Prcticas de Laboratorio de Microbiologa

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1.1.

1.2. 1.3.

Determinar efectos de la temperatura, pH, la presin osmtica y la tensin de oxgeno, sobre la morfologa y desarrollo de cultivos bacterias aislados en la prctica anterior. Aprender tcnicas de siembra y lectura de crecimiento en cultivos slidos y lquidos, y en cultivos en anaerobiosis Realizar tcnica de microcultivo de Hongos para optimizar las observaciones y caracterizacin de estructuras vegetativas y reproductivas

Para estudiar un microrganismo es necesario previamente poder aislarlo y cultivarlo en las condiciones del laboratorio. Para lograr esto es preciso conocer cules son las condiciones medioambientales y los nutrientes que requieren para su ptimo desarrollo y reproduccin. En general, cuando se habla de desarrollo o crecimiento microbiano este puede ser definido por un aumento de la masa celular, en el caso de las bacterias la mayora de las veces nos referimos a un crecimiento poblacional mediado por los procesos de replicacin del ADN y divisin celular, donde cada clula aislada o UFC (Unidad Formadora de Colonia) origina primero 2 clulas hijas por fisin binaria hasta conformarse una colonia y es una medida cuantitativa del nmero de bacterias iniciales. En los hongos podramos hablar de un crecimiento celular ya que de una misma hifa o espora se puede generar una gran cantidad de masa celular sobre el medio de crecimiento formndose, y una vez que esporula cada espora es un individuo potencial y hablamos de crecimiento poblacional. En esta oportunidad nos vamos a centrar en los factores medioambientales o abiticos que condicionan las capacidades metablicas de los microrganismos y por lo tanto su crecimiento, dejando de lado las relaciones intra e inter-especficas que pueden afectar la dinmica del crecimiento microbiano.

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Ya sea que hablemos de crecimiento poblacional o celular factores como la temperatura, el pH, la presin osmtica, la tensin de oxgeno, la intensidad lumnica y la presin atmosfrica afectan, retardan, aceleran o definitivamente detienen el crecimiento de los microrganismos y los llevan a la muerte. El identificar la influencia sobre el desarrollo y crecimiento microbiano de dichos factores nos ayudar a explicar su distribucin en la naturaleza y a disear mtodos para su control o inhibicin total (ver 6. Lectura complementaria). No todos los microrganismos responden de la misma forma a un factor ambiental determinado, convirtindose en una herramienta til a la hora de su aislamiento, cultivo, clasificacin e identificacin en el laboratorio, dependiendo de si el microrganismos es patgeno (causante de enfermedad), saprfito (flora inocua que vive en la materia orgnica muerta y ayuda a su descomposicin) u oportunista (puede causar enfermedad o no dependiendo de los factores nutricionales, estructurales e inmunes del husped y del medio), siendo este ltimo el que puede adaptarse a rangos ms amplios de dichas condiciones. De hecho una condicin ambiental puede ser daina para un microrganismo o beneficiosa para otro, pueden tolerar algunas condiciones adversas, que rebasadas nos les permiten crecer y por lo tanto debemos diferenciar entre las condiciones ambientales y sus efectos sobre la viabilidad y su reproduccin. a. Temperatura: El proceso de desarrollo de las bacterias depende de ms de 2000 reacciones bioqumicas de una gran diversidad, y la velocidad con que se efectan dichas reacciones esta influida por la temperatura, l cuela puede determinar en parte la velocidad de crecimiento y el grado total de desarrollo de los microrganismos. Las variaciones en temperatura pueden influir en los procesos metablicos y en la morfologa celular. Cada especie microbiana posee una temperatura ptima de crecimiento clasificndose segn esto en los siguientes grupos: Psicrfilas: capaces de desarrollarse a 0 C o menos. Su temperatura ptima es alrededor de los 15 C. Ej: Flavobaterium sp Mesfilas: crecen mejor entre 25 y 40 C. Ej: Escherichia coli Euritermfilas: termfilas facultativas, aquellas que son capaces de crecer en temperaturas de las mesfilas. Ej: Bacillus stearothermophilus Termfilas: crecen mejor entre 45 y 60 C. Ej: Thermococcus celer Hipertermfilas: crecen a temperaturas superiores a los 80 C 1 Pyrodictium brockii
1

Hasta hace poco la temperatura ms alta de crecimiento reportada era de 105 C, entonces se crea que el lmite de temperatura para la vida era de 100 C (punto de ebullicin del agua). Se han encontrado bacterias que crecen en chimeneas calientes hidrotermales o "black smokers" (fumarolas negras) ubicadas en las grietas del suelo ocenico que expulsan aguas bentnicas a temperaturas superiores a los 350 C. Se ha demostrado que estas bacterias pueden crecer y multiplicarse a 113 C.

