 1 (0,5) 0 (0,0) 3 (1,5) No amplificados (%)3 131 (63,6) 17 (8,3) 16 (7,8) 1 % = N N total 100% 2 Nmero de casos vlidos segn FISH (o CISH) con la correspondiente puntuacin segn la IHC. 3 % = n Nmero total de casos vlidos segn FISH (o CISH) 100% 3 40 18,1% Total 221 100%

38 31 (14,2) 7 (3,2)

218 37 181

38 32 (15,5) 6 (2,9)

206 36 170

Tabla 2: Concordancia entre CISH e IHC

Resultados de CISH Resultados de IHC Positivos (3+) Negativos (<3+)

Total

32 4 36 Amplificados 6 164 170 No amplificados 38 168 206 Total Se comunicaron 20 casos en los que faltaban o no eran vlidos los resultados de las pruebas de IHC o CISH y quedaron excluidos de la tabla. Concordancia positiva Concordancia negativa Porcentaje total de concordancia = = = 32/38 164/168 (32+164)/206 = 84,2% = 97,6% = 95,1% (IC 95%: 68,8%, 94,0%) (IC 95%: 94,0%, 99,4%) (IC 95%: 91,3%, 97,7%)

Los resultados mostraron una concordancia del 95,1% (IC 95%: 91,3%97,7%), indicando una notable concordancia entre el Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light y HerceptTest.

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Tabla 3: Concordancia entre CISH y FISH

Resultados de CISH Resultados de FISH Amplificados No amplificados Total

34 0 34 Amplificados 2 169 171 No amplificados 36 169 205 Total Se comunicaron 21 casos en los que faltaban o no eran vlidos los resultados de las pruebas de FISH o CISH y quedaron excluidos de la tabla. Concordancia positiva Concordancia negativa Porcentaje total de concordancia = = = 34/36 169/169 (34+169)/205 = 94,4% = 100,0% = 99,0% (IC 95%: 81,3%, 99,3%) (IC 95%: 97,8%, 100,0%) (IC 95%: 96,5%, 99,9%)

Los resultados mostraron una concordancia del 99,0% (IC 95%: 96,5%99,9%), indicando una notable concordancia entre el Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light y el anlisis para HER2 de PathVysion. As pues, el porcentaje de concordancia indic que el Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light produjo resultados equivalentes al anlisis para HER2 de PathVysion. A continuacin se muestra un resumen de los 2 casos discordantes entre el anlisis con la sonda SPOT-Light y el anlisis con la sonda de HER2 de PathVysion. Los datos de CISH y FISH se expresan como media e intervalo y la columna correspondiente a la IHC muestra la puntuacin del HercepTest. Tabla 4: Casos discordantes entre FISH y CISH
HER2 mediante CISH (Neg)/FISH (Pos) Nmero de CISH FISH caso (2, 0,98%)1 A-095-01 4,07 (1,00 10,00) 2,81 (1,67 5,00) B-008 2,77 (2,00 4,00) 2,65 (1,00 6,00) 1 % = nmero de casos discordantes dividido entre el nmero total de casos con FISH y CISH vlidos procedentes del centro correspondiente 100% HER2 mediante CISH (Pos)/FISH (Neg) Nmero de CISH FISH IHC caso IHC

2+ 2+

B. Casos adicionales 2+ segn IHC El centro de estudio A proporcion 60 casos adicionales 2+ por IHC, que fueron analizados en los centros A y B. Los resultados obtenidos en cada centro de estudio demostraron que el Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light produjo resultados equivalentes al anlisis para HER2 de PathVysion. La correlacin de estos resultados se muestra en las tablas 5 y 6. Tabla 5: Concordancia entre CISH y FISH en el centro de estudio A en los casos 2+ por IHC
Resultados de CISH Resultados de FISH Amplificados No amplificados 0 46 46

Total 6 48 54

6 Amplificados 2 No amplificados 8 Total Se comunicaron 6 casos en que los resultados faltaron o no fueron vlidos Concordancia positiva Concordancia negativa Porcentaje total de concordancia = = = 6/8 46/46 (6+46)/54 = 75,0% = 100,0% = 96,3%

(IC 95%: 34,9%, 96,8%) (IC 95%: 92,3%, 100,0%) (IC 95%: 87,3%, 99,6%)

