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Prácticas de Laboratorio de Microbiología Departamento de Biología - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo 1.1.

Prácticas de Laboratorio de Microbiología

Departamento de Biología - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo

de Biología - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo 1.1. Determinar efectos de la temperatura, pH, la
1.1.
1.1.

Determinar efectos de la temperatura, pH, la presión osmótica y la tensión de oxígeno, sobre la morfología y desarrollo de cultivos bacterias aislados en la práctica anterior.

1.2. Aprender técnicas de siembra y lectura de crecimiento en cultivos sólidos y líquidos, y en cultivos en anaerobiosis

1.3. Realizar técnica de microcultivo de Hongos para optimizar las observaciones y caracterización de estructuras vegetativas y reproductivas

caracterización de estructuras vegetativas y reproductivas Para estudiar un microrganismo es necesario previamente

Para estudiar un microrganismo es necesario previamente poder aislarlo y cultivarlo en las condiciones del laboratorio. Para lograr esto es preciso conocer cuáles son las condiciones medioambientales y los nutrientes que requieren para su óptimo desarrollo y reproducción. En general, cuando se habla de desarrollo o crecimiento microbiano este puede ser definido por un aumento de la masa celular, en el caso de las bacterias la mayoría de las veces nos referimos a un crecimiento poblacional mediado por los procesos de replicación del ADN y división celular, donde cada célula aislada o UFC (Unidad Formadora de Colonia) origina primero 2 células hijas por fisión binaria hasta conformarse una colonia y es una medida cuantitativa del número de bacterias iniciales. En los hongos podríamos hablar de un crecimiento celular ya que de una misma hifa o espora se puede generar una gran cantidad de masa celular sobre el medio de crecimiento formándose, y una vez que esporula cada espora es un individuo potencial y hablamos de crecimiento poblacional. En esta oportunidad nos vamos a centrar en los factores medioambientales o abióticos que condicionan las capacidades metabólicas de los microrganismos y por lo tanto su crecimiento, dejando de lado las relaciones intra e inter-específicas que pueden afectar la dinámica del crecimiento microbiano.

dejando de lado las relaciones intra e inter-específicas que pueden afectar la dinámica del crecimiento microbiano.
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Ya sea que hablemos de crecimiento poblacional o celular factores como la temperatura, el pH, la presión

osmótica, la tensión de oxígeno, la intensidad lumínica y la presión atmosférica afectan, retardan, aceleran o definitivamente detienen el crecimiento de los microrganismos y los llevan a la muerte. El identificar la influencia sobre el desarrollo y crecimiento microbiano de dichos factores nos ayudará a explicar su distribución en la naturaleza y

a diseñar métodos para su control o inhibición total (ver 6. Lectura complementaria).

No todos los microrganismos responden de la misma forma a un factor ambiental

determinado, convirtiéndose en una herramienta útil a la hora de su aislamiento, cultivo, clasificación e identificación en el laboratorio, dependiendo de si el microrganismos es patógeno (causante de enfermedad), saprófito (flora inocua que vive en la materia orgánica muerta y ayuda a su descomposición) u oportunista (puede causar enfermedad

o no dependiendo de los factores nutricionales, estructurales e inmunes del huésped y

del medio), siendo este último el que puede adaptarse a rangos más amplios de dichas condiciones. De hecho una condición ambiental puede ser dañina para un microrganismo o beneficiosa para otro, pueden tolerar algunas condiciones adversas, que rebasadas nos les permiten crecer y por lo tanto debemos diferenciar entre las condiciones ambientales y sus efectos sobre la viabilidad y su reproducción.

a. Temperatura: El proceso de desarrollo de las bacterias depende de más de 2000 reacciones bioquímicas de una gran diversidad, y la velocidad con que se efectúan dichas reacciones esta influida por la temperatura, l cuela puede determinar en parte la velocidad de crecimiento y el grado total de desarrollo de los microrganismos. Las variaciones en temperatura pueden influir en los procesos metabólicos y en la morfología celular. Cada especie microbiana posee una temperatura óptima de crecimiento clasificándose según esto en los siguientes grupos:

Su temperatura óptima es

alrededor de los 15° C. Ej:

Mesófilas: crecen mejor entre 25 y 40° C. Ej: Escherichia coli

Euritermófilas: termófilas facultativas, aquellas que son capaces de crecer en

temperaturas de las mesófilas. Ej: Bacillus stearothermophilus

Termófilas: crecen mejor entre 45 y 60° C. Ej: Thermococcus celer

Psicrófilas: capaces de desarrollarse a 0° C o menos.

Flavobaterium sp

Hipertermófilas: crecen a temperaturas superiores a los 80º C 1 Pyrodictium brockii

1 Hasta hace poco la temperatura más alta de crecimiento reportada era de 105º C, entonces se creía que el límite de temperatura para la vida era de 100º C (punto de ebullición del agua). Se han encontrado bacterias que crecen en chimeneas calientes hidrotermales o "black smokers" (fumarolas negras) ubicadas en las grietas del suelo oceánico que expulsan aguas bentónicas a temperaturas superiores a los 350º C. Se ha demostrado que estas bacterias pueden crecer y multiplicarse a 113º C.

Prácticas de Laboratorio de Microbiología Departamento de Biología - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo b.

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b. Potencial de hidrógeno, es un de los factores más importantes ya que condiciona la disponibilidad de nutrientes del medio para el microrganismo y refleja a la vez los

Algunos

Los microrganismos que

soportan pH ácidos se denominan acidófilos y pueden llegar a crecer en ph 4, los que

soportan pH básicos se llaman basófilos o alcalinófilos.

depende del tipo de soluciones que se encuentren presentes y disociadas en el medio,

y así mismo el pH puede cambiar por los procesos metabólicos de los microrganismos que generan sustancias ácidas o básicas que son liberadas al medio por la célula:

efectos sobre

microrganismos toleran cambios de pH de 3 o 4 unidades.

el

medio

del metabolismo mismo

del microrganismo.

