Jornadas Cientficas 99 Grupos de Investigacin Enolgica

Zaragoza, 17-19 de mayo de 1999

Aspectos bioqumicos y microbiolgicos del vino

Utilizacin de compuestos nitrogenados en mostos garnacha inoculados con cepas killer de S. cerevisiae

D. Torrea Goi y C. Ancn Azpilicueta

as toxinas killer disminuyen el gradiente electroqumico de la membrana plasmtica de las levaduras sensibles, interrumpiendo el transporte acoplado de protones y aminocidos.1 El objetivo de este trabajo es estudiar la utilizacin de aminocidos en mostos garnacha, inoculados con dos cepas killer (K2) de S. cerevisiae (D47 y K1M). La implantacin de dichas cepas se verific por PCR, siguiendo el mtodo de Lavalle et al. (1994).2 Los resultados se comparan con un mosto fermentado con sus levaduras autctonas (muestra control). El anlisis de los aminocidos libres se realiz por HPLC, siguiendo el mtodo Pico-Tag.3 En el primer 25 % de azcares fermentados, los aminocidos se consumen en gran proporcin en las tres muestras (tabla 1). Del 25 % al 50 % de azcares fermentados, los

aminocidos se siguen consumiendo, aunque algunos se excretan en las muestras sembradas con las levaduras killer (tabla 1). Del 50 al 75 % de azcares fermentados (tabla 2), hay una tendencia a la excrecin de aminocidos, sobre todo en la muestra D47. En la muestra K1M, se consumen la mayora de estos compuestos; esta cepa, en un medio sinttico, present una demanda de nitrgeno muy superior a la de la cepa D47 (datos no publicados), lo que podra explicar la diferencia entre ambas muestras. En la ltima fase fermentativa (75-100 % de azcares fermentados) (tabla 2) se produce excrecin de aminocidos al medio como consecuencia de la accin txica del etanol.4 Dicha excrecin fue muy superior en las muestras sembradas con las levaduras D47 y K1M; en estas muestras, al efecto txico del etanol sobre la

Tabla 1 Concentracin de aminocidos (Aa) en el mosto y su utilizacin en la primera mitad de fermentacin por distintas cepas
Mosto inicial Aa (mg/L) His Arg Thr Ala Asp Glu 33 2 384 6 15 3 56 3 17 3 64 2 0-25 % de azcares consumidos Control 26 2 376 6 13 3 53 3 14 3 57 3 D47 26 2 349 6 13 3 52 3 13 3 54 2 K1M 24 2 381 6 14 3 48 3 15 3 48 2 25-50 % de azcares consumidos Control 53 1,3 0,1 0,9 0,8 21 43 D47 -3 1 25 1 1,0 0,1 -4 2 1,8 0,1 2,7 0,4 K1M 4,8 0,4 -0,3 0,2 5,6 0,3 8,0 0,2

-: excrecin; : no presenta consumo ni excrecin. Los resultados se presentan con su desviacin estndar

Departamento de Qumica Aplicada, Universidad Pblica de Navarra, Pamplona

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Tabla 2 Utilizacin de aminocidos (Aa) en la segunda mitad de fermentacin por distintas cepas
50-75 % de azcares consumidos Aa (mg/L) His Arg Thr Ala Asp Glu Control 32 -0,7 0,2 -2 1 -9 1 D47 71 -1,3 0,1 -1,8 0,1 -18 1 K1M 3,5 0,4 1,6 0,2 -1,0 0,4 1,1 0,2 1,4 0,2 75-100 % de azcares consumidos Control 2,1 0,6 -0,70,3 -5 1 0,5 0,3 5,4 0,9 D47 -3,2 0,4 -9,6 0,6 -2,1 0,4 -11 1 -2,5 0,1 3,2 0,6 K1M -3,0 0,3 -11 1 -3,0 0,6 -10 1 -3,7 0,4 -8,4 0,3

-: excrecin; : no presenta consumo ni excrecin. Los resultados se presentan con su desviacin estndar

membrana de las clulas habra que sumar la liberacin de aminocidos de levaduras sensibles daadas por la toxina killer. Por todo ello, se puede concluir que los vinos obtenidos a partir de muestras donde las levaduras killer se sembraron y predominaron, presentaron menor estabilidad microbiolgica.

Bibliografa
1. De la Pea P., Barros F., Gascn S., Lazo P.S., Ramos S.: J Biol Chem 1981; 256: 10420-10425. 2. Lavalle F., Salvas Y., Lamy S., Thomas D.Y., Degr R., Dulau L.: Am J Enol Vitic 1994; 45: 86-91. 3. Cohen S.A., Meys M., Tarvin T.L.: The Pico-Tag Method. A manual of advanced tecniques for amino acid analysis, Millipore Corp, Bedford, 1989. 4. Ingram L.O., Dombek K.M., Osman Y.A.: Trends Biotechnol 1986; 4: 40-44.

Seleccin de cepas de levadura para realizar la segunda fermentacin en la elaboracin de vinos de cava

A. Martnez-Rodrguez y A.V. Carrascosa

n la elaboracin del cava tienen lugar dos fermentaciones alcohlicas sucesivas y el envejecimiento del vino en la botella con las levaduras. Las condiciones en las que se desarrolla la segunda fermentacin determinan las caractersticas que deben reunir las levaduras que hay que utilizar para obtener un producto de ptima calidad. En este trabajo se sugiere una metodologa que consideramos adecuada para seleccionar cepas de levadura que lleven a cabo con xito la segunda fermentacin y el envejecimiento en botellas, utilizando criterios enolgicos especficos que deben cumplir las levaduras que participan en la segunda fermentacin e incorporando al sistema de seleccin la capacidad de autlisis de las levaduras en un sistema modelo. El primer criterio de seleccin es el estudio del poder fermentativo en un medio sinttico que presenta una composicin similar al vino base de la segunda fermentacin (25 g/L de sacarosa en un medio de 10o alcohlicos, a pH 3 e incubado a 16 oC). El grupo de cepas que cumple este primer requisito se somete a las siguientes pruebas de seleccin: produccin de acidez voltil, resistencia al SO2, formacin de SH2, capacidad floculante y capacidad autoltica medida

por la liberacin al medio de aminocidos y protenas despus de 24 horas de incubacin en un sistema modelo. El anlisis conjunto de los resultados obtenidos permite hacer una segunda seleccin de las cepas que mejor se adaptan a los criterios de esta vinificacin. Para confirmar la identidad de las cepas se lleva a cabo un estudio de los patrones de digestin del DNA mitocondrial frente a un grupo de enzimas de restriccin diferentes (Nucleic Acids Res 1990;18:1657). Esta sistemtica la hemos seguido en el laboratorio para seleccionar una cepa adecuada para realizar la segunda fermentacin de vinos de cava. Se parti de 35 cepas de la coleccin del Instituto de Fermentaciones Industriales que a priori poda suponerse que eran adecuadas para este fin. En la primera seleccin quedaron 13 cepas. stas se sometieron al segundo grupo de criterios de seleccin superndolo cuatro cepas. El patrn del DNA mitocondrial nos indic que dos de ellas eran la misma cepa por lo que quedaron tres, con las que se han realizado vinificaciones en bodega para llevar a cabo un estudio ms profundo de los cambios que se producen en la segunda fermentacin y de la liberacin de compuestos que tiene lugar durante la autlisis de las levaduras.

Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC, Madrid (ifimr41@ifi.csic.es)

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Aplicacin de la SPE a la extraccin de OTA

D. Jornet, O. Busto y J. Guasch

a presencia de ocratoxina A en los vinos ha suscitado un inters creciente en los ltimos aos debido a sus propiedades toxicolgicas y carcingenas. Hasta este momento, solamente se ha detectado en concentraciones inferiores a 5 ug/L, lmite mximo admitido para los cereales y sus derivados, de acuerdo con el Codex Alimentarius. La tcnica analtica ms empleada para su determinacin es la RP-HPLC, aunque el mtodo oficial propuesto por la AOAC est basado en la cromatografa en capa fina. En estudios recientes, se ha propuesto un mtodo en el cual la OTA se extrae del vino mediante tolueno y, tras un tratamiento de clean up relativamente complejo, se cuantifica por HPLC. El mtodo ha sido reconocido por la OIV como un mtodo satisfactorio bajo un punto de vista analtico, aunque implica la necesidad de seguir unas condiciones estrictamente controladas. En el estudio realizado se utiliza un mtodo de HPLC precedido de una SPE que ha permitido el clean up y la concentracin de

las muestras, pudiendo determinarse concentraciones de OTA en vino a niveles de concentracin inferiores a 5 ug/L. La deteccin se ha realizado fluorimtricamente ( exc=330 nm, =470 nm). em Las muestras de vinos blancos, rosados y tintos han sido extradas directamente con un cartucho de octadecilsilano y concentradas, en una segunda etapa, bajo corriente de nitrgeno. En estas condiciones, la OTA, que se aade a los vinos a una dosis de concentracin de 3 ug/L, se concentra un mnimo de 100 veces. Se ha optimizado el mtodo de trabajo probando diferentes matrices y volmenes de muestra. Se ha comprobado la linealidad de la respuesta en el intervalo de concentracin habitual en los vinos y las recuperaciones han sido superiores al 80 % para todos los vinos analizados. El lmite de deteccin ha sido de 50 ug/L (S/N = 3). El mtodo optimizado es suficientemente rpido y su reproducibilidad aceptable al nivel de concentracin estudiado.

Departamento de Qumica Analtica y Qumica Orgnica, Unidad de Enologa (CeRTA), Facultad de Enologa de Tarragona, Universitat Rovira i Virgili, Tarragona (qaenol@fe.urv.es) Este trabajo ha sido financiado por la Comisin Interministerial de Ciencia y Tecnologa (CICYT, proyecto ALI97-0765)
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Cambios en la composicin de los vinos cencibel debidos a la fermentacin malolctica

M.C. Daz-Maroto Hidalgo, E. Garca Romero, I. Hermosn Gutirrez y M.D. Cabezudo Ibez

a fermentacin malolctica es un proceso bacteriano deseable y determinante en la definicin de las caractersticas sensoriales de los vinos, sobre todo de los tintos. Por ello es importante su conocimiento y control. Han sido estudiados 13 vinos tintos de la variedad cencibel, obtenidos en la planta piloto de la Universidad de Castilla-La Mancha (Ciudad Real). Terminada la fermentacin alcohlica, a seis de ellos se les adicion bacterias lcticas comerciales liofilizadas (Viniflora OENOS, Leuconostoc oenos DSM 7008), dejando los restantes como muestras de control. Adems de las determinaciones convencionales, se han analizado los compuestos voltiles mayoritarios y minoritarios por cromatografa de gases (CG), y los cidos orgnicos fijos y los antocianos por HPLC. Las concentraciones del cido lctico, el cido mlico y el lactato de etilo han sufrido

los cambios esperados. Adems, los cidos ctrico y fumrico han sido metabolizados por las bacterias lcticas utilizadas. La concentracin de acetaldehdo disminuye de forma drstica, pues interviene en la ruta metablica de las bacterias lcticas heterofermentativas, como es el caso de Leuconostoc oenos. Tambin disminuye la concentracin del piruvato de etilo, debido probablemente a las esterasas extracelulares que producen Leuconostoc oenos; adems, el piruvato formado puede entrar en distintas rutas metablicas citadas anteriormente, y favorecer de esta forma la reaccin. Por ltimo, se observa un aumento de los antocianos presentes en el vino, sobre todo de los derivados no acilados, cifrndose desde un 40 % para el 3-monoglucsido de malvidol, hasta un 128 % para el 3-monoglucsido de peonidol.

rea de Tecnologa de los Alimentos, Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad de Castilla-La Mancha, Ciudad Real
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Diferencias en la composicin de los vinos fermentados con cepas de Saccharomyces cerevisiae killer y killer curadas

D. Broceo Caminero, M.S. Prez Coello, E. Garca Romero y M.D. Cabezudo Ibez

e fermentaron alcuotas de un mismo mosto airn a 19 oC y de un mosto cencibel a 25 oC (obtenidos ambos a partir de las uvas a escala de planta piloto) con seis cepas de levaduras Saccharomyces cerevisie de distinta procedencia: con factor killer, tratadas con cicloheximida (killer curadas), killer sensibles y killer resistentes. La fermentacin se sigui mediante monitorizacin del dixido de carbono desprendido. A los vinos obtenidos se les realizaron los anlisis qumicos convencionales, los compuestos voltiles (mayoritarios y minoritarios) por cromatografa de gases (CG), y los cidos orgnicos por HPLC.

Las seis levaduras presentan curvas de fermentacin semejantes aunque con pequeas diferencias de velocidad y de consumo de compuestos nitrogenados. No obstante, todas ellas agotan en su totalidad la glucosa y la fructosa. Se encontraron diferencias en la produccin de acetatos y steres de cidos grasos por los distintos tipos de cepas as como en la produccin de cidos orgnicos. La maceracin de los hollejos en la vinificacin del mosto cencibel produce vinos con mayor concentracin de nitrgeno total, 1-hexanol, 2-feniletanol, glicerina, metanol y acetato de etilo que los vinos airn.

rea de Tecnologa de los Alimentos, Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad de Castilla-La Mancha, Ciudad Real
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cidos grasos libres y esterificados en mostos y vinos base para la elaboracin de cava

S. Francioli, M. Gallart, E. Lpez-Tamames y S. Buxaderas

os cidos grasos se encuentran en mostos y vinos tanto en forma libre como esterificada, mayoritariamente como steres de etilo. Ambas formas se han determinado utilizando un nico mtodo de cromatografa de gases (CG) y, en consecuencia, en el mismo cromatograma. Adems se han solventado los problemas habituales de este tipo de determinaciones (volatilidad variable, concentraciones dispares, interferencias de otros componentes, etc.). El mtodo se ha aplicado para el estudio de la evolucin de cidos grasos y sus steres durante la vinificacin de cuatro variedades de uva blanca (macabeo, xarello, parellada y chardonnay) empleadas en la elaboracin del cava. Para ello, durante tres vendimias consecutivas se han tomado muestras en cuatro puntos del proceso de obtencin, a escala industrial, de los vinos base monovarietales. Se ha comprobado que, debido a los or-

genes diversos de los cidos grasos (procedentes de la uva o fermentativos), el perfil de los mostos difiere del de los vinos, tanto por su naturaleza como por sus concentraciones. As, los steres de etilo son siempre minoritarios respecto a la cantidad de cidos grasos libres. La fraccin esterificada en los mostos es prcticamente inexistente y, en cambio, en los vinos puede representar hasta un 30 % del total. Por otra parte, en los mostos el 96 % (~ 7 ppm) de los cidos grasos son de cadena larga ( de 16 a 18 tomos de carbono), mientras que en los vinos el 95 % (~ 18 ppm) son de cadena corta (de 6, 8 y 10 tomos de carbono). En el caso de los vinos, se ha observado tambin que la distribucin porcentual de los cidos grasos de diferente longitud de la cadena carbonada es la misma para la fraccin libre y la esterificada. Asimismo, estos primeros datos de cidos grasos de vinos base monovarietales apuntan la posibilidad de caracterizaciones varietales.

