CROMATOGRAFIA

I. FUNDAMENTO TEORICO
CROMOTOGRAFIA: La cromatografa, es la tcnica de anlisis qumico utilizada para separar sustancias puras de mezclas complejas. Esta tcnica depende del principio de adsorcin selectiva (no confundir con absorcin). La cromatografa fue descubierta por el botnico ruso, de origen italiano, Mijal Tswett en 1906, pero su uso no se generaliz hasta la dcada de 1930. Tswett separ los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas verdes en ter de petrleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta. A medida que la disolucin va filtrndose por la columna, cada componente de la mezcla precipita a diferente velocidad, quedando la columna marcada por bandas horizontales de colores, denominadas cromatogramas. Cada banda corresponde a un pigmento diferente. Se llama cromatografa a una tcnica que permite separar (o fraccionar, en lenguaje de laboratorio) los componentes de una mezcla de substancias biolgicas. El trmino deriva de chrma, color, ya que los primeros ensayos del mtodo tuvieron por objeto separar compuestos que eran naturalmente coloreados. En un principio se utiliz la cromatografa para fraccionar e identificar molculas pequeas, como aminocidos o azcares. En estos casos, se us la cromatografa de particin, que consiste en aplicar una gota de la solucin con la mezcla de substancias a separar en la parte inferior de una tira de papel (cromatografa en papel) o en una delgada capa de un material inerte, como silicagel o celulosa (cromatografa en capa delgada). Luego, el papel o material inerte (los denominaremos soportes) se colocan en un recipiente con un solvente, de manera que, poco a poco, este los vaya impregnando. Dicho solvente es una mezcla de dos lquidos (por ejemplo, agua y etanol), que se eligen de manera tal que uno de ellos se adsorba ms al soporte que el otro; as, a medida que el solvente avance a lo largo del soporte -los lquidos suben espontneamente por capilaridad-, aquellos componentes de la muestra que sean ms solubles en el lquido que queda adsorbido sern retenidos, y los que tengan mayor afinidad por el que no se adsorbe sern arrastrados por este. Una vez finalizado el proceso, el soporte se seca y se tie con un colorante conveniente, para revelar los compuestos separados, los que se identifican colocando, sobre el mismo soporte, muestras de substancias conocidas. Una pequea cantidad de la muestra en disolucin se evapora cerca del borde del ngulo de una tira de papel La cromatografa en columna utiliza un amplio espectro de adsorbentes

Practica de Lab #6

slidos, incluidas la slice, la almina y la slice gelatinosa. Tambin los lquidos pueden ser adsorbidos en estos slidos y a su vez sirven como adsorbentes (un proceso denominado cromatografa de reparto) permitiendo al qumico elaborar columnas de diferentes propiedades para diversas aplicaciones. En la cromatografa con lquidos de alto rendimiento, una variante de esta tcnica de uso frecuente hoy en da, se utilizan lquidos adsorbidos en partculas muy pequeas y uniformes, lo cual proporciona una sensibilidad bastante alta. Para llevar la mezcla a travs de la columna se precisa una bomba. La cromatografa de capas finas es otra forma de cromatografa en columna en la cual el material adsorbente reposa en un cristal o en una pelcula de plstico. En la cromatografa en papel, una muestra lquida fluye por una tira vertical de papel adsorbente, sobre la cual se van depositando los componentes en lugares especficos. Otra tcnica conocida como cromatografa gas-lquido permite la separacin de mezclas de compuestos gaseosos o de sustancias susceptibles de vaporizarse por calor. La mezcla vaporizada es conducida mediante un gas inerte a travs de un estrecho tubo en espiral que contiene una sustancia, por la que los componentes fluyen en diferentes proporciones, siendo detectados al final del tubo. Otro mtodo es la cromatografa por infiltracin gelatinosa, basado en la accin filtrante de un adsorbente poroso de tamao uniforme. Con este mtodo se consigue separar y detectar molculas de mayor masa molecular. El uso de la cromatografa est ampliamente extendido en el anlisis de alimentos, medicinas, sangre, productos petrolferos y de fisin radiactiva. Tcnicas cromatografas: Segn la forma de llevar a cabo la separacin cromatogrfica, es decir, segn el dispositivo utilizado para conseguir entre la fase mvil y la estacionaria, cabe distinguir dos tipos de tcnicas cromatograficas: en columna y plana. Cromatografa en columna: Se utiliza un tubo cilndrico, en cuyo interior se coloca la fase estacionaria y a su travs se hace pasar la fase mvil. El flujo de la fase mvil (liquido o gas) a travs de la estacionaria se consigue: 1) por presin, 2)por capilaridad, 3) por gravedad.

