SINTESIS DE FLOURESCENA: ABSORCION Y EMISION DE LUZ

OBJETIVOS

Realizar la sntesis de la fluorescena mediante una reaccin de sustitucin electrofilia aromtica. Estudiar el mecanismo de la reaccin y las condiciones necesarias para sintetizar la fluorescena. Analizar la capacidad fluorescente de la fluoresceina y sus variaciones segn el pH. Determinar caractersticas compuestos fluorescentes. de los

Anhdrido Ftlico (AF):

*F= Fluorescena El resorcinol es el reactivo que se consume primero, por este motivo, se determina el porcentaje de rendimiento con la cantidad de producto formado a partir del resorcinol.

Diferenciar las tcnicas espectroscpicas.

RESULTADOS
Tabla 1. Registro de datos para la determinacin del rendimiento de la reaccin de sntesis de fluorescena

REACTIVO/PRODUCTO Resorcinol Anhdrido ftlico Masa papel filtro vaco Masa de papel filtro ms fluorescena Masa del producto

MASA (g) 2,2067 1,5073 0.870

Porcentaje de rendimiento:

2.507 Tabla 2. Aspecto de la fluorescena en el visible y en el ultravioleta 1,637

Disolucion Aspecto/ Color Visible Amarillo Aspecto/ Absorbancia Color en el (546nm) UV Verde fluorescente 0.141 intensidad media Verde fluorescente 0.069 muy intenso Verde fluorescente de poca intensidad

Fluorescena

Determinacin del reactivo lmite: Resorcinol (R):

Fluoresceina en HCl Fluoresceina en NaOH Fluoresceina en agua

Verdoso

Amarillo

una disolucin bsica se tiene un max de 490 nm, neutra 470nm y cida a 437nm. La radiacin electromagntica es un espectro de emisin, ocurre cuando hay una relajacin de las partculas excitadas a niveles de menor energa. Las formas ms comunes para la excitacin de partculas son: bombardeo de electrones, exposicin a chispas de corriente, calor de una llama, horno, radiacin ultravioleta, visible o infrarroja, radiacin electromagntica. Un espectro de emisin en la representacin grfica de la potencia de la radiacin emitida de una sustancia vs la longitud de onda o frecuencia. Hay varios tipos de espectros de emisin, siendo el espectro de lneas la representacin de la excitacin de tomos individuales, las lneas ms intensas en este tipo de espectros se conocen como lneas de resonancia y son caractersticas nicas para cada metal. El espectro de bandas consiste en varias longitudes de ondas definidas y muy cercanas, provenientes de todos las posibles transiciones de los niveles vibracionales que tiene las molculas o radicales.

ANALISIS DE RESULTADOS La fluorescena es una compuesto de la familia de las xantinas, producto de una reaccin de sustitucin electroflica aromtica es una sal de sodio de resorcinol ftalena. Tiene propiedades colorantes y fluorescentes. Es hidrosoluble y colorea el agua de color amarillo. Cuando se encuentra en soluciones de pH mayor a cinco, su color se torna verde y altamente fluorescente. La razn por la cual la fluorescena emite fotones en el UV-vis, se debe a grupos funcionales con enlaces responsables de este tipo de transiciones, conocidos como cromforos. Entre mayor cantidad de grupos funcionales que permitan realizar transiciones * (baja energa), se van a presentar transiciones en el UV-vis a mayor de 250nm. Las longitudes de onda de mayor energa afectan los enlaces * (mayor energa), produciendo la desactivacin de los estados excitados y el rompimiento los enlaces. Esta molcula es muy utilizada como un indicador de pH. Presenta transiciones electrnicas diferentes, al poseer 3 grupos ionizables, en medio cido, estos grupos se van a protonar, en medio bsico se van a desprotonar. Al generar cambios en la forma y el tamao de la nube electrnica dependiendo del pH del medio, se van a presentar diferencias en el color del UV y el UV-vis adems en la absorbancia. En

Figura 1. Transiciones de los espectros de emisin de lneas y de bandas

Cuando la radiacin atraviesa una capa de slido, lquido o un gas, se absorbe energa a diferentes longitudes de onda, dependiendo de la sustancia. La absorcin provoca que las partculas pasen de un estado basal a un estado excitado de energa superior. Los iones y molculas tienen un nmero limitado de niveles de energa discretos y para que se produzca la radiacin tiene que coincidir la energa de los fotones excitadores con la diferencia de energa entre el estado fundamental y uno de los estados excitados El estudio de las diferentes frecuencias de radiacin permite caracterizar los componentes de una muestra, para esto se realiza un espectro de absorcin que representa la absorbancia en funcin de la longitud de onda o frecuencia. La radiacin ultravioleta y visible tiene la energa suficiente para producir transiciones nicamente de los electrones ms externos o electrones enlazantes. Las frecuencias de rayos X al ser mucho ms energticas interaccionan con los electrones ms prximos al ncleo.