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b. Potencial de hidrgeno, es un de los factores ms importantes ya que condiciona la disponibilidad de nutrientes del medio para el microrganismo y refleja a la vez los efectos sobre el medio del metabolismo mismo del microrganismo. Algunos microrganismos toleran cambios de pH de 3 o 4 unidades. Los microrganismos que soportan pH cidos se denominan acidfilos y pueden llegar a crecer en ph 4, los que soportan pH bsicos se llaman basfilos o alcalinfilos. Como ya se sabe el pH depende del tipo de soluciones que se encuentren presentes y disociadas en el medio, y as mismo el pH puede cambiar por los procesos metablicos de los microrganismos que generan sustancias cidas o bsicas que son liberadas al medio por la clula: Utilizacin de carbohidratos---->Produccin de cidos orgnicos----> Acidificacin Catabolismo de protenas---->Produccin de materiales nitrogenados----> Alcalinizacin Aunque los microrganismos crecen a menudo en medios con amplios rangos de pH, su tolerancia tiene un lmite ya que variaciones intensas pueden alterar la membrana citoplasmtica o inhibiendo la actividad de las enzimas y las protenas transportadoras, la muerte bacteriana se produce su el pH interno desciende por debajo de 5.0 a 5.5, los cambios de pH pueden ionizar los nutrientes disminuyendo su disponibilidad por el organismo. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemas tampn o buffer que mantenga el pH del medio regulado durante todo el crecimiento para que no se vea afectado por el metabolismo del microrganismo. Uno de los ms utilizados en microbiologa es la combinacin de Fosfatos de Potasio (KH2PO4 y K2HPO4, manteniendo el pH del medio en aprox. en 6,8) tambin se usa la peptona. El pH del medio se puede ajustar antes de esterilizarlo, titulando parte del medio con Hidrxido de Sodio (NaOH) o Acido Clorhdrico (HCL) y ajustando el resto con las mismas sustancias. De acuerdo al rango de pH ptimo de crecimiento los microrganismos pueden clasificarse como: Acdofilos: 0 a 5,5 Ej: Thiobacillus thiodoxidans, ptimo 2,0 a 3,5 Neutrofilos: 5,5 a 8.0 Ej: Escherichia coli, ptimo 6,0 a 7,0 Basfilos o Alcalfilos: 8,5 a 11,5, Ej: Bacillus alcalophilus, ptimo 10,6 (alcalfilo extremo) c. Presin osmtica/Disponibilidad del agua: Los medios de cultivo deben ser ligeramente hipotnicos que el interior de la clula, ya que de esta manera se facilita el flujo de agua con nutrientes disueltos hacia el interior de las clulas. Aunque para la mayora de los microrganismos el Cloruro de Sodio (NaCl) no es indispensable para su crecimiento (salvo para las bacterias marinas (%NaCl=3) que requieren de

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Departamento de Biologa - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo concentraciones de Na en el medio para mantener en su interior concentraciones de K adecuadas. Existen bacterias que requieren de medio hipertnicos denominadas halfilas como Halobacterium sp (halfilo extremo) que pueden soportar hasta un 20% de concentracin de NaCl, encontrado en lagos salados como los del Mar muerto (aw= 0.75) La concentracin de solutos esta condicionada por la cantidad de agua disponible en el medio, expresada en trminos fsicos como actividad del agua aw 2. Se presenta en rangos desde 1.0 (agua pura y pan), pasando por 0,95 (conservas), 0.80 los lagos salados, 0,75 (cereales, caramelos, frutos secos, chocolate) hasta 0.60 (leche en polvo). Por debajo de 0,55 se altera el ADN y por lo tanto no hay sobrevivencia. La mayora de los microroganismos crecen e aw superiores a 0.95 donde se ubican los En actividades de agua inferiores hablamos de organismos del mar aw= 0,98. osmotorelantes que sintetizan o acumulan sustancias en el citoplasma para obtener agua del medio denominadas solutos compatibles (pues no inhiben la bioqumica celular), tales como la batana, prolina, glutamato, sacarosa, ectona, etc., esta capacidad esta regulada genticamente permitiendo clasificar dichos microrganismos de acuerdo a la concentracin y tipo de soluto compatible encontrado en su citoplasma. Existen especies sacarfilas como la levadura Sacharomyces rouxii que pueden soportar aw cercanos a 0,60, otros se denomina xerfilos que crecen en ambientes muy secos con poca disponibilidad de agua. d. Tensin de Oxgeno: Los principales gases que afectan al desarrollo microbiano son el oxgeno y el dixido de carbono. Casi todos los organismos superiores son aerbicos obligados, donde el oxgeno acta como, aceptor final de electrones durante la respiracin aerbica, adems los eucariotes utilizan el oxgeno para sintetizar esteroles y cidos grasos instaurados. Los microrganismos presentan una respuesta amplia y variable al oxgeno libre (Ver Tabla en la siguiente pgina) Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la exposicin de estos microrganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de anaerobiosis por los siguientes mtodos: Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolato sdico, para disminuir el contenido de O2. Quitando el O2 por procedimientos mecnicos y remplazndolo por N2 o CO2. Mediante reacciones qumicas dentro del recipiente que contiene el medio de cultivo inoculado para combinar el oxgeno libre con otro compuesto. Por ejemplo: al encender una vela se consume el oxigeno presente.
aw: Razn entre la presin de vapor de aire con una sustancia o solucin y presin de vapor del agua pura a la misma temperatura de la sustancia, inversamente proporcional a la presin osmtica.
2

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Tabla 3.1.: Relaciones de los microrganismos con el Oxgeno
Grupo
Aerbicos Obligados o Estrictos

Requerimiento O2
Si

Metabolismo

Ejemplo

Hbitat tpico del Ejemplo

Piel, polvo

Respiracin aerbica

Micrococcus luteus

Facultativos Microaerfilos Anaerobios Aerotolerantes Obligados o Estrictos

No Si, baja tensin No Letal

Respiracin aerbica y anaerobia, Fermentacin Respiracin aerbica

Escherichia coli Spirillium volutans Streptococcus pyogenes Methanobacterium formicicum