Es de destacar que en la actualidad, aunque incorrectamente, el trmino de cromatografa en columna suele aplicarse a la cromatografa liquida para distinguirla de la cromatografa plana ya que, obviamente la cromatografa de gases solo puede realizarse en columna. Cromatografa plana: La fase estacionaria esta colocada en una superficie plana que en realidad es tridimensional, aunque una de sus dimensiones es muy reducida, por lo que puede considerarse bidimensional. Se divide en dos tipos generales:

Cromatografa en papel: en la que el papel acta como soporte de la fase estacionaria (cromatografa de particin). Cromatografa en capa fina: en la que un slido acta como fase estacionaria (cromatografa de particin), se extiende en una capa delgada sobre una placa, generalmente de vidrio. Cromatografa de gases: La cromatografa de gases es una tcnica cromatogrfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografa, la fase mvil no interacciona con las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de cromatografa de gases (GC): la cromatografa gas-slido (GSC) y la cromatografa gas-lquido (GLC), siendo esta ltima la que se utiliza ms ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografa de gases (GC). En la GSC la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de adsorcin, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su nica aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria molculas de lquido inmovilizadas sobre la superficie de un slido inerte.

Cromatografa HPLC: En la actualidad HPLC ha llegado a ser una de las Tcnicas del Laboratorio Moderno ms importantes como herramienta analtica para separar y detectar compuestos qumicos. Como en todas las tcnicas analticas, los pequeos problemas a la larga pueden llegar a tener un mayor impacto en la exactitud y durabilidad del sistema. Aun con la evolucin de los cromatgrafos lquidos en la era de la computadora, hay aun problemas que sta no puede resolver. Hasta los Solventes para HPLC, todos filtrados cuidadosamente en la fbrica, pueden acumular partculas en suspensin que pueden ser perjudicial a los componentes del sistema HPLC. Estas partculas en suspensin pueden venir de varias fuentes, incluso de la exposicin al polvo en el aire durante el trasegado de solvente en el depsito para solvente, la exposicin a particulares del aire durante el almacenamiento del solvente en el depsito del solvente, la degradacin lenta del recipiente solvente, o de condensacin y polimerizacin del solvente. Las partculas pueden ocasionar costosos daos a la bomba HPLC, al guarda columnas, y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan que se filtre y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos

II.

PARTE EXPERIMENTAL
CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Y CAPA SOBRE PAPEL EN CAPA FINA: *Preparamos las placas introduciendo 2 laminas portaobjetos (juntas) en una suspensin preparada al vital 35g de Silicagel G ( o 60g de almina) en 100 ml de una mezcla de cloroformo-metanol (2:1). Esta suspensin puede conservarse en recipientes bien cerrado, debiendo agitarse antes de usar. *Se separan los portaobjetos, se dejan secar y se sealan 2 puntos (equidistantes de los bordes y entre si) que se encuentren en una imaginaria <<lnea de partida>>a 1.50 cm. del borde inferior (use nicamente lpiz) *En uno de los puntos de siembra (en solucin y con un capilar) unas 2 o 3 gotas de la mezcla anaranjado de metilo-azul de metileno y en el otro de estos colorantes (cualquiera). Dejar secar el solvente. *Introducir la placa en una de desarrollo que contiene la fase mvil (1propanol-butanona-agua en la proporcin de 4:1:1) *Cuando el solvente este por llegar al borde superior de la plaquita, retire esta, marque el frente, dejar secar y calcule el Rf. NOTA: Las distancias para el calculo del Rf o Rx se toman siempre desde la <<lnea de partida>> (no desde el borde de la placa o del papel) y hasta el centro de la mancha; si esta es muy alargada, considere el centro de la parte de mayor concentracin o de mayor intensidad de color.

x = 1.7

X = 2.5 Y = 3.0

Anaranjado mezcla de metilo Compuesto Anaranjado de metilo Mezcla (1+2) 2.5 2.5 1.7 3 3 Solvente 0.83 0.83 0.56 Rf

