I marcatori molecolari

Dipartimento di Scienze Agronomiche e Genetica Vegetale Agraria Corso di Genetica Agraria Giovanna Attene

Marcatori molecolari del DNA

I marcatori molecolari sono sequenze di DNA variabili che vengono ereditate in modo mendeliano. La trasmissione ereditaria pu essere seguita con specifiche tecniche di laboratorio. Un M.M. un locus genomico rilevabile con sonde o primer specifici, che contraddistingue quel tratto cromosomico. La presenza del M.M. si basa sulla rilevanza di polimorfismi nel DNA di un individuo o tra individui. I M.M. non sono generalmente riferibili allattivit di specifici geni.

Marcatori molecolari del DNA

Un marcatore molecolare un locus (=posizione sul genoma) rilevabile con: Primers
PRIMER

Locus genico
PRIMER

Sonda

Sonde

che caratterizza il tratto cromosomico e le regioni che lo fiancheggiano

Marcatori molecolari del DNA

Perch importante disporre di marcatori?
Controllare lereditariet di un marcatore significa anche controllare lereditariet delle regioni che li contengono e con queste, eventualmente quella dei geni di interesse (es.: responsabili di resistenze a patogeni, di caratteri legati alla produzione etc) contenuti in queste regioni.

m2

Avendo molti marcatori

g2 m3 m5 m4 g5 g3 g6 g4 m7 g7

marcatore

gene
m6

Marcatori molecolari del DNA

I marcatori molecolari contrariamente ai marcatori morfologici ed enzimatici non sono direttamente riferibili allattivit di specifici geni e pertanto la dipendenza dallespressione genica non in genere rilevante; sono per se non influenzabili dallambiente e rintracciabili nelle cellule di qualsiasi tessuto o organo (vantaggio!). Inoltre, il loro numero molto elevato.

Marcatori molecolari del DNA

Lanalisi del genoma mediante M.M. in grado di rilevare la diversit dovuta a eventi di mutazione di regioni omologhe di DNA in individui appartenenti alla stessa specie o a specie diverse. Lanalisi genomica con M.M. consente la determinazione del fingerprinting molecolare degli individui. Si dispone di numerosi tipi di M.M. che si differenziano per il tipo di sequenze analizzate e/o per il tipo di tecnica utilizzata. Un M.M. pu essere descritto come un frammento di DNA cromosomico (variabile tra 50 e 3000 bp) compreso tra due regioni oligonucleotidiche note (circa 4-30 bp, sia che si tratti di siti di restrizione o di siti di innesco per la DNA pol.)

M.M. basati su tecniche di restrizione e ibridazione

Gli enzimi di restrizione

Si tratta di proteine prodotte da varie specie di batteri che sono in grado di tagliare il DNA in corrispondenza di una corta sequenza specifica di coppie di basi (4-8 a seconda dellenzima) producendo pi frammenti detti di restrizione.

DNA genomico

Enzima di restrizione

In individui diversi il cambiamento nei siti anche di una sola base porta a variazione (=polimorfismo) nella lunghezza dei frammenti di restrizione, cio ad un RFLP (acronimo dallinglese Restriction Fragment Length Polymorphism)

Endonucleasi di restrizione
Enzima
EcoRI

Organismo di origine
Escherichia coli

Sequenza consenso
5..GAATTC..3 3..CTTAAG..5

Tipo di Taglio
5..G AATTC3 G..5

3..CTTAA

Alul

Arthrobacter luteus

5..AGCT.3 3..TCGA.5

5..AG 3..TC

CT.3 GA.5

Marcatori RFLP
(caso di una mutazione puntiforme con perdita di un sito di restrizione)
Sonda usata per libridazione

Sito1
Cromosomi Cromosomi omologhi omologhi

Sito2

Sito3 Genotipo 1

Genotipo 2

Cromosomi omologhi

Genotipo 3

RFLP (Marcatore codominante)

restrizione
Cromosomi omologhi

a a b b/b b a b b
Lastra fotografica

Attraverso una opportuna tecnica di laboratorio definita Southern blotting, a/a a possibile evidenziare i frammenti su una lastra fotografica