Como ya se sabe el pH

Utilización de carbohidratos---->Producción de ácidos orgánicos----> Acidificación

Catabolismo de proteínas---->Producción de materiales nitrogenados---->

Alcalinización

Aunque los microrganismos crecen a menudo en medios con amplios rangos de pH, su tolerancia tiene un límite ya que variaciones intensas pueden alterar la membrana citoplasmática o inhibiendo la actividad de las enzimas y las proteínas transportadoras, la muerte bacteriana se produce su el pH interno desciende por debajo de 5.0 a 5.5, los cambios de pH pueden ionizar los nutrientes disminuyendo su disponibilidad por el

organismo.

tampón o buffer que mantenga el pH del medio regulado durante todo el crecimiento

Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemas

para que no se vea afectado por el metabolismo del

utilizados en microbiología es la combinación de Fosfatos de Potasio (KH 2 PO 4 y K 2 HPO 4, manteniendo el pH del medio en aprox. en 6,8) también se usa la peptona.

microrganismo. Uno de los más

El pH del medio se puede ajustar antes de esterilizarlo, titulando parte del medio con Hidróxido de Sodio (NaOH) o Acido Clorhídrico (HCL) y ajustando el resto con las

mismas sustancias.

los

microrganismos pueden clasificarse como:

De

acuerdo

al

rango

de

pH

óptimo

de crecimiento

Acídofilos: 0 a 5,5 Ej: Thiobacillus thiodoxidans, óptimo 2,0 a 3,5

Neutrofilos: 5,5 a 8.0 Ej: Escherichia coli, óptimo 6,0 a 7,0

Basófilos o Alcalófilos: 8,5 a 11,5, Ej: Bacillus alcalophilus, óptimo 10,6 (alcalófilo

extremo)

c. Presión osmótica/Disponibilidad del agua: Los medios de cultivo deben ser ligeramente hipotónicos que el interior de la célula, ya que de esta manera se facilita el flujo de

Aunque para la mayoría

de los microrganismos el Cloruro de Sodio (NaCl) no es indispensable para su

crecimiento (salvo

requieren de

agua con nutrientes disueltos hacia el interior de las células.

para

las bacterias

marinas (%NaCl=3)

que

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concentraciones de Na en el medio para mantener en su interior concentraciones de K adecuadas. Existen bacterias que requieren de medio hipertónicos denominadas halófilas como Halobacterium sp (halófilo extremo) que pueden soportar hasta un 20% de concentración de NaCl, encontrado en lagos salados como los del Mar muerto (a w =

0.75)

La concentración de solutos esta condicionada por la cantidad de agua disponible en el medio, expresada en términos físicos como actividad del agua a w 2 . Se presenta en rangos desde 1.0 (agua pura y pan), pasando por 0,95 (conservas), 0.80 los lagos salados, 0,75 (cereales, caramelos, frutos secos, chocolate) hasta 0.60 (leche en polvo). Por debajo de 0,55 se altera el ADN y por lo tanto no hay sobrevivencia. La mayoría de los microroganismos crecen e a w superiores a 0.95 donde se ubican los del mar a w = 0,98. En actividades de agua inferiores hablamos de organismos osmotorelantes que sintetizan o acumulan sustancias en el citoplasma para obtener agua del medio denominadas solutos compatibles (pues no inhiben la bioquímica celular), tales como la bataína, prolina, glutamato, sacarosa, ectoína, etc., esta capacidad esta regulada genéticamente permitiendo clasificar dichos microrganismos de acuerdo a la concentración y tipo de soluto compatible encontrado en su citoplasma. Existen especies sacarófilas como la levadura Sacharomyces rouxii que pueden soportar a w cercanos a 0,60, otros se denomina xerófilos que crecen en ambientes muy secos con poca disponibilidad de agua.

d. Tensión de Oxígeno: Los principales gases que afectan al desarrollo microbiano son el oxígeno y el dióxido de carbono. Casi todos los organismos superiores son aeróbicos obligados, donde el oxígeno actúa como, aceptor final de electrones durante la respiración aeróbica, además los eucariotes utilizan el oxígeno para sintetizar esteroles y ácidos grasos instaurados. Los microrganismos presentan una respuesta amplia y variable al oxígeno libre (Ver Tabla en la siguiente página)

Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O 2 por lo que se debe evitar la exposición de estos microrganismos al O 2 . Se puede obtener un ambiente de anaerobiosis por los siguientes métodos:

Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolato sódico,

para disminuir el contenido de O2.

Quitando el O2 por procedimientos mecánicos y remplazándolo por N 2 o CO 2 .

Mediante reacciones químicas dentro del recipiente que contiene el medio de cultivo

inoculado para combinar el oxígeno libre con otro compuesto. Por ejemplo: al encender

una vela se consume el oxigeno presente.

2 a w : Razón entre la presión de vapor de aire con una sustancia o solución y presión de vapor del agua pura a la misma temperatura de la sustancia, inversamente proporcional a la presión osmótica.

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Tabla 3.1.: Relaciones de los microrganismos con el Oxígeno

Grupo

Requerimiento

Metabolismo

Ejemplo

Hábitat típico del Ejemplo

O 2

Aeróbicos

       

Obligados o

Si

Respiración aeróbica

Micrococcus luteus

Piel, polvo

Estrictos

Facultativos

No

Respiración aeróbica y anaerobia, Fermentación

Escherichia coli

Intestino

Microaerófilos

Si, baja

Respiración aeróbica

Spirillium

Lagos

tensión

volutans

Anaerobios

       

Aerotolerantes

No

Fermentación

Streptococcus

Tracto respiratorio

pyogenes

Obligados o

Letal

Fermentación, Respiración anaerobia

Methanobacterium

Diverso, rumen

Estrictos

formicicum

Para los microaerófilos que no soportan tensiones de oxígeno atmosféricas mayores