Intestino Lagos

Fermentacin Fermentacin, Respiracin anaerobia

Tracto respiratorio Diverso, rumen

Para los microaerfilos que no soportan tensiones de oxgeno atmosfricas mayores (20%) se deben suministrar tensiones de 2 al 10%. Entre bacterias y protozoos podemos encontrar todos los 5 grupos de tolerancia e intolerancia al O2, los hongos son normalmente aerbicos, las levaduras anaerobias facultativas y las algas son aerbicas obligadas. El oxgeno puede llegar a ser txico para algunos organismos ya que muchas enzimas se inactivan cuando se oxidan. Cuando los organismos tienen como aceptor de electrones al oxgeno, deben protegerse a si mismos sintetizando enzimas como la superoxido dismutasa y la catalasa, ya que los productos de la reduccin del oxgeno mismo son extremadamente txicos, como el radical superxido, el perxido de hidrgeno y el radical hidrxilo. Estas enzimas son ausentes en los anaerobios estrictos. e. Suministro de luz: Los organismos fotosintticos o fototrfos debern ser expuestos a una fuente de iluminacin ya que la luz es su fuente de energa, como es el caso de las cianobacterias y algas. Esta fuente de iluminacin no debe plantear problemas de variacin de temperatura, por lo que suelen usarse lmparas fluorescentes con un desprendimiento mnimo de calor. Para reproducir los microrganismos en el laboratorio es necesario suministrarles adems de las condiciones ptimas para su desarrollo, los nutrientes necesarios: fuentes de carbono (principalmente azcares), sales inorgnicas (macro y oligoelementos), protenas (aminocidos y N orgnico) y factores de crecimiento (vitaminas) necesarias a travs de la formulacin de medios de cultivo sintticos o la utilizacin de materias primas naturales. Sea cual fuere el origen del medio, este debe prepararse y esterilizarse de tal forma que facilite la observacin del

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Departamento de Biologa - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo crecimiento microbiano y la seguridad de contar con un medio libre de otros organismos contaminantes. Los medios de cultivo deben ser diseados segn la especificidad del anlisis, el tipo de microrganismo interviniente y sus condiciones ptimas de desarrollo. Los medios comnmente utilizados renen los requerimientos bsicos de la mayora de los hetertrofos. En general los medios de cultivo se clasifican segn: a. Estado: Medios lquidos Medios slidos, llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacrido producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45 C. Se usa a una concentracin del 1,5% Medios semislidos: agar a una concentracin del 0,7%. a. Composicin: Medios sintticos o qumicamente definidos, tienen un fuente de carbono, fuente de nitrgeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca...), otros elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a concentraciones conocidas. Medios complejos o de composicin indefinida, estos llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusin de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composicin cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes. Medios de enriquecimiento, son medios complejos (normalmente) con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microrganismos (particularmente hetertrofos exigentes). Ej: adiccin de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas. Medios selectivos, son aquellos que favorecen por su diseo el crecimiento especfico de un microrganismo particular (o grupo de microrganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de microrganismos a partir de una poblacin microbiana mixta. Ej: CO2 como fuente de carbono es selectivo para auttrofos; adicionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram (+); utilizando maltosa como nica fuente de carbono slo crecern los que usen maltosa. Medios diferenciales, son aquellos destinados a facilitar la discriminacin de microrganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Ej: Agar sangre diferencia hemolticos de no hemolticos; McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-). Medios de mantenimiento, suelen ser distintos a los de crecimiento ptimo ya que el crecimiento rpido y prolfico suele ocasionar la muerte rpida de las clulas, por lo general se les suprime la glucosa para mantener una poblacin normal, evitando la acidificacin del medio que afecte las clulas

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Departamento de Biologa - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo Medios de recuento, utilizados para realizar recuentos de microrganismos con algn nivel de seleccin, Ej: Verde bilis brillante, TSA Triptona Soya Agar para mesfilos viables.

Cepas bacterianas aisladas y purificadas en las prcticas anteriores de las muestras tomadas por cada grupo. 3.1. Efectos de la temperatura, pH, la presin osmtica y la tensin de oxgeno. Materiales por grupo:
temperatura 3 cajas de petri pequeas con Agar Nutritivo AN Temperaturas a cultivar: 4 C, 37oC, 60o C 1 tubo de ensayo con TSB Caldo Triptona Soya efecto temperatura de o ebullicin (100 C) pH 3 Cajas de petri pequeas con AN con los siguientes pH 1 caja con pH 2 1 caja con pH 6.8 1 caja con pH 8.5 presin osmtica 4 tubos de ensayo con CN con las siguientes concentraciones: 1 tubo con [0.85%] de NaCl 1 tubo con [3%] de NaCl tensin de oxgeno 1 tubo de ensayo con AN sin solidificar para siembra con prueba de tensin de O2 1 caja de petri pequea con AN para cultivo en anaerobiosis Caja de galletas o frasco de boca ancha de 30 cms, 2 velas

Nevera, Incubadoras (37oCy 60oC), Bao Mara Procedimiento. 1. Realizar pases de la cepa purificada y caracterizada con asa redonda en cada uno de los medios segn sea lquido o solido, y de acuerdo a las pruebas de temperaturas, pH, presin, etc. 2. Salvo las pruebas de temperatura incubar el resto de los medios sembrados a 37 oC 3. Realizar pase de la cepa en tubo de ensayo con TBS, someter 15 minutos a 100 C en Bao Mara, realizar extensin y tincin con Gram y luego incubar a 25 oC 4. Realizar siembra profunda de la cepa, aplicando AN fundido para observar efecto de la tensin de oxgeno sobre el crecimiento 5. Realizar siembra en caja de petri con AN y someter en cmara de anaerobiosis (caja de galletas con velas encendidas) 6. Realizar lecturas comparando crecimiento, morfologa macro y micro de la cepa purificada para determinar efecto de la temperatura y los otros factores sobre la cepa 6. Mantener cepa purificada en nevara sellado con vinipel, no descartar el primer aislamiento.