Fenmeno fsico predominante: ADSORCION Fase fija o estacionaria: AGUA Solvente de desarrollo: 1-PROPANOL-ACETONA-AGUA (en la proporcin de 4:1:1) SOBRE PAPEL: Sobre una cinta de papel Whatman N1 de 3x10 cm. se realiza lo siguiente: *A 1.5cm de un extremo de la tira de papel de filtro, marque una tenue lnea recta con lpiz (lnea de partida). No use tinta. *Doble la tira longitudinalmente, quedando dividida en 2 mitades. En cada mitad, y sobre la lnea de partida, seale el punto medio para la siembra. *En uno de estos puntos y con un tubo capilar, deposite unas gotitas (2 o 6) de mezcla a analizar (azul de metileno y anaranjado de metilo). En el otro punto sembrar uno de los colorantes (cualquiera) en solucin. Espere que cada gota seque antes de sembrar la siguiente. *Deje unos minutos para que se evapore el solvente de la siembra (puede ayudarse con corriente de aire). Introduzca la tira en un tubo de ensayo de 2x15cm en cuyo interior se ha colocado el solvente de desarrollo (1-propanol-cetona-agua 4:1:1) o (La zona de la siembre no debe quedar sumergida en el solvente). NO MUEVBA LA CUBA CORMATOGRAFICA HASTA QUE TERMINE EL DESARROLLO. *Cuando la fase mvil haya ascendido unos 8-10cm. retire el papel, marque el frente del solvente (con lpiz) y djelo secar. *Observe y compare las 2 muestras sembradas y calcule el Rf de cada sustancia.

8.5cm

no se pudo determinar

11cm

1.5cm

Compuesto Anaranjado de metilo 8.5 11

Solvente 0.772

Rf

Mezcla (1+2) no se pudo determinar ya que la calida del papel era mala y la mezcla se desplaz pero no se notaba donde era el lugar de mayor intensidad. Fenmeno fsico predominante: PARTICIN Fase fija o estacionaria: AGUA Solvente de desarrollo: 1-PROPANOL-ACETONA-AGUA (en la proporcin de 4:1:1) EN COLUMNA: Preparacin de la columna: Introducir u trozo de algodn hasta el fondo de la columna. Adicionarle unos 10cc de etanol y luego agregar una suspensin formada al agitar 10g de Silicagel (o almina) en unos 20cc de etanol. Abrir la llave de la columna hasta que la altura del solvente sea de 1mm por encima de la superficie del adsorbente. Siembra: Depositar 1 o 2cc de la mezcla de a separar (en solucin alcohlica), abrir la llave hasta que todo el colorante sea adsorbido por la fase fija. Elusin: Ir adicionando etanol (eluyente) hasta que se eluya el colorante que se desplaza mas rpidamente. Cambie de recipiente y eluya el segundo colorante. Si fuera necesario, cambie el etanol por agua acidulada para eluir este segundo colorante. Compare el color y aspecto de las 2 fracciones obtenidas de la columna cromatografica. Guarde parte de estas fracciones para su anlisis por Cromatografa en capa fina. Fase fija QUIMICA Muestra MEZCLA CLORATO Solvente 1 Eluato ETANOL Solvente 2 Eluato AGUA CON ACIDO Observaciones solvente/ eluato ALUMINA

III.

CUESTIONARIO
CUESTIONARIO DE CROMATOGRAFA EN COLUMNA:
1. Cul es la principal utilidad de la cromatografa en columna? La utilidad de la cromatografa en columna se basa en el anlisis, la separacin o purificacin de sustancias o mezcla de stas a travs de ciertas tcnicas y mtodos muy eficientes usados en los actuales laboratorios de qumica. 2.- Qu fenmenos fijos intervienen en una columna cromatogrfica que utilice Silicagel como fase fija? Los fenmenos fsicos presentes son la adsorcin y desorcin, el primero consiste en que las molculas de una sustancia (adsorbato) se adhieren en la superficie de un slido finamente dividido(adsorbente, Silica Gel) y el segundo es la separacin de las molculas adsorbidas en la superficie del solido. 3.- Cules son las principales diferencias entre un HPCL y una columna cromatogrfica simple? Las principales diferencias derivan en que las columnas de HPCL el solvente o fase mvil circula con gran dificultad (por su empaquetamiento mucho mas compacto), por lo que debe ser impulsado a alta presin (mediante bombas de alta presin) y las columnas suelen estar construidas en materiales muy fuertes como el acero inoxidable. Adems, para lograr la mxima eficiencia de los solventes usados en HPCL deben tener un mayor grado de pureza y el eluato al salir de la columna pasa a travs de un detector para monitorear la presencia del material. 4.- Cul es el factor que hace que la HPCL sea mucho mas eficiente que una columna cromatogrfica simple? La mayor eficiencia de esta tcnica se debe a que la fase estacionaria esta formada de partculas esfricas muy pequeas y de tamao uniforme. Usndose micro esferas con un tamao de 5 a 10 micrones. 5.- Estamos operando una columna cromatogrfica usando como adsorbente Silica gel y casi todos los compuestos se han eluido, excepto un compuesto que no es eluido con este solvente Qu cambios introducira para poder eluirlo? Se tiene que cambiar de adsorbente generalmente la mezcla de dos o tres adsorbentes de distinta polaridad resultan ms eficientes que absorbentes puros. 6.- Como es posible trabajar con unas sustancias incoloras en una columna cromatogrfica, si no es posible localizar las sustancias dentro de una columna? Se realiza el anlisis del eluato por cromatografa en capa fina o sobre papel. Como este proceso es largo suele recibirse el eluato en muchos matraces o tubos de ensayo de volmenes similares, anotndose en cada uno un nmero o cogidos que indique su orden de salida de la columna (utilizando un colector de fracciones el proceso se vuelve casi automtico).