Tabla 6: Concordancia entre CISH y FISH en el centro de estudio B en los casos 2+ por IHC
Resultados de CISH Resultados de FISH Amplificados No amplificados 2 45 47

Total 9 47 56

7 Amplificados 2 No amplificados 9 Total Se comunicaron 4 casos en que los resultados faltaron o no fueron vlidos Concordancia positiva Concordancia negativa Porcentaje total de concordancia = = = 7/9 45/47 (7+45)/56 = 77,8% = 95,7% = 92,9%

(IC 95%: 40,0%, 97,2%) (IC 95%: 85,5%, 99,5%) (IC 95%: 82,7%, 98,0%)

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Tabla 7: Casos 2+ por IHC discordantes entre CISH y FISH

Nmero de caso HER2 mediante CISH (Neg)/FISH (Pos) Nmero de CISH FISH IHC caso Centro A (2, 3,70%)1 S-156-01 2,77 (1,00 5,00) 2,48 (0,50 5,00) 2+ S-173-01 3,67 (1,00 7,00) 2,34 (0,50 8,00) 2+ Centro B (4, 7,14%)1 S-171 5,20 (2,00 8,00) 1,08 (0,50 2,00) 3+ S-156 5,00 (1,00 9,00) 2,23 (1,00 5,00) 3+ S-178 20,00 (20,00 20,00) 1,25 (0,50 2,00) 0 S-183 4,13 (3,00 6,00) 2,73 (1,00 6,00) 0 1 % = nmero de casos discordantes dividido entre el nmero total de casos con FISH y CISH vlidos procedentes del centro correspondiente 100% IHC HER2 mediante CISH (Pos)/FISH (Neg) CISH FISH

C. Casos 2+ por HercepTest Todos los casos consecutivos y adicionales fueron analizados con HercepTest. Los casos que arrojaron un resultado de 2+ con HercepTest se combinaron y fueron analizados en ambos centros de estudio. Los resultados obtenidos en cada centro de estudio demostraron que el Kit para HER2 mediante CISH SPOTLight produjo resultados equivalentes al anlisis para HER2 de PathVysion. La correlacin de estos resultados se muestra en las tablas 8 y 9. Tabla 8: Concordancia entre CISH y FISH en el centro de estudio A en los casos 2+ por HercepTest
Resultados de CISH Resultados de FISH Amplificados No amplificados Total

3 0 3 Amplificados 4 27 31 No amplificados 7 27 34 Total Se comunicaron 2 casos en los que faltaban o no eran vlidos los resultados de las pruebas de FISH o CISH y quedaron excluidos de la tabla. Concordancia positiva Concordancia negativa Porcentaje total de concordancia = = = 3/7 27/27 (3+27)/34 = 42,9% = 100,0% = 88,2% (IC 95%: 9,9%, 81,6%) (IC 95%: 87,2%, 100,0%) (IC 95%: 72,6%, 96,7%)

Tabla 9: Concordancia entre CISH y FISH en el centro de estudio B en los casos 2+ por HercepTest
Resultados de CISH Resultados de FISH Amplificados No amplificados Total

4 1 5 Amplificados 1 35 36 No amplificados 5 36 41 Total Se comunicaron 2 casos en los que faltaban o no eran vlidos los resultados de las pruebas de FISH o CISH y quedaron excluidos de la tabla. Concordancia positiva Concordancia negativa Porcentaje total de concordancia = = = 4/5 35/36 (4+35)/41 = 80,0% = 97,2% = 95,1% (IC 95%: 28,4%, 99,5%) (IC 95%: 85,5%, 99,9%) (IC 95%: 83,5%, 99,4%)

Tabla 10: Casos 2+ por HercepTest discordantes entre CISH y FISH

HER2 mediante CISH (Neg)/FISH (Pos) Nmero de CISH FISH IHC caso Centro A (4, 11,76%)1 A-095-01 4,07 (1,00 10,00) 2,81 (1,67 5,00) 2+ B-008-08 1,77 (1,00 4,00) 2,45 (1,00 5,00) 2+ S-156-01 2,77 (1,00 5,00) 2,48 (0,50 5,00) 2+ S-173-01 3,67 (1,00 7,00) 2,34 (0,50 8,00) 2+ Centro B (2, 4,88%)1 A-023 5,20 (2,00 8,00) 1,49 (0,67 3,50) 2+ B-008 2,77 (2,00 4,00) 2,65 (1,00 6,00) 2+ 1 % = nmero de casos discordantes dividido entre el nmero total de casos con FISH y CISH vlidos procedentes del centro correspondiente 100% Nmero de caso IHC HER2 mediante CISH (Pos)/FISH (Neg) CISH FISH