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Departamento de Biologa - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo 3.2. Crecimiento en Agar Inclinado y Motilidad 1 Tubo con Agar Nutritivo Inclinado 1 Tubo con medio para ver motilidad SIM3 Procedimiento. 1. Sembrar inoculo de la cepa bacteriana aislada con asa recta en tubo de agar inclinado y tubo con medio SIM, de forma precisa y recta. 2. Observar y describir tipo de crecimiento en ambos medios, en el medio SIM observar coloracin y reaccin segn literatura. 3.3. Crecimiento y observacin de estructuras microscpicas de Hongos en Microcultivo Cepas de hongos aisladas y purificadas en las prcticas anteriores de las muestras tomadas por cada grupo. 1 montaje de microcultivo esterilizado por cada grupo con medio PDA o Saboraud

Figura 1. Tcnica de Microcultivo Procedimiento. Se deposita un cuadrado del medio estril sobre un portaobjetos previamente esterilizado. Se siembra el hongo en sus bordes. Se coloca un cubreobjeto sobre el cuadrado de medio, se lleva a incubadora de 25oC, hacen observaciones a las 24, 48 y 72 horas. Cuando se verifica crecimiento de micelio del hongo sobre el medio y por ende en el cubreobjeto, se toma este cuidadosamente y se coloca sobre una gota de azul de lactofenol o azul de metileno, se sella con esmalte y se observa al microscopio para hacer descripcin microscpica de las estructuras vegetativas y de reproduccin del hongo. Anote en cuadro sobre estudio de su cepa de hongo que viene complementando desde la clase anterior Otros materiales. Coloraciones de Gram, Azul de Lactofenol, Azul de Metileno Portas y cubreobjetos Microscopio, Hipoclorito, Alcohol, Solucin salina (0,85%), Asas, Pinzas, Gradilla y Mechero
3

Medio SIM: Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

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Departamento de Biologa - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo Cinta de enmascarar, vinipel

5.1.

5.2.

5.3.

Investigue otros 2 ejemplos de microrganismos, segn la clasificacin realizada de acuerdo las condiciones de temperatura, pH, tensin de oxgeno, presin osmtica, Investigue otros ejemplos de medios de cultivo segn los tipos presentados, cual es la composicin y el principio de lectura del medio SIM que se utilizo para ver motilidad Cules con los organismos barotolerantes y barfilos, donde se encuentran, cite ejemplos.

Anote y dibuje de esta manera sus observaciones de las cepas aisladas/ sembradas en los diferentes medios y factores (temperatura, pH, la presin osmtica y la tensin de oxgeno), referenciado los resultados de crecimiento4 y morfologa macro y microscpica de la cepa
No. Grupo/ Muestra Morfologa 4 C previa Morfo Macro y Crecimiento Macro y Micro del Micro Aislamiento 25 C
Crecimiento

60 C
Crecimiento

100 C
Crecimiento

Morfo Macro y Micro

Morfo Macro y Micro

Morfo Macro y Micro

Anote los resultados sobre efecto del pH:

No. Grupo/ Muestra Morfologa pH 2 previa Morfo Macro y Crecimiento Macro y Micro del Micro Aislamiento pH 6.8
Crecimiento

pH 8.5
Crecimiento

Morfo Macro y Micro

Morfo Macro y Micro

Anote los resultados sobre efecto de la presin osmtica:

Crecimiento: Abundante: +++ , Medio: ++ , Escaso: + , Nulo: 0

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No. Grupo/ Muestra

Morfologa 0.2 % Na Cl previa Macro y Crecimiento Morfo. Micro del Aislamiento

0.85% Na Cl
Crecimiento

15% NaCl
Crecimiento

Morfo.

Morfo.

Anote los resultados sobre efecto de la presin osmtica:

No. Grupo/ Muestra Morfologa 0.2 % Sacarosa previa Morfo Macro y Crecimiento Macro y Micro del Micro Aislamiento 0.85% Sacarosa
Crecimiento

15% Sacarosa
Crecimiento

Morfo Macro y Micro

Morfo Macro y Micro

Anote los resultados del cultivo en AN fundido, teniendo en cuenta la siguiente clasificacin:

O2

Aerbico Obligado o Estricto

Aerbico Facultativo

Microarerfilo

Anaerobio Aerotolerante

Anaerobio Obligado o Estricto

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CONTROL DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS: ESTERILIZACION Y DESINFECCION Reconocer las principales tcnicas de control de las poblaciones microbianas: Esterilizacin y Desinfeccin, revisin terica

a. Esterilizacin: eliminacin de toda forma de vida, includas las esporas. b. Desinfeccin: proceso de destruir los agentes infecciosos. c. Antisepsia: operaciones o tcnicas encaminadas a crear un ambiente que impida el desarrollo de los microrganismos e incluso pueda matarlos. d. Asepsia: tcnicas empleadas para impedir el acceso de microrganismos al campo de trabajo. e. Antibiosis: fenmeno biolgico en el que existe una detencin o destruccin del crecimiento microbiano debido a sustancias producidas por otro ser vivo. f. Antimicrobianos: sustancias que matan o inhiben el crecimiento de los microrganismos (antibacterianos, antifngicos, etc.) g. Microbicidas: sustancias que matan las formas vegetativas, pero no necesariamente las esporas de un microrganismo (bactericida, fungicida, etc.). h. Microbiostticos: sustancias que inhiben el crecimiento de microrganismos (bacteriostticos, fungistticos, etc.). i. Antispticos: se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo. j. Desinfectantes: se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados. k. Agentes teraputicos: antimicrobianos empleados en el tratamiento de infecciones. l. Agentes quimioteraputicos: sustancias qumicas empleadas en el tratamiento de enfermedades infecciosas o enfermedades causadas por la proliferacin de clulas malignas. m. Antibiticos: sustancias producidas por un ser vivo que se oponen a la vida de otro ser vivo

