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Grupo 1: Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa 40261 e Telmo Paiva 40243
Objectivos
Demonstrar a extenso da fosforilao obtida com diferentes substratos atravs do clculo da razo ADP/O; Demonstrar o grau de controlo respiratrio.
DQB-Licenciatura em Bioqumica
Resumo
Clculo das
razes ADP/O
DQB-Licenciatura em Bioqumica
Razo ADP/O
Menos O2 consumido
Maior razo
DQB-Licenciatura em Bioqumica
Complexo II ADP/O 2
So transportados da matriz 6 H+
So transportados da matriz 2 H+
DQB-Licenciatura em Bioqumica
= 0,0426
Clculo da razo ADP/O: 1. Contar o nmero de quadrculas correspondente entre 100% e 0% de O2;
2. Sabendo a quantidade de O2 que se consome e o valor mximo (saturao a 25C), podemos calcular que quantidade de O2 se consome por quadrcula.
3. Saber as quantidades de O2 consumido em cada ensaio que se adiciona ADP
4. Dividir a quantidade de ADP que se adicionou por 2 vezes a quantidade de O2 consumido, obtendo a razo ADP/ O
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DQB-Licenciatura em Bioqumica
25
30 35
8,11
7,52 7,02
0,253
0,230 0,219
Valor utilizado
0,253 106 () 0,253 = = 2,53 104 3 () 1 10 = 2,53 104 = 1,6 = 1,6 103 =
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[O2]/mol
O2 (ppm)
O2 (mol/ml)
100% O2
0% O2 Vpapel/mm min-1
DQB-Licenciatura em Bioqumica
= 4,707 2
Grupos 3 e 4 0 mol O2 Vpapel/mm min-1
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NADH
Substrato do complexo I
NADH citoslico
Shuttle de malatoglutamato
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ADP
Com ADP Ocorre respirao
Mitocndrios acoplados
Sem ADP
Se h respirao
http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Adenosindiphosphat_proto niert.svg, consultado em 14-05-2012
Mitocndrios desacoplados
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CCP
Desacoplador
Maior Consumo de O2
No h gradiente protnico
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ADP
NADH [O2]/mol
17 quadrculas
CCP
Vpapel/mm min-1 = 9,97 103 = 20 = 20 106 = = = 20 106 9,97 103 = 199,4 17 = 17 4,707 2 = 80,02 2
Malato-Glutamato
Substrato do complexo I
Malato-Glutamato
Lanadeira
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[O2]/mol
7 quadrculas
Vpapel/mm min-1
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Succinato
Substrato do complexo II
Succinato
e-
FAD e-
Consumo de O2
Cadeia respiratria
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[O2]/mol
ADP (40 L)
16 quadrculas
Vpapel/mm min-1
= 20 = 20 106 = 199,4
8 4,997 109 = 399,8 16 4,997 = 79,95 2 2 199,4 199,4 = = = 2,45~2 2 39,98 2 79,95
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Ascorbato citocromo c
Substratos do complexo IV
Ascorbato: Actua na desintoxicao do perxido
de hidrognio, nas plantas
Ascorbato - http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:LAscorbic_acid.svg, consultado em 14-05-2012
Transfere
complexo
electres
entre
ubiquinol-citocromo C e o citocromo c
Citocrmo c http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Cytochrome_c.png, consultado em 14-05-2012 DQB-Licenciatura em Bioqumica
oxidoredutase oxidase
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[O2]/mol
Vpapel/mm min-1
Razes ADP/O
Tabela 1. Razes ADP/O para cada um dos substratos utilizados.
Complexo I
II IV
2,45
2 1
Quanto maior a razo ADP/O mais inicial o complexo na sequncia da cadeia respiratria Com base nas razes ADP/O obtidas experimentalmente, a sequncia da cadeia :
Malato-Glutamato
Complexo I
19
Succinato
Complexo II
NADH
Complexo IV
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Razes ADP/O
A sequncia correcta da cadeia : NADH Malato-Glutamato
Complexo I
Succinato
Complexo II
AscorbatoCitocromo c
Complexo IV
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Controlo Respiratrio
Estado 1 Mitocndrios na presena de Pi (fosfato inorgnico); Estado 2 Adio de substrato, respirao baixa devido falta de ADP; Estado 3 uma quantidade limitada de ADP adicionada, permitido uma respirao rpida; Estado 4 Todo o ADP foi convertido em ATP e a respirao torna-se lenta.
Controlo Respiratrio
Para o succinato:
3 8 4,997 2 1 = 13,3 2
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Controlo Respiratrio
Para o estado 4 tem-se: 10 1 29 = 2,9 O controlo respiratrio dado por: = 3 13,3 = = 3,87 > 1 4 3,45 2,9 2 4,997 109 1 = 3,45 2
Mitocndrios acoplados
No incio e no fim
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necessrio consumir maior quantidade de oxignio para sintetizar a mesma quantidade de ATP
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Referncias
Nelson, D., Cox, M. (2008). Lehninger, Principles of Biochemistry, Fifth Edition. New York: W. H. Freeman and Company.
Cain, K. & Skilleter, D.N. (1987) Preparation and use of mitochondria in toxicological
research. In Biochemical Toxicology a practical approach (Snell, K. & Mullock, B., eds.), pp. 217-254, Oxford: IRL Press. Moore, A.L. & Whitehouse, D.G. (1997) Isolation and purification of functionally intact