1 FUNDAMENTOS DE CROMATOGRAFA

Objetivos

* Dar a conocer los fundamentos de las separaciones cromatografcas. * Dar a conocer los fundamentos para poder llevar a cabo las cromatografas de separacin. * Poder realizar la eleccin de las condiciones ptimas de separacin en funcin de la polaridad

y otras propiedades sicoqumicas de los analitos.

Bibliografa

Ll. R. Snyder, J.L. Glajch y J.J. Kirkland, Practical HPLC Method Development, John Wiley & Sons, New York, 2a Ed. 1997 A. Braithwaite y F.J. Smith, Chromatographic Methods, Blackie Academic & Professional, 5a Ed., Glasgow, 1996 P. A. Sewell y B. Clarke, Chromatographic Separations, Analytical Chemistry by Open Learning, John Wiley & Sons, Chichester, 1987 K.A. Rubinson y J.F. Rubinson, Anlisis Instrumental, Prentice Hall, Madrid, 2001 D.A. Skoog y J.J. Leary, Anlisis Instrumental, McGraw-Hill, 4a Ed., Madrid, 1994

1.1.

Introduccin

La primera persona que utilizo el tema de la cromatografa fue el ruso Tswett (1872-1919). Este qumico utiliz la palabra cromatografa para explicar la separacin de los distintos pigmentos de las plantas por medio de una tiza. De todas formas, la cromatografa no se utiliz hasta la dcada de 1930, concretamente cuando se empez a extender la utilizacin de la capa na y el intercambio de iones.

1.1. INTRODUCCIN

La cromatografa, en general, recoge un amplio grupo de mtodos fsicos. A diferencia del resto de mtodos de separacin, las dos fases que se utilizan para la separacin de los componentes tienen una caracterstica comn: una es estacionaria y la otra mvil. Por un lado, la fase estacionaria puede estar empaquetada en una columna o extendida en una capa plana o repartida en una capa na. Debido a eso, en cualquier caso, a la fase estacionaria se le denomina lecho cromatogrco. Por otra parte, la fase mvil puede ser un lquido, un gas o un uido supercrtico. Por medio de la combinacin entre las dos fases se puede llevar a cabo una primera clasicacin de las cromatografas de separacin tal y como se recoge en la tabla 1.1.

Cuadro 1.1: Clasicacin de las cromatografas en funcin de las caractersticas de las fases estacionaria y mvil. Fase Mvil
Gas Lquido Fluido Supercrtico

Fase estacionaria
Slido Lquido Slido Lquido Slido

Nombre
Cromatografa Gas-Slido Cromatografa Gas-Lquido Cromatografa Lquido-Slido Cromatografa Lquido-Lquido Cromatografa de Fluidos Supercrticos

Tal y como se muestra en la Figura ?? la fase estacionaria puede tener distintas formas y en funcin de esas formas se puede llevar a cabo una subclasicacin. Por ejemplo, si la fase estacionaria est extendida en una capa plana sobre una supercie de aluminio, vidrio o plstico entonces se denomina cromatografa de capa na1 o cromatografa plana; si se trata de una capa sobre un papel seria una cromatografa de papel2 y, por ltimo, si el lecho cromatogrco rellena una columna de vidrio o un tubo metlico se hablara de una cromatografa en columna3 . Cuando se dice que la fase estacionaria es un lquido, es preciso comprender que lo que realmente se tiene es un lquido adherido a un soporte slido que queda impregnado gracias al ujo del liquido. Esa adhesin se lleva a cabo sobre la supercie slida a travs de distintos enlaces qumicos. Mientras que la cromatografa de gases solo se puede llevar a cabo en columnas, la cromatografa liquida se puede llevar a cabo tanto en columnas como en capa plana. La cromatografa lquida clsica se llevaba a cabo en columnas de amplio dimetro interno ( 1-2 cm) y hoy en da tambin se puede seguir utilizando en cromatografas de preparacin. En cambio, las croma1 tlc 2 pc

= thin layer chromatography = paper chromatography 3 cc = column chromatography

1.1. INTRODUCCIN

tografas analticas de hoy en da, como la cromatografa de alta resolucin o HPLC4 utilizan columnas estrechas ( = 4,6 mm) y el ujo de la fase mvil es de 1-5 cm3 / min.

Figura 1.1: Esquemas de las cromatografas en columna y planas. La cromatografa en columna puede tener subclasicaciones en funcin del tamao y forma de la columna, si se trata de columnas capilares o empaquetadas, etc. Si la fase estacionaria tapa la supercie de un soporte slido inerte o est asociada a la misma como se muestra en la Figura 1.2 en la pgina siguiente, a la columna as rellena se le denomina empaquetada. En cambio, si la fase estacionaria esta unida a la pared interna de la columna, entonces se habla de columnas o tubos abiertos o capilares. Contemplando el desarrollo de la elucin se observara la separacin de los analitos. Tras inyectar los analitos de la muestra, la propia fase mvil los arrastrar. Esta fase tiene una anidad menor por los analitos que la de la fase estacionaria y gracias a esta diferencia, los analitos se separan unos de otros. En la Tabla 1.2 en la pgina 5 se ha recogido la clasicacin ms signicativa de los mtodos cromatogrcos en funcin de los distintos mecanismos sicoqumicos de retencin. Estos mecanismos sern tratados en el siguiente apartado y son el reparto o distribucin, la adsorcin, el intercambio de iones y la permeacin. A stos se podran aadir la anidad y la electromigracin para poder introducir los mecanismos de separacin basados en las interacciones encima-substrato y los mecanismos de separacin basados en la electroforesis. Sin embargo, las separaciones basadas en la electromigracin no tienen porque tener obligatoriamente una fase estacionaria y por esa razn no se pueden incluir exactamente entre las cromatografas. De todas
4 hplc

= high performance liquid chromatography

1.2. MECANISMOS DE RETENCIN

Figura 1.2: Proceso cromatogrco que tiene lugar en una columna empaquetada. formas y debido a que entre los mtodos electroforticos actuales la electroforesis de geles en fase estacionaria y la electroforesis micelar tienen cada vez una aplicacin cada vez ms extensa, se pueden introducir entre los mtodos cromatogrcos.

1.2.

Mecanismos de retencin

Se ha estimado que entre los mtodos analticos la cromatografa tiene una utilizacin del 60 %. Una de las razones ms importantes de la utilizacin de la cromatografa es el hecho de que puede mostrar distintos mecanismos de retencin. Gracias a ello, tanto los compuestos polares como los apolares, los inicos y las molculas, los de pequeo tamao y los polmeros pueden ser separados eligiendo las condiciones adecuadas. Si el mecanismo para explicar la retencin de los componentes fuese nico no habra ningn problema para saber cual es el orden de elucin de dichos componentes. Pero puesto que las cromatografas de separacin son una consecuencia de distintos mecanismos y las variables que inuyen en cada caso son muchas y muy distintas es imposible predecir cual es la elucin de los componentes de cualquier mezcla.
1.2.1. Adsorcin

Como consecuencia de este proceso, las molculas de soluto y disolvente se disputan los sitios activos de la fase adsorbente. Por ello, para que una molcula de analito pueda llegar a ese sitio

1.2. MECANISMOS DE RETENCIN

Cuadro 1.2: Clasicacin de los mtodos cromatogrcos.