Otro aspecto necesario y crtico en el trabajo en microbiologa es el lavado, desinfeccin y esterilizacin adecuados segn el tipo de material y su uso. En general se utiliza material de vidrio y algunas veces de plstico como el polipropileno, polietileno y el niln (entre ms opaco el material como el niln ms soporta calor y puede ser esterilizado. En todos los casos debe ser esterilizado primero el medio de cultivo o material usado o contaminado antes de descartarlo, luego se retira con cepillo y agua los desechos y se sumerge por 3 horas en detergente, se lava bien y se deja secar en un horno o a temperatura ambiente. Si se requiere estril se lleva al autoclave, el

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Departamento de Biologa - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo cual funciona a base de calor hmedo a temperatura de 121C por 15 libras/pulgada2 de presin, durante 15 a 30 minutos. Tambin se puede esterilizar en fro con oxido de etileno, con radiaciones ionizantes (rayos gamma emanados por fuentes de Cobalto 68 o cesio 139), rayos catdicos (generadores de electrones), rayos X (mortales para todas las clulas), ests tcnicas son costosas, sin embargo son efectivas y puede utilizarse constantemente con material de plstico. La luz ultravioleta (bactericida desde los 333 nm) es usada frecuentemente en laboratorios especializados y quirfanos para reducir el nmero de bacterias del ambiente, sin embargo no se usa para esterilizar material del laboratorio debido a su poca penetrabilidad. Es conveniente tapar o envolver el material antes de esterilizarlo con tapones de algodn y gasa y con papel kraft, mantenindolos en un lugar seco hasta su uso (de esta forma una material esterilizado puede durar hasta un ao disponible). De la misma forma una vez preparados y bien disueltos los medios de cultivo se esterilizan en fiolas llenas hasta la mitad y sin cerrar totalmente. Para luego verterlas en los tubos o cajas de petri siempre al lado del mechero. Los procedimientos de esterilizacin y desinfeccin por calor se basan en que los diferentes microrganismos tienen rangos de temperatura especficos, teniendo un mximo de temperatura sobre la cual detienen su crecimiento y pueden morir por la desnaturalizacin de sus sistema enzimtico y una temperatura mnima bajo la cual no se desarrollan ya sea porque los proceso de sntesis de protenas son extremadamente sensibles al fro o por que los lpidos empiezan de su estructura celular empiezan a solidificarse. Cada microrganismo se ubica dentro de un lmite estrecho de temperatura ptima que favorece su metabolismo y reproduccin. Para la mayora de las bacterias patgenas la temperatura ptima esta entre 35 y 37 C, de esta forma en un proceso infeccioso la fiebre es un mecanismo de defensa del ya que al presentarse una temperatura mayor se desnaturalizan protenas esenciales del patgeno causando su muerte o deteniendo su proliferacin. Las clulas vegetativas son ms sensibles al calor que las esporas, que se constituyen en estructuras de resistencia en las cuales ha ocurrido un proceso de deshidratacin y acumulacin de sustancias como el dipicolinato de calcio en la pared celular. Sin embargo con la temperatura que puede alcanzar el autoclave la mayora de las esporas se inactivan. Criterio de muerte de un microrganismo: prdida irreversible de la capacidad de reproduccin en un medio adecuado. Para poder determinar la eficacia antimicrobiana (la muerte de los microrganismos) se utilizan tcnicas que descubran a los sobrevivientes es decir, a los capaces de reproducirse; ya que los incapaces de reproducirse estn muertos. Esto se determina generalmente mediante mtodos

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Departamento de Biologa - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo cuantitativos de siembra en placa en los que los supervivientes se detectan porque forman colonias. Cuando una poblacin microbiana se expone a un agente letal, la cintica de la muerte es casi siempre exponencial ya que el nmero de supervivientes disminuye de forma geomtrica con el tiempo. Si representamos grficamente el logaritmo del nmero de supervivientes frente al tiempo se obtiene una lnea recta cuya pendiente negativa define la tasa de mortalidad. Esta tasa de mortalidad nos dice solamente que fraccin de la poblacin inicial sobrevive a un determinado perodo de tratamiento. Para determinar el nmero real de sobrevivientes es necesario conocer adems el tamao inicial de la poblacin. De acuerdo con esto, para establecer los procedimientos de esterilizacin hay que tener en consideracin dos factores: la tasa de mortalidad y el tamao de la poblacin inicial. En la prctica de la esterilizacin la poblacin microbiana que ha de ser destruida es mixta. Como los microrganismos difieren ampliamente en su resistencia a los agentes letales, los factores que se hacen significativos son el tamao de la poblacin inicial y la tasa de mortalidad de los miembros ms resistentes de la poblacin mixta. Para asegurar la fiabilidad de los mtodos de esterilizacin se utilizan suspensiones de esporas de resistencia conocida. Los procedimientos rutinarios de esterilizacin se disean siempre de forma que proporcionen un amplio margen de seguridad.