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D. Casos de polisoma Dos centros de estudio evaluaron los casos de polisoma basndose en las respectivas experiencias clnicas de cada centro. En el centro A se defini un caso de polisoma del cromosoma 17 por la presencia de 3 seales de CEP17 en al menos un 10% de las clulas tumorales, mientras que en el centro B el criterio fue la presencia de 3 seales de CEP17 en al menos un 30% de las clulas tumorales. La frecuencia de tumores con polisoma del cromosoma 17 fue del 18,68% en el centro A y del 7,91% en el centro B. La tasa de deteccin de polisoma en el mismo grupo tumoral vari sustancialmente entre ambos centros de anlisis debido a la diferente definicin de polisoma usada en cada centro. El grado de concordancia obtenido independientemente en cada centro de estudio indic que el Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light produjo resultados equivalentes a los del anlisis para HER2 de PathVysion. Los resultados se muestran en las tablas 11 y 12. Tabla 11: Concordancia entre CISH y FISH en los casos de polisoma en el centro de estudio A
Resultados de CISH Resultados de FISH Amplificados No amplificados

Total

12 0 12 Amplificados 2 34 36 No amplificados 14 34 48 Total Se comunicaron 3 casos en los que faltaban o no eran vlidos los resultados de las pruebas de FISH o CISH y quedaron excluidos de la tabla. Concordancia positiva Concordancia negativa Porcentaje total de concordancia = = = 12/14 34/34 (12+34)/48 = 85,7% = 100,0% = 95,8% (IC 95%: 57,2%, 98,2%) (IC 95%: 89,7%, 100,0%) (IC 95%: 85,8%, 99,5%)

Tabla 12: Concordancia entre CISH y FISH en los casos de polisoma en el centro de estudio B
Resultados de CISH Resultados de FISH Amplificados No amplificados Total

12 1 13 Amplificados 0 9 9 No amplificados 12 10 22 Total Se comunicaron 0 casos en los que faltaban o no eran vlidos los resultados de las pruebas de FISH o CISH y quedaron excluidos de la tabla. Concordancia positiva Concordancia negativa Porcentaje total de concordancia = = = 12/12 9/10 (12+9)/22 = 100,0% = 90,0% = 95,5% (IC 95%: 73,5%, 100,0%) (IC 95%: 55,5%, 99,8%) (IC 95%: 77,2%, 99,9%)

Tabla 13: Casos de polisoma discordantes entre CISH y FISH

Nme ro de caso HER2 mediante CISH (Pos)/FISH (Neg) CISH FISH IHC Nmero de caso HER2 mediante CISH (Neg)/FISH (Pos) CISH FISH IHC

Centro A (2, 4,17%)1 A-095-01 4,07 (1,00 10,00) 2,81 (1,67 5,00) 2+ S-156-01 2,77 (1,00 5,00) 2,48 (0,50 5,00) 2+ Centro B (1, 4,55%)1 A-023 5,20 (2,00 8,00) 1,49 (0,67 3,50) 2+ 1 % = nmero de casos discordantes dividido entre el nmero total de casos con FISH y CISH vlidos procedentes del centro correspondiente 100%

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E. Resumen de la comparacin de los resultados entre el Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light y el anlisis con la sonda de ADN de PathVysion Tabla 14: Resumen del Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light y el Kit de sonda de ADN para HER2 de PathVysion
Casos consecutivos 205 94,4% Casos adicionales Centro A 54 75,0% Centro B 56 77,8% Casos equvocos Centro A 34 42,9% Centro B 41 80,0% Casos de polisoma Centro A 48 85,7% Centro B 22 100,0%

Tipos de casos

Nmero de muestras % de concordancia positiva % de concordancia negativa % de concordancia total