Fundamento Cromatogrco Adsorcin: Competencia entre la fase mvil y el slido adsorbente Fase mvil Gas Fase estacionaria Columna Tipo de cromatografa Gas-Slido

Lquido

Columna

Distribucin: Competencia entre la fase mvil y el lquido de la fase estacionara

Lquido Gas

Capa plana Columna

Cromatografa lquida en Columna (LC) Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) Capa na (TLC o PC) Gas - Lquido (GC) Fluidos supercrticos (SFC) Lquido-Lquido (LLC) Alta resolucin (HPLC) Cromatografa de cambio inico (IEC) Cambio inico de alta resolucin (IC/HPLC) Exclusin qumica o separacin por tamao (GPC)

Lquido Cambio Inico: Competencia entre el cambiador inico slido y la fase mvil Permeacin: Competencia entre la matriz polimrica y la fase mvil Lquido

Columna Columna

Lquido

Columna

1.2. MECANISMOS DE RETENCIN

activo primeramente tiene que sustituir a la molcula de disolvente que la ocupaba. Si la fase adsorbente es polar, por ejemplo slica o almina, los componentes apolares (por ejemplo, hidrocarburos) mostrarn una adhesin escasa y no quedarn retenidos. Sin embargo, los que poseen grupos funcionales polares (alcoholes, cetonas, aminas...) o polarizables (anillos aromticos) presentarn una mayor adhesin y quedarn retenidos durante un tiempo ms largo. Teniendo en cuenta todo esto, utilizando una fase adsorbente polar, se puede predecir la elucin de molculas polares en funcin de los grupos funcionales siguiendo la siguiente serie -CH=CH- <-OCH3 <CO2 R <-C=O <-CHO <-SH <-NH2 <-OH <-CO2 H. Si la fase adsorbente fuese apolar, el orden seria el inverso. Un problema tpico con las fases adsorbentes polares es el de la adsorcin del agua puesto que sta tiende a ocupar los lugares ms activos dejando libres los ms dbiles. Como consecuencia de ello, se dice que esa fase est desactivada.

Figura 1.3: Retencin por medio de la adsorcin. Otras de las variables importantes son la supercie de la fase adsorbente y el dimetro medio de sus poros. En general, la retencin depende de la supercie, esto es, cuanto mayor sea el rea (200-250 m2 .g1 para partculas esfricas de slica y 400 m2 .g1 para partculas irregulares de slica) la retencin ser mas ecaz. El dimetro de los poros no es tan determinante a la hora de ver la ecacia de una retencin. La inuencia es importante cuando los poros tienen un tamao bastante superior al de las molculas de analito debido a que en ese caso hay que tener tambin en cuenta factores de tipo estrico.

1.2.2.

Distribucin

Si el mtodo de separacin consiste en la distribucin o reparto, entonces habr que tener en cuenta que el adsorbente en vez de ser un slido es un lquido. En la cromatografa gas-liquido, la fase lquida estar adherida a la pared interna del tubo para que no sea arrastrada. El fundamento

1.2. MECANISMOS DE RETENCIN

de la separacin se basa en la relacin de solubilidades de ambas fases, expresada mediante la constante de reparto Kd . Igualmente, se habr de esperar una elucin en funcin del valor de esa constante, esto es, la elucin mostrar un aumento progresivo con el valor de esa Kd .

1.2.3.

Cromatografa de fase enlazada

Para superar tanto los problemas mecnicos de la fases liquidas estacionarias as como los problemas de las fases adsorbentes polares se han desarrollado las separaciones basadas en fases enlazadas. En este tipo de mecanismos de retencin, al grupo silanol del soporte slido se le une mediante enlaces qumicos estables una fase orgnica apolar (o que tiene una polaridad variable). Estos enlaces se consiguen mediante clorosilanoles (tanto monofuncionales como bifuncionales) y los grupos orgnicos utilizados son hidrocarburos de distintas longitudes (C4 , C8 o C18 ), nitrilos ( -CN) o aminas (-NH2 ). En la Figura 1.4 se muestra la supercie que resulta como consecuencia de esas sustituciones.

Figura 1.4: Aspecto de la supercie de una fase enlazada. Como posteriormente se va a discutir, si la polaridad de la fase estacionaria es mayor que la de la fase mvil entonces se hablar de la cromatografa normal y si es al revs se hablar de la cromatografa de fase reversa o inversa.

1.2.4.

Cambio inico

Basndose en las propiedades de los grupos funcionales inicos de las fases slidas polimricas se pueden obtener intercambiadores aninicos y catinicos para hacer separaciones de tipo cromatogrco. Los detalles de este mecanismo ya se han discutido anteriormente y la nica

1.2. MECANISMOS DE RETENCIN

idea nueva a aportar es que se utiliza en condiciones de alta presin y ecacia para conseguir la separacin y determinacin de muchos analitos.

1.2.5.

Pares inicos

Mediante este mecanismo se lleva a cabo la separacin de iones y especies ionizables utilizando un mecanismo de fase enlazada y no mediante un intercambio de iones. Puesto que la fase enlazada es una fase de pequea polaridad, los iones y los compuestos ionizables no sern retenidos pero si se cambian las condiciones qumicas (mediante el ajuste del pH) o aadiendo un compuesto capaz de formar pares inicos que disminuya o neutralice la carga inica o la ionizibilidad de los componentes, se puede aumentar de forma importante la retencin de los mismos. Esas parejas activas de iones son compuestos orgnicos de gran tamao, del tipo de las aminas cuaternarias y, al igual que los analitos, se trata de compuestos ionizables o iones de carga contraria. Como consecuencia de ello, los analitos (A+ ) y los formadores de pares inicos (B ) formarn una pareja de iones neutra y aumentarn su adhesin a la fase enlazada. R1 COO + (R)4 N+ (R1 COO)((R)4 N)

1.2.6.

Cromatografa de anidad

Este mecanismo es de los ms nuevos dentro de las cromatografas de separacin y se basa en la interaccin selectiva que hay entre las protenas y el ligando. Despus de unir el ligando mediante enlaces covalentes a una matriz glica se obtiene una fase estacionaria especial. Si se disuelven los componentes de la muestra en un disolvente adecuado y se hacen pasar a travs del gel solo quedarn retenidas aquellas protenas que pueden dar lugar a interacciones especcas y todas las dems cruzarn sin problema la columna. La fuerza del enlace entre la fase estacionaria y la protena puede variar si se cambian las caractersticas qumicas de la fase mvil (pH, reactivos adicionales, etc.).

1.2.7.

