2do Capítulo de Muestra - HFG

Fig. 2-1.
Dibujo esque-
mtico que muestra un
microscopio ptico co-
mn. (Dibujo cedido
gentilmente por Fa. Carl
Zeiss AG.)
CAPTULO 2
Mtodos histolgicos
"El arte y la ciencia tienen su punto de encuentro en el mtodo."
La totalidad del conocimiento actual re-
ferido a la estructura y la funcin de los or-
ganismos biolgicos tiene su fundamento
en los m@todos necesarios para la investi-
gacin de las clulas y los tejidos. En algu-
nos casos, los grandes avances en la com-
prensin y el conocimiento fueron conse-
cuencia directa del desarrollo de una nue-
va tcnica. La creacin de la microscopia
electrnica, los mtodos de fracciona-
miento celular, la inmunohistoqumica y
la tecnologa del DNA son ejemplos claros.
Es necesario contar con ciertos conoci-
mientos respecto de los principios funda-
mentales de los mtodos aplicados con
mayor frecuencia, para que el estudio de la
histologa no sea tan slo un aprendizaje
de determinados hechos, sino que adems
permita adoptar una postura crtica frente
a ellos. En consecuencia, se comenzar el
estudio de la histologa con un breve an-
lisis de las generalidades de los mtodos
histolgicos, si bien a menudo ser de gran
utilidad revisar algunos de estos mtodos,
Tornillo
macromtrico
Tornillo
micromtrico
Bulwer
relacionados con el estudio especfico de
las clulas y los tejidos.
En general, los mtodos histolgicos se
clasifican en dos grupos: los que se basan
en la observacin directa de clulas y teji-
dos vivos, y los que analizan material
muerto o inanimado. En un lugar interme-
dio se ubican las tcnicas de aislamiento
de los componentes de clulas vivas me-
diante mtodos de centrifugacin. En to-
dos los casos se comienza con el anlisis
microscpico, de importancia fundamen-
tal para todos los mtodos histolgicos.
Anlisis microscpico
El microscopio es el instrumento ms
importante en la histologa, debido al pe-
queo tamao de las estructuras analiza-
das. Cabe destacar que cuando en este texto
se alude al trmino "microscopio" siempre
se refiere al microscopio ptico, a menos
que se especifique otra cosa.
Revlver
Platina
~ - - - - - - - - - - Condensador
C;ll;llillil-------- Tornillo de centrado
Filtro de luz diurna
1-------------- Brazo del condensador
Lmpara Colector Espejo
MTODOS HISTOLGICOS 19
Cuando la luz atraviesa un material bio-
lgico, por ejemplo un preparado histol-
gico, cambian sus caractersticas, y estas
modificaciones se hacen visibles median-
te los sistemas de lentes. El ojo puede di-
ferenciar variaciones de intensidad de la
luz (contraste entre luz y sombras) y de
color (distintas longitudes de onda). En
consecuencia, es necesario modificar la
luz, para que el preparado se observe co-
mo formado por elementos ms oscuros y
ms claros o de distintos colores. Las c-
lulas y los tejidos no coloreados se suelen
captar con el microscopio como carentes
de color y transparentes, porque no pre-
sentan suficiente contraste. Con la ayuda
de tinciones histolgicas se logra una ab-
sorcin diferencial de la luz, de modo que
se visualizan las distintas estructuras.
Poder de resolucin y aumento. Estos
dos conceptos se emplean para determi-
nar la utilidad de un microscopio y se de-
ben diferenciar con claridad entre s. Es
Apertura numrica y poder de resolucin
La capacidad de refraccin o ndice de
refraccin de un medio se define como
la relacin entre la velocidad de la luz
en el vaco y en el medio en cuestin. Por
lo tanto, el ndice de refraccin es una
medida de la velocidad de dispersin de
una onda luminosa a travs del medio.
La luz se refracta al atravesar un objeto.
El ngulo de refraccin ser tanto mayor
cuanto ms finos sean los detalles.
La apertura numrica (NA) es una me-
dida de la capacidad del microscopio de
agrupar las refracciones de la luz produ-
cidas por los detalles finos del objeto, da-
do que expresa el tamao del haz de luz
que es captado por el objetivo despus de
Fig. 2-2. Este dibujo esquemtico muestra la
mitad del ngulo mximo (u) del haz de luz
captado por el objetivo.
20 MTODOS HISTOLGICOS
mucho ms importante el poder de reso-
lucin d, que se define como la distancia
mnima que debe existir entre dos puntos
del objeto para que se visualicen separa-
dos. La calidad de una imagen (claridad y
riqueza de detalles) depende del poder de
resolucin de un microscopio.
El aumento se define como la relacin
entre el tamao de la imagen y del objeto,
en valores lineales. El aumento no depen-
de del poder de resolucin, pero se tiene
en cuenta esta propiedad al elegir el au-
mento. En cuanto todos los detalles re-
sueltos se visualizan con facilidad, todo
aumento ulterior slo hace ms borrosa la
imagen, porque no se incrementa el poder
de resolucin. La imagen no adquiere ms
detalles y se habla de aumento vaco.
Microscopio ptico
El microscopio ptico est compuesto
por partes mecnicas y pticas. Los com-
haber atravesado el objeto. Se expresa co-
mo NA= n x sen u, donde n es el ndice
de refraccin del medio que separa el cu-
breobjeto del preparado de la lente fron-
tal del objetivo, y u es la mitad del ngu-
lo superior del haz de luz (fig. 2-2).
Como se vio antes, el poder de resolu-
cin es funcin de la apertura numrica
y de la longitud de onda de la luz utili-
zada, A (lambda). El poder de resolucin
( d) se puede expresar segn la siguiente
frmula:
d =
0,61 X A
NA
donde d es la menor distancia entre dos
puntos que permite visualizarlos separa-
dos. Ntese que cuanto menor sea d, tan-
to mayor ser el poder de resolucin. Da-
do que u no puede superar 90, el seno
de u debe ser inferior a 1. En consecuen-
cia, el NA mximo ser de alrededor de
1,4, puesto que el ndice de refraccin a
lo sumo se puede acercar a 1,5 si se
reemplaza el aire que separa el cubreob-
jeto y el objetivo con aceite (denominada
tcnica con aceite de inmersin, para la
que se emplean objetivos de inmersin
especiales). La longitud de onda de la
luz empleada suele ser de alrededor de
0,500 J..Lm, que corresponde a la luz ama-
rillo-verdosa, para la cual el ojo humano
tiene especial sensibilidad. De este mo-
do, se obtiene un poder de resolucin de
aproximadamente 0,25 J..Lm.
CAPTUL9 2
CAPTULO 2
ponentes pticos constan de tres sistemas
de lentes: condensador, objetivo y ocular
(fig. 2-1). El condensador produce un haz
de luz que ilumina el objeto estudiado. El
objetivo aumenta el objeto y proyecta la
imagen sobre el ocular. El ocular aumenta
aun ms la imagen y la proyecta sobre la
retina del ojo del observador.
El aumento total resultante se determi-
na mediante el producto del aumento del
objetivo por el aumento del ocular (even-
tualmente se debe multiplicar por un fac-
tor que depende del tubo).
El poder de resolucin depende de la
longitud de onda de la luz utilizada y de
las aperturas numricas del objetivo y el
condensador (el ocular slo acta aumen-
tando la imagen del objetivo, no mejora el
poder de resolucin).
El mximo poder de resolucin que se
puede obtener es de 0,2 pm, pero con los
preparados de rutina habituales rara vez ex-
cede de 0,5 ..tm.
Como se vio antes, los detalles resueltos
se deben aumentar lo suficiente para poder
ser observados sin esfuerzo, lo cual se lo-
gra con el aumento adicional del ocular.
Para obtener el mximo poder de resolu-
cin, de alrededor de 0,2 ..tm, se requiere
un aumento de unas 1.000-1.400 veces, da-
do que el poder de resolucin del ojo, a la
distancia normal de observacin (25 cm),
es de aproximadamente 0,2 mm. Como re-
gla mnemotcnica vale que, para evitar el
aumento vaco nunca se debe emplear ma-
yor aumento que 1.000 veces la apertura
numrica del objetivo. Por lo general, en el
objetivo estn grabados el aumento y el
valor de la apertura numrica. Adems, se
suele especificar la longitud del tubo y el
espesor de cubreobjetos (en mm) para el
cual est corregido el objetivo.
Sobre la base del microscopio ptico
comn se han desarrollado varios micros-
copios especiales, cada uno de los cuales
presenta ventajas y limitaciones especfi-
cas, segn veremos a continuacin.
Microscopio de campo oscuro
El microscopio de campo oscuro se uti-
liza para analizar partculas pequeas,
que presentan muy escaso contraste con
la microscopia ptica o que se encuentran
en el lmite del poder de resolucin o por
debajo de ste. Para la microscopia de
campo oscuro se emplea un condensador
especial, el cual impide que llegue luz di-
recta al objetivo, de manera que slo inci-
de en esta lente la luz desviada o esparci-
da por las pequeas partculas que se de-
sea investigar. stas se observan lumino-
sas sobre un fondo oscuro (del mismo mo-
do que las partculas de polvo se visuali-
zan por la dispersin que realizan de la
luz de un rayo de sol).
En histologa se utiliza a menudo el
campo oscuro para el anlisis de prepara-
dos radioautogrficos (vase ms adelan-
te), mientras que es una importante aplica-
cin clnica la determinacin de la espiro-
queta de la sfilis, el Treponema pallidum.
Microscopio de' contraste de fase
Los tejidos no coloreados producen muy
escaso contraste, dado que no absorben
cantidades importantes de luz. Sin embar-
go, producen cierto retardo en las longitu-
des de onda, de acuerdo con la "densidad
ptica" variable de los tejidos, es decir, los
distintos ndices de refraccin. Este retraso
variable de las ondas sinusales produce
cierto desfasamiento entre ellas. Mediante
el microscopio de contraste de fase es posi-
ble transformar estas diferencias de fase,
no visibles, en diferencias de amplitud, es
decir, que las diferencias de refraccin en-
tre los componentes del tejido se transfor-
man en diferencias de intensidad, que pue-
den ser captadas por el ojo humano. De es-
ta manera es posible transformar en visibles
componentes de las clulas vivas que, de
otra manera, slo se observan en tejidos
muertos y teidos (fig. 2-3).
Fig. 2-3. Se observan dos fotomicrografas (A y
8) de las mismas clulas vivas (fibroblastos
de cultivo de tejido), A obtenida con un mi-
croscopio ptico comn y 8 captada con un
microscopio de contraste de fase. En la imagen
de contraste de fase se observan con claridad
el lmite entre las clulas (flechas), el ncleo
(N), los nuclolos (Nu), mitocondrias alargadas
(M), lisosomas redondos (L) y otros detalles
que apenas se distinguen con el microscopio
ptico comn. (Segn Novikoff y Holtzman.)
Microscopio de interferencia
El microscopio de interferencia est
construido sobre la base de principios si-
milares al microscopio de contraste de fa-
se, dado que tambin en este caso se utili-
zan las diferencias de fase producidas por
la luz que atraviesa el objeto. Mientras que
el microscopio de contraste de fase slo es
un instrumento cualitativo, mediante el
microscopio de interferencia es posible
obtener datos cuantitativos. Esto se logra
al dividir la luz de una nica fuente en dos
haces luminosos, de los cuales uno se en-
va a travs del objeto y el otro no se alte-
ra, por lo que acta como haz de referen-
cia. Despus se vuelven a unir ambos ha-
ces, que interfieren entre s del mismo mo-
do que en el microscopio de contraste de
fase. El haz que atraves el objeto sufre un
retraso respecto al haz de referencia, es de-
cir, sufre una modificacin de fase. Dado
que el retraso es funcin del ndice de re-
fraccin y del espesor, el valor del retraso
se puede emplear para determinar la masa
por unidad de superficie del preparado y,
en consecuencia, la masa de los elementos
celulares individuales.
Una variante especial del microscopio
de interferencia es el microscopio de con-
traste por interferencia diferencial (tam-
bin denominado microscopio de interfe-
rencia de Nomarski), en el cual los dos ha-
ces luminosos separados tienen polaridad
opuesta, por lo que se aumenta el contras-
te y se obtiene una imagen de aspecto tridi-
mensional del objeto investigado (fig. 2-4).
Microscopio de luz polarizada
Los componentes cristalinos y fibrosos
del material biolgico poseen una orienta-
cin caracterstica de las molculas. En
consecuencia, cuando se ilumina el obje-
to con luz polarizada plana (luz que slo
vibra en un plano), sta se divide en dos
componentes con distinta velocidad, es
decir, desfasados entre s. Se habla de es-
tructuras birrefringentes o anistropas (gr.
an, no; isos, igual; trape, movimiento). En
contraste, se denomina estructuras istro-
pas a las que no dividen la luz polarizada,
por lo que el ndice de refraccin es igual
en todas direcciones.
Se obtienen datos referidos a la anisotro-
pa del objeto mediante el microscopio de
luz polarizada, que se diferencia del mi-
croscopio ptico comn por tener dos fil-
tros polarizantes. Uno de ellos, el polariza-
dor, se encuentra antes del preparado y el
otro, el analizador, est ubicado por detrs.
El polarizador transforma la luz en una po-
larizada plana (al filtrar la luz que vibra en
otros planos) antes de llegar al objeto, mien-
tras que el analizador se utiliza para regs-
trar las modificaciones de la polarizacin
de la luz que ha atravesado el preparado.
La birrefringencia de un objeto depen-
de de una estructura regular determinada.
En las clulas y los tejidos puede ser una
disposicin asimtrica regular de molcu-
las o iones, por ejemplo, en ciertas inclu-
siones celulares, birrefringencia cristali-
na, o una distribucin regular de unida-
des submicroscpicas asimtricas, por
ejemplo, en las fibras musculares, birre-
fingencia de forma. En consecuencia, me-
diante el microscopio de luz polarizada es
posible obtener informacin respecto a la
estructura a nivel molecular. Adems, el