Departamento de Nutricin y Bromatologa (CeRTA), Universidad de Barcelona, Barcelona

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Influencia del etanol y del cido decanoico sobre la actividad H+-ATPasa y la incorporacin de aminocidos por Saccharomyces cerevisiae

J. Fuguet, F. Fort, N. Ferrer, Ll. Arola y F. Zamora

as paradas de fermentacin alcohlica antes del completo consumo de los azcares fermentables son uno de los principales problemas de la enologa actual. Estas paradas de fermentacin comportan un alto de riesgo de desarrollo de bacterias lcticas heterofermentativas que pueden metabolizar las hexosas presentes en el medio e incrementar drsticamente la acidez voltil del vino. La bibliografa existente sobre las paradas de fermentacin seala que las altas concentraciones de etanol y la presencia de cidos grasos de cadena corta liberados por las propias levaduras, podran ser sus principales causas. El principal objetivo de este trabajo fue el de estudiar la influencia del etanol y del cido decanoico sobre algunos de los sistemas de transporte de nutrientes (actividad H+-ATPasa y captacin de aminocidos) a travs de la membrana plasmtica de Saccharomyces cerevisiae. La determinacin de la actividad H + ATPasa y de la velocidad de incorporacin de aminocidos fueron realizada en levaduras (Levuline CHP; GLO) durante la fase tumultuosa de la fermentacin (tercer da). Para la determinacin de la actividad H+ATPasa, las levaduras eran tratadas con liticasa con el propsito de obtener esferoblas-

tos, los cuales eran sometidos posteriormente a un choque osmtico. Tras la purificacin de las membrana se determin la actividad H+-ATPasa mediante la medida de la velocidad de hidrlisis del ATP y del flujo de protones a travs de la membrana plasmtica. La determinacin de la incorporacin de aminocidos fue realizada mediante la utilizacin de un anlogo estructural de los aminocidos no metabolizable, el cido 2-aminoisobutrico (2-AIB) marcado con carbono-14, el cual es transportado al interior de la clula mediante la permeasa general de aminocidos. Los resultados obtenidos muestran que el etanol provoca una fuerte inhibicin de la actividad H+-ATPasa y del flujo de protones a travs de la membrana, mientras que el cido decanoico produce un incremente de su actividad. La disminucin de la actividad H+-ATPasa provocada por la presencia de etanol indica que, a medida que transcurre la fermentacin alcohlica, las levaduras presentarn mayores dificultades para mantener el pH intracelular y, por tanto, todos los sistemas de transporte activo (symport con protones) estarn seriamente comprometidos. El incremento de la actividad H+-ATPasa inducido por la presencia de cido decanoico podra estar relacionada con la necesidad de mantener el pH

Departamento de Bioqumica y Biotecnologa (CeRTA), Facultad de Enologa de Tarragona, Universidad Rovira i Virgili, Tarragona (fzm@ee.urv.es) Este trabajo ha sido financiado por la CICYT (proyectos ALI-95-0887-C04-01 y ALI 98-0534)
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intracelular en condiciones que inducen su acidificacin. Por otra parte, tanto la presencia de etanol como de cido decanoico provocaron una clara inhibicin de la incorporacin de 2-AIB, lo que indicara que el transporte de los aminocidos, necesarios para la multiplica-

cin celular, estara seriamente afectado por estas condiciones. Todo ello indicara que realmente las altas concentraciones de etanol y la presencia de cidos grasos de cadena corta pueden realmente condicionar el correcto desarrollo de la fermentacin alcohlica.

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Optimizacin de un fermentador de laboratorio para la elaboracin de vinagre de vino

W. Tesfaye, M.L. Morales-Gmez, M.C. Garca-Parrilla y A.M. Troncoso

l objetivo del presente trabajo consiste combinacin, se evalu en funcin de la veloen aumentar el rendimiento y la velocicidad de acetificacin y el rendimiento. Se dad de acetificacin para obtener vinarealizaron arbitrariamente 14 experimentos y se calcularon la velocidad de acetificacin y el gres de vino con alto grado actico en menor rendimiento. Se propuso una ecuacin de retiempo. Para ello, se estudian las variables gresin lineal mltiple que se resuelve con el que intervienen en el proceso: concentracin programa estadstico CSS-Statistica. inicial de etanol, velocidad de agitacin, volumen de carga, proporcin de carga, velocidad de carga, Tabla 1 Representacin de las tres variables a dos niveles Factores Niveles temperatura y suministro de aire. Sin codificar Codif. Sin codificar Codif. El estudio se realiz con Agitacin (x1) 250 rpm -1 450 rpm +1 un fermentador a escala de 3400 mL -1 5000 mL +1 Volumen de carga (x2) -1 2:1 vino/vinagre +1 Proporcin de carga (x3) 1:1 vino/vinagre laboratorio de B. Braun Biotech S.A. con un volumen de 5 L de capacidad provisto de control de temResultados peratura, pH, presin parcial de oxgeno y veDel diseo experimental a dos niveles para locidad de agitacin. tres variables se obtuvieron los siguientes reDurante el proceso de acetificacin se sultados: la variable crtica para obtener un mantuvieron constantes los siguientes parmejor rendimiento es la proporcin de carga, metros: a) concentracin inicial de etanol, que y para conseguir una buena velocidad de o acetificacin la agitacin ha demostrado ser se fij a 10 en los casos en que los sustratos la variable ms importante. vnicos presentaran un grado alcohlico superior diluyendo con agua destilada; b) el suministro de aire se mantuvo entre 100-200 L/h Bibliografa (0,33-0,98 vvm), y c) la temperatura se reguCSS-Statistica: Complete Statistical System Statsoft, Inc.Tulsa OK 74104, 1991. l a 30 oC. Gonzlez A.G.: Two level factorial experimental Se han seleccionado tres variables: velocidesigns based on multiple linear regression models: dad de agitacin, volumen de carga y propora tutorial digest illustrated by case studies, Anal Chim Acta 1998; 360: 227-241. cin de carga observndose como afectan al Nieto J.: Algunos aspectos de la tecnologa de la ferproceso de acetificacin. Para ello se aplic mentacin actica. El vinagre de vino, Llaguo C., el diseo factorial a dos niveles (tabla 1). El Polo M.C. (eds.), Consejo Superior de Investigaciones cientficas, Madrid, 1991: 69-103. efecto de cada variable, as como la posible
Departamento de Nutricin y Bromatologa, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, Sevilla (wendu@fafar.us.es)
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Seguimiento e identificacin de bacterias lcticas y acticas mediante mtodos moleculares

C. Reguant, A. Ruiz, M. Poblet, N. Rozs, V. Garcia, M. Constant, J.M. Guillamn, A. Bordons y A. Mas

e han aislado e identificado cepas de bacterias lcticas y acticas despus de una fermentacin alcohlica en tinto de la variedad garnacha negra, correspondiente a la vendimia de 1998, en la finca experimental Mas dels Frares, en Constant, de la Facultad de Enologa de Tarragona. Con ello se pretenda, adems de la puesta a punto de los mtodos identificativos con DNA, verificar por un lado cules eran las bacterias lcticas responsables de la fermentacin malolctica en esta vinificacin y, por otro, cul era la posible proliferacin de bacterias acticas en estas condiciones, as como la identificacin de las mismas. La fermentacin alcohlica se llev a cabo en paralelo en dos depsitos de vinificacin y sin control de temperatura, uno de forma espontnea y otro inoculado con Saccharomyces cerevisiae (L1118). A continuacin, sin adicin de sulfuroso, se dej que se llevara a cabo la fermentacin malolctica espontneamente, siendo el contenido inicial en Lmlico de 2 g/L. Durante el transcurso de dicha fermentacin (10-20 das) se tomaron muestras para cuantificar y aislar los dos tipos de bacterias, lcticas en placas de MRS (suplementado con mlico y zumo de tomate), y acticas en placas con medio de Drysdale y Fleet (1985) modificado. Para cada uno de los dos tipos de bacterias y de cada

muestra, se tomaron unas 20 colonias aisladas para ser identificadas. Las bacterias lcticas han sido identificadas mediante extraccin de su DNA genmico, seguida de amplificacin con PCR mediante dos cebadores (oligonucletidos de 24 bases) complementarios de regiones especficas del gen del enzima malolctico de Oenococcus oeni, obtenindose en la electroforesis una banda de amplificado caracterstico de esta especie. Se ha observado un crecimiento ostensible de la poblacin de lcticas (hasta 108 por mL) solamente en el vino que haba sido previamente inoculado con levadura. Se ha comprobado que la gran mayora de aislamientos de bacterias lcticas de estas fermentaciones eran Oenococcus oeni. Para comprobar si la fermentacin malolctica fue llevada a cabo por una sola cepa o por varias, se est procediendo en la actualidad a la identificacin a nivel de cepas, mediante amplificacin con PCR de regiones inespecficas (RAPD) con diversos cebadores aleatorios de 10 nucletidos. Las bacterias acticas han sido identificadas tambin a nivel de especie, de entre los diversos Acetobacter, Gluconoacetobacter y Gluconobacter, mediante extraccin de su DNA genmico, seguida de amplificacin con PCR mediante cebadores complementarios de regiones especficas del fragmento 16S

Unidad de Enologa, Centro de Referencia de Tecnologa de Alimentos, Departamento de Bioqumica y Biotecnologa, Universidad Rovira i Virgili, Tarragona
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del rDNA, con tratamiento posterior con enzimas de restriccin. Con ello se han obtenido unos perfiles RFLP de amplificados, caractersticos de las diferentes especies de bacterias acticas. Se ha observado que la poblacin de acticas aumenta considerablemente durante la fermentacin malolctica para caer al final de sta. Al principio de la

misma la poblacin de acticas tiene especies representantes de los tres gneros. En cambio, durante la fermentacin malolctica y al final de sta, la especie mayoritaria y casi nica ha sido Acetobacter aceti, con colonias espordicas de Acetobacter pasteurianus y Gluconobacter oxydans.