Exclusin molecular

A diferencia de los mecanismos anteriores, este mecanismo no est basado en interacciones especicas. Es ms, para utilizar la separacin cromatogrca basada en este tipo de mecanismo hay que conrmar o vericar que el resto de mecanismos, sobre todo el de la adsorcin es bastante limitado. La cromatografa de exclusin molecular se lleva a cabo a travs de una fase estacionaria porosa, fase que suele ser de slica o gel polimrico. Los poros de la fase estacionaria

1.2. MECANISMOS DE RETENCIN

suelen aparecer en unos sitios fsicos limitados y solamente son efectivos en esos sitios. Esto es, las molculas de tamao superior a los poros no tendran ningn tipo de retencin mientras que las de tamao menor, una vez que se introducen en los poros, tendran muy difcil salir de los mismos. Esa situacin est descrita en la Figura 1.5 donde se recogen los distintas casos que se pueden tener entre los poros y las molculas en funcin de su tamao as como las consecuencias de la separacin cromatogrca.

Figura 1.5: Esquema del mecanismo de separacin en funcin del tamao de los poros y de las molculas de analito y sus consecuencias en la separacin cromatogrca.
Ejemplo 1.1. Que mecanismo de separacin utilizaras para separar los distintos componentes de las siguientes mezclas?

a) Gases inorgnicos del tipo CO2 , CO, O2 , o SO2 . Como todos son gases inorgnicos habr que uti-

lizar una cromatografa de gases. En cuanto a los mecanismos de separacin, gracias a la distinta polaridad de esos componentes se puede usar la distribucin o reparto mediante una cromatografa gas-liquido utilizando una columna capilar. Esta columna capilar debe de ser muy especial para que asegure un mnimo de retencin. En cuanto a los componentes polares, como tienen la capacidad de adsorberse, esto hace que en este caso tambin se pueda utilizar como mecanismo la adsorcin llevando a cabo en ese caso una cromatografa gas-slido utilizando para ello una columna empaquetada.
b) Hidrocarburos aromticos (antraceno, fenantreno, pireno, criseno...). Se trata de compuestos que

son slidos o lquidos en condiciones normales y puesto que presentan anillos aromticos en su estructura sern compuestos de baja polaridad. Como consecuencia de ello, se vaporizaran fcilmente y no habr problemas para separarlos en fase vapor. La columna cromatogrca capilar es ms adecuada que en el ejemplo anterior y en cuanto al mecanismo de separacin el ms adecuado sera el de reparto o distribucin.

1.3. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

c) cidos grasos de aceites (palmtico, olico,...). Se trata de lquidos polares de alto punto de ebulli-

cin. En general, dado que tienen un grupo polar y una cadena larga apolar son bastante hidrofbicos por lo que no se disolvern muy bien en agua. Si se quiere llevar a cabo una separacin en funcin de los grupos funcionales polares se habr de utilizar una columna polar y un mecanismo de separacin ser el de adsorcin. Si se quiere llevar a cabo una separacin en funcin de la cadena apolar se habr de utilizar una columna apolar y el mecanismo ser el de la fase enlazada.
d) Pesticidas organoclorados (DDT, DDE,...). Estos compuestos son slidos y lquidos polares que

se disuelven poco en agua. Se vaporizan fcilmente y gracias a ello se pueden separar mediante una cromatografa liquida o una cromatografa gaseosa. En cuanto a la cromatografa gaseosa se utilizar una columna tipo capilar y un mecanismo tipo reparto o distribucin mientras que si la cromatografa utilizada es la lquida el mecanismo ser el de la fase enlazada.
e) Los iones Cl , SO2 y CO2 . Como estos compuestos son iones aparecern en condiciones acuosas. 4 3

Para la separacin de estos compuestos el mecanismo adecuado ser el del intercambio de iones. En algunos casos hay que llevar a cabo un control del pH para garantizar la carga de esos iones.
f) Hidrocarburos saturados e insaturados. El grupo de los hidrocarburos es muy extenso. Si se trata

de compuestos de cadena corta hay que tener en cuenta que suelen ser vaporizables. Si se tratan de cadenas muy largas suelen slidos o lquidos. En cualquier caso, se trata de compuestos apolares y en la mayora de los casos vaporizables. Es por ello que la cromatografa ms usada es la de gases y el mecanismo mas recomendable suele ser el de la distribucin o reparto.
h) Mezclas de esteroides. Son componentes polares e ionizables. Teniendo en cuenta estas caracters-

ticas se pueden usar como mtodos de separacin la formacin de pares inicos o las fases enlazadas. La eleccin de un mtodo u otro depender de las condiciones qumicas del medio. Otra posibilidad sera la de la anidad. Como se trata de compuestos de gran repercusin siolgica se puede pensar que las interacciones sustrato-encima pueden ser importantes. En consecuencia, jando encimas especiales sobre soportes slidos se puede llevar a cabo tambin la separacin de cierto tipo de esteroides.
i) Mezclas de aminocidos. Los aminocidos son compuestos polares e ionizables. Por tanto, el tipo de

separacin a utilizar podr ser tanto la formacin de pares ionicos como el uso de fases enlazdas. Dependiendo de otras condiciones del medio sera posible tambin la utilizacin del mtodo de separacin por intercambio de iones.

1.3.

Fundamentos de la separacin

Como anteriormente se ha dicho, en las separaciones por cromatogrcas es la fase mvil la que transporta las partculas de los analitos que componen la muestra. Por ello, el soluto, la fase mvil y la fase estacionaria forman un sistema ternario y hay interacciones entre dos fases cualesquiera. Como consecuencia de la atraccin de la fase estacionaria con respecto a los solutos

10

1.3. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

se origina un retraso en su elucin y debido al distinto grado de atraccin se originan diferentes retrasos o diferentes retenciones de los analitos. A pesar de que los mecanismos vistos en el apartado anterior son distintos se puede decir que en todos ellos el analito (A, B, C, ...) se puede considerar que tiene un reparto distinto en las dos fases, que se puede expresar mediante el siguiente equilibrio:

[Am ] [Ae ]

(1.1)

Donde [Ae ] y [Am ] son, respectivamente, las concentraciones en la fase ja y fase mvil. La constante de reparto Kd(A) se puede escribir como el cociente de esas concentraciones: Kd(A) = Ce [Ae ] = [Am ] Cm (1.2)

Cuanto ms grande sea la Kd la adhesin a la fase estacionaria ser mayor y en consecuencia la elucin ser mas lenta. De todas formas, la cromatografa es una separacin dinmica por lo que el equilibrio no se maniesta en su totalidad a lo largo de la fase estacionaria. En consecuencia, el transporte de los analitos a lo largo de la columna puede considerarse como una sucesin de separaciones o a pasos. En cada paso tiene lugar un acercamiento al estado de equilibrio y se puede considerar que se cumple la relacin de reparto expuesta anteriormente. A cada uno de los cortes de la columna, o a cada uno de los pasos mencionados anteriormente, se le denomina plato terico, con un signicado parecido al que se utiliza en la destilacin. Como se puede observar en la Figura 1.6, la longitud de columna que corresponde a cada plato terico equivale a la altura de cada plato terico (H). Cuanto ms pequeo sea el valor de H surgirn ms pasos de equilibrio en la columna y por lo tanto la separacin ser ms ecaz.