microscopio de luz polarizada se puede
utilizar para el estudio de clulas vivas.
Microscopio de fluorescencia
Determinadas sustancias fluorescen, es
decir, tienen la particularidad de irradiar
luz de otra longitud de onda (color) al ser
Fig. 2-4. Fotomicrografa
de una clula pilosa del
odo interno captada con
microscopio de interfe-
rencia diferencial (o mi-
croscopio de interferen-
cia de Nomarski). Obsr-
vese el notable efecto tri-
dimensional. x625 (Segn
M0rup J0rgensen.)
CAPTULO 2
CAPTULO 2
Submicroscpico
Por submicroscpico se entiende lo
que "est por debajo de la resolucin del
microscopio". La denominacin est mal
definida y se aplica ocasionalmente con
respecto a las estructuras demasiado pe-
queas para ser reconocidas incluso con
iluminadas. La luz irradiada siempre pre-
senta una longitud de onda ms larga que
la original. Algunos componentes biolgi-
cos (p. ej., la vitamina A) tienen fluores-
cencia natural y se denominan autofluo-
rescentes, mientras que otros adquieren la
fluorescencia despus de un tratamiento
con determinados colorantes fluorescen-
tes, por ejemplo fluorescena, que emite
una intensa fluorescencia verdosa al ser
irradiada con luz azul.
En el microscopio de fluorescencia se
ilumina el preparado con intensa luz de la
longitud de onda capaz de activar el colo-
rante fluorescente empleado. Esto se lleva
a cabo mediante un filtro del color ade-
cuado que se coloca por debajo del con-
densador: as se filtra la luz antes de que
incida en el preparado. Adems, se coloca
un filtro por encima del objetivo con un
color correspondiente a la longitud de on-
da de la luz que emite el colorante utiliza-
do cuando fluoresce. De esta manera se lo-
gra que la imagen se forme slo debido a
la emisin de la luz fluorescente. Las es-
tructuras fluorescentes se destacan enton-
ces en color sobre fondo oscuro (vase fig.
2-14), como fuentes luminosas, por lo que
es posible visualizar estructuras de di-
mensiones mucho ms pequeas que el
poder de resolucin del microscopio.
En los ltimos aos se ha observado un
notable incremento en el empleo de la mi-
croscopia de fluorescencia, debido funda-
mentalmente a la aplicacin de colorantes
fluorescentes que se ligan a anticuerpos
especficos, que reaccionan con determi-
nados componentes tisulares (vase ms
adelante en este captulo).
Fig. 2-5. Imagen de las clulas productoras de
insulina en los islotes de Langerhans del pn-
creas, captada con microscopio de barrido
confocal. Se distinguen grnulos citoplasmticos
que contienen insulina mediante reaccin con un
anticuerpo fluorescente azul contra insulina, se
determina la presencia de una molcula ligada a
la membrana celular (denominada transportado-
ra de glucosa) con un anticuerpo fluorescente ro-
jo y se observa una molcula localizada sobre el
ncleo celular (llamada factor de transcripcin
para insulina) mediante un anticuerpo fluores-
cente verde. (Cedida por L.-l. Larsson.)
el microscopio electrnico. Sin embargo,
su uso ms frecuente se aplica a estruc-
turas demasiado pequeas para ser de-
tectadas con el microscopio ptico (la
palabra comenz a utilizarse antes de la
era del microscopio electrnico).
Microscopio de barrido confocal
Una limitacin de la microscopia de
fluorescencia radica en la necesidad de
que todo el espesor del preparado emita
fluorescencia, pero slo es posible enfocar
el objetivo en un plano del corte a la vez.
En consecuencia, la luz emitida por fluo-
rescencia desde zonas del preparado ubi-
cadas por encima y por debajo del plano
focal puede restar nitidez a la imagen. Me-
diante el microscopio de barrido confocal
se impide esta tendencia, dado que se ex-
cluye la luz no emitida por el plano focal.
El preparado se ilumina por un rayo lser
que barre todos los puntos del plano focal,
mientras que la luz emitida por el prepa-
rado atraviesa una hendidura muy estre-
cha que detiene la luz emitida por otros
niveles, distintos del plano focal. De esta
manera se logra obtener la informacin
necesaria para formar una imagen bidi-
mensional (fig. 2-5) que se registra sobre
una pantalla de televisin. Al recoger con
una computadora una serie de imgenes
de distintos planos focales es posible re-
construir una imagen tridimensional del
objeto.
Microscopio de luz ultravioleta
Con el empleo de luz ultravioleta con
longitud de onda de alrededor de 250 nm,
es decir, casi la mitad de la luz visible que
se utiliza habitualmente en el microsco-
pio ptico, en principio es posible dupli-
car el poder de resolucin (disminuir d a
la mitad). El microscopio de luz ultravio-
leta, cuyo sistema ptico suele estar cons-
truido en cuarzo, permite el paso de la luz
ultravioleta, que es invisible. En conse-
cuencia, la formacin de la imagen se re-
gistra en una pelcula fotogrfica.
Aunque se logra un ligero aumento
del poder de resolucin mediante esta
tcnica, la principal importancia del mi-
croscopio de luz ultravioleta es que los
cidos nucleicos absorben la luz ultra-
violeta de determinada longitud de onda
(260 nm}, por lo que se pueden detectar
con facilidad.
Microscopio electrnico
La construccin del microscopio elec-
trnico representa un verdadero logro en
cuanto a incrementos del aumento y del
poder de resolucin. En principio se debe
a que se reemplaza la luz visible, de lon-
gitud de onda de alrededor de 500 nm,
por un haz de electrones de longitud de
onda del orden de 0,005 nm. Dado que d
(poder de resolucin) es directamente
proporcional a A. (vase pg. 20), en teora
la aplicacin de un haz de electrones per-
mite obtener un poder de resolucin muy
elevado. Como los electrones no pueden
atravesar las lentes de vidrio, es necesario
reemplazarlas por bobinas electromagn-
ticas (denominadas lentes electromagnti-
cas), en cuyos campos electromagnticos
o electrostticos se modifica el trayecto
del haz de electrones, de modo similar a
como se refracta el haz de la luz visible en
una lente de cristal.
El esquema de construccin del mi-
croscopio electrnico de transmisin
(MET) se presenta en la figura 2-6 (la pa-
labra transmisin se refiere a que los elec-
trones atraviesan el objeto). Se calienta un
ctodo filamentoso del metal tungsteno
(denominado filamento) en una atmsfera
de vaco, por lo que emite electrones que
son acelerados hacia el nodo debido a
una diferencia de potencial de alrededor
de 50-100 kV. El nodo tiene la forma de
una placa metlica con un orificio ( deno-
minado apertura) en el centro, a travs del
cual pasan algunos de los electrones, para
formar un flujo constante o haz de electro-
nes. El haz de electrones se enfoca me-
diante la lente del condensador en el pla-
no del objeto, y la lente del objetivo forma
la imagen del objeto. La imagen obtenida
Ctodo
nodo
Lente condensadora
Objeto
Lente objetivo
Lente proyectara
Imagen
se aumenta por una lente proyectara, que
corresponde al ocular del microscopio p-
tico. Dado que el haz de electrones es in-
visible, la imagen formada se registra por
proyeccin sobre una pantalla fluorescen-
te o una pelcula fotogrfica. Debido a la
escasa movilidad de los electrones en el
aire, todo el sistema debe estar en una at-
msfera de vaco.
La formacin de la imagen en el mi-
croscopio electrnico se debe, principal-
mente, a la dispersin de los electrones.
As se dispersan los electrones que coli-
sionan con los ncleos atmicos y con sus
electrones en el objeto, a menudo de ma-
nera tal que inciden por fuera de la lente
objetivo. En consecuencia, la imagen so-
bre la pantalla se forma por la ausencia de
estos electrones, como "imagen en som-
bra". La dispersin de los electrones de-
pende del espesor del objeto y de su den-
sidad molecular. En especial depende del
nmero atmico de los tomos presentes
en el objeto, dado que la dispersin obte-
nida es mayor, cuanto ms elevado sea el
nmero atmico. La mayora de los to-
mos de las estructuras biolgicas tienen
nmero atmico bastante bajo y contribu-
yen muy poco a la formacin de la ima-
gen, por lo que se adicionan tomos pesa-
dos al preparar los materiales (vase ms
adelante).
Como se vio antes, el valor del microsco-
pio electrnico radica en el gran poder de
resolucin que se puede obtener, de unos
0,2 nm. No obstante, es importante diferen-
ciar entre el denominado poder de resolu-
cin del instrumento, que es del orden
mencionado y se puede lograr al analizar,
por ejemplo, polvo metlico, y el denomi-
nado poder de resolucin del objeto. Este
ltimo es el poder de resolucin que se
Fig. 2-6. Dibujo esque-
mtico de un microsco-
pio electrnico.
CAPTULO 2
mtico de un microsco-
pio electrnico de barri-
do. (De Hearle, Sparrow y
Cross.)
Fuente de
electrones
Sistema de
lentes
"Scanner''
{barredor)
Objeto
CAPTULO 2
Valor del poder de resolucin
Ntese que el poder de resolucin a
simple vista, a distancia normal de lec-
tura, es de alrededor de 0,2 mm, para
los mejores microscopios pticos, de
aproximadamente 0,2 Jlm, y para los
mejores microscopios electrnicos, de
unos 0,2 nm.
puede lograr en la investigacin de prepa-
rados biolgicos y es del orden de 2 nm, da-
do que depende en gran parte de los proce-
dimientos de preparacin (vase ms ade-
lante). Con el poder de resolucin prctico
que se puede obtener es posible lograr au-
mentos tiles superiores a 500.000 veces.
El microscopio electrnico est limita-
do por el escaso poder de penetracin del
haz de electrones. Esto implica la necesi-
dad de utilizar cortes de tejido muy delga-
dos (de alrededor de 50 nm). Esta limita-
cin se puede superar en parte mediante
el uso del denominado microscopio elec-
trnico de alto voltaje, cuyo haz de elec-
trones es alrededor de 10 veces ms rico
en energa que el que se utiliza en los mi-
croscopios electrnicos comunes. El mi-
croscopio estereoelectrnico permite cor-
tes de tejido ms gruesos, ya que el mismo
preparado es fotografiado desde dos ngu-
los algo diferentes. Si despus se analizan
las fotografas mediante un estereoscopio
se obtiene un notable efecto tridimensio-
nal, en el cual la profundidad es mayor,
cuanto ms grueso es el corte de tejido.
Otra limitacin es el requerimiento de
utilizar alto vaco, lo cual descarta inves-
tigaciones en clulas vivas.
Microscopio electrnico de barrido
Hasta aqu se analiz el microscopio
electrnico estndar que, como se men-
cion, se denomina microscopio electr-
Pantalla de TV
Fig. 2-8. Imagen de cilias de la trquea cap-
tada con microscopio electrnico de barri-
do. (Cedida por B. Holma.)
nico de transmisin (MET). Su contrapar-
tida es el microscopio electrnico de ba-
rrido (MEB) que, en principio y utilidad,
es totalmente diferente de los microsco-
pios ptico y electrnico de transmisin,
pero que representa un importante suple-
mento del MET. En el microscopio de ba-
rrido los electrones no atraviesan el obje-
to, la imagen se forma indirectamente, a
travs de la captacin puntual de detalles
en la superficie del preparado. El prepara-
do se recubre de una delgada capa de un
metal pesado y se bombardea con un haz
de electrones muy estrecho (de alrededor
de 10 nm de dimetro), que "barre" sobre
el objeto en un patrn lineal y lo copia
(fig. 2-7). Desde cada punto se emiten
electrones secundarios, de modo tal que
la intensidad de la emisin secundaria va-
ra segn el ngulo con que incide el haz
de electrones sobre la superficie. Este n-
gulo depende de las irregularidades del
contorno de la superficie. La emisin se-
cundaria se mide con un detector ubicado
cerca del preparado y adaptado a una pan-
talla de televisin, cuyos rayos catdicos
barren en forma coordinada con el haz de
electrones "que iluminan". La imagen ob-
tenida se visualiza directamente sobre la
pantalla y se puede registrar en una foto-
grafa o en forma digital.
El MEB forma la imagen de la superfi-
cie y no es necesario utilizar cortes ultra-
finos, dado que el haz de electrones no
atraviesa el preparado. El poder de resolu-
cin con la microscopia electrnica de ba-
rrido slo es de alrededor de 10 nm pero,
en contrapartida, la nitidez de la imagen
en profundidad es de hasta 10 veces la
que se obtiene con el microscopio ptico.
En consecuencia, se puede lograr una
imagen tridimensional definida de la su-
perficie (fig. 2-8).
Microscopio de tnel de barrido
(MTB)
Con este instrumento es posible captar
la estructura de la superficie de un pre-
parado hasta el nivel atmico. El princi-
pio se basa en colocar una sonda delgada
a una distancia de hasta 1 nm, por deba-
jo de la superficie del preparado. Se apli-
ca luego un contacto elctrico en el ex-
tremo de la sonda, que al mismo tiempo
barre por sobre la superficie del prepara-
do. De este modo se crea un "tnel" de
electrones a travs de la hendidura for-
mada entre el preparado y la sonda.
Mientras que sta se desplaza por sobre
el preparado, se mantiene constante la
corriente debido al movimiento autom-
tico de la sonda hacia arriba y hacia aba-
jo por las irregularidades de la superficie
del preparado. La informacin obtenida
durante estos movimientos se registra en
una computadora, la cual produce una
"imagen" de la superficie del preparado.
La microscopia de tnel de barrido per-
mite, entre otros adelantos, obtener una
imagen de las dos hebras de la molcula
de DNA.
La microscopia de tnel de barrido est
limitada por la necesidad de que el prepa-
rado sea un conductor elctrico.
Difraccin de rayos X
La difraccin de rayos X es un paso adi-
cional en direccin a la resolucin de de-
talles cada vez ms pequeos mediante la
aplicacin de rayos de longitud de onda
ms corta. Los rayos X pareceran ser es-