100,0%

100,0%

95,7%

100,0%

97,2%

100,0%

90,0%

99,0%

96,3%

92,9%

88,2%

95,1%

95,8%

95,5%

Sensibilidad analtica La sensibilidad del Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light fue analizada usando cortes de tejido procedentes de cncer de mama FFPE en estados de HER2 amplificado y no amplificado, as como con lneas celulares FFPE usadas en portaobjetos de control. El gen HER2 se detect como un punto aislado en el corte de tejido y en el corte del bloque de clulas con el gen HER2 normal. Cada una de las muestras amplificada y no amplificada demostr una intensidad de tincin de 3+ y una buena morfologa tisular. Eficiencia de la hibridacin La eficiencia de la hibridacin se estableci analizando 2 muestras de tejido (1 amplificada, 1 no amplificada, 10 secciones de cada una) y 4 muestras de lneas celulares (2 amplificadas, 2 no amplificadas). En cada muestra se analiz el nmero de clulas con seales HER2 en proporcin al nmero total de clulas analizadas (de 100 a 300 clulas). Se estableci que la eficiencia de la hibridacin fue del 94,7 al 100%. En cuanto a la tincin con CISH de 226 muestras clnicas procedentes de 3 laboratorios, la tasa de fallos en cada centro fue del 8,4% (19), 1,3% (3) y 0,9% (2).(28) Especificidad analtica Para determinar la especificidad se realizaron estudios de metafase en portaobjetos preparados citogenticamente, se emple la tcnica de la PCR usando un par cebador especfico para el gen HER2 sobre la plantilla de la sonda de ADN para HER2 y se secuenci el ADN de ambos extremos de los clones BAC usados en la sonda de ADN para HER2. Se demostr que la sonda para HER2 mediante CISH SPOT-Light se uni especficamente al locus del gen HER2 en la banda cromosmica 17q11.2-21. La localizacin en el cromosoma se estableci por FISH en metafase en linfocitos normales, el anlisis con PCR demostr la banda de ADN deseada y la secuenciacin del ADN demostr la correcta ubicacin y cobertura en el cromosoma del gen HER2. Lmites de la tcnica La prueba para HER2 mediante CISH SPOT-Light se llev a cabo en los valores lmite de cada uno de los siguientes parmetros: grosor tisular, pretratamiento, desnaturalizacin, hibridacin, lavado exhaustivo, inmunodeteccin y contratincin. No se observaron diferencias significativas en los resultados de la CISH bajo las condiciones siguientes:

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Tabla 15: Lmites de la tcnica

Rangos aceptables de los parmetros de la prueba Grosor tisular Pretratamiento con calor Digestin enzimtica Desnaturalizacin Hibridacin Lavado exhaustivo Inmunodeteccin Conjugado de polmero HRP Cromgeno DAB Contratincin Ciclador trmico PCR 9398 C 3039 C 6078 C 46 m 99100 C 1020 min. 4-14 min. 28 min. 1018 h 28 min. 25v60 min. 1560 min. 330 s.

Reproducibilidad Se analizaron tres lotes diferentes del Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light en tres muestras de tejido procedente de cncer de mama y en 4 muestras de lneas celulares, con diferentes niveles de gen HER2. No se observaron cambios en el rendimiento en los ensayos en ninguno de los 3 lotes estudiados. Reproducibilidad entre procedimientos (de un da a otro) Se estudi la reproducibilidad entre procedimientos de la CISH en tres das diferentes usando muestras de cncer de mama con tres tipos de estado respecto al HER2 y con 3 muestras de cada tipo. A continuacin se muestra el resumen: Tabla 16: Reproducibilidad entre procedimientos (de un da a otro) Copia del gen N promedio = Desv. estndar CV N 9 9 9 No amplificados 1,79 0,05 3% No amplificados, polisoma 3,45 0,12 4% Amplificados 20,22 1,72 8%

Estudio de observador a observador Tres patlogos recibieron formacin especfica para leer los portaobjetos preparados y teidos usando el Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light. Para validar el grado de competencia, a cada patlogo se le entregaron ocho portaobjetos preteidos (6 no amplificados y 2 amplificados) suministrados por Invitrogen. En ambos tipos de casos (no amplificados y amplificados) todas las muestras (100%) fueron interpretadas correctamente.