Figura 1.6: Platos tericos de las columnas y altura equivalente (H) de cada plato terico. Como consecuencia del distinto reparto de los componentes en cada uno de los platos tericos puede tener lugar la separacin de los mismos. Una imagen de ello y la consecuencia cuantitativa importante es el cromatograma. En un cromatograma aparecern los picos de los distintos

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1.3. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

componentes separados y con ellos se puede estimar la idoneidad as como otros aspectos cuantitativos de la separacin . A modo de ejemplo, la Figura 1.7 muestra un cromatograma y en l aparecen las caractersticas ms importantes del mismo.

tm t0 tA tRa

tiempo muerto inicio del cromatograma tiempo de elucin del compuesto A tiempo de elucin del compuesto A corregido

Figura 1.7: Caractersticas de un cromatograma. Las partculas de la muestra que estn en la fase mvil (molculas/iones) mientras se mueven en la frontera entre las dos fases tienen un movimiento lineal en el sentido de la fase mvil. La fase mvil tiene una velocidad constante (um ) que es la velocidad de todas las partculas que hay en ella. Como consecuencia de ello, mientras las partculas de la muestra estn en la fase mvil tendrn esa velocidad y les costar el mismo tiempo que a la fase mvil cruzar toda la columna. Al tiempo que necesita la fase mvil para atravesar la columna se le denomina volumen o tiempo muerto (tm ). Las partculas que tienen cierta adhesin a la fase ja estarn a veces en la fase mvil y a veces en la fase ja. La distinta elucin de los analitos de la muestra proporcionar los tiempos en los que estn en la fase estacionaria (ts ). Por lo tanto, el tiempo que necesitarn las partculas retenidas para atravesar la columna ser la suma de los tiempos anteriores (tR = ts +tm ). En consecuencia, las velocidades medias para atravesar la columna sern las siguientes:

um =

L tm

ux =

L tR

(1.3)

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1.3. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

El tiempo en el que las partculas quedan retenidas se puede obtener mediante la siguiente relacin de masas: 1 cmVm = um V cmVm + ceVe 1 + cceV

ux = um

(1.4)

m m

donde se expresa la masa del analito que hay en la fase mvil dividida por la masa total de la columna. Si se introduce en la relacin anterior la constante Kd se obtiene una relacin directa entre la velocidad de migracin y el reparto: 1 1 Ve = 1 + k 1 + Kd Vm

ux = um

(1.5)

En el denominador de la ltima ecuacin aparece denida una variable muy utilizada en cromatografa que es el factor de capacidad (k). Rescribiendo la ultima ecuacin se puede llegar a otra del tipo:

um = ux (1 + k )

(1.6)

Teniendo en cuenta la longitud de la columna y la ecuacin 1.3 en la pgina anterior, la ecuacin anterior puede ser escrita tambin de las siguientes formas:

tR = tm (1 + k )

(1.7)

k =

tR tm t = R tm tm

(1.8)

En consecuencia, de modo emprico al menos, se puede relacionar la variable ms importante de la retencin (tR ) con los parmetros sicoqumicos ms importantes de las separaciones cromatogrcas (Kd , k, Vm , Ve ). Los valores del factor de capacidad se pueden obtener a partir del cromatograma teniendo en cuenta las retenciones de los analitos y el tiempo muerto (Ver Figura 1.7 en la pgina anterior). Los factores de capacidad han de oscilar entre 1 y 5. Valores de kmenores que 1 suponen que el analito eluye bastante rpido, es decir, la retencin de ese analito en la fase estacionaria es casi inapreciable. Por otra parte, si kes mayor que 20 el compuesto se retendr muchsimo y su tiempo de retencin (tR ) ser demasiado alto como para poder ser analizado.

13

1.3. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

Teniendo en cuenta las expresiones anteriores se pueden predecir algunas consecuencias con respecto a tR : Al cambiar la longitud de la columna se va a producir un cambio anlogo en tR . Al variar el ujo de la fase mvil cambiar la velocidad de la fase mvil y por lo tanto tR . Al aumentar el valor de Kd el valor de tR tambin ser mas alto. Al aumentar o disminuir el volumen de cada fase la inuencia sobre tR puede ser contrapuesta en funcin de cual es la fase cuyo volumen se ha variado.

Ejemplo 1.2. Los tiempos de retencin de los compuestos A,B y C son 0.84 min, 10.60 min y 11.08 min, respectivamente, y se sabe que la sustancia A es un compuesto sin retencin. Si el volumen de la fase estacionaria es de 12.3 cm3 y el ujo de la fase mvil es de 20.55 cm3 .min1 calcular las constantes de reparto de B y C.
(tR tm ) tm Vm Ve

Ve tR = tm (1 + K Vm ) Kd =

Kd(A) =

(10,60 0,84)/0,84 20,55 10,60 = 206,61 12,3

Kd(B) =

(11,08 0,84)/0,84 20,55 11,08 = 255,66 12,3

En este ejemplo se aprecia la gran capacidad de la cromatografa para separar sustancias de constantes de reparto muy parecidas. Esto sera imposible mediante la extraccin lquida explicada en Captulos anteriores.

1.3.1.

Factores que afectan a la retencin

La velocidad de migracin de un analito a lo largo de la columna est inuenciada por los siguientes factores: 1. Propiedades y composicin de la fase mvil. 2. Caractersticas de la fase estacionaria.

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1.3. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

3. Interacciones de los analitos con la fase mvil y estacionaria 4. Temperatura. Como es habitual, para examinar las interacciones hay que hacer una distincin entre la cromatografa lquida y gaseosa, tal y como se recoge en la Tabla 1.3. En el caso de la cromatografa de gases como la fase mvil no es ms que un simple portador, son la fase slida y la temperatura los nicos factores inuyentes. Por el contrario, en la cromatografa liquida, adems de la temperatura hay que tener en cuenta las propiedades tanto de la fase mvil como de la estacionaria. Cuadro 1.3: Interacciones entre el analito y las distintas fases.
Analito Fase Estacionaria En Cromatografa Gasesosa Analito Fase Estacionaria Fase Mvil En Cromatografa Lquida

Cuando se lleva a cabo un anlisis de las fuerzas de atraccin se pueden destacar dos grupos principales: entre los grupos polares se encuentran las fuerzas de van der Waals y los enlaces de hidrgeno y entre los grupos no polares los ms importantes son las fuerzas de dispersin. Por tanto, las anidades que hay entre la fase estacionaria, mvil y analito se asocian con sus respectivas polaridades o se expresaran mediante el carcter hidrfobo/hidrlo de sus grupos funcionales. De todas formas, las expresiones cuantitativas son muy liosas y como hay que tener en cuanta un gran numero de variables, con el n de facilitar todo esto, se puede hacer una distincin entre la cromatografa de gases y la cromatografa liquida.

Cromatografa de gases

Se analizarn dos casos en funcin de la fase estacionaria: cuando la fase estacionaria es apolar y cuando es polar. En el primero de los casos, las interacciones fundamentales sern las fuerzas de dispersin y stas se pondrn de maniesto en las temperaturas de ebullicin de los analitos. Por tanto, si se utiliza una fase apolar los compuestos apolares se adherirn ms que los polares a la fase slida y como consecuencia de ello su elucin ser mas tarda. El orden de elucin de los compuestos polares y apolares ser acorde con sus temperaturas de ebullicin, esto

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1.3. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

es, para cada uno de estos tipos de compuestos los de menor temperatura de ebullicin saldrn antes que los de mayor temperatura de ebullicin. Si la fase estacionaria es polar, los compuestos polares presentaran mayor adhesin que los apolares. Como consecuencia de ello, los compuestos polares tardarn ms tiempo en salir que los apolares. En este caso las temperaturas de ebullicin no son tan importantes para determinar el orden de elucin.