pecialmente adecuados para el anlisis
microscpico, dado que se puede aumen-
tar el poder de resolucin, pero no existen
lentes capaces de enfocar y sacar prove-
cho de estas longitudes de onda tan cor-
tas. En lugar de lentes se debe aplicar el
anlisis matemtico, lo cual limita la uti-
lidad.
El principio se basa en enviar un estre-
cho haz de rayos X a travs de la muestra
que se desea analizar (fig. 2-9). El haz se
separa y se dispersa en un patrn de di-
fraccin (lat. fractum, rotura) que se regis-
tra en una pelcula fotogrfica ubicada por
debajo de la muestra. En la prctica slo
es posible utilizar la difraccin de rayos X
en la investigacin de estructuras muy or-
denadas de naturaleza cristalina o semi-
cristalina (de all que, en ocasiones, se de-
nomina cristalografa de rayos X) dado
que, en los dems casos, el patrn de di-
Pelcula
fotogrfica
Cristal de NaCI
fraccin obtenido es casi imposible de
descifrar. Incluso en las estructuras orde-
nadas la falta de imagen formada hace que
se pierda informacin referida a las rela-
ciones entre las fases y los rayos secunda-
rios, por lo que el patrn de difraccin no
se corresponde con exactitud con el obje-
to investigado. En consecuencia se debe
trabajar con aproximaciones e interpreta-
ciones, que slo presentan la estructura
ms probable.
Sin embargo, la difraccin de rayos X
ha tenido importancia fundamental en el
desarrollo de la biologa molecular y ha
permitido obtener informacin esencial
respecto a ms de 300 macromolculas,
entre ellas la mioglobina, la hemoglobina
y el DNA.
Mtodos de observacin directa
de clulas y tejidos vivos
Si bien el objetivo de la histologa es la
descripcin y la comprensin de la es-
tructura de las clulas y de los tejidos vi-
vos, lamentablemente, por motivos tcni-
cos, a menudo ha sido necesario seguir el
camino de la investigacin de tejidos
muertos y preservados. Los procedimien-
tos utilizados implican muchas posibili-
dades de modificacin del aspecto de las
estructuras debidas a causas tcnicas y
dejan sin respuesta numerosas incgnitas
referidas a los procesos celulares vitales.
Adems, es imposible lograr un control
ms directo sobre el medio que circunda a
la clula y crear modificaciones experi-
mentales del mismo.
En consecuencia, existen claras venta-
jas en el estudio de clulas y tejidos vivos;
a continuacin se vern algunos de los
mtodos disponibles.
mtico del principio de
difraccin de rayos X.
(Segn Amberson y
Smith.)
CAPTULO 2
Fig. 2-10. Dibujos de
cultivo de tejido conec-
tivo embrionario. En a
se observa el explantado
como una masa central
negra, rodeada del creci-
miento ms claro. b y e
muestran el desarrollo a
aumentos crecientes.
(Segn Leonhardt.)
CAPTULO 2
a
f-----1
1 mm
Cultivo de tejido
b
El cultivo de tejido es un importante
mtodo para el estudio de poblaciones ce-
lulares vivas fuera del organismo. El m-
todo se menciona a menudo como cultivo
in vitro, dado que se refiere a frascos de
reactivo o de vidrio (lat. vitro, vidrio), a
diferencia de in vivo, es decir, en el orga-
nismo vivo.
En la actualidad, el cultivo de tejido se
clasifica en tres categoras: 1) El cultivo de
clulas comprende el cultivo de clulas
aisladas, ya no organizadas en un tejido.
Las clulas se pueden transportar a otro
frasco con medio de cultivo, a medida que
crece su nmero. 2) El cultivo de tejido
por lo general comprende la transferencia
de un trozo de tejido embrionario (gr.
embryon, feto) o explantado a un medio
de cultivo. Durante el cultivo crecen ex-
crecencias celulares, que suelen ser de ti-
po conectivo (fig. 2-10), mientras que las
clulas especializadas del rgano perma-
necen en el explantado, donde mantienen
algunas de sus funciones caractersticas.
3) El cultivo de rganos comprende el ex-
plantado de rganos embrionarios o ma-
duros (totalmente desarrollados), como
rganos completos o partes de ellos. Se in-
Inicios del cultivo de tejido
El cultivo de clulas eucariotas co-
menz a principios de este siglo, como
parte de la investigacin tendiente a de-
terminar si los filamentos nerviosos cre-
can desde el cuerpo de la clula nervio-
sa hacia el exterior o se formaban por fu-
sin de una serie de secciones preforma-
das del filamento. Ross Harrison coloc
partes de mdula espinal del sistema
nervioso no desarrollado de una rana en
un cogulo linftico y observ, con el
microscopio, la clara formacin directa
de filamentos nerviosos, como prolonga-
ciones del cuerpo celular. Otro pionero
f--1
10 11m
e
tenta mantener la estructura del rgano y
sus funciones normales, adems de su po-
sible evolucin ulterior.
Las primeras clulas de mamferos que
se observaron en estado vivo fuera del or-
ganismo fueron las clulas sanguneas.
Eran de fcil acceso y se podan analizar
al colocar una gota sobre un portaobjeto,
cubierta por un cubreobjeto, y sellar los
bordes para evitar la evaporacin. Si se
calentaba a temperatura del cuerpo la pla-
tina del microscopio se lograban condi-
ciones muy cercanas a las del organismo
vivo. De esta manera se descubrieron los
distintos tipos de glbulos blancos y sus
propiedades de movimiento independien-
te y de captacin de partculas (vase cap.
3). En la actualidad estos cultivos a corto
plazo de glbulos blancos tienen amplia
aplicacin como el mtodo ms simple
para estudiar los cromosomas humanos
(ms detalles en el cap. 4).
Los estudios ms prolongados y la in-
vestigacin de las clulas en los tejidos or-
ganizados u rganos recin fueron posi-
bles despus de la incorporacin de los
cultivos de tejido. Para los estudios de
cultivo de tejido se toma la muestra y se
mantiene estril (libre de microorganis-
mos vivos), porque los factores de creci-
fue Alexis Carrel, quien demostr, entre
otros descubrimientos, que los extractos
de fetos de pollo estimulaban el creci-
miento y la divisin celular. Esto condu-
jo al establecimiento de lneas celulares
permanentes y estimul el inters en la
investigacin del crecimiento, la diferen-
ciacin y la divisin de las clulas me-
diante el cultivo de tejidos.
Esta tcnica clsica de explantado in-
cluido en un cogulo ha experimentado
numerosas mejoras tcnicas que incre-
mentaron mucho las posibilidades de
aplicacin.
miento tambin favorecen la formacin de
bacterias y hongos. Despus de obtener la
muestra se debe mantener el tejido en una
solucin de composicin similar a la de
los lquidos tisulares. Mediante el trata-
miento cuidadoso con enzimas digestivas
como tripsina y colagenasa, que degradan
el material extracelular tendiente a man-
tener unidas las clulas, se liberan las
uniones entre ellas. El proceso se facilita
con el agregado de sustancias que captan
calcio, dado que los iones calcio son nece-
sarias para la adhesin intercelular. Ade-
ms se efecta una separacin mecnica.
De esta manera, el tejido obtenido se divi-
de en clulas individuales.
Despus del agregado de medio nutriti-
vo se pueden mantener las clulas en un
cultivo en suspensin, en el que flotan, o
se pueden transferir a una superficie de
vidrio o de plstico, al que se adhieren.
Sobre esta superficie crecen las clulas y
forman una capa nica, denominada mo-
nocapa.
La composicin del medio nutritivo es
de importancia crtica para el exito del
cultivo de tejido. La meta ideal buscada ha
sido obtener medios sintticos con compo-
sicin qumica totalmente definida y sin el
agregado de sustancias orgnicas naturales
como, por ejemplo, plasma sanguneo. Es-
te tipo de medio representa las mejores
condiciones para la investigacin de la in-
fluencia de distintas sustancias sobre el
crecimiento y la funcin de las clulas es-
tudiadas, por ejemplo, factores de creci-
miento bien definidos. Hasta el momento,
los medios sintticos desarrollados slo
satisfacen los requerimientos de creci-
miento de muy pocos tipos celulares, dado
que la mayora de las clulas y tejidos so-
lamente se pueden mantener vivos duran-
te corto tiempo sin el agregado de suero al
medio. En estos ltimos casos se habla de
medios naturales. Un paso importante ha
sido la posibilidad de agregar antibiticos
y disminuir as en gran parte el problema
de las infecciones bacterianas en los me-
dios de cultivo. La temperatura ptima pa-
ra el cultivo de clulas es de alrededor de
37,5C para las clulas de los mamferos
(si bien vara en parte para distintos teji-
dos), pero para mantener una poblacin
celular durante un perodo ms prolonga-
do es necesario recurrir al congelamento.
En condiciones normales, las clulas mue-
ren debido a la formacin de cristales de
hielo si se las enfra por debajo del punto
de congelacin pero, si se toman algunas
precauciones, es posible controlar la for-
macin de cristales y entonces se pueden
congelar y preservar en nitrgeno lquido
a -196C durante meses o aos. Si despus
se descongelan, estarn en condiciones de
continuar su crecimiento.
Mediante el cultivo de tejidos es posi-
ble aislar clones celulares. Un don celu-
lar (gr. klon, rama, brote) es una poblacin
de clulas idnticas, originadas de In mis-
ma clula por mitosis (divisin celular).
El establecimiento de un don celular, de-
nominado clonacin, se efecta, en prin-
cipio, a travs del aislamiento de clulas
individuales, que despus generan el don
por cultivo. A su vez, el don da origen a
una lnea celular pura, es decir, un culti-
vo compuesto por un nico tipo celular.
Para muchas de las investigaciones que se
realizan mediante cultivos de tejido es ne-
cesario el empleo de lneas celulares pu-
ras.
Tambin es posible aislar el tipo celular
que se desea investigar a partir de una
suspensin mixta, que contenga distintos
tipos celulares. Un mtodo especialmente
efectivo para este fin es la seleccin celu-
lar activada mediante fluorescencia
(FACS). Se utilizan anticuerpos que se fi-
jan exclusivamente al tipo celular que se
desea aislar. A las molculas de anticuer-
po se le adiciona un colorante fluorescen-
te (vanse ms detalles ms adelante) y se
agrega la mezcla a la suspensin mixta de
clulas. El anticuerpo fluorescente se fija
exclusivamente al tipo celular que se de-
sea aislar. A continuacin se separan las
clulas fluorescentes mediante un cito-
fluormetro de flujo.
En el cultivo de tejido es importante di-
ferenciar entre lneas celulares primarias y
lneas celulares establecidas. Una lnea
celular primaria aparece en el primer cul-
tivo del tejido, denominado cultivo prima-
rio, inmediatamente despus de la obten-
cin de la muestra, y se caracteriza por ser
un tejido vital al principio, cuando hay es-
casas clulas en relacin con el espacio
disponible. Despus de cierto tiempo las
clulas pierden la capacidad de dividirse,
por lo general, despus de unas 50 divisio-
nes celulares para las clulas humanas, y
la mayor parte de las clulas mueren.
Por el contrario, las lneas celulares es-
tablecidas pueden crecer en cultivos con
elevada densidad de poblacin. Una lnea
celular establecida puede aparecer espon-
tneamente, es decir, sin causa conocida,
debido a que algunas clulas del cultivo
primario retoma el crecimiento, tras lo
cual suele continuar de esa manera. Si es-
te tipo de lnea celular se transfiere unas
70 veces de un frasco de cultivo a otro, se
considera establecido. Se dice que las c-
lulas que dan origen espontneamente a
una lnea celular establecida han sufrido
una modificacin o transformacin es-
pontnea, donde las clulas transformadas
tienen capacidad para formarse casi sin in-
hibiciones. Sin embargo, las clulas tam-
bin se pueden transformar si se las expo-
CAPTULO 2
CAPTULO 2
Virus Sendai
Heterocarion
Clula hbrida
(sincarion)
Fig. 2-11. Dibujo esquemtico de hibridacin
celular. Se induce la fusin celular por agrega-
do de virus Sendai, que favorece la formacin
de un heterocarion y de clulas hbridas cuan-
do ste se divide.
ne a acciones cancergenas como irradia-
ciones, agentes qumicos o infecciones por
virus cancergenos. Se obtene una lnea
celular establecida de este tipo de clulas
transformadas a partir de un tejido tumo-
ral o de un cultivo primario, despus que
este ltimo ha sido expuesto a una accin
cancergena. Se puede entonces establecer
un cultivo homogneo de lnea pura por
clonacin del cultivo primario. Las lneas
celulares transformadas de crecimiento r-
pido y supervivencia ilimitada (ing. im-
mortal celllines) representan un material
especialmente importante para las investi-
gaciones experimentales.
Por ltimo se ver el fenmeno de hibri-
dacin celular, de gran importancia en la
investigacin de clulas cultivadas. Las c-
lulas hbridas se forman por fusin celular,
es decir, la unin de dos o ms clulas. La
fusin celular se puede producir en forma
espontnea, por ejemplo en la fecundacin,
cuando se unen las clulas sexuales mascu-
linas y femeninas, pero tambin se demos-
Clulas HeLa
En 1954 se extrajo un tumor de endo-
metrio de una mujer llamada Henrietta
Lacks. Una muestra del tejido tumoral se
utiliz para generar una lnea celular es-
tablecida y se han cultivauo estas clulas
tumorales desde entonces. Henrietta
Lacks falleci al ao siguiente pero, en su
tr, alrededor del ao 1960, que ocurre en
la formacin de clulas hbridas en cultivos
celulares. Sin embargo, recin cuando poco
despus se descubri que era posible indu-
cir la fusin celular en los cultivos celula-
res, mediante el agregado de ciertos virus
(el ms usado es el denominado virus Sen-
dai, que incrementa la tendencia a la fusin
de las membranas celulares), cobr real im-
portancia la tcnica de la hibridacin. Me-
diante la fusin de dos clulas diferentes
desde el punto de vista gentico, la clula
