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Columnas de relleno

Las columnas de relleno o empacadas consisten en unos tubos de vidrio, metal (inerte a ser posible como el acero inoxidable, Niquel, Cobre o Aluminio) o tefln, de longitud de 2 a 3 metros y un dimetro interno de unos pocos milmetros, tpicamente de 2 a 4. El interior se rellena con un material slido, finamente dividido para tener una mxima superficie de interaccin y recubierto con una capa de espesores entre 50 nm y 1 m. Para que puedan introducirse en el horno, se enrollan convenientemente. El material de relleno ideal consiste en pequeas partculas, esfricas y uniformes, con una buena resistencia mecnica, para tener una mxima superficie donde interaccionar la fase estacionaria y el analito. La superficie especfica mnima ha de ser de 1 m/g. Como todos los componentes de columnas para GC, debe ser inerte a altas temperaturas (~400 C) y humectarse uniformemente con la fase lquida estacionaria durante el proceso de fabricacin. El material preferido actualmente (2005) es la tierra de diatomeas natural, debido a su tamao de poro natural. Estas especies, ya extinguidas, utilizaban un sistema de difusin molecular para tomar nutrientes del medio y expulsar sus residuos. Por tanto, debido a que el sistema de absorcin superficial del analito y la fase estacionaria es parecido, son materiales especialmente tiles. El tamao es crtico a la hora de darse el proceso de interaccin del analito, y a menores tamaos la eficacia de la columna es mejor. Pero existe el problema de la presin necesaria para hacer circular un caudal estable de gas portador por la columna, ya que dicha presin es inversamente proporcional al cuadrado del dimetro de dichas partculas. As, el tamao mnimo para usar presiones mximas de 50 psi es de 250 a 149 m.

Columnas capilares

Las columnas capilares son de dos tipos bsicos: las de pared recubierta (WCOT) y las de soporte recubierto (SCOT). Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared interna se ha recubierto con una finsima capa de fase estacionaria. Las columnas SCOT tienen en su parte interna una fina capa de material absorbente como el empleado en las columnas de relleno (tierra de diatomeas) donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las SCOT frente a las WCOT es la mayor capacidad de carga de esta ltima, ya que en su fabricacin se emplean mayores cantidades de fase estacionaria, al ser la superficie de intercambio mayor. Por orden de eficacia, en primer lugar estn las WCOT, luego las SCOT y por ltimo las columnas de relleno. Las columnas WCOT se fabrican a partir de slice fundida, conocidas como columnas tubulares abiertas de slice fundida o FSOT. Estas columnas se fabrican a partir de slice especialmente pura, sin apenas contenido de xidos metlicos. Debido a la fragilidad inherente a este material, en el mismo proceso de obtencin del tubo se recubre con una capa de poliimida, de esta forma la columna puede enrollarse con un dimetro de unos pocos centmetros. Estas columnas, con propiedades como baja reactividad, resistencia fsica y flexibilidad, han sustituido a las WCOT clsicas. Las columnas FSOT tienen dimetros internos variables, entre 250 y 320 m (para columnas normales) y 150-200 m para columnas de alta resolucin. Estas ltimas requieren menor cantidad de analito y un detector ms sensible, al eluir menor cantidad

de gas. Existen asimismo columnas macrocapilares con dimetros de hasta 530 m, que admiten cantidades de analito comparables a las de relleno pero con mejores prestaciones. En estas columnas existe un problema debido a la absorcin del analito sobre la superficie de la slice fundida, adsorcin debida a la presencia de grupos silanol (SiOH), los cuales interaccionan fuertemente con molculas polares orgnicas. Este inconveniente se suele solventar inactivando la superficie por sililacin con dimetilclorosilano (DMCS). La absorcin debida a los xidos metlicos se ve paliada en gran parte por la elevada pureza de la slice empleada.

La fase estacionaria

Las propiedades necesarias para una fase estacionaria lquida inmovilizada son: 1. Caractersticas de reparto (factor de capacidad ' y factor de selectividad ) adecuados al analito. 2. Baja volatilidad, el punto de ebullicin de la fase estacionaria debe ser al menos 100 C mayor que la mxima temperatura alcanzada en el horno. 3. Baja reactividad. 4. Estabilidad trmica, para evitar su descomposicin durante la elucin. Existen como mucho una docena de disolventes con estas caractersticas. Para elegir uno, debe tenerse en cuenta la polaridad del analito, ya que a mayor polaridad del analito, mayor polaridad deber tener la fase estacionaria. Algunas fases estacionarias utilizadas actualmente (2005) son:

Polidimetilsiloxano, fase no polar de uso general para hidrocarburos, aromticos, polinucleares, drogas, esteroides y PCB. Poli(fenilmetildifenil)siloxano (10% fenilo), para steres metlicos de cidos grasos, alcaloides, drogas y compuestos halogenados. Poli(fenilmetil)siloxano (50% fenilo), para drogas, esteroides, pesticidas y glicoles. Poli(trifluoropropildimetil)siloxano, para aromticos clorados, nitroaromticos, bencenos alquilsustituidos. Polietilenglicol,sirve para compuestos polares, tambin para compuestos como glicoles, alcoholes, teres, aceites esenciales. Poli(dicianoalildimetil)siloxano, para cidos grasos poliinsaturados, cidos libres y alcoholes.