Entre bacterias y protozoos

podemos encontrar todos los 5 grupos de tolerancia e intolerancia al O 2 , los hongos son normalmente aeróbicos, las levaduras anaerobias facultativas y las algas son aeróbicas

obligadas.

muchas enzimas se inactivan cuando se oxidan. Cuando los organismos tienen como aceptor de electrones al oxígeno, deben protegerse a si mismos sintetizando enzimas como la superoxido dismutasa y la catalasa, ya que los productos de la reducción del oxígeno mismo son extremadamente tóxicos, como el radical superóxido, el peróxido de

Estas enzimas son ausentes en los anaerobios

El oxígeno puede llegar a ser tóxico para algunos organismos ya que

(20%) se deben suministrar tensiones de 2 al 10%.

hidrógeno y el radical hidróxilo. estrictos.

e. Suministro de luz: Los organismos fotosintéticos o fototrófos deberán ser expuestos a una fuente de iluminación ya que la luz es su fuente de energía, como es el caso de las cianobacterias y algas. Esta fuente de iluminación no debe plantear problemas de variación de temperatura, por lo que suelen usarse lámparas fluorescentes con un desprendimiento mínimo de calor.

fluorescentes con un desprendimiento mínimo de calor. Para reproducir los microrganismos en el laboratorio es

Para reproducir los microrganismos en el laboratorio es necesario suministrarles además de las condiciones óptimas para su desarrollo, los nutrientes necesarios: fuentes de carbono (principalmente azúcares), sales inorgánicas (macro y oligoelementos), proteínas (aminoácidos y N orgánico) y factores de crecimiento (vitaminas) necesarias a través de la formulación de medios de cultivo sintéticos o la utilización de materias primas naturales. Sea cual fuere el origen del medio, este debe prepararse y esterilizarse de tal forma que facilite la observación del

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crecimiento microbiano y la seguridad de contar con un medio libre de otros organismos contaminantes. Los medios de cultivo deben ser diseñados según la especificidad del análisis, el tipo de microrganismo interviniente y sus condiciones óptimas de desarrollo. Los medios comúnmente utilizados reúnen los requerimientos básicos de la mayoría de los heterótrofos. En general los medios de cultivo se clasifican según:

a. Estado:

Medios líquidos

Medios sólidos, llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacárido

producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45° C. Se usa a una

concentración del 1,5%

Medios semisólidos: agar a una concentración del 0,7%.

a. Composición:

Medios sintéticos o químicamente definidos, tienen un fuente de carbono, fuente de

otros elementos como son

estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a concentraciones conocidas.

Medios complejos o de composición indefinida, estos llevan ingredientes como extracto

de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen

nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.

Medios de enriquecimiento, son medios complejos (normalmente) con aditivos

adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microrganismos (particularmente heterótrofos exigentes). Ej: adicción de sangre, suero o extractos de tejidos de animales

y plantas.

Medios selectivos, son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico

de un microrganismo particular (o grupo de microrganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de microrganismos a partir de una población microbiana mixta. Ej: CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos; adicionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram (+); utilizando maltosa como única fuente de carbono sólo crecerán los que usen maltosa.

Medios diferenciales, son aquellos destinados a facilitar la discriminación de

microrganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos

medios. Ej: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-).

Medios de mantenimiento, suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el

nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca

),

crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células, por lo general se les suprime la glucosa para mantener una población normal, evitando la acidificación del medio que afecte las células

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Medios de recuento, utilizados para realizar recuentos de microrganismos con algún nivel de selección, Ej: Verde bilis brillante, TSA Triptona Soya Agar para mesófilos viables.

brillante, TSA Triptona Soya Agar para mesófilos viables. Cepas bacterianas aisladas y purificadas en las prácticas

Cepas bacterianas aisladas y purificadas en las prácticas anteriores de las muestras tomadas por cada grupo. 3.1. Efectos de la temperatura, pH, la presión osmótica y la tensión de oxígeno. Materiales por grupo:

osmótica y la tensión de oxígeno. Materiales por grupo:   temperatura     pH   presión
osmótica y la tensión de oxígeno. Materiales por grupo:   temperatura     pH   presión
 

temperatura

   

pH

 

presión osmótica

tensión de oxígeno

3

cajas

de

petri

3

Cajas

de

petri

4

tubos

de

ensayo

1 tubo de ensayo con AN sin solidificar para

pequeñas

con

Agar

pequeñas con AN con

con

CN

con

las

Nutritivo AN

 

los siguientes pH

 

siguientes

 

siembra con

prueba

   

concentraciones:

 

de tensión de O 2

 

Temperaturas

 

a

1 caja con pH 2

 

1

tubo

con [0.85%]

1

caja

de

petri

cultivar:

 

1 caja con pH 6.8

de NaCl

pequeña con AN para

4º C, 37 o C, 60 o C

1 caja con pH 8.5

tubo con [3%] de NaCl

1

cultivo en anaerobiosis

1 tubo de ensayo con TSB Caldo Triptona

   

Caja

de

galletas

o

frasco de boca ancha

efecto

de 30 cms, 2 velas

Soya temperatura ebullición (100 o C)

de

Nevera, Incubadoras (37 o Cy 60 o C), Baño María Procedimiento.

1. Realizar pases de la cepa purificada y caracterizada con asa redonda en cada uno

de los medios según sea líquido o solido, y de acuerdo a las pruebas de temperaturas, pH, presión, etc.

2.

Salvo las pruebas de temperatura incubar el resto de los medios sembrados a 37 o C

3.

Realizar pase de la cepa en tubo de ensayo con TBS, someter 15 minutos a 100 º

C

en Baño María, realizar extensión y tinción con Gram y luego incubar a 25 o C

4.

Realizar siembra profunda de la cepa, aplicando AN fundido para observar efecto de

la

tensión de oxígeno sobre el crecimiento

5.