formada contiene dos ncleos con distinto
contenido gentico, lo que se denomina he-
terocarion (fig. 2-11). Algunas de las clu-
las formadas tendrn capacidad para divi-
dirse y los dos ncleos comienzan la divi-
sin al mismo tiempo. A su vez, esto a ve-
ces tambin da lugar a la formacin de dos
clulas, cada una de las cuales contiene un
ncleo. Este ncleo (en cada una de las dos
clulas hbridas neoformadas) contiene una
copia de los cromosomas de ambas clulas;
este tipo celular se denomina sincarion.
Entre otras aplicaciones, la hibridacin
celular ha contribuido a las investigacio-
nes sobre el crecimiento de clulas tumo-
rales, donde se han fusionado clulas nor-
males con clulas cancerosas. La tcnica
tambin se ha utilizado para demostrar
que las protenas de las membranas celu-
lares tienen capacidad para desplazarse
dentro de estas ltimas, como se ver con
mayor detalle en el captulo 3. Una aplica-
cin muy especial es el desarrollo de an-
ticuerpos monoclonales, cuya utilizacin
tiene gran importancia en las investiga-
ciones inmunohistoqumicas (vase ms
adelante en este captulo).
Para terminar con el tema de cultivo de
tejido se puede decir que, si bien no es
una alternativa, representa una posibili-
dad para realizar trabajos experimentales
sobre tejidos humanos sin chocar con pro-
blemas ticos.
Manipulacin experimental
de clulas vivas
Adems de las posibilidades experimen-
tales de actuar sobre clulas y tejidos a tra-
vs de las modificaciones del medio circun-
memoria, se denominaron clulas HeLa
las clulas cultivadas. En la actualidad
se utilizan en cientos de laboratorios y,
como la lnea celular transformarla ms
intensamente estudiada, han contribuido
a dilucidar numerosos interrogantes bio-
lgicos y mdicos importantes.
Macrfagos que contienen carmn de litio
Fig. 2-12. Tincin supravital de macrfagos
de tejido conectivo, por agregado de carmn
de litio a un preparado de tejido vivo. Las part-
culas rojas de carmn de litio han sido fagocita-
das por los macrfagos. x440.
dante relacionadas con el cultivo de tejido,
existen varios mtodos para la manipula-
cin ms o menos directa de clulas vivas.
Tinciones vital y supravital. Algunos
colorantes relativamente inocuos son cap-
tados en forma selectiva por determinadas
clulas vivas. En consecuencia, la locali-
zacin del colorante se puede utilizar pa-
ra detectar estas clulas o determinadas
organelas, a las que se une el colorante
despus de ser captado. De esta manera
tambin se pueden identificar algunas
sustancias intercelulares.
Para la tincin vital se inyecta el colo-
rante en el animal vivo. Para la tincin su-
pravital se agrega el colorante a las clu-
las o el tejido vivo despus de su extrac-
cin del organismo.
El azul tripn y el carmn de litio se
componen de partculas finas y han teni-
do importancia definitiva para el estudio
de la fagocitosis , es decir, la forma en que
determinadas clulas captan partculas
del medio (fig. 2-12).
El rojo neutro y el verde Jano se utilizan
para el estudio de los glbulos blancos. El
verde Jano tie selectivamente las mitocon-
drias y el rojo neutro para identificar los
distintos subtipos de leucocitos.
La alizarina se une a la matriz sea neo-
formada y le confiere coloracin roja. La
tincin vital con alizarina ha sido muy
importante en los trabajos sobre el meca-
nismo de crecimiento seo.
Micromanipulacin mecnica. Nume-
rosas tcnicas, agrupadas bajo la denomi-
nacin micromanipulacin o microciru-
ga, se han desarrollado sobre la base del
micromanipulador. Este instrumento se
compone de un microscopio, en el que el
preparado a estudiar se encuentra en una
cmara hmeda de operacin, sobre la
platina. En el micromanipulador se mon-
tan agujas finas, ganchos o pipetas de vi-
drio, cuyos extremos aparecen en el cam-
po visual y que se pueden desplazar con
tanta precisin, que se pueden disecar las
clulas individuales con gran aumento.
Este mtodo de diseccin ha incrementa-
do el conocimiento de la naturaleza fsica
de las clulas. Se ha demostrado que el pro-
toplasma es viscoso y se han desplazado las
organelas dentro de la clulas. Tambin se
puede empujar el ncleo celular dentro del
citoplasma y ha demostrado ser una vescu-
la deformable llena de lquido. As, se pue-
den hacer muescas en l al presionar con
una aguja. Con la microdiseccin tambin
se demostr muy pronto la existencia de
una membrana celular (fig. 2-13).
Fig. 2-13. Fotomicrografas (a campo oscuro)
de clulas huevo de rana vivas, que demuestran
cmo se procede en la micromanipulacin
mecnica. En a se observan dos invaginaciones
en la membrana celular producidas por presin
con dos microelectrodos. En b se visualizan los
microelectrodos despus de atravesar la mem-
brana celular hacia el interior del citoplasma. La
medida incluida representa 100 11m. (Segn
Kanno y Loewenstein.)
CAPTULO 2
Fig. 2-14. Fotomicrogra-
fa de una neurona de la
retina captada con mi-
croscopio de fluorescen-
cia. Mediante un microin-
yector se inyect el colo-
rante fluorescente amari-
llo Lucifer directamente
en la neurona viva. Luego
se sacrific el animal y se
efectu un preparado his-
tolgico de la retina. (Ce-
dida por J. Zimmer.)
CAPTULO 2
Los microelectrodos son pipetas muy
finas que contienen soluciones salinas
concentradas. Mediante la micromanipu-
lacin se inyectan stas en las clulas, y
despus se puede medir la diferencia de
Fig. 2-15 Fotomicrografa de una clula viva cap-
tada con microscopio de contraste de fase. La c-
lula se encuentra en la etapa denominada metafa-
se de una divisin celular, por lo que se observan
claramente los cromosomas. La lnea clara angos-
ta entre las dos flechas se forma por irradiacin
con un haz de luz ultravioleta de 3 .m de an-
cho, que parece haber "desplazado" un corto seg-
mento de una hilera de cromosomas paralelos.
Esto se confirma al demostrar que los segmentos
claros de cromosomas ya no contienen DNA (me-
diante investigacin histoqumica, segn el mto-
do de Feulgen). x900. (Segn Bloom y zarslan.)
potencial elctrico entre el interior de la
clula y el medio (fig. 2-13). De esta mane-
ra es posible investigar los potenciales de
membrana variables de los tejidos nervio-
so y muscular.
Los microinyectores son una variante
especial de microelectrodos y se pueden
emplear para la inyeccin de cantidades
microscpicas (picolitros) de sustancias
dentro de las clulas. Una aplicacin es-
pecial es la inyeccin de un colorante que
difunde en las distintas partes del cito-
plasma y que se hace fluorescente con el
microscopio ptico. Con esta tcnica es
posible dibujar el contorno de cada clula
individual en tejidos con estructuras muy
complicadas, por ejemplo, del sistema
nervioso central (fig. 2-14).
Utilizacin de haces de rayos angostos
y de alta energa. Mediante aparatos es-
peciales es posible concentrar protones
en un haz de rayos con un dimetro de
2,5 f.1m, y con irradiacin ultravioleta se
pueden lograr dimetros de alrededor de
1 f.1m. Este microrrayo es tan angosto que
puede incidir y, en consecuencia, destruir
los componentes ip.dividuales del ncleo
celular, por ejemplo, parte de un cromoso-
ma (fig. 2-15). En el ltimo tiempo se han
utilizado especialmente los rayos lser
con este propsito.
Microcinematografa. Si bien esta tc-
nica no implica en s misma una manipu-
lacin directa de clulas vivas, representa
un mtodo importante para su observa-
cin. La microcinematografa (gr. kinema,
movimiento) es una tcnica que registra
en una pelcula (como imgenes vivas) lo
que se observa a travs del objetivo de un
microscopio, mediante una cmara de vi-
deo. Tiene especial importancia para el
anlisis de movimientos cuando son de-
masiado rpidos o lentos para poder ser
considerados directamente. Por ejemplo,
con una aceleracin de cien veces es posi-
ble observar la divisin celular y, adems,
se puede observar cmo se desplazan las
mitocondrias dentro de la clula viva.
Por el proceso inverso (frenando los
movimientos muy rpidos) es posible
analizar, por ejemplo, los movimientos de
las cilias.
Mtodos de fraccionamiento
celular
Mediante los mtodos de fracciona-
miento celular es posible separar los dis-
tintos componentes celulares y mantener,
al mismo tiempo, sus funciones. Por lo
tanto, los mtodos de fraccionamiento ce-
lular han jugado un importante papel en
la resolucin de la organizacin funcional
de la clula.
Centrifugacin diferencial (centrifuga-
cin dinmica). ste es el mtodo ms uti-
lizado para la separacin de organelas ce-
lulares. Antes de la centrifugacin se efec-
ta una homogenizacin. Se colocan pe-
queos trozos de tejido en una solucin
adecuada (p. ej., de sacarosa) que contri-
buye a mantener intactas las organelas y
se opone a su tendencia a agruparse. Des-
pus se coloca la solucin con los trozos
de tejido en un hornogenizador, que pue-
de tener la forma de un cilindro de vidrio,
en el cual rota a gran velocidad una vari-
lla de tefln (fig. 2-16). Los trozos de te ji-
do son aplastados por la friccin de la va-
rilla contra las paredes del cilindro. As se
rompen las membranas celulares y que-
dan libres en la solucin las organelas y
las inclusiones. Se pueden utilizar otros
mtodos para la hornogenizacin de las
clulas y los tejidos, por ejemplo ultraso-
nido. Despus de unos minutos de reposo
se centrifuga el sobrenadante (lat. super-
natant, t1otante) con velocidad moderada
y temperatura apenas superior a 0C. Des-
pus de la sedimentacin de las partculas
ms pesadas se puede hacer sedimentar
las partculas con masa menor, mediante
centrifugaciones con velocidades crecien-
tes. La identificacin de una fraccin y la
evaluacin de su grado de pureza, en el
caso de los ncleos celulares, se puede
efectuar por microscopia de contraste de
fase. Las partculas ms pequeas (es de-
cir, la mayora) deben ser identificadas
mediante microscopia electrnica de los
cortes ultrafinos del sedimento slido ob-
tenido por centrifugacin, el denominado
"pellet". De esta manera se tiene la seguri-
dad de que las fracciones no contienen
mezclas de distintos tipos de organelas.
Centrifugacin por gradientes de den-
sidad (centrifugacin equilibrada). Con
este mtodo es posible obtener mayor
cantidad de fracciones ms limpias que
con la centrifugacin diferencial. Se ob-
tiene el hornogenizado corno en el caso
anterior y se agrega una solucin de, por
ejemplo, sacarosa, que contiene concen-
traciones crecientes de sacarosa a medida
que se acerca al fondo, es decir, con den-
sidad creciente. La centrifugacin prolon-
gada a gran velocidad hace que las part-
culas sedimenten en el sitio que les per-
mite su densidad (se detienen cuando al-
canzan una "profundidad" equivalente a
su propia densidad).
De esta manera se logra obtener fraccio-
nes casi puras de ncleos, elementos nu-
cleares, rnitocondrias, lisosornas, riboso-
rnas, retculo endoplasrntico y grnulos
de secrecin. Estos hornogenados celula-
res fraccionados, en los cuales los compo-
nentes mantienen su funcin biolgica, se
denominan sistemas libres de clulas. El
estudio de estos sistemas libres de clulas
ha contribuido con gran parte del conoci-
miento actual sobre la biologa molP-r.ular
de la clula, por ejemplo respecto a la re-
plicacin y la transcripcin del DNA y a
la sntesis de protenas.
En aos recientes, los mtodos de frac-
cionamiento celular han sido suplementa-
dos con varias tcnicas para la investiga-
cin de rnacrornolculas, entre ellas dis-
tintas formas de cromatografa y de elec-
troforesis. Sin embargo, estas tcnicas
pertenecen ms a la parte bioqumica de
la biologa celular y no se las incluir en
esta presentacin general (se refiere al lec-
tor a textos de biologa molecular y bio-
qumica), si bien es obvio que se har re-
ferencia a ellas en relaciones relevantes
de los prximos captulos.
Preparacin e investigacin
de tejidos muertos
El estudio directo de clulas y tejidos
vivos slo tiene aplicaciones limitadas. Es
difcil diferenciar los distintos componen-
tes entre s con la microscopia de transmi-
sin, dado que tienen igual grado de re-
fraccin de la luz. Adems, por lo general
el tejido presenta un espesor tal que la pe-
netracin de la luz es demasiado escasa.
En consecuencia, se utiliza con mucha
mayor frecuencia el tejido muerto, que se
mantiene mediante acciones qumicas in-
mediatamente despus de extrado y en-
tonces se corta en secciones muy delga-
das, denominadas cortes histolgicos.
Despus de la tincin con distintos colo-
rantes se observan los cortes con el mi-
croscopio ptico, dado que el mayor con-
traste entre los componentes tisulares per-
mite diferenciarlos. Es obvio que al prepa-
rar los cortes histolgicos se debe procu-
rar mantener, en lo posible, el aspecto de
las estructuras en el organismo vivo.
Preparacin de tejidos
para microscopia ptica
Fijacin. Las clulas se matan con la fi-
jacin, para detener los procesos celulares
dinmicos con la mayor rapidez posible y
mantener la estructura con las mnimas
modificaciones posibles. Esto se logra con
la insolubilizacin de los componentes
estructurales de la clula y la formacin
de enlaces cruzados, por la accin de dis-
tintos agentes qumicos, los fijadores. En
el proceso de fijacin se estabilizan las
protenas, porque los fijadores favorecen
la formacin de enlaces cruzados entre las
molculas proteicas. De esta manera se
mantienen todas las relaciones entre las
estructuras corno en la clula viva. Las
CAPTULO 2
mtico del procedimiento
de fraccionamiento ce-
lular (vase el texto para
los detalles).
CAPTULO 2
Clula intacta
\
Reposo
} de u}
Homogeneizacin
.,. 0 0