Ejemplo 1.3. Se han obtenido los dos cromatogramas de gases, en dos columnas X1 ( %1 polisiloxano o -Si-O-R) y XWAX (polietilenglicol o (-O-CH2 -CH2 -O)n ), que se presentan a continuacin:

X1

XWAX

y las temperaturas de ebullicin (TE) y las polaridades de 3 compuestos a separar se recogen en la siguiente tabla:

Compuesto
A. Metanol B. Etanoato de metilo C. Dietileter

TE (o C) 65 57 36

Polaridad alto

intermedio
bajo

Puesto que la primera columna es apolar el orden de elucin ser el opuesto al de la polaridad. Esto es, la primera elucin corresponder al ms polar, es decir, el metanol. A continuacin el etanoato de metilo y por ltimo el dietileter. En el segundo de los casos, al ser la columna de tipo polar el orden ser distinto. La primera corresponder al ms apolar, concretamente el dietileter, a continuacin el etanoato de metilo y nalmente el metanol.

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1.3. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

Cromatografa lquida

Anteriormente se ha dicho que la cromatografa lquida consiste en un sistema ternario por lo que hay que analizar las interacciones entre dos componentes cualesquiera para llevar a cabo la separacin ptima. De todas formas, antes de todo, hay que tener en cuenta unas condiciones fundamentales previas. Por ejemplo, para que el analito sea arrastrado hay que disolverlo en la fase mvil. Si la anidad con respecto a la fase mvil es alta, no tendr ningn retraso y no quedar retenido en la fase estacionaria y por lo tanto la separacin no sera adecuada. Por el contrario, si la anidad con respecto a la fase estacionaria es alta, la retencin sera muy larga. Por lo tanto, para conseguir mejores separaciones a medida que progresa la elucin se habr de cambiar la composicin de la fase mvil puesto que es difcil cambiar la de la fase estacionaria. A este cambio se le denomina gradiente y en general el aumento de la fuerza de la fase mvil provocar una disminucin de la retencin. El aumento de la fuerza de la fase mvil puede tener distintos signicados o consecuencias en funcin de las caractersticas de la fase estacionaria. Por lo tanto, en funcin de las caractersticas de la fase estacionaria se hablar de cromatografa lquida de fase normal o de fase reversa. Cuadro 1.4: Caractersticas de la fase normal y fase reversa.

Tipo de Cromatografa Fase Normal Fase Reversa

Polaridad de la F. E. Polar Apolar

Intervalo de polaridad de la F.M. Dbil-Intermedia Fuerte-Intermedia

Como se puede ver en la Figura 1.8 en la pgina siguiente cuando la fase estacionaria es polar (fase normal) el orden de elucin ser el opuesto al de la polaridad, primero se producir la del apolar (B) y luego la del polar (A). Adems, al aumentar la polaridad de la fase mvil la retencin disminuir. Si la fase estacionaria es apolar (fase reversa) el orden de elucin ser el opuesto al anterior, primero el ms polar (A) y luego el ms apolar (B). La utilizacin de fases mviles ms fuertes se consigue mezclando disolventes ms apolares. La variacin con respecto a la temperatura del coeciente de reparto se puede expresar a travs de la ecuacin de vant Hoff:

dlnK H = dT RT 2

(1.9)

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1.4. CARACTERSTICAS DE LA CROMATOGRAFA DE SEPARACIN

donde H es la entalpa de reparto. Si la relacin de volmenes de las fases no depende de la temperatura en vez de la constante de reparto se pude usar el factor de capacidad (k). Como consecuencia de esta ecuacin, el tiempo de retencin es inversamente proporcional al cuadrado de la temperatura y eso es muy importante en la cromatografa de gases. Por el contrario, tiene menor inuencia en la de lquidos porque la entalpa de la fase liquida o entre la slida y la liquida no es tan grande.

Figura 1.8: Inuencia de los cambios en la fase mvil (Polarid.A >Polarid.B ).

1.4.

Caractersticas de la cromatografa de separacin

Si anteriormente se ha llevado a cabo un anlisis de la separacin, en este apartado se van a ver los resultados de dichas separaciones: los picos cromatogrcos. Para ello, se analizar la geometra del pico as como sus deformaciones, la anchura de los picos y su inuencia en la

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1.4. CARACTERSTICAS DE LA CROMATOGRAFA DE SEPARACIN

selectividad, la resolucin, etc. Por ltimo, se ver cuales son las variables ms importantes a tener en cuenta para poder realizar una separacin adecuada.

t (m in )

Figura 1.9: Forma tpica de un cromatograma. Analizando la Figura 1.9 se pueden observar una serie de caractersticas: los picos cromatogrcos son simtricos o casi simtricos y gracias a ello se puede hablar de un reparto normal o gaussiano. Los analitos que salen primero producen unos picos ms estrechos y altos que los que salen al nal. Los picos tambin presentan distintos tiempos de retencin.

1.4.1.

Geometra de los picos

El principal responsable de los picos cromatogrcos es la difusin de las molculas. De hecho, cualquier molcula tiene tendencia a moverse en cualquier sentido, a pesar de que el arrastre que sufre por parte de la fase mvil hace que la movilidad en el sentido de la fase mvil sea muy superior. Adems, se producir un movimiento del analito de los sitios de alta concentracin a los de baja concentracin (a favor del gradiente). Como consecuencia, la distribucin del analito ser normal o gaussiana como muestra la Figura 1.10 en la pgina siguiente. La concentracin de analito asociada a la fase slida depende de la concentracin de la fase mvil segn la constante de reparto. A la relacin (Ce /Cm ) de cada una de las fases se le llama isoterma de adsorcin. Si la relacin es lineal, esto es, si para cualquier concentracin (Ce /Cm ) es constante, la cromatografa obtenida ser lineal y los picos gaussianos. Pero en muchos casos las isotermas no son lineales, es decir la relacin (Ce /Cm ) depende de Cm (Figura 1.11 en la pgina

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1.4. CARACTERSTICAS DE LA CROMATOGRAFA DE SEPARACIN

12 10 8 6
h tR

4 2

Wh

0 2 2 .2 2 .4

Figura 1.10: Geometra de los picos.

siguiente). Las desviaciones con respecto a la idealidad pueden ser de dos tipos: las llamadas isotermas de Langmuir y anti-Langmuir. La primera tiene una forma logartmica y las tangentes a la curva (K-k) tienen cada vez valores ms pequeos. Las segundas tienen forma exponencial y las pendientes tienen tendencia a aumentar. Estas situaciones provocan irregularidades en los picos debido a que la velocidad o la migracin de los analitos a lo largo de la columna va aumentando a medida que disminuye el valor de K. En el primer caso, en la isoterma tipo Langmuir, ese efecto es mayor en la cumbre del pico que en la base. Es por ello que parece que la cumbre del pico est ms adelantada. Sin embargo, en la segunda, ocurre justo lo contrario, es decir, la migracin de la base es ms fuerte que la de la cumbre y es por ello que la cumbre aparece retrasada. A pesar de que las isotermas lineales muestran una dependencia respecto a la concentracin cuando las masas de los analitos son bajas (en la mayora de los casos <1 mg) se considera que los picos son gaussianos. Cuando las concentraciones (o masas inyectadas) son ms altas se dice que la columna est sobresaturada y entonces las deformaciones de los picos son mayores. En la Figura mostrada anteriormente se han expresado las fracciones a y b como las fracciones anterior y posterior para una altura de pico de 1/10. Las relaciones entre esas dos fracciones nos darn la simetra del pico y se considera aceptable cuando sta vara entre 0.9 y 1.1.