Realizar siembra en caja de petri con AN y someter en cámara de anaerobiosis

(caja de galletas con velas encendidas)

6. Realizar lecturas comparando crecimiento, morfología macro y micro de la cepa

purificada para determinar efecto de la temperatura y los otros factores sobre la cepa

6. Mantener cepa purificada en nevara sellado con vinipel, no descartar el primer

aislamiento.

Prácticas de Laboratorio de Microbiología Departamento de Biología - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo 3.2.

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3.2. Crecimiento en Agar Inclinado y Motilidad

1 Tubo con Agar Nutritivo Inclinado

1 Tubo con medio para ver motilidad SIM 3

Procedimiento.

1. Sembrar inoculo de la cepa bacteriana aislada con asa recta en tubo de agar

inclinado y tubo con medio SIM, de forma precisa y recta.

2. Observar y describir tipo de crecimiento en ambos medios, en el medio SIM observar

coloración y reacción según literatura.

3.3. Crecimiento y observación de estructuras microscópicas de Hongos en Microcultivo

Cepas de hongos aisladas y purificadas en las prácticas anteriores de las muestras

tomadas por cada grupo. 1 montaje de microcultivo esterilizado por cada grupo con medio PDA o Saboraud

esterilizado por cada grupo con medio PDA o Saboraud Figura 1. Técnica de Microcultivo Procedimiento. Se

Figura 1. Técnica de Microcultivo

Procedimiento. Se deposita un cuadrado del medio estéril sobre un portaobjetos previamente esterilizado. Se siembra el hongo en sus bordes. Se coloca un cubreobjeto sobre el cuadrado de medio, se lleva a incubadora de 25 o C, hacen observaciones a las 24, 48 y 72 horas. Cuando se verifica crecimiento de micelio del hongo sobre el medio y por ende en el cubreobjeto, se toma este cuidadosamente y se coloca sobre una gota de azul de lactofenol o azul de metileno, se sella con esmalte y se observa al microscopio para hacer descripción microscópica de las estructuras vegetativas y de reproducción del hongo. Anote en cuadro sobre estudio de su cepa de hongo que viene complementando desde la clase anterior

Otros materiales. Coloraciones de Gram, Azul de Lactofenol, Azul de Metileno Portas y cubreobjetos Microscopio, Hipoclorito, Alcohol, Solución salina (0,85%), Asas, Pinzas, Gradilla y Mechero

3 Medio SIM: Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Cinta de enmascarar, vinipel Prácticas de Laboratorio de Microbiología Departamento de Biología - FACENED Mb.

Cinta de enmascarar, vinipel

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5.1.
5.1.

Investigue otros 2 ejemplos de microrganismos, según la clasificación realizada de acuerdo las condiciones de temperatura, pH, tensión de oxígeno, presión osmótica,

5.2. Investigue otros ejemplos de medios de cultivo según los tipos presentados, cual es la composición y el principio de lectura del medio SIM que se utilizo para ver motilidad

5.3. Cuáles con los organismos barotolerantes y barófilos, donde se encuentran, cite ejemplos.

Anote y dibuje de esta manera sus observaciones de las cepas aisladas/ sembradas en los diferentes medios y factores (temperatura, pH, la presión osmótica y la tensión de oxígeno), referenciado los resultados de crecimiento 4 y morfología macro y microscópica de la cepa

No.

Morfología

4º C

25º C

60º C

100 º C

Grupo/

previa

 

Morfo

 

Morfo

 

Morfo

 

Morfo

Muestra

Macro y

Micro del

Crecimiento

Macro y

Crecimiento

Macro y

Crecimiento

Macro y

Crecimiento

Macro y

Micro

Micro

Micro

Micro

Aislamiento

Anote los resultados sobre efecto del pH:

No.

Morfología

pH 2

pH 6.8

pH 8.5

Grupo/

previa

 

Morfo

 

Morfo

 

Morfo

Muestra

Macro y

Micro del

Crecimiento

Macro y

Crecimiento

Macro y

Crecimiento

Macro y

Micro

Micro

Micro

Aislamiento

Anote los resultados sobre efecto de la presión osmótica:

Prácticas de Laboratorio de Microbiología Departamento de Biología - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo No.

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No.

Grupo/

Muestra

Morfología

previa

Macro y

Micro del

Aislamiento

0.2 % Na Cl

0.85% Na Cl

15% NaCl

Crecimiento

Morfo.

Crecimiento

Morfo.

Crecimiento

Morfo.

Anote los resultados sobre efecto de la presión osmótica:

No.

Morfología

0.2 % Sacarosa

0.85% Sacarosa

15% Sacarosa

Grupo/

previa

 

Morfo

 

Morfo

 

Morfo

Muestra

Macro y

Micro del

Crecimiento

Macro y

Crecimiento

Macro y

Crecimiento

Macro y

Micro

Micro

Micro

Aislamiento

Macro y Micro Micro Micro Aislamiento Anote los resultados del cultivo en AN fundido, teniendo en

Anote los resultados del cultivo en AN fundido, teniendo en cuenta la siguiente clasificación:

O 2

Aeróbico Aeróbico Microarerófilo Anaerobio Obligado o Facultativo Aerotolerante Estricto
Aeróbico
Aeróbico
Microarerófilo
Anaerobio
Obligado o
Facultativo
Aerotolerante
Estricto
Aeróbico Microarerófilo Anaerobio Obligado o Facultativo Aerotolerante Estricto Anaerobio Obligado o Estricto

Anaerobio

Obligado o

Estricto

CONTROL ESTERILIZACION Y DESINFECCION Prácticas de Laboratorio de Microbiología Departamento de Biología - FACENED Mb.

CONTROL ESTERILIZACION Y DESINFECCION

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DE

LAS

POBLACIONES

MICROBIANAS:

Mb. Bibiana Duarte Restrepo DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS: Reconocer las principales técnicas de control de las

Reconocer las principales técnicas de control de las poblaciones microbianas:

Esterilización y Desinfección, revisión teórica

a.
a.