, . .. , . f; . .
Homogenado .. . a
conectivo
Sobrenadante
' \!/ , .,

Sobrenadante
100.000 g, 1 hora
Mitocondias \ 1\1
.... ,,,
...
centrifugacin {u
Sobenadante r }
"Microsomas" O 8 O
Complejo de Golgi O () \j e:::::,
o o
e::::>

o
Centrifugacin u
200.000 g, 1 hora
}
protenas solubles se unen a las estructu-
rales y se transforman as en insolubles.
Al mismo tiempo se alcanza cierta fuerza
mecnica, que posibilita los pasos si-
guientes del proceso de preparacin. Al-
gunos fijadores como, por ejemplo, el for-
maldehdo y, en especial, el glutaraldeh-
..
.:: , :; . '" 1
do son especialmente efectivos en lo refe-
rido a la formacin de enlaces transversa-
les. Estos dos fijadores, junto con el tetr-
xido de osmio, que tambin forma enlaces
transversales, son algunos de los agentes
ms efectivos. Mantienen el aspecto de la
clula en condiciones muy similares a las
que se observan con el microscopio de
contraste de fase, como control de la es-
tructura de las clulas vivas.
La fijacin tambin produce la inactiva-
cin de algunas de las enzimas celulares,
las cuales de otro modo iniciaran la auto-
digestin o autlisis y conduciran a la
degeneracin post mortem (lat. mors,
muerte). Adems, se eliminan bacterias y
muchos otros microorganismos, que po-
dran destruir el tejido.
En la prctica, la fijacin se lleva a ca-
bo por inmersin de un pequeo trozo
de tejido en el fijador, apenas se haya to-
mado la muestra. Es conveniente reali-
zar la extraccin del tejido mediante
pinzas y una cuchilla afilada, y procurar
no daar el tejido. Para los tejidos huma-
nos, esto se puede efectuar durante pro-
cedimientos quirrgicos o por biopsia
(gr. bios, vida; opsis, sin), es decir, una
muestra de tejido extrada del organismo
vivo. De los tejidos accesibles directos ,
como la piel, se puede tomar la muestra
por corte con cuchillo, pero tambin es
posible tomar muestras de rganos inter-
nos como, por ejemplo, el hgado o el ri-
n, mediante cnulas especiales. Las
biopsias tambin se pueden extraer du-
rante procedimientos como endoscopias
(gr. endon, dentro; skopein, ver), es decir
estudios internos de cavidades mediante
un instrumento munido de una fuente
luminosa, el endoscopio. Despus de la
extraccin del tejido se lo sumerge en el
fijador, en la fijacin por inmersin, a
diferencia de la fijacin por perfusin,
que se puede aplicar a animales de expe-
rimentacin. En este caso se inyecta el
fijador en el torrente sanguneo del ani-
mal vivo anestesiado y el fijador llega
por va hematgena rpidamente a todo
el tejido. De esta manera se logra matar
todas las clulas de un rgano completo
en forma casi instantnea despus de in-
terrumpir la administracin de oxgeno,
y se obtiene una fijacin ms rpida y
uniforme. El mtodo se aplica en traba-
jos muy exigentes, por ejemplo prepara-
dos para microscopia electrnica, en los
que se destacan con nitidez incluso las
pequeas modificaciones estructurales
post mortero.
Inclusin y corte. El tejido fijado se cor-
ta en secciones delgadas, que permiten el
paso de la luz. La mayora de los prepara-
dos para microscopia ptica tienen un es-
pesor de alrededor de 5-1 O f.1m, para lo
que se requiere un micrtomo, instrumen-
to similar, en principio, a una cortadora
de fetas . Para obtener la consistencia ne-
cesaria para poder cortar secciones tan
delgadas es necesario incluir antes el teji-
do en un material que, al solidificarse, le
confiera suficiente dureza. Las sustancias
Fig. 2-17. La ilustracin muestra el corte de
tejidos incluidos en un micrtomo de parafi
na. Tras el corte se renen los trozos en serie
sobre una pequea "cinta transportadora" y se
colocan en el bao de agua caliente de la dere-
cha para que se estiren. A continuacin se
montan sobre portaobjetos y se procesan. So
bre la mesa se ven 7 bloques de parafina, en
los que se distinguen los trozos de tejido inclui-
dos. Cada bloque est fijado a un pequeo cu-
bo de madera que se ajusta al micrtomo du-
rante el corte del bloque.
adecuadas para este fin, los medios de in-
clusin, son tipos de cera insolubles en
agua, por lo general parafina. En conse-
cuencia, antes de la inclusin, es necesa-
rio deshidratar el tejido. Para ello se pasa
el tejido por una serie de soluciones acuo-
sas de etanol en concentraciones crecien-
tes, hasta llegar al anhidro. El tejido se su-
merge entonces en un lquido miscible en
etanol y parafina, por ejemplo xileno, pro-
ceso denominado "aclaramiento". Des-
pus del aclaramiento se coloca el tejido
en parafina lquida, que disuelve el xileno
y penetra as en el tejido. Al enfriar, se so-
lidifica la parafina y forma, junto con el
tejido incluido, un bloque slido o "taco",
que es lo que se secciona (fig. 2-17).
A pesar de los cuidados, se producen
ciertas modificaciones al procesar el taco.
El alcohol y el xileno extraen grasas y el
calentamiento de la inclusin inactiva
muchas enzimas; adems, a menudo el te-
jido se contrae de modo perceptible. Para
evitar estos problemas, a veces se efecta
un corte por congelamiento de tejido fija-
do o no. Un taco de tejido congelado tiene
consistencia suficiente para ser cortado
en un cristato (vase fig. 2-33, pg. 43).
La tcnica de congelacin es tan rpida
que se pueden obtener secciones en pocos
minutos. Se utiliza, por ejemplo, para de-
terminar si el material de una biopsia ex-
trada en un acto quirrgico es benigno o
maligno. El resultado de la biopsia se ob-
tiene mientras el paciente permanece
CAPTULO 2
CAPTULO 2
anestesiado, por lo que el cirujano puede
decidir en el momento el alcance del pro-
cedimiento quirrgico.
Mtodo de congelacin-desecacin.
Con este mtodo se intenta lograr que la
variacin estructural y la extraccin qu-
mica sean las mnimas posibles, para
conservar la actividad enzimtica. Se
congela rpidamente el trozo de tejido y
se lo coloca en una cmara de vaco aba-
ja temperatura, despus se seca (se deshi-
drata) por evaporacin lenta (sublima-
cin) del agua.
En la congelacin-sustitucin se efec-
ta primero una fijacin moderada y un
tratamiento con sacarosa, despus una
congelacin rpida del tejido y a conti-
nuacin una deshidratacin a -85C en
metanol puro. Una vez eliminada el agua
se transfiere el tejido a un medio de inclu-
sin plstico adecuado, que se infiltra
mientras se incrementa gradualmente la
temperatura hasta alrededor de -zooC. Por
ltimo se polimeriza por irradiacin con
luz ultravioleta el medio de inclusin,
que se seca, y ya se puede cortar el taco
terminado.
Fig. 2-18. Fotomicrografa que muestra las ga-
mas de color del mtodo de tincin histolgica
de uso ms frecuente, la coloracin con he-
matoxilina-eosina (HE). El corte de tejido es
de pncreas, por lo que se distingue un islote
de Langerhans, con clulas cuyo citoplasma se
tie de color rosa claro con la eosina, y nume-
rosos cinos, con clulas cuyo citoplasma se ti-
e de azul lilceo con la hematoxilina en la zo-
na basal y de rosa con la eosina, en la porcin
apical. x660.
El mtodo es muy poco agresivo con el
tejido y es apropiado para muchos proce-
dimientos inmunohistoqumicos (vase
ms adelante).
Coloracin. Los cortes de tejido se sue-
len montar sobre portaobjetos y se colo-
rean. La mayora de los colorantes histol-
gicos se utilizan en solucin acuosa, por
lo que los cortes incluidos en parafina de-
ben ser "desparafinados", mediante un
tratamiento con xileno, y rehidratados por
pasajes por concentraciones decrecientes
de alcohol en agua, antes de ser teidos.
Los cortes por congelacin se pueden tra-
tar con las soluciones acuosas inmediata-
mente despus de seccionados.
La mayor parte de los mtodos de tin-
cin histolgicos se desarrollaron en fun-
cin de su capacidad para teir selectiva-
mente los distintos componentes tisula-
res. El mtodo de tincin ms utilizado es
la combinacin de hematoxilina y eosina
(HE), que tie los componentes nucleares
de azul violceo, mientras que casi todas
las estructuras citoplasmticas adquieren
una tonalidad rosada (fig. 2-18). En con-
secuencia, la tincin con HE muestra con
nitidez la forma yla estructura del n-
cleo, adems de la forma y la extensin
de la clula. Cabe destacar, sin embargo,
que la tincin histolgica es un pro ce di-
miento qumico y que se ha producido
un gran desarrollo en los mtodos que in-
forman sobre la composicin qumica de
las clulas y los tejidos. Esto se ver con
mayor detalle en la seccin sobre histo-
qumica.
Despus de la tincin, por lo general se
deshidrata y se aclara nuevamente la
muestra de tejido y entonces se monta, es
decir, se cubre con una gota de medio de
montaje transparente (Depex, Eukitt). Por
ltimo se coloca un cubreobjeto para pro-
teger el preparado. Algunos medios de
montaje son miscibles en agua, por lo que
se puede montar inmediatamente, sin ne-
cesidad de deshidratacin y aclaramiento.
Preparacin de tejidos
para microscopia electrnica
Debido al poder de resolucin mucho
mayor del microscopio electrnico, en es-
te caso se agudizan las exigencias de man-
tener las estructuras originales del tejido.
Para la fijacin se suele utilizar glutaral-
dehdo. Tambin se puede emplear tetr-
xido de osmio que, adems de fijar el teji-
do, se une con las membranas lipoprotei-
cas y as logra mayor contraste en la ima-
gen del microscopio electrnico. Esto se
debe al aumento de la dispersin de elec-
trones por la membrana, a causa del eleva-
do nmero atmico del osmio. En conse-
cuencia, se habla de "tincin" o contras-
tado. El contrastado con osmio se emplea
a menudo despus de la fijacin con glu-
taraldehdo, que por s misma no aumen-
ta el contraste.
Despus de la fijacin se deshidrata y
se incluye el tejido. Para la inclusin se
suelen utilizar resinas epoxi y distintos
materiales plsticos, que adquieren gran
dureza despus del secado y permiten la
seccin de cortes ultrafinos.
'?
. . '
- .. ""
"""' ":. .......
., .;_, _ Fig. 2-19. Imagen de un
,. corte ultrafino captada
con microscopio elec-
trnico, aumentada
13.000 veces. La imagen
muestra la pared de un
tbulo renal, y se observa
con claridad una clula
del tbulo completa, ro-
deada de partes de dos
clulas vecinas. Ntese la
gran riqueza de detalles
que facilitan la identifica-
cin de organelas e inclu-
siones, por ejemplo, mito-
condrias (M. (Cedida por
A.B. Maunsbach.)
El haz de electrones se detiene con faci-
lidad, por lo que los cortes de tejido utili-
zados no deben exceder de 20-100 nm.
Desde el punto de vista tcnico, el corte
de estas secciones ultrafinas es muy di-
fcil y se necesita un ultramicrtomo,
con una cuchilla de vidrio o de diaman-
te. El corte se controla con un microsco-
pio y se aumenta el contraste mediante
el pasaje rpido de las secciones por una
CAPTULO 2
CAPTULO 2
-
Fig. 2-20. Fotomicrografa de un corte semifi-
no de tejido de rin. Tras la fijacin se incluy
el tejido en plstico y se cort en secciones de
1 11m de espesor, que se colorearon con azul
de toluidina. x660.
solucin de acetato de uranilo. Por lo
general no es necesario eliminar el pls-
tico de inclusin, dado que es homog-
neo y transparente, y adems estabiliza
el preparado durante el anlisis con el
microscopio. Los cortes ultrafinos se
montan despus de la seccin sobre un
pequeo reticulado de cobre, denomina-
do "grilla", que suele estar cubierto por
una pelcula plstica de sostn muy del-
gada. En la observacin microscpica
(fig. 2-19), el haz de electrones atraviesa
el corte por los orificios de la grilla.
La gran calidad tcnica que se obtiene
con la preparacin de tejidos para la mi-
croscopia electrnica tambin se aplica
para la microscopia ptica, con los cor-
tes semifinos, de alrededor de 1 ..trn de
espesor, y la posterior tincin con, por
ejemplo, azul de toluidina (fig. 2-20). Se
usa azul de toluidina por su capacidad
para penetrar en los medios de inclu-
sin de resinas epoxi, lo cual no ocurre
con los colorantes histolgicos comu-
nes. Los cortes sernifinos tambin se
pueden seccionar despus de ser inclui-
dos en resinas acrlicas (en lugar de re-
sinas epoxi), que dan resultados de cali-
dad muy similar y permiten la tincin,
por ejemplo, con hematoxilina y eosina
(fig. 2-21).
Congelacin y fractura (ing. freeze-
cleaving o freeze-fracture). Es una tcni-
Fig. 2-21. Fotomicrografa de la crnea. Es un
corte semifino de tejido incluido en resina
acrlica y teido con hematoxilina-eosina. x440.
ca nueva que se aplica a la investigacin
de tejidos por microscopia electrnica.
Consiste en congelar rpidamente el te-
jido en nitrgeno lquido y luego colo-
carlo en vaco, para despus fracturarlo
con un cuchillo o navaja (de modo simi-
lar a corno se parte un ladrillo). Se colo-
ca entonces vapor de platino sobre la su-
perficie de fractura, en ngulo inclina-
do, lo que forma una delgada plantilla
de platino de esa superficie, o rplica,
que acenta las formas del relieve. Se
refuerza entonces la rplica de platino
mediante la aplicacin de partculas de
carbn. A continuacin se elimina el te-
jido con un cido fuerte y se monta la r-
plica de platino sobre una grilla, para la
observacin con el microscopio electr-
nico de transmisin, dado que el haz de
electrones es capaz de atravesar la rpli-
ca delgada.
Las ventajas del mtodo son evitar las
acciones de los fijadores qumicos y de los
medios de deshidratacin y de inclusin,
por lo que se han podido comparar las es-
tructuras de los tejidos fijados y no fijados
con el microscopio electrnico (fig. 2-22).
El mtodo tiene aplicacin especialmente
importante en la investigacin de las es-
tructuras internas de las membranas (va-
se con ms detalle en el cap. 3).
El poder de resolucin es de alrededor
de 3 nm.
Mtodos histoquinicos
El elemento fundamental de los mto-
dos histolgicos es la utilizacin de ac-
ciones fsicas y qumicas sobre prepara-
dos histolgicos, para determinar la lo-
calizacin de sustancias qumicas en las
clulas y los tejidos. Para la histoqumica
es esencial la localizacin, dado que el
empleo de cortes de tejido puede dar in-
formacin sobre la localizacin, imposi-
ble de obtener por determinaciones bio-
qumicas obtenidas de homogenados de
tejidos.
Antes de la reaccin histoqumica en s
es necesario efectuar una fijacin y una
preparacin adecuadas, que conserven la
sustancia qumica estudiada y las estruc-
turas celular y tisular. Los lpidos son so-
lubles en solventes orgnicos como el xi-
lena, por lo que se deben evitar cuando se
estudian esos compuestos. Debido a la ac-
cin desnaturalizante de los agentes fija-
dores sobre las protenas, la mayora de
las enzimas se inactivan con la fijacin
pero, por otra parte, algunas enzimas son
solubles y se pierden si no se lleva a cabo
una fijacin previa a la determinacin his-
toqumica.
La reaccin histoqumica debe inducir
la formacin de un producto insoluble
visible. En consecuencia, debe ser colo-
reado o poder transformarse en fluores-
cente. Para la microscopia electrnica es
necesario que posea electrondensidad
suficiente.
Se debe considerar la sensibilidad de la
reaccin histoqumica, dado que los re-
sultados negativos no se pueden interpre-
tar de inmediato como ausencia de la pro-
piedad buscada. Es posible que la canti-
dad presente sea demasiado pequea para
ser detectada, o que la sustancia se haya
perdido o modificado durante la prepara-
cin previa.
Se pasa gradualmente de los mtodos
de tincin morfolgicos a los procedi-
mientos histoqumicos ms especficos.
Por lo tanto, se vern primero algunas
reacciones ms generales antes de anali-
zar los principales mtodos histoqumi-
cos.
Fig. 2-22. Imagen de la
rplica de un preparado
realizado por congela-
cin y fractura, captada
con microscopio elec-
trnico. La imagen mues-
tra una clula epitelial (del
plexo coroideo cerebral) y
se observan con claridad
el nucleolema y sus po-
ros. x22.400. (Cedida por
B. Van Deurs.)
CAPTULO 2
Fig. 223. Fotomicrografa
de un corte de la mdula
espinal teido con tionina.
En el centro de la imagen
se distingue una neurona
(una clula motora del as-
ta anterior, n) con nuclo-
lo basfilo y cmulos ci-
toplasmticos muy ba-
sfilos. x440.
CAPTULO 2
Acidofilia y basofilia
Para obtener suficiente contraste de co-
lor en los cortes histolgicos comunes,
por lo general se emplean combinaciones
de colorantes cidos y bsicos. Tradicio-
nalmente se denomina acidofilia (gr. fi-
lein, amar) a la capacidad de tincin de
los colorantes cidos y basofilia a la capa-
cidad de tincin de Jos colorantes bsicos,
pero la designacin de colorantes "ci-
dos" y "bsicos" proviene de la era clsi-
ca de la histologa, cuando las definicio-
nes de cidos y bases diferan de las ac-
tuales (un cido es una sustancia capaz de
liberar un protn y una base es una sus-
tancia capaz de aceptar un protn). En el
lenguaje histoqumico, un colorante ci-
do (aninico) tiene capacidad para formar
un enlace electrosttico (iongeno) con
un grupo tisular con carga positiva. En
contrast e, un colorante bsico (catinico)
puede formar un enlace electrosttico con
un grupo tisular con carga negativa.
As, las uniones entre colorantes cidos
( aninicos} y bsicos ( catinicos} y los
grupos tisulares tienen, esencialmente,
caractersticas electrostticas. En un corte
de tejido, el esqueleto proteico y muchas
otras macromolculas contienen grupos
ionizables, capaces de formar enlaces
electrostticos con los colorantes. Las dis-
tintas protenas de un corte de tejido tie-
nen diferentes puntos isoelctricos, dado
que varan las composiciones de amino-
cidos. Para las tinciones histolgicas co-
munes se utiliza un pH del que se conoce
por experiencia su buen contraste de co-
lor. Con el pH elegido, algunos compo-
nentes tisulares son acidfilos, mientras