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1.4. CARACTERSTICAS DE LA CROMATOGRAFA DE SEPARACIN

350 S (cn t) 300 Cg / Cm = K 250 200 150 100 50 0 5 5.5 6 6.5 t (m in ) 7

Cm Cg

(a)
350 S (cn t) 300 250 200 150 100 50 0 5 5.5 6 6.5 t (m in ) 7
Cm Cg

350 S (cn t) a > b 300 250 200 150 100 50 0 5 5.5 6 6.5 t (m in ) 7
Cm Cg

a < b

(b)

(c)

Figura 1.11: Relacin entre las isotermas de adsorcin y los cromatogramas: (a) Gaussiana; (b) Langmuir; (c)anti-Langmuir.

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1.4. CARACTERSTICAS DE LA CROMATOGRAFA DE SEPARACIN

1.4.2.

Ecacia de la columna. Aproximacin clsica5

Como antes se ha dicho, los picos cromatogrcos son ms estrechos al principio que al nal del cromatograma. En general, la anchura de los picos muestra la ecacia de la columna, es decir, a medida que la anchura de los picos es menor mayor es la ecacia de la columna. Las variables que tienen inuencia sobre la anchura de los picos son varias y cada una tienen su aportacin a la varianza total de esa anchura (S2 ). En el lenguaje cromatogrco el tiempo de retencin o el volumen son valores medios y solamente expresan la retencin de la mayora de las partculas de cada uno de los componentes. Si se dan por buenas las condiciones expuestas en el apartado anterior, el pico cromatogrco ser gaussiano y se podr denir a travs de una media y su desviaciones estndar. Variables ms manejables que esa media pueden ser la anchura de base o pie de pico (Wb ) y la anchura del mismo a la altura media (W1/2 ) con las siguientes equivalencias:

Wb = 4

(1.10)

W1/2 = 2,35

(1.11)

La ecacia de la columna, por lo tanto, depende del numero de platos tericos (N) y de la altura equivalente del plato (H) siendo la relacin de las mismas la longitud de la columna. H= L N (1.12)

Para expresarla en funcin de la anchura del pico, el numero de platos tericos de la columna se puede dar mediante la siguiente expresin: tR
2

N=

= 5,54

tR W1/2

= 16

tR Wb

(1.13)

Las tres expresiones necesitan del conocimiento del valor de tR as como la lnea base para dar la altura del pico o para calcular la anchura de base. El numero de platos tericos as calculados puede corregirse teniendo en cuenta la retencin de la fase mvil. De esta forma se dara el numero de platos tericos ecaces.
5 Martin

& Synge. Premio Nobel 1952.

22

1.4. CARACTERSTICAS DE LA CROMATOGRAFA DE SEPARACIN

Ne f icaz = 5,54

tR tm W1/2

(1.14)

1.4.3.

Procesos de ensanchamiento de picos. Aproximacin cintica

La explicacin cuantitativa o mecanstica de los procesos de expansin o ensanchamiento de picos es muy tediosa. Se puede expresar de forma cualitativa tal y como se recoge en la Tabla 1.5 donde se indica cuales son los factores que inuyen en dicho ensanchamiento. En la Figura 1.12 en la pgina siguiente se recoge de forma grca cuales son los aportes de cada uno de los factores sobre el ensanchamiento. Se pueden considerar tres factores: la difusin Eddy o efecto de los diferentes caminos (A), la difusin molecular (B) y las transferencias de masa (C). Cuadro 1.5: Variables que afectan a la ecacia de la columna cromatogrca. Variable Velocidad de la fase mvil Coeciente de difusin en la fase mvil Coeciente de difusin en la fase estacionaria Dimetro del material empaquetado Grosor de la capa lquida supercial en la fase estacionaria Velocidad de desorcin del analito Dimetro de la columna Smbolo u DM Ds dp df td dc Dimensin cm.s1 cm2 s1 cm2 s1 cm cm s cm

Las tres contribuciones se pueden recoger en una nica ecuacin que es la ecuacin de Van Deemter: B +Ce u +Cm u u

H = A+

(1.15)

Difusin Eddy o efecto de los diferentes caminos

Tal y como se ve en la Figura 1.12 en la pgina siguiente en funcin del empaquetamiento de la fase estacionaria las partculas de analito tienen muchos posibles caminos a seguir, siendo stos unos ms largos que otros. En consecuencia, las partculas de analito recorrern caminos de distinta longitud para recorrer una misma distancia lineal utilizando para ello distintos tiempos de retencin hasta conseguir la elucin.

23

1.4. CARACTERSTICAS DE LA CROMATOGRAFA DE SEPARACIN

Figura 1.12: Las tres contribuciones a la ecuacin de van Deemter (a) efecto de los diferentes caminos, (b) difusin molecular y (c) transferencia de masa.

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1.4. CARACTERSTICAS DE LA CROMATOGRAFA DE SEPARACIN

La contribucin sobre la longitud equivalente del plato terico se expresa mediante la variable (A) y sta, a su vez, depende del tamao de las molculas de la fase estacionaria (d p ) as como del empaquetamiento (): A = 2d p
Difusin molecular

(1.16)

Como se ha dicho antes, las partculas de analito tienen la posibilidad y la tendencia a moverse en cualquier sentido aunque es el sentido del ujo el sentido principal. Esa difusin no tiene solamente lugar en la fase mvil (gas o lquido) sino que tambin puede producirse en la fase estacionaria (slido/lquido) siendo en esta ltima ms dbil. La contribucin de la difusin molecular sobre la longitud equivalente del plato terico viene dada por la siguiente expresin: B = 2DM (1.17)

donde es el factor de impedimento que viene a explicar el empaquetamiento y DM es el coeciente de difusin en la fase mvil.
Transferencia de masa

Esta contribucin nos da las velocidades de adsorcin y desorcin de los analitos. Esta contribucin tiene dos vertientes distintas: la cintica de adsorcin-desorcin y la cintica controlada por difusin. d2 f Ds d2 p Dm

Ce =

Cm =

(1.18)

La inuencia de todas las contribuciones sobre H se muestra en la Figura 1.13 en la pgina siguiente donde se aprecia que la variacin de H con respecto a la velocidad presenta un mnimo, sobre todo en la cromatografa de gases. En ese mnimo se consiguen las condiciones ms ecaces de separacin puesto que se consigue el mayor numero de platos tericos (N). Adems, en esas condiciones la variacin de H es muy suave y cualquier variacin pequea de la velocidad no tendr ninguna inuencia importante sobre la ecacia de la separacin. En referencia a la contribucin A (2d p ), cuanto ms pequeo es el tamao de partcula (d p ) el valor de H ser menor tambin. En ese mismo sentido, al disminuir el valor de d p el empaquetamiento de la columna ser ms complicado aumentando as el factor de empaquetamiento ().