Generalmente, en columnas comerciales, la fase estacionaria se presenta enlazada y entrecruzada para impedir su prdida durante las operaciones de elucin o lavado. De esta forma se obtiene una monocapa adherida qumicamente a la superficie de la columna. La reaccin implicada suele ser la adicin de un perxido al lquido a fijar, inicindose una reaccin por radicales libres que tiene como resultado la formacin de un enlace carbono-carbono que adems incrementa su estabilidad trmica. Otra forma es la irradiacin con rayos gamma.

Otro tipo de fase estacionaria son las quirales, lo cual permite resolver mezclas enantiomricas. Este tipo de fases suelen ser aminocidos quirales o algn derivado adaptado al trabajo en columna. El grosor de la pelcula vara entre 0,1 y 5 m; el grosor depende de la volatilidad del analito. As, un analito muy voltil requerir una capa gruesa para aumentar el tiempo de interaccin y separar ms efectivamente los diferentes componentes de la mezcla. Para columnas tpicas (dimetros internos de 0,25 o 0,32 mm) se emplean grosores de 0,25 m, y en las columnas macrocapilares el grosor sube hasta 1 m. El grosor mximo suele ser de 8 m
1.1.01 Cromatografa La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el cual los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una que es estacionaria (fase estacionaria) mientras que la otra, (la fase mvil) se mueve en una direccin determinada. 1.1.02 Cromatograma Es un grfico u otra representacin de la respuesta del detector, de la concentracin del analito en el efluente o de otra magnitud utilizada para medir una propiedad del efluente frente al volumen de efluente o tiempo. En cromatografa en plano, "cromatograma" puede ser el papel o capa con las zonas separadas. 1.1.04 Cromatgrafo Sistema instrumental para llevar a cabo la separacin cromatogrfica. 1.1.05 Fase estacionaria La fase estacionaria es una de las dos fases que forman un sistema cromatogrfico. Puede ser un slido, un gel, o un lquido. Si es un lquido puede estar adherido sobre un slido. Este slido puede o no contribuir al proceso de separacin. El lquido tambin se puede unir qumicamente al slido (fase unida qumicamente) o inmovilizarse sobre l (fase inmovilizada). La expresin lecho cromatogrfico o sorbente, se puede emplear como trmino general para denominar cualquiera de las diferentes formas en las que se presenta la fase estacionaria. Nota: En particular, en cromatografa de gases en la que la fase estacionaria es con frecuencia un lquido, el trmino fase lquida se utiliza en lugar del de fase estacionaria por contraposicin con el de fase gaseosa, que es la fase mvil. Por otro lado, y fundamentalmente en los comienzos de la cromatografa de lquidos, el trmino "fase lquida", se utiliz tambin para caracterizar la fase mvil por contraposicin con la fase slida, que es la fase estacionaria. Debido a esta ambigedad, se ha rechazado el uso del trmino. Si es necesario expresar el estado fsico de la fase estacionaria, se propone el uso de formas adjetivas tales como fase estacionaria lquida, fase estacionaria slida o fase inmovilizada. 1.1.05.1 Fase unida qumicamente Es una fase estacionaria que est covalentemente unida a las partculas del soporte o a la pared interna del tubo de la columna. 1.1.05.2 Fase inmovilizada

Es una fase estacionaria que est inmovilizada sobre las partculas del soporte o sobre la pared interna de la columna, por ejemplo, por polimerizacin in situ (reticulacin) despus del recubrimiento. 1.1.06 Fase mvil Es un fluido que penetra a travs o a lo largo del lecho estacionario, en una direccin determinada. Puede ser un lquido (cromatografa de lquidos) o un gas (cromatografa de gases) o un fluido supercrtico (cromatografa de fluidos supercrticos). En cromatografa de gases se puede utilizar la expresin gas portador para designar la fase mvil, y en cromatografa de elucin se puede utilizar la palabra eluyente para designar esta misma fase. 1.1.07 Eluir Cromatografiar por cromatografa de elucin. El proceso de elucin se puede detener mientras todos los componentes estn an en el lecho cromatogrfico, o continuar hasta que todos los componentes lo hayan abandonado. Nota: El trmino eluir es preferible al trmino desarrollar utilizado en la anterior nomenclatura de cromatografa en plano. 1.1.08 Efluente Es la fase mvil que sale de la columna. 1.1.09 Muestra La muestra consiste en un determinado nmero de componentes cuya separacin se alcanza en el lecho cromatogrfico cuando son arrastrados o eluidos por la fase mvil. 1.1.10 Componentes de la muestra Son los constituyentes qumicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria, estar parcialmente retenidos ( es decir eluidos en tiempos diferentes ), o bien permanentemente retenidos. Se puede aceptar tambin la palabra analito para designar a un componente de la muestra. 1.1.11 Soluto Es un trmino que designa a los componentes de una muestra en una cromatografa de reparto. 1.1.12 Disolvente Es un trmino con el que algunas veces se denomina a la fase estacionaria lquida, en una cromatografa de reparto. Nota: En cromatografa de lquidos, el trmino "disolvente" se ha empleado con frecuencia para designar la fase mvil. Esta utilizacin no es recomendable. 1.1.13 Zona Es una regin del lecho cromatografico donde se localizan uno o ms componentes de la muestra. Se puede utilizar tambin el trmino banda. 1.2 MTODOS PRINCIPALES 1.2.01 Cromatografa frontal Es un procedimiento en el cual la muestra (lquido o gas), se introduce de forma continua dentro del lecho cromatogrfico. En cromatografa frontal no se utiliza ninguna fase mvil adicional.