"\ ...
. .
-

..
*'
..
. ' .
. .
que otros sern basfilos (fig. 2-18), pero
siempre en relacin con el pH. A pH neu-
tro, el DNA y el RNA presentan fuerte ba-
sofilia, debido a la disociacin de los gru-
pos fosfato de las molculas (fig. 2-23).
Con ese mismo pH, la mayora de las pro-
tenas citoplasmticas son acidfilas.
Cuando se desea analizar si la basofilia
se debe a los cidos nucleicos de, por ejem-
plo el RNA, antes de la tincin se puede
tratar el corte control con la enzima ribonu-
cleasa. De esta manera se elimina el RNA
del corte control , por lo que las zonas ricas
en RNA ya no sern basfilas. El DNA se
identifica de modo similar, con la aplica-
cin de la enzima desoxirribonucleasa.
Con la fijacin se modifican las propie-
dades de las protenas, debido a la desna-
turalizacin, y el resultado es un aumento
de la afinidad por el colorante.
Para algunos mtodos de tincin, por
ejemplo la coloracin tricrmica de Ma-
llory, se utilizan varios colorantes, todos
cidos, que tien distintas estructuras tisu-
lares. Se desconoce el fundamento qumico
de la unin entre los colorantes y los com-
ponentes tisulares, debido a que estos m-
todos no son especficos, desde el punto de
vista histoqumico. Por el contrario, se de-
nominan selectivos cuando tien determi-
nados componentes tisulares (fig. 2-24).
Los mtodos de tincin selectivos tienen
Fig. 2-24. Fotomicrografa de un preparado de
la cpsula de un rgano, coloreado por el mto-
do de Mallory. Se observa una tincin selecti-
va, dado que, entre otras, las numerosas fibras
colgenas del tejido conectivo se colorean de
azul intenso. x275.
Sitio de unin en el
polianin
Metacromasia
(rojo)
Molcula de
colorante
Ortocromasia (azul)
Fig. 2-25. Dibujo esquemtico de la metacro-
masia, que muestra la agregacin de las mol-
culas de colorante sobre la superficie de un po-
lmero polianinico de elevado peso molecular
(p. ej., un glucosaminoglucano en un cartlago)
con viraje del color azul del colorante a violeta
rojizo. (Segn Bradley y Wolf.)
gran valor prctico, dado que el mayor con-
traste de color facilita la identificacin de
los distintos componentes del tejido.
Metacromasia
Cuando se tien ciertos componentes
tisulares, como por ejemplo, la matriz car-
tilaginosa, con el colorante azul de tolui-
dina, se modifica el color azul a prpura o
rojo violceo por unin con el tejido. Esta
variacin cromtica se denomina meta-
cromasia (gr. meta, variacin; kroma, co-
lor) y los colorantes capaces de sufrir esta
transformacin se denominan colorantes
metacromticos. Pertenecen a este tipo de
agentes ciertos colorantes bsicos, de los
cuales los ms importantes son los deriva-
dos tiaznicos azul de toluidina y tionina.
Una solucin diluida de un colorante
tiaznico es azul, debido a que se encuen-
tra como monmero. Si la solucin es
concentrada, el colorante se agrega y for-
ma polmeros, por lo que el color vira al
rojo. As, un colorante tiaznico puede
presentar distinto color, de acuerdo con el
estado de agregacin de las molculas y
es precisamente este estado de agrega-
cin, que puede ser modificado por los
componentes tisulares, el que produce la
metacromasia. Si se tie un corte con una
solucin diluida de azul de toluidina, es-
te colorante catinico forma enlaces elec-
trostticos con los sitios aninicos y, por
los componentes tisulares capaces de ser
teidos metacromticamente (hay poli-
aniones de alto peso molecular), se agre-
gan las molculas del colorante (fig. 2-25).
En consecuencia, el colorante vira a rojo.
Los componentes tisulares que se colo-
rean por metacromasia son, en su mayor
parte, los muy cidos glucosaminogluca-
nos sulfatados de la matriz cartilaginosa
(fig. 2-26) y los mastocitos del tejido co-
nectivo, que contienen la sustancia po-
lianinica heparina. Las nucleoprotenas
presentan metacromasia moderada.
Mtodos basados en la reaccin
de Schiff para grupos aldehdo
El reactivo de Schiff es la leucofucsina
formada por el tratamiento del colorante
rojo fucsina con bisulfito. La leucofucsina
es incolora, pero forma un producto de
adicin estable rojo con los grupos aldeh-
do. Esta reaccin se incluye como paso fi-
nal de dos importantes mtodos de tin-
cin histoqumicos: la reaccin del cido
perydico-Schiff para compuestos ricos
en hidratos de carbono y la reaccin de
Feulgen para DNA.
Mtodo del cido perydico-Schiff(PAS).
La reaccin de PAS se emplea para deter-
minar la presencia de macromolculas ri-
cas en hidratos de carbono como el gluc-
geno y las glucoprotenas.
El principio del mtodo de PAS se basa
en que el cido perydico (HI0
4
) oxida
primero los grupos hidroxilo libres de dos
tomos de carbono adyacentes, por lo que
se transforman en grupos aldehdo. Al
mismo tiempo se escinde la unin entre
los tomos de carbono, por lo que se detie-
ne la oxidacin. Los grupos aldehdo neo-
formados reaccionan entonces con el
fa de un corte de tr-
quea teido con hemato-
xilina-eosina, que mues-
tra un ejemplo de meta-
cromasia. La ancha zona
intensamente rojo viol-
cea de la mitad inferior
de la imagen es cartlago
hialino (e), cuya sustancia
basal se tie por meta-
cromasia. x110.
CAPTULO 2
fa de una tincin con el
mtodo de PAS de un
preparado de la mucosa
del intestino delgado. En
el epitelio se distinguen
clulas caliciformes de
color rojo intenso, que
contienen secrecin
(una glucoprotena) que
se tie con la reaccin
de PAS. x275.
Fig. 2-28. Muestra el
principio del mtodo de
Feulgen, en el que los
grupos pricos del DNA
son eliminados por hidr-
lisis cida dbil.
CAPTULO 2
,
'