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1.4. CARACTERSTICAS DE LA CROMATOGRAFA DE SEPARACIN

6 5 4 3 2 1 0 0

B/u

Cgu

Cmu

Figura 1.13: Variacin de los factores de la ecuacin de van Deemter con la velocidad de ujo de la fase mvil. tendr los valores mas pequeos en el caso de partculas esfricas y cuando el intervalo de tamaos de esa partcula es muy estrecho (esto es, adems de saber que el tamao medio de partcula es, por ejemplo, de 5 m hay que saber tambin cual es el intervalo de tamaos. Por ejemplo, que el 90 % de las partculas estn entre un tamao que oscila entre 4-6 m o 3-7 m) . Es ms, la permeabilidad de la columna disminuir a medida que disminuye d p tenindose que utilizar saltos de presin mayores para poder hacer pasar la fase mvil a travs de la columna. Como en la cromatografa de gases los saltos de presin muy altos van a impedir una mejora sobre H, los tamaos de partcula utilizados sern de 100-200 m. En la cromatografa liquida (HPLC), sin embargo, los saltos de presin son ms grandes debido a que los tamaos de partcula son mas pequeos, concretamente de 3-10 m. En lo que se reere a la contribucin de B hay que destacar que tiene en cuenta la difusin (DM ) de los solutos de la fase estacionaria. Esto es ms importante cuando la fase mvil es un gas puesto que el slido tiene un valor de DM ms pequeo, sobre todo comparndolo con la alta densidad del gas portador. En consecuencia, el gas portador ms tpico es el N2 que resulta ser ms adecuado que molculas pequeas como He e H2 . De todas formas y en referencia a las representaciones de H con respecto a la velocidad (ecuacin de Van Deemter) para esos gases se ve que las condiciones ms favorables en el caso del N2 se dan a bajas velocidades y para hacer anlisis ms rpidos los otros dos, He e H2 , sern ms adecuados. En cuanto a la tercera de las contribuciones, la transferencia de masa (C) hay que tener en cuenta que es bastante liosa puesto que recoge varias variables: coecientes de difusin de la fase mvil y estacionaria (DM y De ), espesor de la capa (d f ) y el factor de capacidad (k). En la cromatografa de gases es el espesor de capa el factor ms importante, teniendo que ser ste

26

1.4. CARACTERSTICAS DE LA CROMATOGRAFA DE SEPARACIN

lo mas pequeo posible. En HPLC de fase enlazada el concepto de espesor de capa es lioso puesto que es funcin de la composicin de la fase mvil. Los cambios de la composicin de esta fase provocaran cambios en k debido a la dependencia existente entre estos dos conceptos. Por ltimo, los dos coecientes de difusin dependen del dimetro de partcula y es por ello por lo que se pueden usar partculas lo ms pequeas posibles (3-10 m). La eleccin de la fase mvil y estacionaria se hace en funcin de sus selectividades y de los valores de k y no en funcin de sus coecientes de difusin. De todas formas, la eleccin entre dos fases mviles o dos fases estacionarias se puede hacer por medio de la ecuacin de van Deemter o una de sus ecuaciones derivadas. Si se analiza la inuencia de la temperatura se observa un descenso de H al aumentar la T pero al estudiar la cromatografa de gases se ver como se puede usar esa temperatura para controlar la resolucin.
Ejemplo 1.4. Basndose en la ecuacin de van Deemter explicar como se pueden obtener los valores mnimos de H:

a) Cuando la fase estacionaria es slida se conseguir con un tamao de partcula lo ms pequeo posible

y cuando es lquida se conseguir cuando el espesor de la capa lquida sea lo ms no posible.

b) Cuando el empaquetamiento de la fase estacionaria sea lo mas homogneo posible, es decir, cuando

el intervalo de tamaos de partcula sea el ms estrecho posible.

c) Cuando el dimetro de la columna sea el ms pequeo posible. d) Cuando los coecientes de difusin de la fase estacionaria sean lo ms grandes posible y los de la fase

mvil lo ms pequeos posible.

1.4.4.

Selectividad y resolucin

Tal y como se ve en el cromatograma mostrado, los analitos no salen en el mismo tiempo de retencin sino a distintos tiempos porque sino no sera posible la separacin. En consecuencia, se podra decir que la mezcla de analitos o compuestos han sido separados de forma selectiva o que la columna utilizada es selectiva respecto a esos analitos. La selectividad () o retencin selectiva se puede expresar a travs de la siguiente ecuacin: KA kA tRA tm = = KB kB tRB tm

(1.19)

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1.4. CARACTERSTICAS DE LA CROMATOGRAFA DE SEPARACIN

donde se muestra que las separaciones de los analitos A y B tienen un fundamento termodinmico. Para que los valores de sean superiores a 1 el analito B ha de salir antes que A. De todas formas, a la hora de dar los valores de se toma una referencia y a travs de los valores de se puede predecir el orden de elucin de los analitos
Ejemplo 1.5. Basndose en la separacin del ejemplo 1.2 dar los valores de los factores de separacin entre B y C o los valores de las selectividades. 11,08 0,84 = 1,05 10,60 0,84

BC =

A pesar de que la selectividad de los analitos es capaz de mostrar la diferenciacin de picos no tiene en cuenta la anchura de los mismos as como tampoco muestra el modo de poder separarlos. Para ello, habr que considerar la resolucin (Rs ) porque para poder separar los picos tendr que existir entre ellos una lnea base y esta exige un espacio mnimo entre los tiempos de retencin para as ver dos picos simples y no la superposicin parcial de los mismos.

tr = 0.2 min Rs = 1.00

tr = 0.15 min Rs = 0.75

tr = 0.10 min Rs = 0.5

tr = 0.075 min Rs = 0.37

Figura 1.14: Variacin de la resolucin de picos de igual altura. Los picos de los analitos, si son de alturas equivalentes, presentarn una anchura parecida y por lo tanto para distinguirlos estadsticamente tendrn que cumplir la desigualdad tR > 6. La resolucin, por lo tanto, se dene mediante la siguiente expresin:

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1.4. CARACTERSTICAS DE LA CROMATOGRAFA DE SEPARACIN

Rs =

tRB tRA 2B + 2A

tR 4

(1.20)

Si la anchura del pico se mide en la base o a la altura media resulta ms adecuado que las desviaciones estndar de esos picos. tR tR = Wpie 2 W1/2

Rs =

(1.21)