Luego se juntan las fracciones que tienen igual o similar contenido y se elimina o recupera el solvente (por destilacin o usando un rota vapor) obtenindose el residuo de cada fraccin. Posteriormente se pueden aplicar otros procesos de purificacin (cristalizacin, destilacin, etc.) o de identificacin de sustancias (puntos de ebullicin, espectro IR, etc.. 7.- Qu tipo de cromatografa utilizara para eliminar las sales minerales que estn contaminando una muestra de cafena? Cromatografa en capa fina 8.- Qu es un colector de fracciones y cual es su principal utilidad? La cromatografa en columna consta de tres etapas: llenado de columna, aplicacin de muestras y elusin. Durante la elusin se procura que las primeras porciones del solvente sirvan para lavar las paredes de la columna y que toda la muestra sea adsorbida por la fase fija. Cuando se hace un anlisis generalmente por cromatografa en capa fina o sobre papel, este suele ser un proceso muy lento y suele recibir el solvente en muchos matraces que indican su orden de salida de la columna. Es en esta parte que se usa el colector de fracciones para llevar el proceso de forma automtica aprovechando la mayor cantidad de tiempo posible. 9.- Qu diferencias encuentras entre la cromatografa de gases y la cromatografa de columna? Criterio Fase fija Fase mvil Fenmeno fsico predominante y estado fsico de las fases involucradas Complejidad relativa Eficiencia relativa Costo relativa Automatizacin C. DE COLUMA Lquido Slido Adsorcin y particin Simple: Menor Barato Casi automtica C. DE GASES Lquida Gaseosa Particin Complejo: Mayor Costoso Automtica

10. Qu son Resinas de Intercambio inico y cul es su utilidad? Las resinas sintticas de intercambio inico consisten en una matriz polimrica reticulada por la accin de un agente entrecruzante y derivatizada con grupos inorgnicos que actan como grupos funcionales. Son los materiales ms habituales en las aplicaciones de intercambio inico en la industria.