reactivo de Schiff, para dar lugar a la apa-
ricin del color rojo magenta caractersti-
co (fig. 2-27).
Varios componentes tisulares reaccio-
nan con el mtodo de PAS, se dice que
son "FAS-positivos", como se ver en los
prximos captulos.
Para determinar si una sustancia FAS-po-
sitiva est compuesta por glucgeno se tra-
ta un preparado control con la enzima ami-
lasa, que escinde el glucgeno especfica-
mente, antes de realizar la tincin de PAS.
Mtodo de Feulgen. Es un mtodo espe-
cfico para la determinacin histoqumica
de DNA, sobre la base del contenido de
desoxirribosa en el DNA. Se eliminan los
grupos purnicos del DNA por medio de
una hidrlisis cida suave. De esta mane-
ra se abre el anillo de la desoxirribosa y se
forma un grupo aldehdo (fig. 2-28), que
-o- p- o =
1
o
1
1 Base prica 1
H H J:l idrl isis
ac1da suave
H
O H
1
-o- P- o =
1
o
1
Fig. 2-29. Fotomicrografa de un preparado del
extremo de la raz de una cebolla, teida con el
mtodo de Feulgen, especfico para DNA. S-
lo se tie de rojo la cromatina del ncleo (que
contiene DNA). El color verde del citoplasma se
debe al colorante de contraste verde claro. En-
tre otras, en el centro de la imagen se distingue
una clula en mitosis (divisin), donde los cro-
mosomas estn bien teidos. x440.
reacciona con el reactivo de Schiff, con
aparicin del color rojo caracterstico en el
sitio que corresponde al DNA (fig. 2-29) .
Como control se utilizan cortes tratados
con la enzima desoxirribonucleasa antes
de la tincin de Feulgen.
Por lo general, los materiales positivos
para Feulgen se limitan a la cromatina nu-
clear. Como se ver, en el captulo 3, las
mitocondrias poseen DNA, pero en canti-
dad demasiado pequea para ser detecta-
da con el mtodo de Feulgen.
Determinacin histoqumica de lpidos
Despus de la fijacin de los lpidos
con formalina se cortan secciones conge-
ladas, para evitar la extraccin de los lpi-
dos mediante solventes orgnicos. Para la
demostracin histoqumicase utilizan
muy a menudo los denominados coloran-
tes Sudn. Son casi insolubles en agua,
por lo que se utilizan disueltos en alcohol
diluido, que no disuelve las grasas. La
"tincin" se produce cuando las molcu-
las del colorante se distribuyen entre los
lpidos y el solvente, en relacin corres-
pondiente a la solubilidad en los dos me-
dios. Pare evitar la extraccin del coloran-
U pido Adipocitos
Fig. 230. Fotomicrografa de un corte congela-
do de tejido adiposo teido con rojo Sudn
para los lpidos de los adipocitos (se us "Light
Green" como colorante de contraste). x440.
te y los lpidos se incluyen los cortes, des-
pus de la tincin, en un medio acuoso.
De este modo, los colorantes Sudn ti-
en con intensidad los triacilgliceroles,
como por ejemplo, en la tincin de los
adipocitos con rojo Sudn (fig. 2-30). El
negro Sudn tiene gran utilidad en la tin-
cin de las vainas de mielina de las fibras
nerviosas, compuestas por lipoprotenas.
Determinacin histoqumica de enzimas
Las enzimas tienen vital importancia en
el metabolismo celular, dado que actan
como catalizadore's biolgicos de casi to-
das las reacciones qumicas celulares. En
consecuencia, es muy importante conocer
con exactitud la localizacin histoqumica
de las enzimas. Entre los numerosos mto-
dos enzimohistoqumicos, algunos tam-
bin se pueden utilizar para el microsco-
pio electrnico. En estos casos se requiere
un producto electrondenso, compuesto
por cantidad suficiente de partculas pe-
queas para sacar provecho del gran poder
de resolucin del microscopio electrnico.
Las sustancias que son escindidas o
afectadas de alguna manera por las enzi-
mas se denominan sustratos. Las enzimas
se caracterizan por la especificidad de sus-
trato. As, en muchos casos una enzima ac-
ta slo sobre un nico sustrato. Es preci-
samente en la especificidad de sustrato que
se basa la localizacin histoqumica exacta
de las enzimas, dado que de distintas ma-
neras se obtiene un producto de reaccin
visible que se expresa en el sitio de la reac-
cin y seala la localizacin de la enzima.
Para muchas enzimas, la reaccin his-
toqumica se puede describir de la si-
guiente manera: A es el sustrato, que se
escinde a B + C. Se agrega un reactivo R,
enzima
A - - ~ B R t + C
R
capaz de formar un complejo insoluble
con B o con C (fig. 2-31).
La reaccin enzimtica se produce
cuando los cortes se incuban, es decir, se
colocan en un lquido que contiene los
reactivos necesarios para determinar la
actividad enzimtica en cuestin.
En el esquema de reaccin de la figura
2-31, por lo general BR es incoloro y des-
pus de la incubacin suele sufrir una
transformacin secundaria para dar un
precipitado coloreado, que se observa con
el microscopio ptico (fig. 2-32).
Dado que casi todas las enzimas son
protenas, la mayora de los fijadores dis-
minuye la actividad enzimtica, aunque
en grado variable para las distintas enzi-
mas. Se conserva la mayor parte posible
de la actividad enzimtica cuando se sec-
cionan en un cristato cortes congelados
de tejido no fijado, entre -1ooc y -20C
(fig. 2-33), aunque con el riesgo de que la
enzima se extraiga por dilucin, cuando
se descongele el corte. La fijacin impide
o inhibe esta extraccin.
Mtodos inmunohistoqumicos
El organismo est en condiciones de
reaccionar ante sustancias extraas o ant- -
genos, y formar anticuerpos especficos,
que se unen con los antgenos. Por lo gene-
ral actan como antgenos las macromol-
culas proteicas o polisacridas. Los anti-
Fig. 2-32. Fotomicrografa de la determinacin
de fosfatasa cida mediante mtodos histo-
qumicos en un corte de tejido renal. Dentro de
las clulas, la fosfatasa cida est localizada en
organelas redondeadas denominadas lisoso-
mas que, en consecuencia, se identifican en la
imagen como granos o esferas negras. x870.
Fig. 2-31. El esquema
muestra la forma en que
habitualmente se produce
la reaccin histoqumica
con una enzima (vase
el texto para los detalles).
CAPTULO 2
Fig. 2-34. Fotomicrografa
captada con microscopia
de fluorescencia de un cor-
te de msculo de pollo. El
corte se colorea primero
con anticuerpo fluores-
cente contra miosina de
pollo, y se baa en una
solucin del anticuerpo. La
antimiosina se une a las
bandas A ricas en miosina,
por lo que stas se ven
fluorescentes {blancas en
la imagen). x750. (Segn
Finck, Holtzer y Marshall.)
CAPTULO 2
Fig. 2-33. La ilustracin muestra el corte de
trozos de tejido en un cristato. En principio
se trata de una cmara fra, en la que se ubica
un micrtomo, que se opera a travs de dos ori-
ficios en la parte anterior; el corte se vigila por
una ventana calefaccionada. Los cortes de teji-
do se congelan instantneamente al ser extra-
dos y se mantienen as a temperatura baja
constante (p. ej. -20C), durante todo el proce-
so de corte, lo que reviste especial importancia
en enzimohistoqumica.
cuerpos son protenas producidas por las
denominadas clulas plasmticas y circu-
lan por la linfa y la sangre. Las clulas pro-
ductoras de anticuerpos pertenecen al sis-
tema inmune del organismo, que protege
al individuo contra las macromolculas
extraas que intentan ingresar, por ejem-
plo, como componentes de bacterias o vi-
rus. As, los anticuerpos son un eslabn
importante en la defensa del organismo
contra las enfermedades infecciosas (vase
con ms detalle en el cap. 16). La reaccin
entre un antgeno y su anticuerpo es en ex-
tremo especfica.
Los mtodos inmunohistoqumicos se
basan sobre la utilizacin de un anticuer-
po especifico, que se marca mediante un
Fig. 2-35. Fotomicrografa de neuronas teidas
mediante inmunohistoqumica con anticuer-
po contra la molcula transmisora serotonina
(5-hidroxitriptamina), unido a peroxidasa. La
determinacin enzimohistoqumica de la peroxi-
dasa permite la identificacin del anticuerpo
despus de su unin con el antgeno del corte
de tejido y da origen a una reaccin de color ro-
jo parduzco. x440.
enlace qumico en una sustancia que se
puede transformar en visible, sin afectar la
capacidad del anticuerpo para formar un
complejo con el antgeno. El principio se
ilustra con la denominada tcnica de anti-
cuerpo fluorescente. Para localizar la pro-
tena muscular miosina se inyecta en un
conejo miosina purificada de msculo de
pollo. Al cabo de cierto tiempo, el suero
del conejo contendr anticuerpos contra el
antgeno miosina de pollo. A continuacin
se extrae el anticuerpo del suero del cone-
jo y se adosa a fluorescena. Cortes histol-
gicos extrados de pollo se baan en una
solucin del anticuerpo fluorescente (anti-
miosina), que se une especficamente con
la miosina del corte. El anticuerpo en ex-
ceso se elimina por lavado y se analiza el
preparado con el microscopio de fluores-
cencia (figs. 2-34, 2-36 y 2-37).
En lugar de marcar el anticuerpo con
fluorescena se puede adosar a la enzima
peroxidasa, por lo que se pueden identi-
ficar complejos antgeno-anticuerpo me-
diante la determinacin enzimohisto-
qumica de la peroxidasa (fig. 2-35). De
esta manera es posible utilizar el mtodo
para la microscopia electrnica. Ade-
ms, se puede acoplar el anticuerpo a la
protena electrondensa que contiene hie-

.: - L-iL
iV}.lfp. .p - .
.. n ' '
___ j

,.,, '
-_ _;
+
+
+
"J'
Fluorescena

Peroxidasa

Ferritina
rro, ferritina, o a partculas de oro, que
tambin se puede identificar con el mi-
croscopio electrnico (fig. 2-36).
La especificidad de los mtodos inmu-
nohistoqumicos depende totalmente de
que el antgeno utilizado se asle sin mez-
clas con otras sustancias, para que sea po-
sible producir anticuerpos puros con la
inmunizacin. En consecuencia, la inves-
tigacin del grado de pureza del antgeno
es un importante control del mtodo. Se
obtiene un antgeno totalmente puro
cuando se lo sintetiza, por ejemplo un po-
lipptido de secuencia de aminocidos
conocida. Es esencial sealar que no es
necesario aislar el anticuerpo primario es-
pecfico de la fraccin mezclada de anti-
cuerpos en el conejo inmunizado ni los
anticuerpos especficos anticonejo en la
cabra (vase recuadro).
lnmunohistoqumica indirecta
El mtodo inmunohistoqumico antes
descrito tambin se denomina mtodo di-
recto, hoy reemplazado casi totalmente
por una tcnica ms sensible, llamada
mtodo indirecto. En principio es un
procedimiento que consta de dos pasos:
primero se hace reaccionar el preparado
a analizar con un anticuerpo primario no
marcado dirigido contra el componente
que se desea demostrar. Cuando el anti-
cuerpo primario reaccion con el prepa-
rado se elimina el exceso, no fijado, y se
hace reaccionar el preparado con un an-
[ .. . l.l
En los ltimos aos ha sido posible ob-
tener gran cantidad de molculas de anti-
cuerpo totalmente iguales, los denomina-
dos anticuerpos monoclonales. La tcnica
para formarlos implica una fusin celular
de clulas de mieloma (una lnea celular
tumoral transformada) murinos con los
denominados linfocitos B, productores de
anticuerpo, del timo de ratones previa-
mente inmunizados por la inyeccin del
antgeno que se desea demostrar con el
anticuerpo monoclonal. Despus de la fu-
sin celular, las denominadas clulas de
hibridoma (hbridas de mieloma) forma-
das han adquirido la capacidad de las c-
lulas del mieloma de desarrollar un creci-
miento prolongado en cultivos celulares y
la capacidad de los linfocitos B de produ-
cir determinado anticuerpo. Despus de
la clonizacin de las clulas hbridas indi-
ticuerpo secundario marcado (p. ej.,
fluorescente), dirigido contra el anticuer-
po primario. Por ejemplo, si se obtuvo el
anticuerpo primario contra una protena
X del preparado por inyeccin de X en
un conejo, el anticuerpo secundario po-
dra ser un anticuerpo de cabra dirigido
contra anticuerpos de conejo en general,
obtenido por inyeccin del anticuerpo de
conejo en una cabra. Este mtodo es ms
sensible porque cada molcula del anti-
cuerpo primario reacciona con varias
molculas del anticuerpo secundario
marcado, y la reaccin se refuerza.
mtico del principio de la
inmunohostoqumica .
Se presentan los tres m-
todos ms usuales de de-
terminacin histoqumica
de protenas especficas
mediante anticuerpos
marcados.
CAPTULO 2
fa de un microtbulo den-
tro del citoplasma de fi-
broblastos provenientes
de un cultivo de tejido, de-
mostrado por inmunohis-
toqumica mediante la
utilizacin de un anti-
cuerpo fuorescente mo-
noclonal contra la prote-
na tubulina que conforma
el microtbulo. Los micro-
tbulos citoplasmticos se
distinguen de color verde
fluorescente sobre fondo
negro. x400. (Cedida por
H. Hager.)
CAPTULO 2
viduales, cada clon produce grandes can-
tidades de anticuerpo monoclonal idnti-
co (fig. 2-3 7).
Los mtodos inmunohistoqumicos son
uno de los ms importantes utilizados en
las investigaciones histolgica y biolgica
celular. En principio es posible demostrar
la localizacin de cada una de las prote-
nas que se forman en el organismo. Por
ejemplo, en muchos casos se ha podido es-
tablecer cules son las clulas que forman
determinada hormona. Los anticuerpos
tambin se pueden formar contra otras
molculas, distintas de las protenas, ya
sea antgenos en s mismos o, en los casos
de molculas pequeas, compuestos que
se acoplan a sustancias antignicas como
las protenas, a veces debido a otro trata-
miento. Por ejemplo, se ha podido demos-
trar la existencia de pequeas molculas
transmisoras como la serotonina (5-hidro-
xitriptamina) (fig. 2-35).
Histoqumica con lectinas
Las lectinas son protenas (en su mayor
parte extradas de vegetales, por ejemplo,
porotos rojos) que poseen sitios de unin
especficos para hidratos de carbono. Dis-
tintas lectinas se unen con diferentes mo-
lculas de hidratos de carbono o secuen-
cias <le slas con notable especificidad.
As, existen lectinas que se unen a gluco-
protenas y glucolpidos especficos de la
superficie externa de las membranas celu-
lares y a determinados proteoglucanos del
tejido conectivo. La utilizacin histoqu-
mica de las lectinas se debe a que, al igual
que a los anticuerpos, se las puede mar-
car, por ejemplo con un colorante fluores-
cente o con la enzima peroxidasa, que
permiten su localizacin en un corte de
tejido. La histoqumica con lectinas tiene
amplia aplicacin para demostrar la exis-
tencia de determinadas secuencias de hi-
dratos de carbono en las molculas de las
membranas celulares.
Hibridacin in situ
La hibridacin in situ se basa sobre la
capacidad que poseen los cidos nucleicos
para hibridarse entre s, es decir, la capa-
cidad de unirse entre s que presentan las
monocadenas de cidos nucleicos que
tienen secuencias de bases complementa-
rias. La hibridacin puede ser de DNA-
DNA, DNA-RNA, o RNA-RNA. Debido a la
caracterstica muy especfica de la hibrida-
cin es posible demostrar con gran especi-
ficidad la presencia de determinadas se-
cuencias de DNA o de RNA en su localiza-
cin en la clula. Para la tcnica de hibri-
dacin in situ se utiliza una sonda (ing.
sonde, probe), formada por un cido nu-
cleico monocatenario con una secuencia
de bases conocida, complementaria de la
secuencia de bases que se desea demos-
trar. Las sondas son producidas en labora-
torios (p. ej., mediante tcnicas de clona-
cin de genes, vase con mayor detalle en
el cap. 4) y se marcan con un istopo ra-
diactivo (para ser demostradas por ra-
dioautografa, vase la prxima seccin) o
con una ramificacin adosada, que permi-
te identificar la sonda mediante otras tc-
nicas, por ejemplo la inmunohistoqumi-
ca. Estas sondas varan en longitud, desde
10-15 bases hasta varios miles de bases.
Por ejemplo, si se desea demostrar la
existencia de determinada secuencia de
DNA en un cromosoma de las clulas de
un corte histolgico o en un preparado es-
pecial de cromosomas, primero se expone
el preparado a un pH elevado (bsico), que
induce la separacin de la doble cadena de
la molcula de DNA por desnaturaliza-
cin. Despus se agrega la sonda, que pue-
de poseer la secuencia complementaria de
DNA o de RNA. Una vez hibridada la son-
da con las zonas complementarias del
DNA de los cromosomas se transforma en
visible la localizacin en los ncleos celu-
lares, por ejemplo, mediante radioautogra-
fa o inmunohistoqumica.
Si se desea demostrar la presencia de
molculas especficas de RNA, no se efec-
ta ningn tratamiento previo de los cor-
tes histolgicos con pH elevado, dado que
precisamente se desea que las cadenas do-
bles de las molculas de DNA no se sepa-
ren y, en consecuencia, no se unan a la
sonda. En este caso es suficiente incubar
los cortes de tejido con la sonda (despus
de una fijacin suave del tejido), que pue-
de contener una secuencia complementa-
ria de DNA o de RNA.
As, mediante la hibridacin in situ es
posible demostrar las secuencias de ci-
dos nucleicos correspondiente a determi-
nados genes (vase fig. 4-36), adems de la
expresin de determinados genes por la
demostracin de la presencia de secuen-
cias especficas de RNA mensajero (mR-
NA).
Radioautografa
Con esta tcnica es posible obtener in-
formacin directa respecto al sitio dentro
de la clula donde se sintetiza un produc-
to y los componentes qumicos que lo for-
man, adems de sus eventuales desplaza-
mientos dentro de la clula o hacia otras
localizaciones del organismo, despus de
salir de la clula. Adems, es posible seguir
los desplazamientos de toda la clula y su
posterior destino en el organismo. Por lo
tanto, la radioautografa provee de infor-
macin referida a los aspectos dinmicos
de la morfologa de las clulas y los tejidos.
La radioautografa se basa sobre dos
principios fundamentales: 1) la radiacin
ionizante tiene el mismo efecto sobre una
emulsin fotogrfica que la luz visible. 2)
Un precursor biolgico con marca radiac-
tiva, por ejemplo, un aminocido, tiene
exactamente iguales propiedades biolgi-
cas y destino metablico en el organismo
que la molcula correspondiente sin mar-
ca. Por marca radiactiva se entiende que
un tomo de la molcula determinada es
reemplazada por su istopo radiactivo co-
rrespondiente, por ejemplo el reemplazo
de hidrgeno por tritio
3
H.
El procedimiento radioautogrfico pue-
de ser el siguiente, por ejemplo: en un ani-
mal de experimentacin se inyecta una
molcula de importancia biolgica marca-
da con un istopo radiactivo, por ejemplo
3
H-leucina, que interviene en la formacin
de varias protenas. Las molculas con
marca radiactiva son integradas rpida-
mente a las macromolculas, que se pue-
den conservar en los cortes de tejido al ha-
cerlas insolubles por fijacin. Las molcu-
las inyectadas son solubles y se eliminan
por lavado durante la preparacin de los
cortes histolgicos, a menos que hayan si-
do incorporadas al producto de sntesis
macromolecular antes de ser sacrificado el
animal. Despus del montaje de los cortes
se les agrega en cmara oscura una capa
muy delgada de emulsin fotogrfica (cris-
tales de bromuro de plata en emulsin de
gelatina) (fig. 2-38). Durante el posterior
perodo de exposicin, que puede durar
algunos das o semanas, de acuerdo al tra-
bajo experimental, desde los sitios radiac-
tivos del tejido se emiten partculas o ra-
yos gamma. Algunos de ellos atraviesan la
emulsin fotogrfica e inciden en los cris-
Fig. 2-38. Dibujo esquemtico de un preparado
radioautogrfico para uso en el microscopio
electrnico. Parte superior. el preparado du-
rante la exposicin. Una partcula beta prove-
niente de un compuesto tritiado en el corte de
tejido ha incidido sobre un cristal de bromuro
de plata (grisado) de la emulsin fotogrfica su-
prayacente y generado una transformacin par-
cial de los iones plata del cristal en plata metli-
ca (presentado como una mancha negra arriba
a la izquierda del cristal). Parte inferior. el pre-
parado tras el revelado y la fijacin. El cristal in-
cidido se ha transformado totalmente en grnu-
lo de plata metlica y se eliminaron los dems
cristales (no incididos) . (Segn Caro.)