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Tabla 17: Reproducibilidad de observador a observador Seal CISH, promedio de puntos/clula para HER2 mediante CISH y estado respecto al gen HER2 Observador 1 Observador 2 Observador 3 2 puntos NAM Grupo grande + mltiples puntos AM 2-5 NAM 2-4 NAM 2 NAM 2-5 NAM Grupo grande + mltiples puntos AM 2-5 NAM 1-5 puntos NAM Grupo grande + puntos AM 1-5 NAM 2,8 NAM 1-5 NAM 1-5 NAM Grupo grande AM 3,4 NAM 1-2 NAM >10 AM 3-5 NAM 3-5 NAM 1-2 NAM 4 NAM Grupo grande + mltiples puntos AM 4,3 NAM

ID del portaobjetos 1 2

N de portaobjetos Muestra 1 (NAM) Muestra 2 (AM) Muestra 3 (NAM) Muestra 4 (NAM) Muestra 5 (NAM) Muestra 6 (NAM) Muestra 7 (AM) Muestra 8 (NAM)

Reproducibilidad entre centros El estudio de la reproducibilidad de la CISH entre centros se bas en 226 casos consecutivos repetidos en tres centros de estudio. Los porcentajes de concordancia total en cuanto a la reproducibilidad de la CISH usando un valor >5 como dato de corte para la positividad fueron del 99,0, el 98,6 y el 98,1%, indicando una notable reproducibilidad de las pruebas efectuadas con el Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light. Tabla 18: Reproducibilidad de la CISH en todos los casos consecutivos Examinados por los centros A y B Centro A Centro B: resultados de la CISH Resultados de la CISH Amplificados No amplificados Total Amplificados 34 0 34 No amplificados 2 170 172 Total 36 170 206 Se comunicaron 20 casos en los que faltaban o no eran vlidos los resultados de las pruebas de CISH y quedaron excluidos de la tabla. Porcentaje total de concordancia = (34+170)/206 99,0% (IC 95%: 96,5%, 99,9%)

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Tabla 19: Reproducibilidad de la CISH en todos los casos consecutivos Examinados por el centro C y el centro B Centro C Centro B: resultados de la CISH Resultados de la CISH Amplificados No amplificados Total Amplificados 35 0 35 No amplificados 3 184 187 Total 38 184 222 Se comunicaron 4 casos en los que faltaban o no eran vlidos los resultados de las pruebas de CISH y quedaron excluidos de la tabla. Porcentaje total de concordancia = (35+184)/222 98,6% (IC 95%: 96,1%, 99,7%)

Tabla 20: Reproducibilidad de la CISH en todos los casos consecutivos Examinados por el centro C y el centro A Centro C Centro A: Resultados de la CISH Resultados de la CISH Amplificados No amplificados Total Amplificados 32 1 33 No amplificados 3 171 174 Total 35 172 207 Se comunicaron 19 casos en los que faltaban o no eran vlidos los resultados de las pruebas de CISH y quedaron excluidos de la tabla. Porcentaje total de concordancia = (32+171)/207 98,1% (IC 95%: 95,1%, 99,5%)

Estudios de repetitividad y reproducibilidad en cortes de tejido consecutivos y con distintos grosores tisulares Se llevaron a cabo estudios de repetitividad y reproducibilidad para evaluar la repetitividad y la reproducibilidad del Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light al analizar muestras consecutivas de tejidos de varios grosores procedentes de cncer de mama amplificados y no amplificados. Las muestras estudiadas incluyeron portaobjetos de tres bloques de tejido procedentes de cncer de mama: sin amplificacin del HER2 (normal), en el lmite de la amplificacin del HER2 y amplificacin del HER2 (alta). Diez muestras por cada bloque de secciones consecutivas de 4 m de grosor fueron procesadas y analizadas segn los procedimientos estndar (situacin de control) y, del mismo modo, muestras de diferentes grosores (de 2 a 8 m) de cada bloque fueron procesadas y analizadas por duplicado segn los procedimientos estndar. Los resultados de esta prueba se muestran en las tablas 21 y 23. Tabla 21. Promedio de puntos por clula de HER2 mediante CISH en secciones consecutivas de 4 m (cncer de mama con HER2 normal) Nmero de seccin 1 2 3 Promedio de puntos/ncleo de 1,8 2,0 1,9 HER2 segn la CISH Promedio de HER2 STD % CV 4 2,0 5 1,6 6 1,7 1,8 0,16 8,9 7 1,7 8 1,6 9 1,7 10 2,0

Tabla 22. Promedio de puntos por clula de HER2 mediante CISH en secciones consecutivas de 4 m (cncer de mama con amplificacin del HER2 en el lmite de lo normal) Nmero de seccin 1 2 3 4 5,4 5,5 5,3 5,8 5 5,2 6 6,2 5,6
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Promedio de puntos/ncleo de HER2 segn la CISH Promedio de HER2