Figura 2. Espectros de absorcin a diferente pH de la fluorescena Los espectros de absorcin molecular son ms complejos que los espectros atmicos, debido a la gran cantidad de estados de energa que tienen las molculas en comparacin a los tomos aislados. Esto se debe a que las molculas estn constituidas por energa electrnicas, energa vibracionales y energa rotacionales, las cuales al absorber energa. Una de las diferencias que presentan los espectros de absorcin y emisin, radica en que un compuesto absorbe a longitudes de ondas especficas para pasar de un estado basal a uno excitado, pero en un espectro de emisin no siempre se emite a la misma longitud de onda de absorcin, un gran ejemplo de estos es la fluorescena que emite a longitudes de onda mayores, es decir, a menor energa.1

Figura 3. Estados de transicin de la fluorescencia La fluorescencia est caracterizada por tener estados singuletes excitados, este estado tiene la misma direccin del spin del electrn del estado fundamental. En el estado fundamental o basal, se mantiene un estado singulete, caracterizado por tener dos electrones en el orbital, con espines en diferente direccin (principio de exclusin de Pauli). Entre los niveles de energa, van a aparecer niveles vibracionales. Cuando se excita la molcula va a presentarse una serie de relajaciones vibracionales hasta llegar al nivel de energa ms bajo, as se genera emisiones de menor energa, es decir a mayores longitudes de onda. La energa disipada permite que aumente la temperatura por las colisiones entre las molculas excitadas y el disolvente. Se va a generar una transferencia de energa y un incremento en la temperatura del disolvente. Las emisiones de la fluorescencia se ven favorecidas entre menos tiempo dure la excitacin, es decir, entre ms rpido se

llegue al estado fundamental para poder tener un menor tiempo de vida media del estado excitado. En la fluorescencia se van a presentar desactivaciones radiantes y no radiantes, siendo estas ltimas las pertenecientes a las relajaciones vibracionales, las desactivaciones radiantes son las que permite la emisin de los fotones. Al desactivar la fluorescencia (procesos radiantes) mucho ms rpido que los procesos no radiantes, se favorece la emisin de la molcula. En cambio, si la desactivacin no radiante es mucho ms rpida, la fluorescencia desaparece o es menos intensa. La fluorescencia es afectada por: 2 Estructura: a mayor cantidad de dobles enlaces, el aumento del nmero de anillos y del grado de condensacin va a aumentar la eficacia (relacin entre el nmero de molculas que emiten, respecto al nmero total de molculas excitadas). Los heterocclicos sencillos no presentan fluorescencia, pero aquellas estructuras condensadas con piridina, furano y tiofeno etc., si la presentan (quinolina, indol). Los halgenos disminuyen la fluorescencia porque quitan carga a los compuestos. Efectos de la temperatura: al aumentar la temperatura va a aumentar la frecuencia de las colisiones, conllevando a la desactivacin del estado electrnico excitado por la transferencia de energa que ocurren entre las molculas excitadas y el disolvente. Efectos del pH: la influencia del pH se ha utilizado para la determinacin de puntos

de equivalencia en titulaciones de cido/base. Esto se debe a la gran cantidad de formas resonantes que se pueden presentar. Efectos de la concentracin: al aumentar la concentracin, se van a presentar una mayor cantidad de colisiones que va a generar que se absorba mucho ms rpido los fotones emitidos, es por esta razn que durante la determinacin de los diferentes comportamientos de la fluorescena segn el pH, se necesit diluirla lo suficiente, para poder apreciar la fluorescencia.

Esta reaccin de sustitucin electrofilca aromtica se cataliza en un medio cido con el fin que se protone el oxgeno y se pueda formar un carbocatin (figura 5) que va a ser atacado por el resorcinol.

Figura 6. Mecanismo de la sntesis de la fluorescena

Figura 4. Estructuras resonantes de la fluorescena

La forma lactona de la fluorescena carece de grupo cromforo y no presenta coloracin, en cambio su forma quinoidea al presentar el cromforo va a permitir que absorba en medio alcalino.