Esterilización: eliminación de toda forma de vida, incluídas las esporas.

b. Desinfección: proceso de destruir los agentes infecciosos.

c. Antisepsia: operaciones o técnicas encaminadas a crear un ambiente que impida el desarrollo de los microrganismos e incluso pueda matarlos.

d. Asepsia: técnicas empleadas para impedir el acceso de microrganismos al campo de

trabajo. e. Antibiosis: fenómeno biológico en el que existe una detención o destrucción del

crecimiento microbiano debido a sustancias producidas por otro ser vivo. f. Antimicrobianos: sustancias que matan o inhiben el crecimiento de los microrganismos (antibacterianos, antifúngicos, etc.)

g. Microbicidas: sustancias que matan las formas vegetativas, pero no necesariamente las

esporas de un microrganismo (bactericida, fungicida, etc.). h. Microbiostáticos: sustancias que inhiben el crecimiento de microrganismos (bacteriostáticos, fungistáticos, etc.). i. Antisépticos: se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo.

j. Desinfectantes: se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados.

k. Agentes terapéuticos: antimicrobianos empleados en el tratamiento de infecciones.

l. Agentes quimioterapéuticos: sustancias químicas empleadas en el tratamiento de enfermedades infecciosas o enfermedades causadas por la proliferación de células malignas.

m. Antibióticos: sustancias producidas por un ser vivo que se oponen a la vida de otro ser vivo

por un ser vivo que se oponen a la vida de otro ser vivo Otro aspecto

Otro aspecto necesario y crítico en el trabajo en microbiología es el lavado, desinfección

y esterilización adecuados según el tipo de material y su uso.

material de vidrio y algunas veces de plástico como el polipropileno, polietileno y el nilón (entre más opaco el material como el nilón más soporta calor y puede ser

En general se utiliza

esterilizado.

material usado o contaminado antes de descartarlo, luego se retira con cepillo y agua

En todos los casos debe ser esterilizado primero el medio de cultivo o

los desechos y se sumerge por 3 horas en detergente, se lava bien y se deja secar

Si se requiere estéril se lleva al autoclave, el

en un horno o a temperatura ambiente.

Prácticas de Laboratorio de Microbiología Departamento de Biología - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo cual

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cual funciona a base de calor húmedo a temperatura de 121ºC por 15 libras/pulgada2 de presión, durante 15 a 30 minutos. También se puede esterilizar en frío con oxido de etileno, con radiaciones ionizantes (rayos gamma emanados por fuentes de Cobalto 68 o cesio 139), rayos catódicos (generadores de electrones), rayos X (mortales para todas las células), estás técnicas son costosas, sin embargo son efectivas y puede utilizarse constantemente con material de plástico. La luz ultravioleta (bactericida desde los 333 nm) es usada frecuentemente en laboratorios especializados y quirófanos para reducir el número de bacterias del ambiente, sin embargo no se usa para esterilizar material del laboratorio debido a su poca penetrabilidad.

Es conveniente tapar o envolver el material antes de esterilizarlo con tapones de algodón y gasa y con papel kraft, manteniéndolos en un lugar seco hasta su uso (de esta

De la misma

forma una vez preparados y bien disueltos los medios de cultivo se esterilizan en fiolas llenas hasta la mitad y sin cerrar totalmente. Para luego verterlas en los tubos o cajas

forma una material esterilizado puede durar hasta un año disponible).

de petri siempre al lado del mechero.

Los procedimientos de esterilización y desinfección por calor se basan en que los

diferentes microrganismos tienen rangos de temperatura específicos, teniendo un máximo de temperatura sobre la cual detienen su crecimiento y pueden morir por la desnaturalización de sus sistema enzimático y una temperatura mínima bajo la cual no se desarrollan ya sea porque los proceso de síntesis de proteínas son extremadamente sensibles al frío o por que los lípidos empiezan de su estructura celular empiezan a solidificarse. Cada microrganismo se ubica dentro de un límite estrecho de temperatura óptima que favorece su metabolismo y reproducción. Para la mayoría de las bacterias patógenas la temperatura óptima esta entre 35 y 37º C, de esta forma en un proceso infeccioso la fiebre es un mecanismo de defensa del ya que al presentarse una temperatura mayor se desnaturalizan proteínas esenciales del patógeno causando su

Las células vegetativas son más sensibles al

muerte o deteniendo su proliferación.

calor que las esporas, que se constituyen en estructuras de resistencia en las cuales ha ocurrido un proceso de deshidratación y acumulación de sustancias como el dipicolinato

de calcio en la pared celular.

Sin embargo con la temperatura que puede alcanzar el

autoclave la mayoría de las esporas se inactivan.

Criterio de muerte de un microrganismo:

reproducción en un medio adecuado. Para poder determinar la eficacia antimicrobiana

capacidad de

pérdida

irreversible

de

la

los

sobrevivientes es decir, a los capaces de reproducirse; ya que los incapaces de

determina generalmente mediante métodos

reproducirse están muertos.

(la muerte

de

los

microrganismos)

Esto

se

se

utilizan

técnicas que

descubran a

Prácticas de Laboratorio de Microbiología Departamento de Biología - FACENED Mb. Bibiana Duarte Restrepo cuantitativos

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cuantitativos de siembra en placa en los que los supervivientes se detectan porque forman colonias.