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7 5,7

8 5,4

9 5,5

10 5,8

STD % CV

0,30 5,4

Tabla 23. Promedio de puntos por clula de HER2 mediante CISH en secciones consecutivas de 4 m (cncer de mama con HER2 amplificado) Nmero de seccin 1 2 3 4 CM CM CM CM

Promedio de puntos/ncleo de HER2 segn la CISH

5 6 7 8 CM CM CM CM

9 10 CM CM

Solucin de problemas
Problema
Seal dbil o inexistente

Posible causa
1. No se siguieron las instrucciones del pretratamiento. a) Condiciones incorrectas del pretratamiento con calor (tiempo o temperatura de incubacin) Condiciones incorrectas del pretratamiento enzimtico (tiempo o temperatura)

Medidas aconsejables
1. Asegrese de que se usaron las condiciones correctas de pretratamiento. Consulte el procedimiento. a) Asegrese de que se usaron las condiciones correctas de pretratamiento por calor: 15 minutos de 98 a 102 C. Asegrese de que se usaron las condiciones correctas de pretratamiento enzimtico (recomendado 5 min, rango de 220 min). Asegrese de que la enzima alcance la temperatura ambiente (1530 C) antes de usarla. Dependiendo del grosor del tejido (4 6 m) y de las condiciones de fijacin, es posible que haya que prolongar o abreviar el tiempo de incubacin del pretratamiento enzimtico ptimo.

b) b)

c) c) Corte de tejido ms grueso de lo debido

2. Condiciones incorrectas de desnaturalizacin

2. Asegrese de que se usaron las condiciones correctas de desnaturalizacin. Consulte el procedimiento. a) Asegrese de que la temperatura de desnaturalizacin es de 95 C (en un rango de 9598 C) para el ciclador trmico y el bloque trmico, de 90 C (en un rango de 8590 C)

a) Temperatura incorrecta de desnaturalizacin

b) Tiempo de desnaturalizacin incorrecto 3. Condiciones incorrectas del lavado exhaustivo

Asegrese de que el tiempo de desnaturalizacin es de 5 min para el ciclador trmico PCR. 3. Asegrese de que se usaron las condiciones correctas para el lavado exhaustivo. Consulte el procedimiento. a) Asegrese de que el lavado exhaustivo se realiza a 70 C. Se recomienda usar un termmetro graduado para verificar la temperatura. b) Asegrese de que el tiempo de incubacin del lavado exhaustivo es correcto (5 min) 4. Compruebe las condiciones de almacenamiento. El Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light se deber almacenar a 28 C. Almacene el reactivo J a temperatura ambiente (1530 C). 1. Asegrese de que se usaron las condiciones correctas de pretratamiento por calor. Pgina 23 de 26

b)

a)

Temperatura incorrecta del lavado exhaustivo (supera los 80 C) Tiempo de incubacin del lavado exhaustivo incorrecto

b)

4. Temperatura excesivamente elevada durante el almacenamiento o el transporte Mala morfologa tisular PI84-0150 1. Condiciones incorrectas del pretratamiento con calor (tiempo o temperatura) Rev 0.0