Figura 5. Formacin del electrfilo del anhdrido ftlico

El anhdrido ftlico es el electrfilo, el cual es atacado por el anillo del resorcinol. Al unirse a la molcula, el OH del anhdrido se protona y presenta una prdida de agua formando de nuevo un carbocatin. Viene otra molcula de resorcinol y ataca de nuevo al carbocatin. Se presenta un ataque del OH del resorcinol sobre el carbono contiguo, eliminndose agua y dndose la formacin de un ciclo. En este instante se forma un equilibrio entre la forma lactona y la forma quinoidea, diferencindose esta ltima por la formacin de COOH debido al rompimiento del enlace ster.

En la determinacin del rendimiento de la reaccin se obtuvo un 49%, este valor debi haber sido ms alto ya que la reaccin se hizo en reflujo. La temperatura acelera la velocidad de la reaccin aumentando las colisiones entre las molculas de resorcinol y anhdrido ftlico. Pero la temperatura aplicada no puede ser muy grande porque puede descomponerse alguno de los componentes ya que no poseen puntos de ebullicin muy grandes. Adems de la sntesis de la fluorescena, se analiz su comportamiento en soluciones de diferente pH, observndose que tanto en medio acido como en neutra el compuesto colorea la solucin de amarillo, pero en medio bsico la solucin presentaba una coloracin verdosa. Adems, en al observarse las soluciones en una cmara de UV, la solucin neutra y la acido dieron un color verde pero de poca intensidad, a diferencia de la solucin alcalina, que dio un verde fluorescente muy intenso. Este comportamiento debe a que en pH neutros o acidos, se favorece la forma lactona y en pH bsico se favorece la forma quinoidea, que posee un grupo cromforo que le permite absorbe y emitir en este medio.
Figura 7. Espectro fluorescena. de masas de la

La espectrometra de masas es una tcnica muy sensible que puede identificar compuestos a partir de la masa. En la cmara de ionizacin se pueden introducir muestras solidas o liquidas, o con acoples con otros instrumentos como cromatgrafos. Se bombardea con una corriente de electrones que al chocar con las molculas producen iones cargados positivamente. Estos iones formados denominados iones moleculares, pasan a travs de un campo elctrico a una cmara de seleccin que separa cada uno de los iones moleculares segn la relacin masa/carga, la mayora de los iones tiene una carga de +1. A partir del espectro de masas de la fluorescena, se aprecia que el correspondiente ion molecular aparece a 332, este ion determina entonces la masa del compuesto que concuerda con la literatura. La abundancia de la seal es muy pequea, debido a que el compuesto presenta un gran peso molecular y porque tiene una estructura no lineal.

Se presenta un pico a 287 muy intenso (pico base) por la prdida de COOH de m/z 45. Aparece tambin un pico a 303, producto de la prdida de CHO del fenol.

Figura 8. Prdida de COOH fluorescena.

de la

caracterstica de los grupos hidroxilo tanto del fenilo como del cido carboxilo que forman parte de la estructura del compuesto. Generalmente se esperara que dicha banda apareciera por encima de los 3500cm-1 y con una intensidad mayor de la observada. La disminucin de la intensidad de la banda, es ocasionada por el uso de un solvente lquido para realizar la lectura en el IR, el cual hace que las molculas del compuesto interaccionen entre ellas mediante enlaces de hidrogeno. Adems, la presencia de los dobles enlaces en la molcula, permiten que haya resonancia especialmente los de los anillos aromticos, haciendo que la seal se desplace hacia menores frecuencias. Entre 3000 y 2800cm-1 hay una banda intensa caracterstica de la vibracin de tensin de los enlaces C-H de hibridacin sp2, tambin se encuentra desplazada hacia la derecha por el efecto de resonancia producida por mltiples enlaces dobles de la molcula, ya que, generalmente en un hidrocarburo aromtico la banda se observa entre los 3100-3000cm-1. Teniendo en cuenta la estructura del compuesto, se esperara encontrar una banda intensa en 1720cm-1 debido a la presencia de un grupo carboxilo en la fluorescena, pero en el espectro de referencia, la banda no aparece y la ms cercana a ese valor se encuentra en 1600cm-1 banda caracterstica de la vibracin de tensin del doble enlace carbono-carbono de los anillos aromticos. Pero para este caso,

Figura 9. Perdida de COH fluorescena

de la

Figura 10. Espectro IR de la fluorescena

En el espectro de absorcin infrarroja para la fluorescena se observ aproximadamente en 3300cm-1, una banda ancha pero de mediana intensidad,

normalmente se esperara ver 4 bandas de intensidad variable unas cerca de los 1600cm-1 y las otras cerca de los 1500 cm-1, realmente en el espectro no se ve tal comportamiento solo se observan dos bandas un poco intensas cercanas a las regiones ya mencionadas, lo que sugiere un solapamiento de las seales de los enlaces C=C y C=O, adems siendo la fluorescena una sal, su grupo carboxilo estara en su forma anicnica como anin carboxilato, donde los dos enlaces carbono-oxigeno estn fuertemente acoplados con fuerza de enlace intermedia entre el C=O y C-O.3

Figura 11. Espectro RMN1H fluorescena

de la

El espectro de RMN1H, tomado con la forma estructural lactona de la fluorescena, aparentemente muestra que la molecula posee cinco tipos de hidrgenos, que se encuentra en medios electromagnticos diferentes.