a. Temperatura: a mayor temperatura mayor accin. b. Tipo de microrganismo: las clulas vegetativas en desarrollo son mucho ms susceptibles que las esporas. c. Estado fisiolgico de las clulas: las clulas jvenes son ms vulnerables que las viejas. d. Ambiente: El calor es ms eficaz en un medio cido que en uno alcalino. La consistencia del material, acuoso o viscoso, influye marcadamente en la penetracin del agente. Las concentraciones altas de carbohidratos aumentan, por lo general, la resistencia trmica de los organismos. La presencia de materia orgnica extraa reduce notablemente la eficacia de los agentes qumicos antimicrobianos por inactivar stos o proteger al microrganismo.

a. Altas Temperaturas: La alta temperatura combinada con un alto grado de humedad es uno de los mtodos ms efectivos para destruir microrganismos. Hay que distinguir entre calor hmedo y calor seco. El hmedo mata los microrganismos porque coagula sus

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Departamento de Biologa - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo protenas siendo ms rpido y efectivo que el calor seco que los destruye al oxidar sus constituyentes qumicos. La accin letal del calor es una relacin de temperatura y tiempo afectada por muchas condiciones. Por ejemplo, las esporas de Clostridium botulinum son destruidas en 4 a 20 minutos a 120 C en calor hmedo, mientras que se necesitan alrededor de 2 horas de exposicin al calor seco para obtener los mismos resultados. Esterilizacin por calor hmedo: (se utiliza para soluciones acuosas) Autoclave: El calor en la forma de vapor a saturacin y a presin es el agente ms prctico para esterilizar ya que el vapor a presin proporciona temperaturas superiores a las que se obtienen por ebullicin. El aparato utilizado se llama autoclave (una olla que regula la presin interna y el tiempo). Los autoclaves de laboratorio se emplean generalmente a una presin de vapor de una atmsfera por encima de la presin atmosfrica lo cual corresponde a una temperatura de 120 C. El tiempo de exposicin depende del volumen del lquido, de tal manera que para volmenes pequeos (hasta unos 3 litros) se utilizan 20 minutos a 120 C; si los volmenes son mayores debe alargarse el tiempo de tratamiento. Algunos materiales no se deben esterilizar en el autoclave. Sustancias que no se mezclan con el agua no pueden ser alcanzadas por el vapor sobreviviendo los microrganismos que contengan. Otras sustancias se alteran o son destruidas por tratamientos prolongados de calor emplendose en estos casos otros mtodos de esterilizacin. Tindalizacin: Se utiliza cuando las sustancias qumicas no pueden calentarse por encima de 100 C sin que resulten daadas. Consiste en el calentamiento del material de 80 a 100 C hasta 1 hora durante 3 das con sucesivos perodos de incubacin. Las esporas resistentes germinarn durante los perodos de incubacin y en la siguiente exposicin al calor las clulas vegetativas son destruidas. Pasteurizacin: La leche, nata y ciertas bebidas alcohlicas (cerveza y vino) se someten a tratamientos de calor controlado que slo matan a ciertos tipos de microrganismos pero no a todos. La leche pasteurizada no es estril. La temperatura seleccionada para la pasteurizacin se basa en el tiempo trmico mortal de microrganismos patgenos (es el tiempo ms corto necesario para matar una suspensin de bacterias a una temperatura determinada). Mycobacterium tuberculosis es de los microrganismos patgenos ms resistentes al calor que puede transmitirse por la leche cruda y se destruye en 15 minutos a 60 C. Posteriormente se descubri que Coxiella burnetti, agente causal de la fiebre Q, se encuentra a veces en la leche y es ms resistente al calor que Mycobacterium tuberculosis por lo que la pasteurizacin de la leche se realiza a 62,8 C durante 30 minutos o a una temperatura ligeramente superior, 71,7 C durante 15 segundos (Flash-Pasteurizacin). Esterilizacin por calor seco: (se utiliza para materiales slidos estables al calor)

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Departamento de Biologa - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo Horno Pasteur: El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material de vidrio y otros materiales slidos estables al calor. El aparato que se emplea es el horno Pasteur. Para el material de vidrio de laboratorio se consideran suficientes dos horas de exposicin a 160 C. Incineracin: La destruccin de los microrganismos por incineracin es una prctica rutinaria en los laboratorios. Las asas de siembra se calientan a la llama de mecheros Bunsen. La incineracin tambin se utiliza en la eliminacin de residuos hospitalarios. b. Bajas Temperaturas. En general, el metabolismo de las bacterias est inhibido a temperaturas por debajo de 0 C. Sin embargo estas temperaturas no matan a los microrganismos sino que pueden conservarlos durante largos perodos de tiempo. Esta circunstancia es aprovechada por los microbilogos para conservar los microrganismos indefinidamente. Los cultivos de microrganismos se conservan congelados a -70 C o incluso mejor en tanques de nitrgeno lquido a -196 C. c. Radiaciones Radiaciones ionizantes: Rayos gamma: Las radiaciones gamma tienen mucha energa y son emitidas por ciertos istopos radiactivos como es el Co60 pero son difciles de controlar ya que este istopo emite constantemente los rayos gamma en todas direcciones. Estos rayos gamma pueden penetrar los materiales por lo que un producto se puede empaquetar primero y despus esterilizar. Rayos catdicos (Radiacin con haz de electrones): Se usan para esterilizar material quirrgico, medicamentos y otros materiales. Una ventaja es que el material se puede esterilizar despus de empacado (ya que stas radiaciones penetran las envolturas) y a la temperatura ambiente. Radiaciones no ionizantes Luz ultravioleta: La porcin ultravioleta del espectro incluye todas las radiaciones desde 15 a 390 nm. Las longitudes de onda alrededor de 265 nm son las que tienen mayor eficacia como bactericidas (200 - 295 nm). Se usan para reducir la poblacin microbiana en quirfanos, cuartos de llenado aspticos en la industria farmacutica y para tratar superficies contaminadas en la industria de alimentos y leche. La luz UV tiene poca capacidad para penetrar la materia por lo que slo los microrganismos que se encuentran en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la accin de la luz UV son susceptibles de ser destrudos. d. Filtracin Algunos materiales como los lquidos biolgicos (suero de animales, soluciones de enzimas, algunas vitaminas y antibiticos) son termolbiles. Otros agentes fsicos como