2. Condiciones incorrectas del pretratamiento enzimtico (tiempo o temperatura)

2. Asegrese de que se usaron las condiciones correctas de digestin enzimtica. Para la mayora de los tejidos cancerosos, 5 min a temperatura ambiente (1530 C) es ptimo. Dependiendo del grosor del tejido y del tiempo de fijacin, es posible que haya que prolongar o abreviar el tiempo de incubacin de la digestin. 3. Asegrese de que se usaron las condiciones correctas de desnaturalizacin. Consulte el procedimiento. 4. No presione el portaobjetos. Bae previamente los portaobjetos a temperatura ambiente (1530 C) en tampn SSC durante 23 min o hasta que los cubreobjetos se desplacen fcilmente. 5. A menos que se especifique lo contrario, no deje que se seque el tejido durante el procedimiento de CISH. 6. Asegrese de que el tejido es de 46 m. 7. Asegrese de que el tejido se fija durante 648 horas. 8. Asegrese de que el tejido se fija en formol tamponado neutro al 10%. 1. Asegrese de que la temperatura del lavado exhaustivo es correcta (70 C). 2. Asegrese de que el tiempo de incubacin con DAB es de 30 min a temperatura ambiente (1530 C). 3. El tampn de lavado (reactivos E1 + E2) debe usarse durante los pasos de inmunodeteccin. 1. Asegrese de realizar la contratincin del tejido durante 35 segundos. Si no est seguro del tiempo ptimo de tincin, realice la contratincin del tejido durante 3 s. y lave despus con agua del grifo durante 2 min. Compruebe el tejido contrateido al microscopio. Si an est demasiado claro, contine la contratincin durante otros 35 s. antes de proceder a colocar el cubreobjetos. 1. Asegrese de que no se forman burbujas al aadir la sonda y colocar el cubreobjetos. 2. Aada unos 15 l al tejido que se encuentra correctamente tapado por un cubreobjetos de 22 x 22 mm. Para tejidos mayores es posible que se requiera usar ms sonda y un cubreobjetos mayor (use 20 l para un tejido que use un cubreobjetos de 24 x 30 mm).

3. Condiciones incorrectas de desnaturalizacin (tiempo o temperatura) 4. Al eliminar el portaobjetos se da fsicamente el tejido

5. Se dej que el tejido se secara durante el procedimiento de CISH 6. Grosor tisular incorrecto 7. Tiempo de fijacin incorrecto 8. Fijador incorrecto Tincin con ruido de fondo 1. Temperatura incorrecta del lavado exhaustivo (<70 C) 2. Incubacin excesiva con DAB

Se observan seales, pero son difciles de ver

3. Reactivos incorrectos usados como tampn de lavado 1. Excesiva contratincin con hematoxilina

reas sin seal

1. Formacin de burbujas de aire bajo el cubreobjetos tras aadir la sonda 2. Insuficiente volumen de sonda para el tamao del tejido

NOTA: Si el problema no consta anteriormente o si la medida aconsejada no resuelve el problema, llame al servicio de asistencia tcnica al 1-800-955-6288 (slo EE. UU.) o enve un correo electrnico a techsupport@invitrogen.com.

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BIBLIOGRAFA
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MARCAS COMERCIALES
Clearmount, HistoGrip, Histomount y SPT, son marcas comerciales de Invitrogen Corporation. SPOT-Light y Zymed son marcas comerciales registradas de Invitrogen Corporation. Herceptin es una marca comercial registrada de Genentech, Inc. HercepTest es una marca registrada de Genentech, Inc. PathVysion es una marca comercial registrada de Abbott Molecular, Inc.

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Invitrogen Corporation 542 Flynn Road Camarillo CA 93012 +1-800-955-6288 Para problemas tcnicos, enve un correo electrnico a: techsupport@invitrogen.com Para obtener informacin general del Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light, enve un correo electrnico a her2cish@invitrogen.com URL: www.invitrogen.com/her2cish Explicacin de los smbolos Nmero de catlogo Lmite de temperatura Contiene cantidad suficiente para <n> pruebas Usar antes de Consulte las instrucciones de uso Nmero de lote Fabricante Representante autorizado para la CE Diagnstico in vitro Consulte la documentacin adjunta

para IVDD 98/79/CE: Invitrogen Ltd., Inchinnan Business Park, 3 Fountain Drive, Paisley, PA4 9RF, Reino Unido

Copyright Invitrogen Corporation. 16 de julio 2008

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Apndice A: Gua para la interpretacin del anlisis del HER2 mediante CISH
Amplificacin del gen HER2
Amplificacin
Amplificacin alta: >10 puntos, o grupos grandes, o una mezcla de mltiples puntos y grupos grandes del gen HER2 presentes por cada ncleo en >50% de clulas cancerosas. Ver figuras A, B y C.

Un grupo grande es un grupo de seales de forma irregular, que es 5 veces superior al dimetro de un solo punto. Como referencia deber usarse un solo punto de las clulas epiteliales tumorales o normales del mismo portaobjetos. Consulte la figura A.

A. Grupos grandes.

B. Mltiples puntos (>10 puntos).

Baja amplificacin: >5 puntos a 10 puntos, o pequeos grupos, o mezcla de puntos mltiples y grupos pequeos del gen HER2 presentes por ncleo en >50% de clulas cancerosas. Consulte las figuras D y E.
C. Grupos grandes y mltiples puntos. D. >5 a 10 puntos.