Cuando una población microbiana se expone a un agente letal, la cinética de la muerte es casi siempre exponencial ya que el número de supervivientes disminuye de forma geométrica con el tiempo. Si representamos gráficamente el logaritmo del número de

supervivientes frente al tiempo se obtiene una línea recta cuya pendiente negativa define

la tasa de mortalidad. Esta tasa de mortalidad nos dice solamente que fracción de la

población inicial sobrevive a un determinado período de tratamiento. Para determinar el número real de sobrevivientes es necesario conocer además el tamaño inicial de la

población. De acuerdo con esto, para establecer los procedimientos de esterilización hay que tener en consideración dos factores: la tasa de mortalidad y el tamaño de la población inicial. En la práctica de la esterilización la población microbiana que ha de ser destruida es mixta. Como los microrganismos difieren ampliamente en su resistencia

a los agentes letales, los factores que se hacen significativos son el tamaño de la

población inicial y la tasa de mortalidad de los miembros más resistentes de la población mixta. Para asegurar la fiabilidad de los métodos de esterilización se utilizan suspensiones de esporas de resistencia conocida. Los procedimientos rutinarios de esterilización se diseñan siempre de forma que proporcionen un amplio margen de seguridad.

a. Temperatura: a mayor temperatura mayor acción.
a.
Temperatura: a mayor temperatura mayor acción.

b. Tipo de microrganismo: las células vegetativas en desarrollo son mucho más susceptibles que las esporas.

c. Estado fisiológico de las células: las células jóvenes son más vulnerables que las viejas.

d. Ambiente:

El calor es más eficaz en un medio ácido que en uno alcalino.

La consistencia del material, acuoso o viscoso, influye marcadamente en la

penetración del agente.

Las concentraciones altas de carbohidratos aumentan, por lo general, la resistencia

térmica de los organismos.

La presencia de materia orgánica extraña reduce notablemente la eficacia de los

agentes químicos antimicrobianos por inactivar éstos o proteger al microrganismo.

por inactivar éstos o proteger al microrganismo. a. Altas Temperaturas: La alta temperatura combinada con un

a. Altas Temperaturas: La alta temperatura combinada con un alto grado de humedad es uno de los métodos más efectivos para destruir microrganismos. Hay que distinguir entre calor húmedo y calor seco. El húmedo mata los microrganismos porque coagula sus

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proteínas siendo más rápido y efectivo que el calor seco que los destruye al oxidar sus constituyentes químicos. La acción letal del calor es una relación de temperatura y tiempo afectada por muchas condiciones. Por ejemplo, las esporas de Clostridium botulinum son destruidas en 4 a 20 minutos a 120° C en calor húmedo, mientras que se necesitan alrededor de 2 horas de exposición al calor seco para obtener los mismos resultados.

Esterilización por calor húmedo: (se utiliza para soluciones acuosas)

Autoclave: El calor en la forma de vapor a saturación y a presión es el agente

más práctico para esterilizar ya que el vapor a presión proporciona temperaturas superiores a las que se obtienen por ebullición. El aparato utilizado se llama autoclave (una olla que regula la presión interna y el tiempo). Los autoclaves de laboratorio se emplean generalmente a una presión de vapor de una atmósfera por encima de la presión atmosférica lo cual corresponde a una temperatura de 120° C. El tiempo de exposición depende del volumen del líquido, de tal manera que para volúmenes

pequeños (hasta unos 3 litros) se utilizan 20 minutos a 120° C; si los volúmenes son mayores debe alargarse el tiempo de tratamiento. Algunos materiales no se deben esterilizar en el autoclave. Sustancias que no se mezclan con el agua no pueden ser

alcanzadas

sustancias se alteran o son destruidas por tratamientos prolongados de calor empleándose en estos casos otros métodos de esterilización.

Tindalización: Se utiliza cuando las sustancias químicas no pueden calentarse por

encima de 100° C sin que resulten dañadas. Consiste en el calentamiento del material de 80 a 100° C hasta 1 hora durante 3 días con sucesivos períodos de incubación. Las esporas resistentes germinarán durante los períodos de incubación y en la siguiente

exposición al calor las células vegetativas son destruidas.

Pasteurización: La leche, nata y ciertas bebidas alcohólicas (cerveza y vino) se

someten

microrganismos pero no a todos. La leche pasteurizada no es estéril. La temperatura

de

microrganismos patógenos (es el tiempo más corto necesario para matar una suspensión de bacterias a una temperatura determinada). Mycobacterium tuberculosis es de los microrganismos patógenos más resistentes al calor que puede transmitirse por la leche cruda y se destruye en 15 minutos a 60° C. Posteriormente se descubrió que Coxiella burnetti, agente causal de la fiebre Q, se encuentra a veces en la leche y es más resistente al calor que Mycobacterium tuberculosis por lo que la pasteurización de la leche se realiza a 62,8° C durante 30 minutos o a una temperatura ligeramente superior, 71,7° C durante 15 segundos (Flash-Pasteurización).

de

sobreviviendo los microrganismos que contengan. Otras

por

el

vapor

a tratamientos

de

calor controlado

se

que

en

sólo matan

el

tiempo

a

ciertos

tipos

mortal

seleccionada para

la pasteurización

basa

térmico

Esterilización por calor seco: (se utiliza para materiales sólidos estables al calor)

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Horno Pasteur: El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material de

vidrio y otros materiales sólidos estables al calor. El aparato que se emplea es el horno

Pasteur. Para el material de vidrio de laboratorio se consideran suficientes dos horas de exposición a 160° C.

Incineración: La destrucción de los microrganismos por incineración es una práctica

rutinaria en los laboratorios. Las asas de siembra se calientan a la llama de mecheros Bunsen. La incineración también se utiliza en la eliminación de residuos hospitalarios.

b. Bajas Temperaturas. En general, el metabolismo de las bacterias está inhibido a temperaturas por debajo de 0° C. Sin embargo estas temperaturas no matan a los microrganismos sino que pueden conservarlos durante largos períodos de tiempo. Esta circunstancia es aprovechada por los microbiólogos para conservar los microrganismos indefinidamente. Los cultivos de microrganismos se conservan congelados a -70° C o incluso mejor en tanques de nitrógeno líquido a -196° C.

c. Radiaciones

Radiaciones ionizantes:

Rayos gamma: Las radiaciones gamma tienen mucha energía y son emitidas por

ciertos isótopos radiactivos como es el Co60 pero son difíciles de controlar ya que este isótopo emite constantemente los rayos gamma en todas direcciones. Estos rayos gamma pueden penetrar los materiales por lo que un producto se puede empaquetar primero y después esterilizar.