Figura 12. Estructura de la fluorescena para RMN!H.

Pero al observar la imagen estructural que acompaa al espectro se observan siete tipos de hidrgenos diferenciados con las letras del alfabeto. En primero lugar se encuentra el protn A que est 10.1ppm, a simple vista la seal no es muy notoria debido a su poco intensidad, esta seal corresponde a los hidrgenos que estn unidos a los oxgenos. Siendo el oxgeno un tomo ms electronegativo que el hidrogeno y el carbono, ocasiona una desproteccin en el hidrogeno desplazando la seal hacia frecuencias ms altas y la baja intensidad ocurre porque el hidrogeno en esta posicin no posee hidrgenos vecinos que puedan desdoblar su seal. El protn tipo B, aparece cerca de los 8.1ppm, es el hidrogeno que se encuentra cerca del grupo carboxilo, el cual est induciendo el desplazamiento de la seal. Los protones C, D y E corresponden a los protones que estn ms lejos del grupo carboxilo pero ubicados en el mismo aillo, son responsables de la seal que aparece entre 7.2 y 7.8 ppm, que tiene apariencia de multiplete pero no se alcanza a distinguir por la resolucin de del espectro. Estos tres protones son diferentes, pero la diferencia de sus ambientes electromagnticos no es tan grande y por lo tanto, sus seales estn muy juntas. Los hidrgenos tipo F, aparecen aproximadamente a 6.7 ppm, se encuentra desplazados por el efecto de los oxgenos presentes en la molcula y su seal corresponde a un singulete, debido a que no tiene hidrgenos vecinos. Muy cerca de esta seal, aproximadamente a unos 6.5 ppm aparece la seal de los hidrgenos tipo G, que se encuentras ms

lejos de los oxgenos, pero se encuentran desplazados a mayores frecuencias, debido a que el fenmeno de desproteccin ocasionado por la electronegatividad del oxgeno es muy fuerte. PREGUNTA

Interacciona con el ADN y el ARN por intercalacin dentro de la molcula o por atraccin electrosttica, respectivamente. El mximo de excitacin es a a 502 nm y una emisin a 525 nm (en el verde). Cuando est asociado al ARN, la excitacin mxima deriva a 460 nm (en el azul) y la emisin mxima a 650 nm (en el rojo). El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. El color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentracin. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y rojo si est muerto.4 CONCLUSIONES Los compuestos fluorescentes tiene capacidad de emitir fotones longitudes de ondas mayores que irradiacin utilizada para excitacin. la a la la

Rodamina B Las rodaminas B son un tipo de colorantes rojos, de la familia de las xantinas, se deriva por la condensacin de las interacciones del meta N,N dimetilamino fenol y el anhdrido ftlico. Estos colorantes orgnicos solubles son ampliamente empleados para la fabricacin de barnices coloreados y tintas tipogrficas.

La fluorescena tiene una mayor absorbancia y emisin de luz, cuando se encuentra en un pH alcalino, debido a que en este medio se favorece la forma quimoidea que posee un cromforo. En la espectrometra de masas, a diferencia de las dems tcnicas como UV, IR, RMN., las molculas al ser ionizadas a partir de un haz de electrones se rompen los enlaces de las molculas, destruyndose la muestra.

Naranja de acridina El naranja de acridina es un colorante catinico selectivo para los cidos nuclicos y til para realizar determinaciones sobre el ciclo celular.

REFERENCIAS 1. SKOOG, PRINCIPIOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL, quinta edicin, editorial Mc Graw Hill. Pg. 139- 141 2. SKOOG, PRINCIPIOS DE ANALISIS INSTRUMENTAL, quinta edicin, editorial Mc Graw Hill. Pg. 384-391 3. ZULUAGA, F; INSUASTY, B.; YATES, B.; ANALISIS ORGANICO CLASICO Y ESPECTRAL, Universidad del Valle, Facultad de ciencias, departamento de qumica, mayo 2006. Pg. 133-135 4. http://www.bionica.info/biblioteca/TincionBacterias.p df. Visitada 01/09/2011