1.2.02 Cromatografa de desplazamiento Es un procedimiento en el que la fase mvil contiene un compuesto (el desplazante), que est ms fuertemente retenido que los componentes de la muestra a analizar. La muestra se introduce en el sistema en una cantidad determinada. 1.2.03 Cromatografa de elucin. Es un procedimiento por el cual la fase mvil pasa continuamente a travs o a lo largo de un lecho cromatogrfico, y la muestra se introduce en el sistema en una cantidad determinada. CLASIFICACIN SEGN EL ESTADO FSICO DE LA FASE MVIL 1.4.01 Las tcnicas cromatogrficas se clasifican, a menudo, indicando el estado fsico de las dos fases utilizadas. Segn esta clasificacin, se utilizan las siguientes expresiones: Cromatografa gas-lquido (GLC) Cromatografa gas-slido (GSC) Cromatografa lquido-lquido (LLC) Cromatografa lquido-slido (LSC) La expresin cromatografa de reparto gas-lquido (GLPC), tambin se puede encontrar en la bibliografa. Sin embargo, la distincin entre estas dos formas algunas veces no es fcil. Por ejemplo, en GC se puede utilizar un lquido para modificar un adsorbente slido empleado como fase estacionaria. 1.4.02 Cromatografa de gases (GC) Es una tcnica de separacin en la que la fase mvil es un gas. La cromatografa de gases se lleva a cabo siempre en columna. 1.4.03 Cromatografa de lquidos (LC) Es una tcnica de separacin en la que la fase mvil es un lquido. La cromatografa de lquidos se puede realizar tanto en columna como en plano. Nota: Hoy da, la cromatografa de lquidos en la que, normalmente se utilizan partculas muy pequeas y presiones de entrada relativamente altas, se suele denominar cromatografa de lquidos de alta eficacia (o alta presin), y con el acrnimo HPLC. 1.4.04 Cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) Es una tcnica de separacin en la que la fase mvil es un fluido ligeramente por encima de su temperatura y presin crticas. Nota: En general, los trminos y definiciones utilizados en cromatografa de gases o lquidos, son aplicables a la cromatografa de fluidos supercrticos.

1.5 CLASIFICACIN SEGN EL MECANISMO DE SEPARACIN 1.5.01 Cromatografa de adsorcin La separacin se basa fundamentalmente en las distintas afinidades de adsorcin de los componentes de la muestra hacia la superficie de un slido activo. 1.5.02 Cromatografa de reparto La separacin se basa fundamentalmente en las diferencias de solubilidad de los componentes de la muestra en la fase estacionaria (cromatografa de gases) o en las diferencias de solubilidad de los componentes en la fase mvil y en la fase estacionaria (cromatografa de lquidos). 1.5.03 Cromatografa de intercambio inico La separacin se basa fundamentalmente en la distinta susceptibilidad para el intercambio de iones de los componentes de la muestra. Nota: Hoy da, la cromatografa de intercambio inico sobre partculas pequeas con columnas de alta eficacia, en la que se utilizan normalmente detectores conductimtricos o espectroscpicos, se suele denominar cromatografa inica (IC). 1.5.04 Cromatografa de exclusin La separacin se basa fundamentalmente en efectos de exclusin, tales como diferencias en el tamao de las molculas y /o en su forma o en su carga. El trmino cromatografa de exclusin por tamao, se puede utilizar cuando la separacin se basa en el tamao molecular. Los trminos cromatografa de filtracin sobre gel o permeacin sobre gel (GPC), se han utilizado con anterioridad para describir este proceso cuando la fase estacionaria es un gel hinchado. El trmino cromatografa de exclusin de iones es especfico para la separacin de iones en una fase acuosa. 1.5.05 Cromatografa de afinidad Esta expresin caracteriza a una particular variante de la cromatografa, en la que se utiliza para la separacin una interaccin biolgica especfica entre el analito y la fase.

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