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Departamento de Biologa - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo las radiaciones son perjudiciales para estos materiales e imprcticos para esterilizarlos, por lo que se recurre a la filtracin a travs de filtros capaces de retener los microrganismos. Los microrganismos quedan retenidos en parte por el pequeo tamao de los poros del filtro y en parte por adsorcin a las paredes del poro durante su paso a travs del filtro debido a la carga elctrica del filtro y de los microrganismos. Debido al pequeo tamao de los virus, nunca es posible tener certeza de que, por los mtodos de filtracin que dejan libre de bacterias una solucin, se van a eliminar tambin los virus. Filtros de membrana: Los filtros de membranas son discos de steres de celulosa con poros tan pequeos que previenen el paso de los microrganismos. Existen distintos tipos de filtro dependiendo del tamao de poro. Estos filtros son desechables. Adems de utilizarse en la esterilizacin de lquidos se usan en el anlisis microbiolgico de aguas ya que concentran los microrganismos existentes en grandes volmenes de agua. Filtros HEPA: Un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) est compuesto por pliegues de acetato de celulosa que retienen las partculas (includos los microrganismos) del aire que sale de una campana de flujo laminar. e. Desecacin. La desecacin de las clulas vegetativas microbianas paraliza su actividad metablica. Este proceso fsico se utilizaba ampliamente antes del desarrollo de la refrigeracin. El tiempo de supervivencia de los microrganismos despus de desecados depende de muchos factores, entre ellos la especie microbiana. En general, los cocos Gram (-) son ms susceptibles a la desecacin que los cocos Gram (+). Las endoesporas bacterianas son muy resistentes a la desecacin pudiendo permanecer viables indefinidamente.

a. Oxido de etileno: El requerimiento esencial para un agente qumico esterilizante es que sea voltil as como txico para los microrganismos, de manera que pueda ser fcilmente eliminado del objeto esterilizado despus del tratamiento. Normalmente se utiliza el xido de etileno, un lquido que hierve a 10,7 C. Se usa en la industria para la esterilizacin de placas Petri, jeringas y otros objetos de plstico que se funden a temperaturas superiores a los 100 C. Debido a su alto poder de penetracin estos objetos se empaquetan primero y despus se esterilizan. El xido de etileno acta inactivando enzimas y otras protenas que contienen grupos sulfidrilos (R-SH) mediante una reaccin llamada alquilacin (R-S-CH2CH2O-H). b. Glutaraldehido: Una solucin acuosa al 2% presenta una amplia actividad antimicrobiana. Es efectivo frente a virus, clulas vegetativas y esporas de bacterias y hongos. Se usa en medicina para esterilizar instrumentos urolgicos y pticos.

a. Esterilizacin: es el proceso de destruccin de todas las formas de vida microbiana.

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Departamento de Biologa - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo b. Desinfeccin: es el proceso de destruccin de los agentes infecciosos. Desinfectantes: son aquellas sustancias qumicas que matan las formas vegetativas y no necesariamente las formas de resistencia de los microrganismos patgenos. Se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados. c. Antispticos: son aquellas sustancias qumicas que previenen el crecimiento o accin de los microrganismos ya sea destruyndolos o inhibiendo su crecimiento y actividad. Se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo. INORGANICOS. Metales: Los ms efectivos son el mercurio, plata ,cobre y zinc. Actan inactivando las protenas celulares al combinarse con ellas. Entre los compuestos de mercurio que se emplean como antispticos en heridas superficiales de la piel y mucosas estn el mercurocromo (mercromina) y el mertiolato. Entre los compuestos de plata utilizados como antispticos est el nitrato de plata (AgNO3) que en solucin al 1% se ha utilizado para prevenir infecciones gonoccicas en los ojos de los recin nacidos aunque actualmente se est remplazando por antibiticos como la penicilina. Entre los compuestos de cobre se encuentra el sulfato de cobre (CuSO4) que se utiliza como algicida en los recipientes abiertos que contienen agua. Tambin es fungicida por lo que se utiliza para controlar las infecciones fngicas de plantas (Mezcla Bordolesa). Acidos y lcalis: Actan alterando la permeabilidad y coagulando las protenas. En general los cidos son ms eficaces que los lcalis. Dentro de estos compuestos se encuentran el sulfrico (H2SO4), ntrico (HNO3), hidrxido sdico (NaOH) e hidrxido potsico (KOH). Tienen aplicacin limitada debido a su naturaleza custica y corrosiva. Aun as el NaOH se utiliza en la industria del vino para limpiar las cubas de madera. Compuestos inorgnicos oxidantes: actan oxidando los componentes de la membrana y enzimas. El agua oxigenada (H2O2) al 6% (20 volmenes) se utiliza como antisptico en pequeas heridas de la piel. Halgenos: Los halgenos especialmente el cloro y el iodo son componentes de muchos antimicrobianos. Los halgenos son agentes fuertemente oxidantes por lo que son altamente reactivos y destructivos para los componentes vitales de las clulas microbianas. Cloro: La muerte de los microrganismos por accin del cloro se debe en parte a la combinacin directa del cloro con las protenas de las membranas celulares y los enzimas. As mismo en presencia de agua desprende oxgeno naciente (O) que oxida la materia orgnica: Cl2 + H2O ----------------> HCl + HClO (cido hipocloroso) HClO ----------------> HCl + O (oxgeno naciente)

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Departamento de Biologa - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo El gas cloro licuificado se utiliza en la desinfeccin del agua de bebida y piscinas. El hipoclorito sdico (leja) al 1% se puede utilizar como desinfectante domstico. Iodo: El mecanismo mediante el cual el iodo ejerce su accin antimicrobiana es debido a su accin oxidante. Adems la habilidad que tiene el iodo para combinarse con el aminocido tirosina resulta en la inactivacin de enzimas y otras protenas. El iodo se puede utilizar como antisptico bajo dos formas: i) tintura de iodo, es una solucin alcohlica (tintura) de iodo (I2) ms ioduro potsico (KI) o ioduro sdico (NaI). ii) iodforos, son mezclas de iodo (I2) con compuestos que actan como agentes transportadores y solubilizadores del iodo. Por ejemplo, la povidona iodada (Betadine) es un complejo de iodo y polivinilpirrolidona (PVP). Los iodforos tienen la ventaja de que no tien la piel. Las preparaciones de iodo se utilizan principalmente para desinfectar la piel as como en la desinfeccin de pequeas cantidades de agua. Los vapores de iodo se utilizan a veces para desinfectar el aire. ORGANICOS Alcoholes: El alcohol metlico (1C) es menos bactericida que el etlico (2C) y adems es altamente txico. Hay un aumento en el poder bactericida a medida que aumenta la longitud de la cadena carbonada; pero como los alcoholes con peso molecular superior al del proplico (3C) no se mezclan en todas las proporciones con el agua, no se suelen utilizar como desinfectantes. Los alcoholes actan desnaturalizando las protenas, disolviendo las capas lipdicas y como agentes deshidratantes. El etanol al 96% se usa como antisptico de la piel y como desinfectante en los termmetros clnicos orales y algunos instrumentos quirrgicos. Fenol y compuestos fenlicos: Una solucin acuosa al 5% de fenol mata rpidamente a las clulas vegetativas de los microrganismos. Sin embargo, las esporas son mucho ms resistentes al fenol. Debido a que el fenol es txico y tiene un olor desagradable ya casi no se usa como desinfectante o antisptico, siendo reemplazado por compuestos fenlicos que son sustancias derivadas del fenol menos txicas y ms activas frente a los microrganismos. Lysol es una mezcla de compuestos fenlicos que se utiliza para desinfectar objetos inanimados como los suelos, paredes y superficies. El fenol y compuestos fenlicos actan alterando la permeabilidad de la membrana citoplsmica as como desnaturalizando protenas.

a. Tcnica de dilucin en tubo: Primero se realizan diferentes diluciones del agente qumico. El mismo volumen de cada dilucin se dispensa en tubos estriles. A cada tubo se le aade la misma cantidad de una suspensin del microrganismo utilizado como

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Departamento de Biologa - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo prueba. A determinados intervalos de tiempo se transfiere una alcuota de cada tubo a otro tubo que contenga medio de cultivo. Estos tubos inoculados se incuban a la temperatura ptima de crecimiento del microrganismo utilizado como prueba durante 24 a 48 horas. Al cabo de este tiempo se examina el crecimiento del microrganismo mediante la aparicin de turbidez en el tubo (crecimiento +) o ausencia de turbidez (crecimiento -). Aquellos tubos que presenten crecimiento negativo indican la dilucin a la cual ese agente qumico mata al microrganismo utilizado como prueba cuando este microrganismo es expuesto al agente qumico durante ese perodo de tiempo. b. Tcnica de la placa de agar: Se inocula una placa que contenga medio de cultivo slido con el microrganismo utilizado como prueba. El agente qumico se coloca en el centro de la placa, bien dentro de un cilindro o impregnado en un disco de papel. Al cabo de 24 a 48 horas se observan zonas de inhibicin (crecimiento -) alrededor del agente qumico. Una modificacin de esta tcnica es la incorporacin del agente qumico en el medio de cultivo antes de verterlo sobre la placa. Una vez solidificado se inocula con el microrganismo utilizado como prueba, se incuba y se examina el crecimiento microbiano. c. Tcnica del coeficiente fenlico: Es una tcnica estandarizada que se utiliza para comparar el poder desinfectante de un agente qumico frente al del fenol. Es una modificacin de la tcnica de dilucin en tubo tal como se describe a continuacin: (i) Se prepara una serie de tubos conteniendo cada uno 5 ml de diferentes diluciones del desinfectante. (ii) A la vez se prepara una segunda serie de tubos que contengan diferentes diluciones de fenol. (iii) Cada tubo de las dos series se inocula con 0,5 ml de un cultivo de 24 horas del microrganismo utilizado como prueba (cepas especficas de Salmonella typhi o Staphylococcus aureus). (iv) A los 5, 10 y 15 minutos se recoge una alcuota de cada tubo que se inocula en otro tubo que contenga medio de cultivo estril. (v) Estos tubos inoculados se incuban durante 24 a 48 horas y se observa el crecimiento del microrganismo (aparicin de turbidez). (vi) La mayor dilucin del desinfectante que mate a los microrganismos en 10 minutos pero no los mate en 5 minutos se divide por la dilucin mayor de fenol que d los mismos resultados. El nmero obtenido es el coeficiente fenlico de ese desinfectante.