Cromosomi omologhi

Cromosomi omologhi

M.M. basati su tecniche di amplificazione (PCR derivati) Sequenze ripetute: microsatelliti (SSR = Simple Sequence Repeat)
I genomi degli eucarioti comprendono molte sequenze ripetute costituite da 1-6 pb che vengono definite DNA microsatellite o SSR (Simple Sequence Repeat)

Dinucleotidiche Esempio : (CA)n Trinucleotidiche Esempio : (CAC)n Tetranucleotidiche Esempio : (CACT)n Pentanucleotidiche Esempio : (CACTG)n n volte
CACT CACT CACT ... CA CA CA

n volte

n volte
CAC CAC CAC ...

n volte
CACTG CACTG CACTG ...

Microsatelliti o SSR

Sono piuttosto abbondanti nel genoma nucleare delle specie eucariotiche ma non nei procarioti La loro frequenza comunque pu variare a seconda degli organismi. Nei mammiferi il motivo pi frequente della sequenza ripetuta (AC)n e (GT)n Da uno studio su 54 specie di piante coltivate i pi diffusi sono risultati: (AT)n>(A)n>(AG)n>(AAT)n

Microsatelliti o SSR
Il polimorfismo ad un dato locus in una specie dovuto alla variazione di lunghezza del microsatellite. Ogni variante in lunghezza un allele microsatellite Lallele quindi definito dal numero di volte in cui ripetuto il motivo di base Gen. 1 Gen. 2 Gen. 3 Gen. 4 Gen. 5 Gen. 6 Quanti alleli diversi ? 3 5 2 1 1 7 ripetizioni 10 ripetizioni 11 ripetizioni 12 ripetizioni 13 ripetizioni

12 alleli di cui 5 diversi

SSR
come riuscire ad osservarli?
La strategia si fonda sullosservazione che le sequenze fiancheggianti in 3 e 5 un determinato locus microsatellite nel genoma sono conservate allinterno delle specie, fra specie, fra specie allinterno di un genere e, pi raramente anche tra generi affini.
PRIMER

Locus microsatellite
PRIMER

Sequenza fiancheggiante conservata

Sequenza variabile

Sequenza fiancheggiante conservata

Conoscendo le sequenze fiancheggianti il microsatellite, dunque possibile sintetizzare primers per lamplificazione selettiva di singoli loci microsatelliti

SSR

5---attgtgatgccgtagtcGAGAGAGAGAGAGAGAgcgctcttaggccaatt--------------3

Forward primer

Reverse primer

3---taacactacggcatcagCTCTCTCTCTCTCTCTCTcgcgagaatccggttaa--------------5

c. 30 cicli PCR

Crescita esponenziale della sequenza microsatellite bersaglio

METODO
Estrazione DNA vegetale separatamente di ciascuno degli 8 individui da analizzare Analisi del polimorfismo ai loci microsatelliti in ciascun individuo via PCR (=necessarie le diverse coppie di primers )

In ogni provetta:
-DNA -dNTP -2 primers -Taq polimerasi -MgCl2 -Tampone di reazione

PCR Elettroforesi e lettura gel

SSR (marcatori codominanti)

Gen. 1 Gen. 2
160 140 160

M
(pb)
200

180 160

180 160 140 120 100

Gen. 3 Gen. 4 Gen. 5 Gen. 6

120

120

80

80

80 60

Gel di poliacrilammide

= siti di annealing dei primers

SSR

Caratteristiche generali
Sono individuabili sia nelle regioni codificanti che non codificanti Sono co-dominanti (cio sono riconoscibili entrambi gli alleli nei genotipi eterozigoti) Non sono influenzati dallambiente Sono identificabili in tutti i tessuti vegetali ed in tutti gli stadi di sviluppo Presenti nel genoma del cloroplasto (CpSSR)

Applicazione di M.M. in uno studio di diversit genetica

SSR

ISSR

cpSSR