Cuantificacin de Protenas mediante el mtodo KjelDahl

Entre los nutrientes bsicos para nuestro organismo se encuentran las protenas, cadenas de molculas asociadas con parmetros de calidad de los alimentos , y que pueden tener influencia en los procesos industriales (gelificacin, extrusin) , en el color o aroma de alimentos (productos horneados de panificacin, tostado de caf) o en el precio de los cereales ( porcentaje de protenas vegetales).
Imprimir >> Volver >> Las unidades constitutivas de las protenas son los aminocidos, molculas que poseen Nitrgeno en su estructura. Si bien se han encontrado aproximadamente 200 aminocidos en la naturaleza, son 20 de ellos los ms frecuentes. El contenido de Nitrgeno en una protena vara de acuerdo al origen de la misma entre 15 % y 18 % , tomndose como un valor promedio 16 %. En el anlisis qumico de protenas , se cuantifica el contenido de Nitrgeno y luego se determina el porcentaje de aquellas presente en la muestra relacionndolo con el origen de la misma (vegetal, animal, fertilizante, medicamento). PRINCIPIO DEL METODO KJELDAHL El Mtodo desarrollado por Kjeldahl consta de tres etapas:

1. 2. 3.

Digestin: conversin del Nitrgeno (proveniente de las protenas, por ejemplo) en ion amonio. Destilacin: separacin por arrastre con vapor del amonaco y posterior solubilizacin en una solucin cida de concentracin conocida. Valoracin: medicin de la cantidad de cido neutralizado por el amonaco disuelto, lo que indica la cantidad de Nitrgeno presente en la muestra inicial.

De acuerdo al origen de la muestra, a travs de un factor se relaciona la cantidad de Nitrgeno encontrado con el porcentaje de protenas que lo originaron. 1. DIGESTIN La muestra a analizar ,cuyo contenido de protenas es desconocido, es atacada por una mezcla de Acido Sulfrico al que se le aade una mezcla de una sal ( Sulfato de Potasio o de Sodio ) conteniendo una pequea proporcin de un catalizador. En la actualidad, el ms ampliamente usado es Sulfato de Cobre, por no ser txico y resultar inocuo para el medio ambiente. El agregado de la sal mezclada con el catalizador provoca que la temperatura durante la digestin se eleve e incremente la velocidad de ruptura de los enlaces moleculares, facilitando la completa conversin del Nitrgeno proteico en ion Amonio. La tcnica consiste entonces en colocar la muestra en el tubo de reaccin , aadir el cido junto con la mezcla de la sal y el catalizador. Se procede entonces a incrementar la temperatura mediante la calefaccin directa del tubo que contiene a toda la mezcla, hasta alcanzar los 370*C; una vez alcanzada esa temperatura se la mantiene hasta lograr la completa digestin de la muestra. Entre los modelos existentes en el mercado, la firma BUCHI de Suiza provee digestores identificados como modelos K-424 y K435 que permiten la operacin simultnea de 6 o 12 tubos, mediante calefaccin por radiacin infrarroja logrando un calentamiento rpido hasta alcanzar la temperatura mxima de operacin. En el caso de ser necesaria la digestin simultnea de ms muestras, se podr optar por el modelo K-370, que calefacciona mediante block de Aluminio hasta 20 tubos. Este modelo permite adems la programacin del proceso de calefaccin a contraturno, lo que permitira contar con las muestras ya digeridas en el momento de comenzar la jornada laboral. Es importante destacar que en esta etapa se hace necesario eliminar los gases sulfurosos provenientes de la digestin de cada uno de los tubos. Para ello se crea una leve corriente de aspiracin mediante vaco, colectando y solubilizando los gases en una solucin alcalina, que evita la contaminacin de la atmsfera en el mbito laboral. Tambin aqu podemos recurrir a BUCHI, que nos ofrece una solucin prctica, mediante el disolutor de gases modelo B-414, que elimina toda posible contaminacin. El uso de los tubos de digestin BUCHI tiene como ventajas: su gruesa pared de vidrio resistente al trabajo con cido y lcalis concentrados y calientes, posee una junta hermtica en la boca que evitar la prdida de gases y el angostamiento que tienen evita salpicaduras con la consiguiente prdida de muestra y reactivos; su dimetro de 48 mm evita que se formen altas columnas de espuma , siendo su volumen de 300 ml adecuado para la operacin con muestras de baja densidad y gran volumen.