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Efecto de la proteasa de Oenococcus oeni sobre las protenas de vinos blancos y tintos

M.C. Manca de Nadra,* V. Moreno-Arribas,** E. Pueyo,** M.E. Faras* y M.C. Polo**

as protenas del vino proceden en su mayora de la uva. Se eliminan en parte de una forma espontnea durante la elaboracin por insolubilizarse a medida que avanza la fermentacin y aumenta el grado alcohlico y por formar complejos con los compuestos fenlicos, especialmente en el caso de los vinos tintos. Aunque estn normalmente en el vino en concentraciones muy pequeas, generalmente del orden de varios mg/L, pueden ocasionar turbidez en los vinos. Tambin se ha descrito que forman parte de los inhibidores de la precipitacin tartrica (Correa-Gorospe et al., 1991) dificultando la eliminacin del bitartrato potsico del vino, por lo que es necesario eliminarlas. Las enzimas que existen en el mercado no actan sobre estas protenas, sin que conozcamos totalmente las causas. Waters et al. (1996) atribuyen la causa de dicha resistencia al hecho de ser protenas de resistencia a patgenos de la planta, con secuencias homlogas a taumatina y quitinasa. Rolln et al. (1993 y 1995) han aislado cepas de Leuconostoc oenos ( Oenococcus oen ) que producen dos proteasas extracelulares. Esta actividad tiene un gran inters en vinificacin no slo por el hecho antes mencionado, sino porque la fermentacin malolctica se produce generalmente despus de la fermentacin alcohlica, cuando el vino es

deficiente en compuestos nitrogenados. La actuacin de estos enzimas puede aportar al vino los aminocidos necesarios para el crecimiento de las bacterias lcticas. El objetivo del trabajo es conocer el efecto de la actividad protesica de la cepa Oenococccus oeni X2L sobre las protenas de vinos blancos y tintos. Los ensayos se han realizado con los sobrenadantes de un cultivo libre de clulas como solucin del enzima, y las protenas obtenidas por dilisis y posterior liofilizacin de los vinos, como sustratos. Se han realizado ensayos comparativos antes y despus de la accin de la proteasa comprobndose la liberacin de aminocidos y de pptidos por HPLC. Adems, se ha realizado la identificacin parcial de algunos de los pptidos liberados, mediante el anlisis espectral. Los primeros resultados de este estudio ya han sido publicados (Manca de Nadra et al., 1997 y 1999).

Bibliografa
Correa-Gorospe et al.: Food Chem 1991; 41: 135-146. Manca de Nadra et al.: FEMS Microbiol. Letters 1997; 150: 135-139 . Manca de Nadra et al.: FEMS Microbiol Letters 1999 (en prensa). Rolln et al.: World J Microbiol Biotechnol 1993; 9: 587-589. Rolln et al.: World J Microbiol Biotechnol 1995; 11: 153-155. Waters et al.: J Agric Food Chem 1996; 44: 3-5.

* Facultad de Bioqumica, Qumica y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumn y Centro de Referencias para Lactobacilos (CERELA), Tucumn, Argentina ** Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC, Madrid
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Ecologa de la fermentacin alcohlica espontnea durante varios aos consecutivos. Influencia en la cintica fermentativa

P. Santamara, A.R. Gutirrez A.R.,* Epifanio, R. Lpez y P. Garijo

a fermentacin alcohlica espontnea del mosto de uva es un proceso llevado a cabo por la accin de levaduras pertenecientes a diferentes gneros y especies. Las levaduras de bajo poder fermentativo crecen durante las etapas iniciales de las fermentaciones; cuando la concentracin de etanol se incrementa, las levaduras ms tolerantes a este compuesto pertenecientes al genero Saccharomyces completan la fermentacin. Dentro del gnero Saccharomyces existe una gran diversidad gentica. Para estudiar esta diversidad se han utilizado diversas tcnicas de biologa molecular. En los ltimos aos se han llevado a cabo gran cantidad de trabajos encaminados a estudiar si la fermentacin alcohlica espontnea se lleva a cabo por un nmero alto o bajo de clones distintos de Saccharomyces y si estos clones se mantienen en el ecosistema de la bodega de un ao a otro. En el presente trabajo se ha estudiado la ecologa de la fermentacin alcohlica espontnea en la bodega experimental del CIDA durante cinco aos consecutivos (vendimias 1994-1998). Para ello se han tomado muestras de 42 depsitos de elaboracin de vinos blancos. Los aislamientos de levaduras se realizaron en tres etapas: mosto, fermentacin tumultuosa y fin de fermentacin. La identificacin de los aislados se realiz utili-

zando el anlisis de restriccin del DNA mitocondrial. El anlisis de restriccin del DNA mitocondrial de los aislados procedentes de los mostos mostr la ausencia de levaduras pertenecientes al gnero Saccharomyces en esta etapa. Por el contrario, todas las colonias de las etapas fermentativas pertenecan a este gnero, salvo algunos aislados obtenidos en 1997. Los patrones de restriccin del DNA mitocondrial de los 840 aislados estudiados revelaron 73 perfiles diferentes, que corresponden a diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae. El nmero de cepas diferentes detectadas para cada ao y su frecuencia de aparicin varan en funcin de la campaa estudiada. Al comparar los patrones obtenidos en los cinco aos se observ que algunos de ellos estaban presentes en aos consecutivos, pero su presencia vara notablemente de un ao a otro. Estos resultados nos llevan a pensar sobre la existencia de un conjunto de clones propios del ecosistema de cada bodega, cuya participacin en la fermentacin viene determinada por su capacidad de adaptacin a las condiciones en que se llevan a cabo las vinificaciones (caractersticas del mosto en cada campaa, tecnologa empleada en las elaboraciones, etc.).

Centro de Investigacin y Desarrollo Agrario de La Rioja (CIDA) * Universidad de La Rioja, Logroo

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En los cinco aos del estudio, cuatro tuvieron fermentaciones normales; la excepcin fue la campaa de 1997. Este ao fue problemtico en varias regiones vitivincolas espaolas, donde se detectaron numerosas paradas de fermentacin. En todos los depsitos sometidos a muestra este ao los vinos quedaron dulces y con una acidez voltil muy elevada. Esta inusual situacin tambin se reflej en los datos microbiolgicos obteni-

dos; la poblacin de bacterias acticas en el mosto de partida fue muy superior al resto de los aos y adems levaduras no Saccharomyces fueron las cepas dominantes durante la fermentacin tumultuosa con una presencia del 50 %. As, en este caso concreto, el desequilibrio en la poblacin microbiolgica inicial y la falta de cepas del genero Saccharomyces explicaran las disfunciones detectadas en estas fermentaciones.