Rayos catódicos (Radiación con haz de electrones): Se usan para esterilizar

material quirúrgico, medicamentos y otros materiales. Una ventaja es que el material se

puede esterilizar después de empacado (ya que éstas radiaciones penetran las envolturas) y a la temperatura ambiente.

Radiaciones no ionizantes

Luz ultravioleta: La porción ultravioleta del espectro incluye todas las radiaciones

desde 15 a 390 nm. Las longitudes de onda alrededor de 265 nm son las que tienen mayor eficacia como bactericidas (200 - 295 nm). Se usan para reducir la población microbiana en quirófanos, cuartos de llenado asépticos en la industria farmacéutica y para tratar superficies contaminadas en la industria de alimentos y leche. La luz UV tiene poca capacidad para penetrar la materia por lo que sólo los microrganismos que se encuentran en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la acción de la luz UV son susceptibles de ser destruídos.

d. Filtración

Algunos materiales como los líquidos biológicos (suero de animales, soluciones de enzimas, algunas vitaminas y antibióticos) son termolábiles. Otros agentes físicos como

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las radiaciones son perjudiciales para estos materiales e imprácticos para esterilizarlos, por lo que se recurre a la filtración a través de filtros capaces de retener los microrganismos. Los microrganismos quedan retenidos en parte por el pequeño tamaño de los poros del filtro y en parte por adsorción a las paredes del poro durante su paso a través del filtro debido a la carga eléctrica del filtro y de los microrganismos. Debido al pequeño tamaño de los virus, nunca es posible tener certeza de que, por los métodos de filtración que dejan libre de bacterias una solución, se van a eliminar también los virus.

Filtros de membrana: Los filtros de membranas son discos de ésteres de celulosa

con poros tan pequeños que previenen el paso de los microrganismos. Existen distintos tipos de filtro dependiendo del tamaño de poro. Estos filtros son desechables. Además

de utilizarse en la esterilización de líquidos se usan en el análisis microbiológico de aguas ya que concentran los microrganismos existentes en grandes volúmenes de agua.

Filtros HEPA: Un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) está compuesto por

pliegues

microrganismos) del aire que sale de una campana de flujo laminar. e. Desecación. La desecación de las células vegetativas microbianas paraliza su actividad metabólica. Este proceso físico se utilizaba ampliamente antes del desarrollo de la refrigeración. El tiempo de supervivencia de los microrganismos después de desecados depende de muchos factores, entre ellos la especie microbiana. En general, los cocos Gram (-) son más susceptibles a la desecación que los cocos Gram (+). Las endoesporas bacterianas son muy resistentes a la desecación pudiendo permanecer viables indefinidamente.

los

de

acetato

de

celulosa que

retienen

las

partículas (incluídos

acetato de celulosa que retienen las partículas (incluídos a. Oxido de etileno: El requerimiento esencial para

a. Oxido de etileno: El requerimiento esencial para un agente químico esterilizante es que sea volátil así como tóxico para los microrganismos, de manera que pueda ser fácilmente eliminado del objeto esterilizado después del tratamiento. Normalmente se utiliza el óxido de etileno, un líquido que hierve a 10,7° C. Se usa en la industria para la esterilización de placas Petri, jeringas y otros objetos de plástico que se funden a temperaturas superiores a los 100° C. Debido a su alto poder de penetración estos objetos se empaquetan primero y después se esterilizan. El óxido de etileno actúa inactivando enzimas y otras proteínas que contienen grupos sulfidrilos (R-SH) mediante una reacción llamada alquilación (R-S-CH2CH2O-H). b. Glutaraldehido: Una solución acuosa al 2% presenta una amplia actividad antimicrobiana. Es efectivo frente a virus, células vegetativas y esporas de bacterias y hongos. Se usa en medicina para esterilizar instrumentos urológicos y ópticos.

para esterilizar instrumentos urológicos y ópticos. a. Esterilización: es el proceso de destrucción de todas

a. Esterilización: es el proceso de destrucción de todas las formas de vida microbiana.

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b. Desinfección: es el proceso de destrucción de los agentes infecciosos. Desinfectantes: son aquellas sustancias químicas que matan las formas vegetativas y no necesariamente las formas de resistencia de los microrganismos patógenos. Se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados. c. Antisépticos: son aquellas sustancias químicas que previenen el crecimiento o acción de los microrganismos ya sea destruyéndolos o inhibiendo su crecimiento y actividad. Se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo.

INORGANICOS. Metales: Los más efectivos son el mercurio, plata ,cobre y zinc. Actúan inactivando las proteínas celulares al combinarse con ellas. Entre los compuestos de mercurio que se emplean como antisépticos en heridas superficiales de la piel y mucosas están el mercurocromo (mercromina) y el mertiolato. Entre los compuestos de plata utilizados como antisépticos está el nitrato de plata (AgNO3) que en solución al 1% se ha utilizado para prevenir infecciones gonocócicas en los ojos de los recién nacidos aunque actualmente se está remplazando por antibióticos como la penicilina.

Entre los compuestos de cobre se encuentra el sulfato de cobre (CuSO4) que se utiliza como algicida en los recipientes abiertos que contienen agua. También es fungicida por lo que se utiliza para controlar las infecciones fúngicas de plantas (Mezcla Bordolesa). Acidos y álcalis: Actúan alterando la permeabilidad y coagulando las proteínas. En general los ácidos son más eficaces que los álcalis. Dentro de estos compuestos se

encuentran el sulfúrico (H2SO4), nítrico (HNO3),

e

hidróxido potásico (KOH). Tienen aplicación limitada debido a su naturaleza cáustica y corrosiva. Aun así el NaOH se utiliza en la industria del vino para limpiar las cubas de

madera.

hidróxido sódico (NaOH)

Compuestos inorgánicos oxidantes: actúan oxidando los componentes de la membrana y enzimas. El agua oxigenada (H2O2) al 6% (20 volúmenes) se utiliza como antiséptico en pequeñas heridas de la piel.