Gelatina
Cristal de AgBr
-- Corte de tejido
Pelcula de sostn
.... e.:;p_la_t_a ________ -- Gelatina

-- Corte de tejido
="'"""".,..,.,......,..,.,...
;;,,e;:;_,_; ;-- Pelcula de
sostn
CAPTULO 2
CAPTULO 2
Fig. 2-39. Fotomicrografa de un preparado ra-
dioautogrfico para microscopia ptica de
tejido renal. En el animal vivo se inyect timidi-
na tritiada, que antes de ser sacrificado el ani-
mal se incorpor al DNA en todos los ncleos
celulares en fase de sntesis como paso previo
a la divisin celular. Los puntos negros repre-
sentan los grnulos de plata metlica y se loca-
lizan en los ncleos de las clulas marcadas
(ntese que, por lo general, las clulas total-
mente desarrolladas no se dividen en los tbu-
los renales, pero en este caso fueron estimula-
das experimentalmente para la divisin). x870.
(Cedida por R. Rasch.)
tales de bromuro de plata, que se transfor-
man entonces, en parte, de iones plata a
plata metlica. Despus de un perodo
prudencial de exposicin se aplica un re-
velador qumico que transforma todos los
cristales incididos por los rayos en plata
metlica. Por ltimo set:eliminan todos los
cristales no incididos mediante una solu-
cin de tiosulfato (fijacin fotogrfica). A
continuacin se puede tratar el corte de la
misma manera que cualquier otro, por
ejemplo teirlo de manera adecuada, con
posterior deshidratacin e inclusin.
En la observacin con el microscopio se
distinguen los granos de plata metlica
como pequeas manchas o puntos negros
en los sitios de localizacin de la sustan-
cia radiactiva en el corte de tejido subya-
cente (fig. 2-39).
El poder de resolucin, entendido como
la exactitud de la localizacin del istopo
radiactivo, es de alrededor de 1 f.Lm con el
microscopio ptico, pero si se utiliza el mi-
croscopio electrnico (fig. 2-40) es posible
obtener un poder de resolucin de alrede-
dor de 0,1 f.Lm. En las imgenes obtenidas
por microscopio electrnico a menudo los
grnulos ocultan varias estructuras y el es-
tudio ms exhaustivo de las radioautogra-
fas puede requerir un anlisis estadstico.
El mtodo slo demuestra sustancias
que se incluyen en los componentes tisu-
lares, mientras que el material marcado
se encuentra dentro del organismo. Preci-
samente por ello es posible obtener infor-
macin sobre las relaciones dinmicas de
los procesos metablicos. Una importante
Fig. 2-40. Imagen de un preparado radioauto-
grfico de eritrocitos y reticulocitos (glbulos ro-
jos inmaduros), captada con microscopio electr-
nico. Previo a la preparacin para la radioauto-
grafa para el microscopio electrnico se incuba-
ron las clulas in vitro con leucina tritiada; se ob-
serva gran cantidad de grnulos de plata por so-
bre un reticulocito (R), pero ninguno sobre los
dos eritrocitos (E). Esto se debe a que el reticu-
locito incorpor la leucina radiactiva durante la
incubacin, puesto que an es capaz de sinteti-
zar hemoglobina (protena que requiere leucina),
mientras que los eritrocitos maduros han perdido
la capacidad de sntesis proteica. x80.000.(Cedi-
do en prstamo por A.B. Maunsbach.)
aplicacin de la radiautografa es el mar-
cado de los ncleos celulares (fig. 2-39),
tras el cual se puede seguir el desplaza-
miento y el destino de las clulas marca-
das dentro del organismo. Si, por ejemplo,
se inyecta timidina marcada con tritio
(que en el organismo se incluye como la
base timina en el DNA) en un feto, ser in-
cluido en el ncleo de todas las clulas
que sintetizaban DNA en el momento de
la inyeccin, como paso previo para la di-
visin celular. En la actualidad el mtodo
es muy importante para el estudio de la
histognesis (el desarrollo de las clulas
embrionarias indiferenciadas a clulas es-
pecializadas en un tejido).
Problemas en la interpretacin
de cortes de tejido
Por ltimo se vern algunas condicio-
nes que conviene recordar respecto de la
microscopia ptica prctica.
Artificios. La palabra artificio significa
producto artificial y designa estructuras
del preparado que no existen en el tejido
vivo, pero que aparecen artificialmnte du-
rante el procedimiento de preparacin.
Algunos de los artificios ms comunes
son la retraccin (fig. 2-41a), que en mayor
o menor grado son una consecuencia inevi-
table de la preparacin habitual de los cor-
tes tisulares. La retraccin se presenta en
los tejidos como hendiduras u orificios va-
cos y sin estructuras (p. ej., no presentan,
como los capilares, una cubierta endotelial
hacia el interior del espacio vaco). Los pre-
cipitados de colorante se observan como
cristales coloreados, a menudo ubicados
por encima del corte (fig. 2-41b). Los plega-
mientos se pueden formar en el momento
de la seccin o durante el posterior proce-
samiento de los delgados cortes (fig. 2-41c),
mientras que las imperfecciones de la cu-
chilla del micrtomo causan defectos en el
corte que se visualizan como lneas rectas
que atraviesan las estructuras biolgicas
(fig. 2-41d). La rotura del tejido durante la
extraccin, por ejemplo debido a la pinza,
puede dar lugar a la formacin de groseras
variaciones del aspecto de las clulas. Por
ltimo se debe nombrar la fijacin dema-
siado lenta o insuficiente como causa de
cortes de mala calidad, debido a la degene-
racin post mortem (vase con mayor deta-
lle en la seccin de lisosomas, en el cap. 3).
a
e
Interpretacin tridimensional de un
corte. Siempre se debe recordar que los
cortes de tejido representan una delgada
y, en principio, bidimensional rodaja de
un objeto tridimensional. En la figura 2-42
se muestra cmo un corte seccionado a
travs del mismo objeto puede presentar
aspectos totalmente diferentes de los mis-
mos tipos celulares. Muchas estructuras
histolgicas son tubulares, y la figura 2-43
presenta el aspecto muy variable de dis-
tintos cortes transversales de la misma es-
tructura tubular.
Para establecer la forma tridimensional
correcta de un rgano o de una estructura
de gran tamao a menudo se realizan cortes
seriados, en los que se presentan sucesivas
secciones a travs de toda la estructura u r-
gano. Mediante el cuidadoso anlisis de las
relaciones entre los cortes de toda la serie
es posible obtener una representacin ms
cierta de la conformacin espacial, en algu-
nos casos despus de construir un modelo
sobre la base de la serie de cortes. La infor-
macin obtenida en el anlisis tambin se
puede transferir a una computadora, capaz
de reconstruir un modelo tridimensional.
Aqu termina la somera introduccin a
la microscopia prctica, recordando que
para el diagnstico es ms importante
descubrir la estructura de las clulas y los
tejidos que Jos colores, dado que estos
pueden variar de una tcnica a otra.
b
. : . _ ~ --
--:--.... OIII(IE- - - -
s-...--..,......- -
d
--
-
- .. ..
Fig. 2-41. Estas 4 fotomi-
crografas (a-d) de cortes
coloreados con hematoxi-
lina-eosina muestran
ejemplos de los artifi-
cios histolgicos ms
comunes. a muestra es-
pacios como consecuen-
cia de retraccin (fle-
chas), mientras que en
b se observa un cristal
grande de colorante so-
bre el tejido (flecha). e es
un ejemplo de plega-
miento del corte al ser
montado, mientras que
d muestra lneas debidas
a muescas en la cuchi-
lla del micrtomo
(flechas).
CAPTULO 2
o
- - ~
Corte de 5 1m
que atraviesa
t una clula
~ ~ ~ - - ~ ~ - - - - ~ - - - - - - - - - - ~ ~ - - ~ ~ - - ~ de15flm
~ - -------------------- --------- ------------~ , : :
, ,
' ,
' ,
' ,
CAPTULO 2
,
'
,
,
Fig. 2-42. Dibujo esquemtico que muestra c-
mo un corte fino entre un grupo de clulas si-
milares puede presentar un aspecto totalmen-
te diferente cuando se observa el corte por el
microscopio. (Segn Ham.)
Cuestionario sobre mtodos histolgicos
1. Qu se entiende por poder de reso-
lucin?
2. Qu se entiende por aumento?
3. Cul es el mximo poder de resolu-
cin para el ojo a distancia normal
de lectura, los mejores microscopios
pticos y los mejores microscopios
electrnicos?
4. Qu se entiende por in vivo e in vitro?
5. Qu es un clon celular, y qu es la
clonacin?
6. Intente explicar en pocas palabras el
mtodo de fraccionamiento celular
que utiliza la centrifugacin diferen-
cial.
7. Cul es el objetivo de la fijacin de
los tejidos cuando se preparan cortes
histolgicos?
8. Cul es la importancia clnica de la
tcnica de cortes por congelacin?
9. Qu se entiende por cortes semifi-
nos y cul es su espesor?
10. Cul es el objetivo de usar mtodos
histolgicos?
11. Qu se entiende por acidofilia y ba-
sofilia?
Fig. 2-43. Este dibujo esquemtico muestra c-
mo cortes en distinta direccin a travs de
la misma estructura tubular pueden presentar
aspectos totalmente diferentes.
12. Nombre un colorante metacromtico
y algunas sustancias tisulares que
presentan metacromasia.
13. Cul es el principio bsico del mto-
do de FAS y qu se demuestra con
l?
14. Cul es el principio bsico del mto-
do de Feulgen y qu demuestra espe-
cficamente?
15. Describa brevemente el principio b-
sico de un mtodo enzimohistoqu-
mico.
16. Intente explicar brevemente el prin-
cipio fundamental de un mtodo in-
munohistoqumico directo.
17. Se puede utilizar la inmunohisto-
qumica a nivel de microscopia elec-
trnica?
18. Qu sustancias se pueden demostrar
mediante la histoqumica con lecti-
nas?
19. Intente explicar brevemente el prin-
cipio fundamental de la hibridacin
in situ.
20. Qu se entiende por marca radiacti-
va de una molcula?
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CAPTULO 2

2do Capítulo de Muestra - HFG

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