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Aislamiento e identificacin por mtodos moleculares de la poblacin levaduriforme presente en mostos

B. Esteve-Zarzoso, *,** F. Uruburu* y A. Querol**

a transformacin del mosto de uva en vino es el resultado de la accin sucesiva de diferentes especies de microorganismos, en la que las levaduras juegan un papel primordial, predominando al final de la fermentacin cepas de la especie Saccharomyces cerevisiae. Durante los primeros estadios de la fermentacin se aslan otras especies de levaduras que pueden aportar caractersticas organolpticas deseables a los vinos, estas especies que nosotros denominamos no Saccharomyces, se aslan principalmente de fermentaciones espontneas, siendo difcilmente aisladas de fermentaciones inoculadas. Los mtodos de identificacin basados en la asimilacin y fermentacin de distintos compuestos carbonados y nitrogenados permiten actualmente una identificacin lenta de las especies de levaduras, adems de dar un resultado no muy fiable. Sin embargo, la metodologa descrita por Esteve-Zarzoso et al. (1999) para identificar especies de levaduras permite una rpida y fiable identificacin de las mismas. Esta tcnica consiste en la amplificacin por PCR y restriccin de la regin ribosomal ITS-5,8S. Utilizando esta metodologa se han podido identificar la mayor parte

de las 2591 colonias de levaduras que se aislaron durante la vendimia de 1997 en las bodegas Gonzalez-Byass de Jerez de la Frontera (Cdiz). Los aislamientos se realizaron tanto de fermentaciones espontneas como inoculadas, y en dos medios de cultivo diferentes. Uno de los medios utilizados es el agar lisina, descrito para aislar especies de levaduras no Saccharomyces, y el otro medio de aislamiento fue agar YPD, como medio general de aislamiento de levaduras. De esta forma se pudo observar la presencia de una gran variedad de especies de levaduras durante las primeras fases de la fermentacin, como especies pertenecientes a los gneros Candida, Hanseniaspora, Issatchenkia, Zygosaccharomyces, entre otros. Dichas especies fueron reemplazadas por cepas de la especie Saccharomyces cerevisiae en el transcurso de la fermentacin, dominando al final de la misma. Cabe destacar que mediante esta tecnologa se han aislado e identificado cepas de levaduras de las especies Candida albicans, C. sorbosa, Kluyveromyces polysporus, Yarrowia lipolytica y Zygoascus hellenicus que nunca se haba descrito su aislamiento de este ambiente.

* Coleccin Espaola de Cultivos Tipo, Edificio de Investigacin Jeroni Muoz, Universidad de Valencia, Burjassot, Valencia ** Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos, CSIC, Burjassot, Valencia (braulio@iata.csic.es)
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Sistemas moleculares de identificacin y tipificacin de Lactobacillus heterofermentativos presentes en el vino

G. Lluesma, A. Rodas, I. Pardo y S. Ferrer

actobacillus es uno de los gneros de bacterias lcticas que pueden desarrollarse durante el proceso de elaboracin del vino. Dentro de dicho gnero existen especies homofermentativas, heterofermentativas facultativas y heterofermentativas obligadas. En algunos casos, Lactobacillus puede alterar las caractersticas organolpticas de los vinos, de ah la importancia de detectar la presencia de estas bacterias de una forma rpida y fiable con la finalidad de tomar medidas para evitar sus efectos perjudiciales. Los objetivos de este trabajo son: 1) desarrollar sistemas moleculares de identificacin y tipificacin de las especies de Lactobacillus presentes en el vino; 2) comparar estas tcnicas y seleccionar la ms adecuada para tales fines; 3) utilizar estas tcnicas para llevar a cabo el seguimiento de poblaciones naturales en vinificaciones. Las tcnicas inicialmente elegidas para cumplir estos objetivos han sido RAPDS, anlisis de fragmentos de macrorrestriccin mediante electroforesis en campo pulsante (RFLP-PFGE) y desarrollo de cebadores especficos. Durante la vendimia de 1997-1998 se aislaron 181 cepas de Lactobacillus a partir de vinos y mostos procedentes de diferentes

bodegas de las denominaciones de origen Utiel-Requena y Jumilla. De ellas, 91 pertenecan a especies heterofermentativas obligadas, de las cuales se identificaron 43 como Lactobacillus hilgardii, 12 como Lactobacillus buchneri y 36 como Lactobacillus brevis, siguiendo los criterios del libro The Prokaryotes (vol. II, 2 ed.). Tras poner a punto la tcnica de extraccin de DNA en discos de agarosa, se llev a cabo el anlisis de estas cepas mediante RFLP-PFGE con el enzima SfiI, y el anlisis de bandas generadas por RAPDS utilizando para ello el cebador 17R. Los resultados obtenidos muestran en general una buena correlacin con la identificacin fenotpica de las tres especies. Sin embargo, se ha observado con ambas tcnicas que las cepas identificadas fenotpicamente como L. brevis muestran tres grupos diferentes de patrones de macrorrestriccin y RAPDS. En algn caso estos perfiles son muy parecidos a los que presentan cepas identificadas como L. hilgardii. Esto muestra que existe cierta confusin entre ambas especies, por lo que es necesario profundizar mediante otras tcnicas moleculares para la correcta separacin de ambas.

Departamento de Microbiologa, Facultad de Biologa, Universidad de Valencia, Burssajot, Valencia (Gloria.Lluesma@uv.es) Este trabajo ha sido financiado por la CIYT (proyecto ALI97-1077-C02-01)
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Sistemas moleculares de identificacin y tipificacin de Pediococcus del vino

A. Rodas, G. Lluesma, I. Pardo y S. Ferrer

ediococcus es uno de los gneros de bacterias lcticas que puede desarrollarse durante la elaboracin del vino. El gnero Pediococcus incluye diferentes especies, pero en el vino fundamentalmente se presentan Pediococcus parvulus y Pediococcus pentosaceus. La presencia de Pediococcus puede ser potencialmente peligrosa para la industria enolgica al producir alteraciones en el sabor (produccin de elevadas cantidades de diacetilo) y en la viscosidad (produccin de polisacridos). Por lo tanto, es necesario disponer de tcnicas de identificacin rpida que permitan detectar su presencia en vino con el fin de poner medidas para evitar sus efectos perjudiciales en el mismo. Los objetivos de este trabajo son analizar la capacidad de distintas tcnicas moleculares para identificar y tipificar las especies de Pediococcus presentes en el vino. Las tcnicas seleccionadas son RAPDS, oligonucletidos especficos del rDNA 16S y macrorrestriccin mediante electroforesis de campo pulsante (RFLP-PFGE). Una vez seleccionadas aquellas metodologas ms adecuadas se realizarn estudios ecolgicos sobre la presencia y evolucin de los Pediococcus durante la vinificacin. En este trabajo se aislaron 114 cepas de Pediococcus a partir de 32 muestras recolec-

tadas de mostos y vino durante la vendimia 1997-1998. Las muestras fueron tomadas en distintas bodegas de las denominaciones de origen Utiel-Requena y Jumilla. Dichas cepas se identificaron segn los criterios expuestos en el Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (9 ed.) y el Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (9 ed.), utilizando como controles las cepas tipo de las siguientes especies de Pediococcus previamente descritas en el vino: P. acidilactici (CECT 98), P. parvulus (CECT 813), P. damnosus (DSM 20331), P. inopinatus (DSM 20285) y P. pentosaceus (CECT 923). El resultado de la identificacin fenotpica a nivel de especie de los 114 Pediococcus mostr que tres cepas presentaban el perfil fenotpico de P. pentosaceus y 111 cepas presentaban el perfil fenotpico de P. parvulus. Para llevar a cabo la identificacin y tipificacin molecular se puso a punto la extraccin de DNA en bloque de agarosa, consiguiendo minimizar el tiempo de lisis celular y obtener un elevado rendimiento de DNA de gran pureza. Tras analizar varios oligonucletidos hemos seleccionado uno de ellos, denominado 16R, como ms adecuado para la identificacin a nivel de especie. Se ha realizado tipificacin intraespecfica mediante RAPDS con el oligonucletido 17R y RFLP-

Departamento de Microbiologa, Facultad de Biologa, Universidad de Valencia, Burjasssot, Valencia (Ana.M.Rodas@uv.es) Este trabajo ha sido financiado por la CICYT (proyecto ALI97-1077-C02-01)
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PFGE con los enzimas Sfi I, Not I y Sma I. Debido a los tamaos de fragmentos generados por dichos enzimas, se requiri la puesta a punto de las condiciones adecuadas de electroforesis en campo pulsante. Tras el anlisis de estos fragmentos hemos observa-

do que el enzima Sfi I es ms discriminativo que los otros dos enzimas. En la actualidad estamos trabajando en el diseo de cebadores especficos para la deteccin directa de las especies presentes en el vino.