Halógenos: Los halógenos especialmente el cloro y el iodo son componentes de muchos antimicrobianos. Los halógenos son agentes fuertemente oxidantes por lo que son altamente reactivos y destructivos para los componentes vitales de las células microbianas. Cloro: La muerte de los microrganismos por acción del cloro se debe en parte a la combinación directa del cloro con las proteínas de las membranas celulares y los enzimas. Así mismo en presencia de agua desprende oxígeno naciente (O) que oxida la materia orgánica:

Cl2 + H2O ----------------> HCl + HClO (ácido hipocloroso) HClO ----------------> HCl + O (oxígeno naciente)

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El gas cloro licuificado se utiliza en la desinfección del agua de bebida y piscinas. El hipoclorito sódico (lejía) al 1% se puede utilizar como desinfectante doméstico.

Iodo: El mecanismo mediante el cual el iodo ejerce su acción antimicrobiana es debido a su acción oxidante. Además la habilidad que tiene el iodo para combinarse con el aminoácido tirosina resulta en la inactivación de enzimas y otras proteínas. El iodo se puede utilizar como antiséptico bajo dos formas: i) tintura de iodo, es una solución alcohólica (tintura) de iodo (I2) más ioduro potásico (KI) o ioduro sódico (NaI). ii) iodóforos, son mezclas de iodo (I2) con compuestos que actúan como agentes transportadores y solubilizadores del iodo. Por ejemplo, la povidona iodada (Betadine) es un complejo de iodo y polivinilpirrolidona (PVP). Los iodóforos tienen la ventaja de que no tiñen la piel. Las preparaciones de iodo se utilizan principalmente para desinfectar la piel así como en la desinfección de pequeñas cantidades de agua. Los vapores de iodo se utilizan a veces para desinfectar el aire.

ORGANICOS Alcoholes: El alcohol metílico (1C) es menos bactericida que el etílico (2C) y además es altamente tóxico. Hay un aumento en el poder bactericida a medida que aumenta la longitud de la cadena carbonada; pero como los alcoholes con peso molecular superior al del propílico (3C) no se mezclan en todas las proporciones con el agua, no se suelen utilizar como desinfectantes. Los alcoholes actúan desnaturalizando las proteínas, disolviendo las capas lipídicas y como agentes deshidratantes. El etanol al 96% se usa como antiséptico de la piel y como desinfectante en los termómetros clínicos orales y algunos instrumentos quirúrgicos.

Fenol y compuestos fenólicos: Una solución acuosa al 5% de fenol mata rápidamente a las células vegetativas de los microrganismos. Sin embargo, las esporas son mucho más resistentes al fenol. Debido a que el fenol es tóxico y tiene un olor desagradable ya casi no se usa como desinfectante o antiséptico, siendo reemplazado por compuestos fenólicos que son sustancias derivadas del fenol menos tóxicas y más activas frente a los microrganismos. Lysol es una mezcla de compuestos fenólicos que se utiliza para desinfectar objetos inanimados como los suelos, paredes y superficies. El fenol y compuestos fenólicos actúan alterando la permeabilidad de la membrana citoplásmica así como desnaturalizando proteínas.

citoplásmica así como desnaturalizando proteínas. a. Técnica de dilución en tubo: Primero se realizan

a. Técnica de dilución en tubo: Primero se realizan diferentes diluciones del agente químico. El mismo volumen de cada dilución se dispensa en tubos estériles. A cada tubo se le añade la misma cantidad de una suspensión del microrganismo utilizado como

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prueba. A determinados intervalos de tiempo se transfiere una alícuota de cada tubo a otro tubo que contenga medio de cultivo. Estos tubos inoculados se incuban a la temperatura óptima de crecimiento del microrganismo utilizado como prueba durante 24 a 48 horas. Al cabo de este tiempo se examina el crecimiento del microrganismo mediante la aparición de turbidez en el tubo (crecimiento +) o ausencia de turbidez (crecimiento -). Aquellos tubos que presenten crecimiento negativo indican la dilución a la cual ese agente químico mata al microrganismo utilizado como prueba cuando este microrganismo es expuesto al agente químico durante ese período de tiempo. b. Técnica de la placa de agar: Se inocula una placa que contenga medio de cultivo sólido con el microrganismo utilizado como prueba. El agente químico se coloca en el centro de la placa, bien dentro de un cilindro o impregnado en un disco de papel. Al

cabo de 24 a 48 horas se observan zonas de inhibición (crecimiento -) alrededor del agente químico. Una modificación de esta técnica es la incorporación del agente químico en el medio de cultivo antes de verterlo sobre la placa. Una vez solidificado se inocula con el microrganismo utilizado como prueba, se incuba y se examina el crecimiento microbiano.

Es una técnica estandarizada que se utiliza para

comparar el poder desinfectante de un agente químico frente al del fenol. Es una modificación de la técnica de dilución en tubo tal como se describe a continuación: (i) Se prepara una serie de tubos conteniendo cada uno 5 ml de diferentes diluciones del desinfectante. (ii) A la vez se prepara una segunda serie de tubos que contengan diferentes diluciones de fenol. (iii) Cada tubo de las dos series se inocula con 0,5 ml de un cultivo de 24 horas del microrganismo utilizado como prueba (cepas específicas de Salmonella typhi o Staphylococcus aureus). (iv) A los 5, 10 y 15 minutos se recoge una alícuota de cada tubo que se inocula en otro tubo que contenga medio de cultivo estéril. (v) Estos tubos inoculados se incuban durante 24 a 48 horas y se observa el crecimiento del microrganismo (aparición de turbidez). (vi) La mayor dilución del desinfectante que mate a los microrganismos en 10 minutos pero no los mate en 5 minutos se divide por la dilución mayor de fenol que dé los mismos resultados. El número obtenido es el coeficiente fenólico de ese desinfectante.

c. Técnica del coeficiente fenólico: