Bioqumica Experimental II, PL2, 2011/2012, Professor: Carlos Farinha

Grupo 1: Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa 40261 e Telmo Paiva 40243

Objectivos

Demonstrar o efeito de diversos inibidores e de um desacoplador da cadeia

de transporte electrnico;
Demonstrar o passo de derivao do succinato na cadeia respiratria; Verificar a respirao independente do cianeto.

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Resumo
Testou-se a respirao

independente
do cianeto

Sequenciou-se a cadeia respiratria usando diferentes combinaes de substratos e inibidores 96 %

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Cadeia respiratria nas plantas

Protocolo Bioqumica Experimental II Respirao mitocondrial e fosforilao oxidativa Ano Lectivo 2011/2012

Atravs do estudo dos inibidores podemos sequenciar os complexos

da cadeia transportadora de electres

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Ensaio 1 - Malato - Glutamato

ADP

Succinato

Malato Glutamato

Rotenona

Ascorbato Citocromo c

[O2]/mol

Antimicina A

KCN

Oligomicina
Figura 1. Ensaio dos inibidores 1 (G1/2). 5 Vpapel/mm min-1
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Ensaio 2 - Malato-Glutamato

[O2]/mol

Malato Glutamato

NADH Rotenona

Figura 2. Ensaio dos inibidores 2 (G3/4).

Vpapel/mm min-1

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Ensaio 3 - Succinato

ADP

Succinato
[O2]/mol Malonato

NADH

Ascorbato Citocromo C

Malato Glutamato

Antimicna A KCN

Figura 3. Ensaio dos inibidores 3 (G3/4).

Vpapel/mm min-1

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Ensaio 4 - Succinato
ADP

[O2]/mol

Succinato Oligomicina

CCP

Figura 4. Ensaio dos inibidores 4 (G3/4).

Vpapel/mm min-1

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Ensaio 5 - Succinato

ADP
Succinato

[O2]/mol

Rotenona

Antimicina A

Figura 5. Ensaio dos inibidores 5 (G1/2).

Vpapel/mm min-1

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Ensaio 6 - NADH

ADP [O2]/mol

Succinato

Rotenona

Figura 6. Ensaio dos inibidores 6 (G1/2).

Vpapel/mm min-1

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Passo de derivao do succinato

Duas formas de demonstrar: Malato-Glutamato ADP Rotenona Succinato Malonato ou Succinato ADP Malonato Malato-Glutamato Rotenona
Complexo I Pool Q Malato Glutamato

Rotenona
Complexo II

Succinato

Malonato
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Sequenciao da cadeia
Mnimo de adies:

Malato-Glutamato Rotenona Succinato Antimicina A Ascorbato citocromo c KCN

Succinato Malonato Malato - Glutamato Antimicina A Ascorbato citocromo c KCN

Na presena de ADP.

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Sequenciao da cadeia
Complexo I Pool Q Malato Glutamato Rotenona Antimicina A Ascorbato + citocromo c Cianeto Complexo III Complexo IV O2

Complexo II

Succinato

Malonato
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Respirao Independente de Cianeto

[O2]/mol

Adio KCN 8 quadrculas 29 mm 20 mm 10 quadrculas

Figura 7. Ensaio com KCN (G1/2). 14

Vpapel/mm min-1
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Respirao Independente de Cianeto

Antes da adio de KCN: 10 mm ---- 1 minuto 20 mm ---- x

x = 2 minutos

Sabendo que a quantidade de O2 consumido por quadrcula de 4,707 nmol.

2 minutos ---- 8 quadrculas x 4,707 nmol de O2 consumido/ quadrcula 1 minuto ---- y y = 0,188 nmol de O2 consumido por minuto

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Respirao Independente de Cianeto

Depois da adio de KCN: 10 mm ---- 1 minuto 29 mm ---- x x = 2,9 minutos

2,9 minutos ---- 10 quadrculas x 4,707 nmol de O2 consumido/ quadrcula 1 minuto ---- y y = 0,162 nmol de O2 consumido por minuto

Razo da respirao independente do cianeto:

Respirao Independente do = cianeto = Depois da Adio Antes da Adio 0,162 0,168
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x 100

x 100 = 96%

Referncias
Nelson, D., Cox, M. (2008). Lehninger, Principles of Biochemistry, Fifth Edition. New York: W. H. Freeman and Company.

Cain, K. & Skilleter, D.N. (1987) Preparation and use of mitochondria in toxicological
research. In Biochemical Toxicology a practical approach (Snell, K. & Mullock, B., eds.), pp. 217-254, Oxford: IRL Press. Moore, A.L. & Whitehouse, D.G. (1997) Isolation and purification of functionally intact

mitochondria and chloroplasts from plant cells. In Subcellular fractionation a practical

approach (Graham, J.M., Rickwood, D., eds.), pp. 243-270, Oxford: IRL Press. Rickwood, D., Wilson, M.T., Darley-Usmar, V. (1987) Isolation and characteristics of intact mitochondria. In Mitochondria a practical approach (Darley-Usmar, V., Rickwood,

D., Wilson, M.T., eds.), pp. 1-16, Oxford: IRL Press.

Verleur, J.D. (1965) Studies on the Isolation of Mitochondria from Potato Tuber Tissue, Plant Physiol 40, pp.1003-1007.
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