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Anlisis estadstico del efecto del desfangado sobre la cintica fermentativa de mostos blancos

F. Varela, F. Caldern, M.C. Gonzlez, B. Colomo y J.A. Surez Lepe

a elaboracin de vinos blancos de calidad ha de realizarse a partir de un mosto limpio, un mosto que haya sufrido el proceso de desfangado, tratamiento que consiste en provocar una clarificacin del mosto antes de la fermentacin, con el fin de eliminar las partculas susceptibles de comunicar aromas desagradables al vino. El efecto favorable del desfangado es puesto en evidencia por la superioridad organolptica de los vinos obtenidos a partir de mostos desfangados, principalmente en el carcter aromtico; adems, los vinos obtenidos a partir de mostos desfangados son ms estables, sobre todo frente a fenmenos oxidativos. Frente a estos efectos positivos del desfangado, los mostos sometidos a este tratamiento sufren ciertos problemas relacionados con el proceso fermentativo, como son los arranques tardos, las ralentizaciones de la fermentacin o las paradas de sta. Estos problemas se atribuyen al empobrecimiento qumico y microbiolgico causado por el desfangado. El trabajo que se presenta evala el efecto de diez tcnicas de desfangado, estticas y dinmicas sobre la poblacin de levaduras, la composicin en cidos grasos y la cintica fermentativa de los mostos obtenidos. Se observa cmo los mostos tratados mediante fro son ms limpios que los desfan-

gados a temperatura ambiente, no se observan diferencias, en relacin a la turbidez, de los mostos desfangados en fro y los obtenidos mediante tratamientos dinmicos, aunque estos ltimos presentan la ventaja de realizarse en pocas horas frente a la 48 necesarias para los desfangados estticos. El desfangado reduce la poblacin de levaduras presente en los mostos, los tratamientos enzimticos y dinmicos son los que mayor influencia ejercen sobre la poblacin de levaduras. En relacin a las concentraciones de cidos grasos los resultados indican que las burbas son ms ricas que los mostos; el desfangado produce un descenso en la composicin de cidos grasos del mosto en todos los tratamientos, el desfangado mediante flotacin es el que mayor prdida de cidos grasos induce. El cido graso que se encuentra en mayor concentracin es el cido oleico, de los cidos grasos saturados el palmtico es el principal. El tratamiento de desfangado provoca un aumento en la duracin de la fermentacin, las fermentaciones ms largas para los tratamientos dinmicos, intermedias para los desfangados en fro y cortas para el desfangado a temperatura ambiente. En relacin al anlisis estadstico de componentes principales se observan altas corre-

Departamento de Tecnologa de Alimentos, Escuela Tcnica Superior de Ingenieros Agrnomos, Universidad Politcnica de Madrid, Madrid (varela@tca.etsia.upm.es)
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laciones entre limpidez con poblacin de levaduras, turbidez con cidos grasos y poblacin de levaduras con cidos grasos. Se observa cmo la duracin de la fermentacin es ms larga cuando la clarificacin del mosto es ms efectiva, esto es, cuando la turbidez es ms baja. Tambin se observa cmo los diferentes mostos aparecen agrupados en diferentes

clusters segn el tratamiento de desfangado a que ha sido sometido el mosto, as los tratamientos dinmicos forman un cluster, los enzimticos otro grupo, mientras que el desfangado a temperatura ambiente se comporta de forma intermedia entre el mosto no desfangado y los mostos desfangados mediante fro.

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Participacin de los hongos filamentosos en el gusto a corcho: biosntesis y degradacin de compuestos organoclorados in vitro

E. Navascus, F. Caldern, B. Colomo, J.A. Surez y C. Garca Vallejo*

a alteracin sensorial de vinos conocida como gusto a corcho o gusto a tapn se debe a derivados organoclorados de la familia de los cloroanisoles, particularmente al 2,4,6 tricloroanisol (TCA) (Buser et al ., 1982; Amon et al., 1989; Duncan, 1995). Estos compuestos producen, en concentraciones pequeas (del orden de ng/L), sensaciones olfativas muy marcadas, generalmente englobadas dentro del trmino mohoso, terroso o relacionados (humedad, cueva, pozo). El problema parece derivar de la presencia de fenoles clorados, que son transformados en cloroanisoles mucho ms voltiles y odorferos por ciertas especies de hongos filamentosos (Curtis et al. 1975; Tindale et al, 1989). En este estudio se indujo la biosntesis de 2,4,6-tricloroanisol (TCA), 2,3,4,6 tetracloroanisol (TeCA) y pentacloroanisol (PCA) a partir de los clorofenoles 2,4,6-triclorofenol (TCF), 2,4,6 tetraclorofenol (TeCF) y pentaclorofenol (PCF) en sistemas modelo in vitro por especies de Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Trichoderma, Rhizopus y Monilia, aislados de vinos y tapones correspondientes, afectados por gusto a corcho. Se pretendi la bsqueda de aquella especie o especies

que participan directamente en la produccin de la anomala sensorial, observando que todas ellas lo hacen en mayor o menor medida. Existen diferencias cuantitativas en funcin de la especie, siendo Penicillium purpurogenum, especialmente activo. Se detectan igualmente diferencias intraespecficas, relacionadas con el grado de alteracin de los vinos y corchos de partida, as como de la situacin del hongo en el cuerpo del tapn de corcho. En cualquier caso, las pautas de degradacin de clorofenoles y sntesis de cloroanisoles a lo largo del tiempo son comunes para todas las especies. Por ltimo se demuestra que la biosntesis de cloroanisoles por hongos filamentosos puede llevarse a cabo a partir de otros sustratos clorados distintos de los clorofenoles, como son ciertos detergentes de uso comn en bodega y fitosanitarios (lindano) que presentan cloro en su composicin. La formacin de cloroanisoles se interpreta como la respuesta del hongo frente a un metabolito txico como el cloro. El hecho de que la presencia de corcho en los sistemas de cultivo potencie la biosntesis de organoclorados parece deberse a la cesin de su estructura aromtica, en la que quedan englobadas las molculas de cloro.

Departamento de Tecnologa de Alimentos, Escuela Tcnica Superior de Ingenieros Agrnomos, Universidad Politcnica de Madrid, Madrid * Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias, Madrid
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Vas metablicas de utilizacin de arginina por bacterias lcticas. Produccin de aminas

M.E. Arena y M.C. Manca de Nadra

rginina es uno de los aminocidos que se encuentra en mayor proporcin en vinos y jugos de frutas, y puede ser degradado por bacterias lcticas. El conocimiento de las vas metablicas para su utilizacin es de especial inters, principalmente en lo referente a la produccin de aminas. Las bacterias lcticas juegan un papel fundamental en la elaboracin de alimentos fermentados y las aminas bigenas pueden ser agentes causales de intoxicaciones alimentarias. En cepas de Lactobacillus plantarum aisladas de jugo de naranja y en cepas de Oenococcus oeni, Pediococcus pentosaceus y Lactobacillus hilgardii, aisladas de vinos, investigamos el o los caminos que utilizan para catabolizar arginina: sistema arginina dihidrolasa (ADI), sistema arginasa-ureasa y/o arginina descarboxilasa. En ninguno de los microorganismos se detect el sistema arginasa-ureasa. Con respecto al sistema ADI, dos cepas de Lb plantarum, N4 y N8, producen los metabolitos intermedios de este camino, citrulina y ornitina en concentraciones dependientes de la cepa. De los gneros de bacterias lcticas de inters enolgico, en Lactobacillus hilgardii se evidenci la degradacin de arginina a CO2, NH3 y ornitina, detectndose citrulina como compuesto intermedio. Pediococcus pentosaceus y una cepa de Oenococcus oeni no tie-

nen capacidad para degradar arginina. Sin embargo, otra cepa de Oenococcus oeni tiene informacin para utilizar citrulina, dando como productos ornitina CO2 y NH3. Como el sistema ADI es un camino que conduce a la sntesis de ATP, las bacterias que lo poseen tienen ventajas para desarrollar en medios nutricionalmente pobres. Esta capacidad es de especial importancia en medio vino con microflora lctica mixta. Al compartir el mismo nicho ecolgico se producen interacciones y de las potencialidades de cada uno de ellos depender la simbiosis positiva o negativa establecida. Por la capacidad decarboxilante sobre los aminocidos arginina y ornitina, demostramos que arginina conduce a la sntesis de agmatina y ornitina a la de putrescina. Agmatina puede ser enzimticamente convertida en putrescina. Lactobacillus plantarum N8 produce ambas aminas bigenas a partir de ornitina. La cepa N4 slo produce putrescina, pero en mayor cantidad. Lactobacillus hilgardii produce agmatina a partir de arginina y ornitina. Los resultados hasta el presente indican que se debe conocer la actividad metablica de los microorganismos respecto a la utilizacin de arginina, en los ambientes naturales en los cuales desarrollan, para predecir la posibilidad de sntesis de compuestos txicos para el hombre y actuar en consecuencia.

Universidad Nacional de Tucumn y CERELA, Tucumn, Argentina (mcmanca@unt.edu.ar)

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Oenococcus oeni: degradacin de protenas

M.E. Faras y M.C. Manca de Nadra

urante el proceso de vinificacin, los microorganismos que intervienen en la desacidificacin de los vinos estn sujetos a condiciones ambientales desfavorables. Una cepa de Oenococcus oeni aislada de vino argentino tiene elevado potencial malolctico y demostramos, por primera vez, que posee un sistema proteoltico que se expresa en diferentes condiciones de cultivo. Las proteasas liberan aminocidos esenciales para el crecimiento de los microorganismos y pueden jugar un importante papel al degradar las protenas, evitando su precipitacin. Ambas propiedades son beneficiosas durante la elaboracin de los vinos. El sistema est integrado por dos actividades exoprotesicas, expresadas en los momentos de mayor estrs para el crecimiento bacteriano: inicio y final de fase exponencial. Los enzimas tienen diferentes ptimos de pH y temperatura, para la produccin y actividad. Son inhibidas completamente por cistena y beta-mercaptoetanol y parcialmente por ditiotreitol, indicando que uniones disulfuro estn implicadas en sus actividades. EDTA y omega-fenantrolina, inhibidores de metaloproteasas; iodoacetamida y p-hidroximercuribenzoato, reactivos covalentes de grupos sulfhidrilos, no afectan las actividades enzimticas sugiriendo que un ion metal no es requerido y que grupos sulfhidrilos no estn involucrados en el sitio activo. PMSF (fenilmetilsulfonilfluo-

ruro), inhibidor de serina proteasa, no afecta al enzima. El enzima producido al final de la fase de crecimiento exponencial es inhibido por Ca2+ y estimulado por Mg2+. La actividad proteoltica en clulas enteras se detecta solamente en presencia de Ca 2+, indicando que este catin podra mantener unida la proteasa a la clula. El cido mlico, en un rango de concentracin de 2 a 4 g/L estimula la sntesis de las proteasas y a concentraciones superiores las inhibe. El cido ctrico (0,1 a 0,5 g/L), estimula la produccin de ambos enzimas. Clulas no proliferantes de Oenococcus oeni, en condiciones de estrs nutricional y energtico, producen una proteasa extracelular despus de 2 horas de incubacin a 30 oC. A su vez, SO2 (60 mg/L) + etanol (8 %) estimulan su produccin. Purificada a homogeneidad, el enzima nativo tiene un peso molecular aproximado de 33,5 kDa. La protena est formada por dos subunidades idnticas de 17 kDa.

Bibliografa
Rolln G.C, Faras M.E., Manca de Nadra M.C.: World J Microbiol Biotechnol 1993; 9: 587-589. Rolln G.C, Faras M.E., Manca de Nadra M.C.: World J Microbiol Biotechnol 1995; 11: 153-155. Faras M.E., Rolln G.C., Manca de Nadra M.C.: J Appl Bacteriol 1996; 81: 398-402. Rolln G.C., Faras M.E., Strasser de Saad A.M., Manca de Nadra M.C.: J Appl Bacteriol 1998; 85: 219223. Faras M.E., Manca de Nadra M.C.: Microbiol Alim Nutr 1998; 16: 101-105.

Universidad Nacional de Tucumn y CERELA, Tucumn, Argentina (mcmanca@unt.edu.ar)

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Influencia de la contaminacin por Botrytis cinerea en la calidad de vinos para la elaboracin de cava

M. Quintana, S. Francioli, C. Andrs, E. Lpez-Tamames, S. Buxaderas y M.C. de la Torre

e ha estudiado la calidad de vinos destinados a la elaboracin de cava cuya uva presentaba una infestacin espontnea por Botrytis cinerea. Para ello, se han considerado distintos tipos de vinos de la variedad xarello procedentes de uva afectada, en mayor o menor medida, por el hongo. El grado de infestacin se ha establecido de forma visual por la observacin del porcentaje de superficie daada, estipulndose diferentes lotes de uva que se han vinificado paralelamente a escala industrial (control, botritico 15 % y muy botrtico > 35 %). En los mostos y vinos se han determinado parmetros generales y especficos de Botry-

tis, as como aromas y potencial espumante como parmetros de calidad. Los resultados ponen de manifiesto que a medida que aumenta el grado de infestacin de la uva, en los vinos hay una prdida de potencial espumante y aparecen compuestos de oxidacin, lo que evidencia el metabolismo oxidativo del hongo y la consecuente prdida de calidad. Asimismo, estos primeros datos de mostos y vinos resultantes de uva con distintos niveles de contaminacin botrtica apuntan la posibilidad de controlar vinos procedentes de uva infestada mediante la determinacin del cido glucnico, el glicerol y el benzaldehdo.

Departamento de Nutricin y Bromatologa (CeRTA), Universidad de Barcelona, Barcelona

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Anlisis global del conocimiento actual del vino de cava

M.C. Polo, E. Pueyo, V. Moreno-Arribas, A. Martnez-Rodrguez y M.A. del Pozo

e acuerdo con la legislacin espaola actual, se denominan cavas a los vinos espumosos de calidad producidos por fermentacin en botella segn el mtodo tradicional, en una regin determinada. Para optar a la denominacin cava, el vino debe estar en contacto con las levaduras de la segunda fermentacin un mnimo de nueve meses. La legislacin determina adems que las variedades de uva autorizadas para la obtencin de vinos destinados a la elaboracin de cavas son: macabeo, xarello, parellada, subirat (malvasa riojana) y chardonnay, como variedades de uva blanca, y garnacha tinta y monastrell, como variedades de uva

tinta. Para le elaboracin de rosados estn admitidas las variedades pinot noir y trepat. En este trabajo se revisan las investigaciones que se han llevado a cabo sobre los mostos y los vinos base de las variedades autorizadas para la elaboracin del cava, sobre los vinos de cava y sobre los cambios que se producen durante la segunda fermentacin y el envejecimiento con las levaduras, extrayendo las conclusiones de estos trabajos. Los temas se abordan por grupos de compuestos. Tambin se dedica atencin a los estudios que se han realizado sobre los aspectos microbiolgicos de la elaboracin del cava.

Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC, Madrid (mcpolo@ifi.csic.es)

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Estudio de las actividades enzimticas con inters enolgico en levaduras no Saccharomyces

M. Fernndez, J. beda y A. Briones

e estudiaron las actividades enzimticas de inters en enologa de 182 levaduras no Saccharomyces aisladas de mostos antes de empezar la fermentacin y de mostos al inicio de la misma, en bodegas acogidas a la DO La Mancha. Para conocer si cada uno de los 182 aislados mostraba las actividades proteoltica, poligalacturonsica y beta-glucosidsica, se realizaron ensayos en placa con los sustratos diferenciales adecuados para cada caso (casena y gelatina, cido poligalacturnico y arbutina). Con objeto de que los resultados de las actividades enzimticas se pudieran comparar entre las levaduras a estudiar, los sustratos se inocularon con el mismo nmero de clulas. Se encontr que casi el 80 % de las levaduras espontneas posean algn enzima de inters biotecnolgico. Una vez conocidas las actividades enzimticas de los aislados, se caracterizaron genticamente 69 de ellos, que posean alguna actividad de forma pronunciada y 11 sin ninguna escogidos al azar, mediante PCR/ RFLP, para ello se les extrajo el DNA, se amplific la regin ITS y se someti a restriccin con el enzima Hinf I, obtenindose 13 perfiles moleculares diferentes.

Los aislados pertenecientes a cada perfil se identificaron mediante las galeras API ATB32C y otras pruebas de taxonoma clsica recomendadas por el manual de Barnett et al. (1990) para levaduras vnicas. El enzima beta-glucosidasa estuvo muy relacionado con la especie Metschnikowia pulcherrima, mientras que la actividad poligalacturonsica fue frecuente en la mayora de las especies identificadas. La actividad proteoltica se observ en Pichia membranaefaciens y en Metschnikowia pulcherrima. Todos los perfiles genticos posean aislados con alguna de las actividades estudiadas, excepto Debaryomyces hansenii. La caracterizacin gentica mostr que puede haber diferenciacin intraespecfica en Pichia membranaefaciens, porque para la misma especie se obtuvieron seis perfiles moleculares distintos con alguna banda de restriccin en comn. El polimorfismo obtenido mediante PCR/ RFLP manifest gran coincidencia con las caractersticas fenotpicas y permiti nombrar correctamente aquellas especies en las que hubo discrepancia por los mtodos clsicos.

Departamento de Qumica Analtica y Tecnologa de Alimentos, Universidad de Castilla-La Mancha, Ciudad Real
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Desarrollo de marcadores moleculares en cepas de Saccharomyces cerevisiae basados en microsatlites

I. Martnez, F.J. Gallego,* M.A. Prez y P. Hidalgo

a caracterizacin e identificacin rpida, precisa y poco laboriosa de cepas de Saccharomyces cerevisiae, especie de notable importancia en el proceso de vinificacin, constituye en la actualidad un aspecto relevante cada vez ms demandado por investigadores del campo enolgico y profesionales del moderno sector vitivincola. Con este fin, en los ltimos aos se han desarrollado diversos mtodos entre los que se encuentran los fundamentados en el anlisis del polimorfismo del DNA celular, como el anlisis de restriccin del DNA genmico y mitocondrial (RFLP), cariotipos moleculares por electroforesis en campo pulsante y huella gentica del DNA. La aplicacin de modernas tcnicas de biologa molecular basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para la tipificacin de levaduras vnicas han representado un gran avance en relacin con las utilizadas previamente. En el presente trabajo de desarrolla un nuevo mtodo rpido, sencillo y fiable para ob-

tener perfiles genticos de cepas de S. cerevisiae. ste incluye la localizacin de secuencias repetidas en la base de datos del DNA genmico de S. cerevisiae, la bsqueda de cebadores para amplificar mediante PCR alguna de esas secuencias, la amplificacin con los primeros elegidos y el anlisis de la variabilidad obtenida en las cepas. Concretamente, la utilizacin del microsatlite SCTAT1 localizado en el cromosoma XIII ha servido como marcador molecular para caracterizar y diferenciar nueve cepas de S. cerevisiae en estudio. En ellas se han observado cinco genotipos homocigotos con un solo tamao de alelo y cuatro heterocigotos con dos alelos de distinto tamao. El nmero de secuencias TAT repetidas se situ entre 18 y 45. Consecuentemente, la utilizacin de microsatlites amplificados mediante PCR constituye una potente herramienta para analizar el genoma de las levaduras de esta especie.

Instituto Madrileo de Investigacin Agraria y Alimentaria, Alcal de Henares, Madrid * Departamento de Mejora Gentica y Biotecnologa, CIT-INIA, Madrid.
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Separacin y cuantificacin por HPLC de lpidos liberados durante la autlisis de levaduras vnicas

A. Martnez-Rodrguez, B. Bartolom, G. Santa-Mara, M.C. Polo y E. Pueyo

a autlisis de las levaduras que se produce de forma espontnea en las elaboraciones que conllevan un prolongado tiempo de envejecimiento con las levaduras, como es el caso de los vinos espumosos elaborados por el mtodo champenoise y de los vinos sur lie que se elaboran en algunas regiones francesas, confiere a estos vinos unas caractersticas peculiares que los diferencian de otros. Entre los compuestos de las levaduras que se liberan al vino durante la autlisis se encuentran los lpidos. La escasez de mtodos analticos que permitan separar y cuantificar de forma fiable esta compleja fraccin, que se encuentra en el vino en concentraciones del orden de microgramos o a lo sumo de miligramos, ha hecho que hasta el momento actual exista un gran desconocimiento sobre este grupo de compuestos. El objetivo de este trabajo es la puesta a punto de un mtodo de anlisis de lpidos por HPLC, as como el estudio de la liberacin al vino de los lpidos de las levaduras. Debido a que la autlisis de las levaduras en el vino tarda varios meses en producirse o al menos en ser detectable analticamente, se ha realizado una induccin de la autlisis en un medio vnico modelo. Los autolizados se han

extrado con cloroformo:metanol (2:1, v/v). Para la separacin de las distintas familias de lpidos, se ha adaptado a la separacin de los lpidos presentes en las levaduras, el mtodo propuesto por Christie y Urbin (J High Resol Chromatogr 1995; 18: 97-100) que emplea una columna YMC PVA-Sil. La deteccin se ha realizado con un detector de dispersin de luz. Se ha determinado la concentracin de steres de esterol, triacilgliceroles, esteroles, 1,3-diacilgliceroles, cidos grasos libres, 1,2diacilgliceroles, 2-monoacilgliceroles y 1-monoacilgliceroles. Se ha comprobado que las curvas de calibrado de los lpidos se ajustan a un modelo polinomial de tercer grado, obtenindose coeficientes de determinacin mayores de 0,94 en todos los casos con un error estndar de la prediccin menor del 6 % para seis de las ocho clases de lpidos cuantificadas. La repetibilidad del proceso de extraccin (n = 3) medida por la desviacin estndar relativa es del 3 al 7 %. Se ha observado una liberacin de lpidos en los primeros momentos de la autlisis y una disminucin posterior lo que podra indicar la solubilizacin de enzimas procedentes de las levaduras que degradan a los lpidos liberados.

Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC, Madrid (ifip305@ifi.csic.es)

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Enzimas implicados en la biosntesis de acetatos con diferentes levaduras enolgicas

M.C. Plata, M.C. Milln, E. Valero, J.C. Mauricio y J.M. Ortega

os acetatos, tales como el acetato de etilo y el acetato de isoamilo, son compuestos importantes en el aroma del vino. Estos steres son sintetizados por las levaduras durante la fermentacin a travs de dos enzimas, la alcohol acetiltransferasa (AATasa, EC 2.3.1.84) y las esterasas (EC 3.1.1.1). La sucesin de levaduras en una fermentacin alcohlica de mosto de uva natural es un hecho comprobado. En este trabajo se ha estudiado la contribucin de diferentes levaduras enolgicas al aporte de este grupo de sustancias en el aroma del vino. Las levaduras utilizadas fueron las que se encuentran normalmente en la primera fase de fermentaciones industriales llevadas a cabo en la zona de DO Montilla-Moriles: Pichia membranae faciens, Candida guilliermondii, Hansenula subpelliculosa, Kluyveromyces marxianus, Kloeckera apiculata y Torulaspora delbrueckii. Como levadura tpica fermentadora se utiliz Saccharomyces cerevisiae raza cerevisiae (E-1). Las experiencias se realizaron en un mosto sinttico para eliminar el posible efecto que acarrean las diferentes vendimias en la composicin del mosto. Las levaduras de primera fase de fermentacin produjeron mayor cantidad de estos acetatos en las primeras horas de desarrollo del proceso fermentativo (seis horas para la

produccin de acetato de etilo con las levaduras H. subpelliculosa, T. delbrueckii y K. marxianus y 24 horas para la de acetato de isoamilo con K. apiculata, H. subpelliculosa y K. marxianus). La levadura tpica fermentadora produjo mayores cantidades de acetato de isoamilo que el resto de las levaduras utilizadas en los estadios finales de la fermentacin. La sntesis de acetatos llevada a cabo por las esterasas slo se mostr activa para la sntesis de acetato de etilo. Esta actividad se detect en las primeras horas de fermentacin en K. apiculata, K. marxianus y P. membranaefaciens, mientras que en C. guilliermondii y T. delbrueckii fue al final de la misma. No hubo deteccin de esta actividad en H. subpelliculosa y S. cerevisiae raza cerevisiae. En todas las levaduras utilizadas se observaron sntesis de acetato de etilo y acetato de isoamilo por el enzima AATasa, siendo sus cinticas distintas en cada levadura. El acetato de etilo se acumul en el medio durante toda la fermentacin excepto con K. marxianus donde disminuy al final. La especie ms productora fue K. apiculata. El acetato de isoamilo se acumul en el medio durante toda la fermentacin con S. cerevisiae raza cerevisiae, C. guilliermondii y P. membranaefaciens y descendi al final de la misma con K. marxian us, H. subpelliculosa y T. delbrueckii.

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