En general, para poder hacer una buena distincin y para dar buenos datos sobre la anchura de los picos la resolucin debe de estar comprendida entre los valores de 1.2 y 1.5. Como se muestra en la Figura 1.14, se ha dado la resolucin de picos de la misma altura y a pesar de que en el primer caso la distincin es buena en los ltimos parece que solo hay un pico. Los valores de la resolucin dependen de las informaciones obtenidas en el cromatograma que en general son la pureza de los analitos, nmero de analitos, concentraciones de los mismos y la pureza de los compuestos recuperados.
Ejemplo 1.6. Se ha obtenido el siguiente cromatograma utilizando una columna de fase reversa (C18 ) y utilizando un ujo de 2.5 ml/min para la fase mvil (70 % de agua y 30 % de AcN). Teniendo en cuenta que el pico de inyeccin se ha obtenido a los 0.80 min, calcular:

t (m in )

a) Tiempo de retencin de cada componente: Retenciones (min) t1 1.7 t2 2.0 t3 2.9 t4 3.5 t5 4.1

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1.4. CARACTERSTICAS DE LA CROMATOGRAFA DE SEPARACIN

b) Resolucin y selectividad entre los distintos componentes: Pareja 1-2 2-3 3-4 4-5 W base 0.2 0.3 0.45 0.55 Rs 1.5 3 1.33 1.09 N 1156-1600 1600-841 841-784 784-747

1.33 1.75 1.29 1.22

c) Cantidad media de platos tericos: 1025.

Ecuacin de optimizacin

Como se ha estudiado, en la geometra de los picos, en las anchuras, en la variacin de las anchuras, en la selectividad y en la resolucin aparecen muchas variables a tener en cuenta para conseguir una separacin ecaz. Las distintas expresiones estudiadas aparecen recogidas en la Tabla 1.6 y a travs de ellas se obtendrn una serie de conclusiones: Cuadro 1.6: Parmetros a tener en cuenta en la optimizacin.

Ecacia Selectividad Factor de retencin Resolucin Tiempo de retencin

N = 5,54

2 tR t = 16 WR W1/2 pie k = KA = kA KB B k = tRttm m tR tR Rs = Wpie = 2W1/2

tRA = tm (k + 1)

Ordenado todas las ecuaciones se puede obtener una expresin general de la resolucin en funcin de los platos tericos de la columna y en funcin de las variables k y : N Rs = 4 o 1
2

k k +1

(1.22)

N = 16 R2 s

1+k k

(1.23)

30

1.4. CARACTERSTICAS DE LA CROMATOGRAFA DE SEPARACIN

donde las tres caractersticas principales estudiadas aparecen de la forma indicada: selectividad: ( 1)/ factor de capacidad: k /(k + 1) ecacia de la columna: resolucin: Rs y por medio del ajuste experimental de las mismas se puede obtener la separacin de los analitos. N

Selectividad

Mientras las otras dos variables permanecen constantes es posible ver la inuen-

cia de la selectividad en la resolucin. Si = 1 no hay separacin, por lo tanto >1, por ejemplo 1.01. La principal responsable de la selectividad es la propia fase estacionaria o columna puesto que la inuencia de la fase mvil es muy limitada.

Factor de capacidad

Como antes, manteniendo jas las otras dos variables se puede observar

la variacin de la resolucin con respecto a k. En este caso k >0 pero tal y como se ve en la Figura no tiene porque tener valores muy altos porque la mejora no seria muy signicativa.

Esta variable tienen efectos contrapuestos. Por un lado, al aumentar N, por ejemplo al doblar su valor, se observa una mejora en la resolucin del orden de 2 pero
Ecacia de la columna

en contraposicin se producir el hecho de que el tiempo de retencin (tR ) se duplique tambin.

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1.5. EJERCICIOS

1.5.

Ejercicios

1. Calcular el nmero de platos tericos ecaces de una columna de GC teniendo en cuenta que los tiempos de retencin del analito y la fase mvil son respectivamente 3.64 y 0.21 minutos y la anchura en la base del pico es de 0.33 minutos. 2. Comparar las anchuras en la base de los picos de los analitos A y B teniendo en cuenta los siguientes datos: N= 1600, tiempo de retencin tRa = 6.0 min., tRb = 5.5 min. y tm = 0.3 min. Calcular tambin la resolucin de estos analitos. 3. Los datos que se recogen en la siguiente Tabla han sido obtenidos en una columna de HPLC de fase reversa. Calcular la selectividad () y el factor de capacidad (k) de cada analito respecto al alfenol teniendo en cuenta que el tiempo de retencin de las fase mvil es de 23 segundos. Tiempos de retencin de algunos barbitricos.

Analito Amobarbital Pentobarbital Fenobarbital Alfenol Metakualona

tR (min) 3.53 4.17 5.11 6.31 10.74

4. En una columna parecida a la del ejercicio anterior se han obtenido los resultados de la Tabla que se muestra a continuacin de anchuras en la base y retenciones referidas a diversos pesticidas clorados. Sabiendo que el ujo de la fase mvil es de 2.10 cm3 .min1 y la longitud de columna y dimetro interno de la misma son 15 cm y 4.6 mm, respectivamente, calcular el volumen de retencin de cada analito y el numero de platos tericos ecaces. As mismo, calcular la altura equivalente media del plato terico (H).

32

1.5. EJERCICIOS

Tiempos de retencin y anchura de la base de los picos de algunos pesticidas.

Pesticida DDT Lindano Dikofol Hexaclorobenceno

tR (min) 3.73 5.25 6.91 10.75

Woina (min) 0.20 0.27 0.36 0.56

5. Calcular la anchura de los picos de los analitos A y B (tRa = 4.4 min., tRb = 5.0 min) y su resolucin si los separamos en dos columnas distintas: a) L= 900 mm y H= 1 mm y b) L = 900 mm y H= 3 mm. 6. Una columna cromatogrca tiene una ecacia equivalente de 3700 platos tericos y las retenciones del pireno y 2-metilantraceno son respectivamente de 13.05 min y 12.79 min. Cual es la resolucin de esa columna respecto a esos dos analitos? Cuantos platos tericos son necesarios para que muestre una resolucin de 1.0 con esos tiempos de retencin? 7. Para un sistema de GC dado, los valores A, B y C de la ecuacin de Van Deemter son 0.012, 0.25 y 0.0022, respectivamente. Si se da la velocidad de ujo en cm.s1 y la altura equivalente (H) de los platos tericos en cm: a) Cual es la velocidad ptima del gas portador? b) Cual es la altura equivalente media del plato terico asociada a esa velocidad ptima del gas portador? c) Si la longitud de la columna fuese de 1 metro cuantos platos tericos tendramos? 8. Para dos columnas de la misma longitud los valores de los parmetros A,B y C estn recogidos en la siguiente Tabla. Calcular: a) Si la velocidad del gas portador es de 10.6 cm.s1 cual de las dos columnas tendr un mayor nmero de platos tericos. b) La velocidad ptima de cada columna

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1.5. EJERCICIOS

Parmetros de van Deemter de dos columnas.

A (cm) Columna 1 Columna 2 0.15 0.127

B (cm2 s1 ) 0.47 0.39

C (s) 0.005 0.014

9. Una columna de GC de 50 metros tiene 49000 platos tericos ecaces para un ujo de 15 cm.s1 y de 44000 para un ujo de 40 cm.s1 . Calcular: a) La velocidad ptima de ujo b) La ecacia a la velocidad ptima.

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