Para una muestra de 1 gramo, es necesario aadir 20 ml de cido Sulfrico, 9,500 gramos de Sulfato de Potasio y 0,500 gramos de Sulfato de Cobre. Para esta proporcin la operacin se prolonga durante 90 minutos o hasta 30 minutos luego de que la mezcla digerida haya tomado una coloracin verde azulada. El control de la temperatura es muy importante, ya que una temperatura inferior a la citada provoca una digestin incompleta mientras que una temperatura mayor provocar prdida de compuestos nitrogenados en la corriente de gases que salen de los tubos; en ambos casos, los resultados finales darn un porcentaje de protenas inferior al real. 2. DESTILACION. Durante esta etapa se procede a efectuar una reaccin de desplazamiento formando Amonaco libre y posteriormente se provoca una arrastre con vapor para poder recogerlo mediante una solubilizacin en un medio cido y valorarlo en la etapa siguiente. Luego del enfriamiento del tubo salido de la digestin, se diluye con agua deionizada y se aade una solucin de Hidrxido de Sodio con el propsito de liberar el ion Amonio presente, convirtindolo en Amonaco, el que deber recogerse por burbujeo del vapor de arrastre en una solucin cida de concentracin conocida. Existen dos posibilidades de medio cido receptor : solucin de cido Brico al 2% (o al 4%) o una solucin valorada de cido fuerte mineral ( Clorhdrico o Sulfrico). En la mayora de los casos se opta por el Brico, ya que es menos riesgoso el manejo del mismo, tampoco hay riesgo de prdidas de Amonaco y corresponde a la mayora de los mtodos oficiales de anlisis. BUCHI ofrece distintos modelos de destiladores: semiautomticos, como los modelos K-350 y K-355, en que el aadido del agua y cido puede hacerse de manera manual o mediante bomba de diafragma, o como el modelo B-324, en donde la dosificacin se hace exclusivamente mediante bombas de diafragma, evitando la incertidumbre provocada por el operado en la medicin de volmenes de lquidos. Una vez iniciada la destilacin, luego de 3 a 5 minutos se completa el arrastre y disolucin del Amonaco , debiendo procederse a la valoracin mediante una titulacin. 3. VALORACIN. En esta etapa se cuantifica la cantidad de Amonio formado, lo que permite medir la cantidad de Nitrgeno presente en la muestra original y que a su vez, conociendo el origen de la muestra y a travs de un factor promedio, establecer el porcentaje de protenas del que se parti. La reaccin de la valoracin, responde a: (Ver 3ra Frmula) Para efectuar la titulacin, an cuando existe la posibilidad de la valoracin visual mediante el uso de indicadores cido/base y la normativa no establece la obligacin de su uso, es muy recomendable la valoracin potenciomtrica utilizando un titulador automtico, que detectar el punto final de acuerdo al pH final alcanzado. Entre las ventajas de la valoracin potenciomtrica, la deteccin del punto final es muy precisa, permitiendo independizarse de la estimacin visual del operador, disminuyendo la dispersin de los resultados y la incertidumbre que provocaran distintos operadores que debieran fijar el punto final mediante el uso de indicadores cido/base. Al tener en el inicio de la valoracin slo una disolucin de cido brico en agua, su pH es 4,65. Una vez finalizada la etapa de la Destilacin, el Amonaco solubilizado provoca que el pH sea mayor, por lo que se deber valorar dosificando un cido de concentracin conocida , por ejemplo Acido Sulfrico 0.5 N, hasta alcanzar nuevamente el valor inicial de pH 4,65. BUCHI ofrece la posibilidad de operar con el modelo B-370, que es un DESTILADOR con un TITULADOR AUTOMATICO incorporado, por lo que se unifican las etapas de Destilacin y Valoracin, programndolo para que efecte ambas operaciones de manera combinada y consecutiva, brindando de manera automtica el resultado final. En caso de ser necesario un muestreador debido a la presencia de gran cantidad de muestras, se le puede adosar un portamuestras identificado por BUCHI como B-371, que permitir automatizar completamente las etapas de destilacin y valoracin hasta 20 muestras. Otra posibilidad sencilla se presenta para aquellos que quieran optar por una valoracin mediante un titulador automtico, es el uso del nuevo modelo DL 15 presentado por METTLER poco tiempo atrs; robusto, fcil de manejar y preparado para valoraciones potenciomtricas a punto final, permitir obtener resultados precisos que ahorrarn tiempo y errores en los resultados finales de protenas a informar, con el consiguiente ahorro de dinero. CALCULOS

%P = ( V -- VB ). 1,4007

N . 100/m

donde: %P: porcentaje de protenas en la muestra, V: volumen de cido consumido durante la valoracin de la muestra, (mililitros) VB: volumen de cido consumido durante la valoracin del blanco, (mililitros) N: Normalidad del cido titulante M: masa de la muestra (gramos) F: Factor de protena, acorde al origen de la muestra gelatina (5,55) leche, (6,30), Carne bovina (6,25), pescado (6,25), aceite vegetal (5,40), maz (6,25) Por la consistencia de los resultados obtenidos durante los 120 aos transcurridos desde su desarrollo inicial por Kjeldahl, es que se la considera altamente recomendable, atrevindonos a augurar su uso por mucho tiempo ms en la industria nacional.