CUESTIONARIO DE CROMATOGRAFA EN CAPA FINA Y CAPA SOBRE PAPEL

1. Qu entiende por Rx? A la relacin entre el desplazamiento de una sustancia, con respecto a otra patrn (qumicamente similar a la muestra). 2. Cules son las diferencias entre la c.c.f. y la de papel? La cromatografa en capa fina permite el uso de absorbentes eficientes, los que se aplican formando una capa delgada y uniforme que se adhiere sobre la superficie de un soporte inerte rgido por el uso de un agente aglomerante o por las propias cualidades del material. El espesor de la capa adsorbente vara entre 0,1 y 2 mm. Las sustancias se depositan en solucin en la base de la plancha, la que se coloca verticalmente en la Cuba cromatografa que contiene el solvente escogido. Cuando este llega a la altura deseada, se saca el cromatograma, se seca, se revela y se determina el Rf o Rx de cada sustancia. En cambio, la cromatografa sobre papel es un tipo de particin que utiliza el papel filtro como soporte inerte de la fase fija que puede ser el agua u otro liquido. Las separaciones se realizan por la particin continua de las sustancias entre la fase acuosa y la fase orgnica que fluye por el papel por capilaridad. La muestra se siembra cerca del borde inferior del papel filtro. Luego de que la siembra esta seca se sumerge el extremo del papel en un recipiente, hermticamente sellado, que contiene el solvente de desarrollo, ste asciende por capilaridad y los componentes de la muestra se van desplazando a diferente velocidad del lugar en que fueron sembrados. La identificacin de los distintos componentes de la mezcla se hace por comparacin con sustancias patrn o midiendo su desplazamiento respecto al de la fase mvil. 3.- Cite algunas de las aplicaciones de la cromatografa en su especialidad. Anlisis de Alimentos por Cromatografa: El anlisis de los alimentos mediante la cromatografa de columna, de capa delgada, de papel y cromatografa de gas son de mucha utilidad en el campo de la nutricin, la investigacin de nuevos productos, el control de la calidad de los alimentos, etc. Asimismo, colabora con la identificacin de aquellas plantas y animales que merecen consideracin como alimentos para el hombre. Tareas todas stas en las que est involucrado el Ingeniero en Industrias Alimentarias. 4. Interprete los valores de Rf 0,05; 0,6 y 0,98. El valor de Rf es una constante usada para intentar la identificacin de un compuesto ya que el desplazamientote una sustancia con respecto al desplazamiento del disolvente es constante y caracterstico de ella. Rf= Distancia recorrida por la sustancia Distancia recorrida por el disolvente Los 3 valores pueden ser interpretados como 3 diferentes sustancias de las cuales, la 1era (Rf=0,05) tiene un desplazamiento menor, la 2da (Rf=0,6) un desplazamiento algo mas amplio, y la 3era (0,98) un desplazamiento mayor a las dems. 5.- Introducira algn cambio cuando se tiene un Rf de 0,05, Por qu?

Si, por que esa distancia es muy pequea para utilizarla como identificacin de un compuesto. 6.- Explique algn mtodo para localizar las bandas de adsorcin cuando se trabaja con sustancias incoloras en una columna cromatogrfica. Es un tipo de cromatografa d particin que utiliza papel de filtro (fibras de ceulosa) como soporte inerte de la fase fija que puede ser el agua que, normalmente, contiene otro lquido con el que se ha impregnado el papel filtro. Las separaciones se realizan por participacin de las sustancias entre la fase acuosa (estacionaria) y la fase orgnica (mvil) que fluye por el papel por gravedad y/o capilaridad. La muestra a analizar o separar se siembra (en solucin) cerca del borde inferior de la tira de papel. Luego de secar o evaporar el solvente de siembra, se sumerge este extremo de papel de un recipiente (cuba cromatogrfica), hermticamente cerrado, que contiene el solvente de desarrollo, ste asciende por capilaridad (cromatografa ascendente) y los componentes de la muestra se van desplazando a diferente velocidad del lugar en que fueron sembrados. Cuando el solvente llega a la altura adecuada, se saca el cromatograma y se seca. La identificacin de los distintos componentes de la muestra se hace por comparacin con sustancias patrn o midiendo su desplazamiento respecto al de la fase mvil (Rf) pudiendo ser necesario el uso de un revelador. El disolvente tambin puede desplazarse en sentid contrario (de arriba hacia abajo), desde una cubeta colocada en la parte superior de la cuba (cromatografa descendente) o desde el centro de un papel circular hacia los bordes de ste (cromatografa circular). La cromatografa sobre papel es una valiosa herramienta en todos los campos de la qumica pero, el solo hecho de que todas las separaciones se hacen sobre celulosa le impone una gran limitacin tcnica ya que esta no siempre es satisfactoria para todos los casos. Es particularmente til en la separacin de compuestos muy polares (como azcares, aminocidos, etc.). Otro inconveniente es que slo se puede trabajar con pequeas cantidades de muestra, por lo que su principal utilidad es con fines analticos. 7. Qu es la electroforesis y cul es su principal aplicacin en los compuestos biolgicos? La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas (protenas o cidos nucleicos) sobre la base de su tamao molecular y carga elctrica. Los cidos nucleicos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los dirigir al polo positivo, mientras que las protenas se cargan con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente del peso molecular. Para la separacin se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas, como una malla). Al poner la mezcla de molculas y aplicar un campo electrico, stas se moveran y deberan ir pasando por la malla, por la que las pequeas se movern mejor, ms rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de partida. La principal aplicacin de la electroforesis capilar es para la determinacin de residuos de antiobiticos.

BIBLIOGRAFIA
Anlisis qumico e instrumental moderno. Harold F. Walton y Jorge Reyes. Ed. Revert. Mxico D.F. Anlisis Qumico Cuantitativo. Gilbert H. Ayres. Ed. Harla. Mexico D.F. http://html.rincondelvago.com/obtencion-de-la-cafeina.html