ESPERMATOBIOSCOPIA

OBJETO:

Establecer el procedimiento estandarizado basado en los lineamientos de la OMS, para evaluar los parmetros del eyaculado obtenido por masturbacin aportando informacin fidedigna y til al mdico. El presente tiene aplicacin en el rea de fertilidad del Laboratorio Biotest, para la evaluacin de la fertilidad masculina.

CAMPO DE APLICACIN

RESPONSABLES: Qumico Fundamento: La reproduccin es la capacidad que los seres vivos tienen para perpetuarse y dar lugar a otros individuos semejantes a ellos y constituye una funcin bsica de todo organismo. En el ser humano la reproduccin es sexual y se inicia con la produccin de clulas o gametos. En el hombre los llamados espermatozoides y en la mujer los vulos. La espermatogenesis es el proceso por el cual se producen los espermatozoides y tiene lugar en los testculos. El anlisis del semen es la prueba clnica de laboratorio ms importante disponible en la evaluacin de la fertilidad masculina. Muestra: Semen (eyaculado total) -La muestra debe obtenerse por masturbacin y eyaculacin en un recipiente de boca ancha. El recipiente debe estar tibio para evitar un cambio de temperatura que reduzca la motilidad de los espermatozoides. -Recoger la muestra entre del 3er y 7mo da de abstinencia sexual y alcohlica. -No tener fiebre ni estar cursando con un proceso viral o bacteriano durante la obtencin de la muestra. -Lo ideal es que la muestra se obtenga dentro del laboratorio o entregarse antes de transcurrida una hora de haberse obtenido. -No deben usarse condones de ningn tipo para recoger el semen. -El coito interrupto no es aceptable para la recoleccin de la muestra. -La muestra debe protegerse de temperaturas extremas no menos de 20oC ni ms de 40oC durante el traslado al laboratorio. Tiempo mximo desde la emisin de la muestra hasta su anlisis: 1 hora. (optimo 1 hora). Volumen mnimo aceptable: Eyaculado total. Reactivos: Solucin para contar espermatozoides. Tiras de pH. Colorantes eosina buferizada.

Materiales: Tubos de ensayo 12 x 75. Gradilla

Portaobjetos Cubreobjetos 22 x 22 mm Puntas desechables para pipeta Pipeta graduada 5 ml Cmara hmeda

Equipo: Incubadora. Microscopio Pipetas semiautomticas. Cmara de Neubauer. Contador manual de clulas. Timer

Instrucciones: IDENTIFICACION DE LA MUESTRA 1. Al recibir la muestra anotar en la solicitud nombre del paciente, periodo de abstinencia, fecha y hora de la recoleccin. 2. Rotular la muestra en cuanto llegue al laboratorio y en presencia del paciente. Con nmero de identificacin nombre y apellido del paciente. 3. Verificar que la muestra se encuentre en un recipiente que cumpla las especificaciones.

EXAMEN MACROSCOPICO a) Licuefaccin. La muestra se coagula en cuanto es eyaculada y se licua dentro de los siguientes 60 minutos. Examinar la muestra en cuanto llega al laboratorio mantener la en incubadora mezclar por rotacin cada 10 minutos hasta que se complete la licuefaccin y anotar el tiempo. b) Aspecto. Examinar la muestra inmediatamente despus de su licuefaccin o dentro de los 60 minutos de recolectada, observar los siguientes aspectos si es transparente. Translucida, opaca u opalescente. c)Volumen. Medir el volumen con una pipeta graduada de 5ml y con ayuda de la perilla. d)Viscosidad. Con la misma pipeta que se midi el volumen dejar en cada libre la muestra y observar la longitud de filamento formado. Normal: se observan pequeas gotas bien definidas. Anormal: se forma un filamento mayor de 2 cm de longitud. e)pH. Medir el pH con tira de papel, humedecer la tira en la muestra y comparar con la carta de color. f)Color. Una muestra normal es homognea y gris opalescente. Se clasifica como blanco grisceo o blanco amarillento.

EXAMEN MICROSCOPICO Preparacin inicial 1. Homogenizar suavemente la muestra mediante movimientos circulares por 5 minutos y en todas direcciones. 2. Pipetear 10 ul de la mestra por pipeteo inverso y colocarlos en un portaobjetos , poner en un cubreobjetos de 22 x 22 mm. Permitir que la muestra se estabilice por un minuto. 3. Observar al microscopio con 40x. Observar el nmero de espermatozoides por campo para determinar la dilucin que debe hacerse. Menos de 15 xc Dilucin 1:5 16 a 40 xc 41 a 200 xc Mas de 200 xc Dilucin 1:10 Dilucin 1:20 Dilucin 1:50

Evaluacin de la motilidad. -En la preparacin inicial. Se evala dentro del rea definida del campo indicada con lneas punteada en la siguiente figura, o en todo el campo en caso de que la concentracin sea baja.

Lneas paralelas en el campo de visin.

Seleccin sistemtica de ocho campos a 5 mm de los bordes del cubreobjetos. La motilidad de los espermatozoides de clasifica de acuerdo a lo siguiente: A: Motilidad progresiva rpida (> 25 um/s a 37oC ; >20um/s a 20oC) 25um es aprox la longitud de 5 cabezas o media cola. B: Motilidad progresiva lenta. C: Motilidad no progresiva (< 5 mm/s). D: Inmviles. -Primero realizar conteo de espermatozoides con A y B, luego los de tipo C y por ltimo los inmviles o D en la misma campo. Se debe contar con el contador manual de laboratorio. Deben contarse 200 espermatozoides. -Repetir todo el procedimiento en otra preparacin. Los resultados se expresan en % y se comparan entre si los dos conteos.

Control de calidad. -Calcular el promedio de cada categora y calcular su diferencia. Interpolar estas en la Figura y analizar si se rechazan o se aceptan los conteos. Se rechazan si la diferencia entre porcentajes esta por arriba de la curva segn el nmero de espermatozoides contados en total. En caso de rechazo evaluar la motilidad por duplicado nuevamente.
15
Diferencia entre porcentajes

N=100

10 N=200 N=400 5

10

20 30 Porcentaje promedio

40

50

Observar Aglutinacin. Se debe evaluar en el momento de determinar la motilidad. Aglutinacin es cuando los espermatozoides mviles se adhieren entre ellos cabeza con cabeza, cola con cola, o cabeza con cola. No se considera aglutinacin cuando se unen con otras clulas, filamentos mucoides o detritos. -Determinar en 10 campos al azar. Calcular el promedio. -Se informa: Negativa (sin aglutinacin) + a ++++ describiendo la forma de aglutinacin. Positiva: sugiere causa inmunolgica de infertilidad pero no es suficiente para probarla.

Elementos celulares diferentes de espermatozoides clulas redondas. Clulas redondas.- son clulas diferentes al espermatozoide, incluyen espermatogonias, espermatocitos primarios y secundarios, espermatides, leucocitos y clulas epiteliales uretrales y prostticas. -Deben contarse clulas redondas por 100 espermatozoides y se calculan con la siguiente frmula: C: (N x S)/100 Donde C: tipo celular evaluado N: cantidad de clulas por 100 espermatozoides S: recuento de espermatozoides en mil/ml. -Si no se observan clulas en el total del portaobjetos, es apropiado informar menos de 3700 cel/ml Normal: menor de 5 millones de cel redondas/mL.

CONCENTRACION ESPERMATICA Una vez hecha la estimacin preliminar de la concentracin de espermatozoides y determinado que dilucin se ha de efectuar se procede a realizar el conteo utilizando la cmara de Neubauer. -Diluir la muestra en tubos de 12x75 utilizando pipeta semiautomtica y por la tcnica de pipeteo inverso. -Homogenizar la dilucin en vortex. -Cargar la cmara con 10 ul en cada lado de la cmara. -Dejar reposar 5 minutos en cmara hmeda. -Hacer un conteo rpido en la cuadricula central. Si hay menos de 10 espermatozoides contar 25 cuadritos Si hay entre 10 y 40 espermatozoides contar 10 Si hay mas de 40 espermatozoides contar 5. -Contar por duplicado y verificar el error. Obtener la suma de los dos conteos y obtener la diferencia de la misma, extrapolarlo en la grafica. En la siguiente figura se muestra el rango de diferencia que se espera ocurran en un 95% de las muestras causadas por error estadstico. Diferencias mayores sugieren un error de dilucin, de conteo o una distribucin no uniforme de los espermatozoides en el semen diluido.

50

Diferencia entre contajes

40

30

20

10

0 0 100 200 300 400 500 600

Suma de los dos contajes

-Para determinar la concentracin de espermatozoides en mill/ml, el promedio de espermatozoides se divide por el factor de conversin apropiado segn del siguiente cuadro. Factores de dilucin y conversin para el hemocitometro mejorado de Neubauer

en + diluyente) Esper

Espermatozoides Por campo De 400x <15 15-40 41-200 >200

-E por campo de 40-0Eo de cuadradeo

Dilucin (semen + Diluyente 1:5 (1+4) 1:10 (1+9) 1:20 (1+19) 1:50 (1+49)

Factores de conversin Numero de cuadros Grandes contados 25 10 5 20 10 5 10 4 2 5 2 1 2 0.8 0.4

En la cuadricula central de la cmara de neubauer contar las cabezas que quedan sobre la lnea superior e izquierda. -Contar por duplicado y calcular la suma y diferencia. -Ver en la grafica si el error no es superior al esperado.

Menos de 1-2 espermatozoides por campo. -Centrifugar 1ml de mestra a 600 g / 15 minutos, retirar un volumen conocido de plasma seminal y resuspender. La concentracin final es corregida en funcin del volumen inicial. -Para fines clnicos es til informar una concentracin menor a 2 x 106 espermatozoides /mL. Aparente azoospermia. -Centrifugar la muestra a mas de 3000 g durante 15 minutos. -Efectuar una bsqueda completa y sistematica de TODO el sedimento para poder informar como 0.0 x 106 espermatozoides/mL. MORFOLOGIA La morfologa se observa en extensiones fijadas y tenida con tincin de diferenciales. Si la concentracin es mayor de 20 mill/ml utilizar 5ul de muestra homogenizada Si la concentracin es menor de 20 mill/ml utilizar 10ul de muestra homogenizada. Realizar la preparacin con el borde del portaobejtos. Secar al aire en posicin horizontal. Fijar y teir como diferencial. -Se observa al microscopio con 100x de inmersin. -Contar 200 espermatozoides -Informar el % de formas anormales