Un grupo pequeo es un grupo de seales de forma irregular, que tiene entre 3 y 5 veces el dimetro de un solo punto. Como referencia deber usarse un solo punto de las clulas epiteliales tumorales o normales del mismo portaobjetos. Consulte la figura E.

E. Grupos pequeos.

Sin amplificacin del gen HER2

Sin amplificacin
Polisoma: 3 a 5 puntos del gen HER2 presentes por ncleo en >50% de clulas cancerosas. Consulte la figura F. Un solo punto tiene bordes lisos y redondeados en clulas tumorales o normales. Consulte la figura F.
F. Polisoma: 3-5 puntos. G. Diploide: 1-2 puntos.

Diploida: 1 a 2 puntos de gen HER2 presentes por ncleo en >50% de clulas cancerosas. Consulte la figura G. Un solo punto tiene bordes lisos y redondeados en clulas tumorales o normales. Consulte la figura G.

Doblete
Si dos seales aparecen separadas por una distancia inferior al dimetro de una sola seal, ambas seales debern ser contabilizadas como un solo punto. Los dobletes se ven como parejas y no representan realmente un grupo pequeo. Consultar la figura H.
H. Doblete = 1 punto. Imagen por cortesa de la Dra. Adrienne Morey.

www.invitrogen.com
2008 Invitrogen Corporation. Todos los derechos reservados. Estos productos pueden estar cubiertos por una o ms licencias de uso limitado (consulte el catlogo de Invitrogen o www.invitrogen.com). Al usar estos productos, usted acepta los trminos y condiciones de todas las licencias de uso limitado aplicables. No previsto para uso teraputico o diagnstico en animales o el hombre a menos que se especifique lo contrario. O-079226-r1 0808

Apndice B: Hoja de puntuacin del HER2 mediante CISH

Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light , n de cat. 84-0150

ID del registro del proceso de tincin: _____________________________________________________________________________ Kit para HER2 mediante CISH SPOT-Light (84-0150) N de lote: __________________________________________________________ ID de la muestra: ______________________________________________________________________________________________

Resultados de la CISH (registre el nmero de seales HER2 en cada clula evaluada):

Grfica 1. Resultados de CISH

N de clula 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Puntos o grupos de HER2

N de clula 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Puntos o grupos de HER2

N de clula 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Puntos o grupos de HER2

Nota: Para los grupos le rogamos que facilite la estimacin ms exacta posible de los puntos/copias de genes (grupo pequeo = 5 puntos, grupo grande = 10 puntos).

Suma de puntos en 30 clulas ____________________________ Promedio de puntos en 30 clulas _________________________

Si el promedio oscila entre 4 y 6 puntos, cuente los puntos en otras 30 clulas hasta un total de 60 clulas y anote los resultados en la grfica 2. Si el promedio es <4 o >6, no ser necesario contar otras 30 clulas y la muestra podr registrarse como amplificada o no amplificada.

Puntuacin de CISH

Pautas de Invitrogen para la puntuacin del HER2 mediante CISH

No amplificacin: de 1 a 5 seales/ncleo en clulas tumorales Amplificacin: >5 seales/ncleo, o grupo de seales/ncleos amplificados en >50% de clulas tumorales

Resultado:

No amplificacin (5)

Amplificacin (>5)

Firma y fecha del tcnico: _______________________________________________________________________________________ Firma y fecha del patlogo: _____________________________________________________________________________________

Grfica 2 (resultados de la CISH). Si es necesario, introduzca el nmero de puntos en el segundo conjunto de 30 clulas:

N de clula 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Puntos o grupos de HER2

N de clula 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Puntos o grupos de HER2

N de clula 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Puntos o grupos de HER2

Suma de puntos en las clulas 31-60 _______________________ Suma de puntos en las clulas 1-30 ________________________ Promedio de puntos en 60 clulas _________________________

Puntuacin de CISH

Pautas de Invitrogen para la puntuacin del HER2 mediante CISH

No amplificacin: de 1 a 5 seales/ncleo en clulas tumorales Amplificacin: >5 seales/ncleo, o grupo de seales/ncleos amplificados en >50% de clulas tumorales

Resultado:

No amplificacin (5)

Amplificacin (>5)

Firma y fecha del tcnico: _______________________________________________________________________________________ Firma y fecha del patlogo: _____________________________________________________________________________________

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