Bioqumica Experimental II, PL2, 2011/2012, Grupo 1:

Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa 40261 e Telmo Paiva 40243
Professor: Rodrigo Almeida

Objectivos
Introduo espectroscopia vibracional no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR):

Aplicao anlise estrutural de protenas.

Introduo s medidas fluorimtricas: Espectros de excitao e emisso; Introduo fluorescncia de protenas: O triptofano como composto modelo;

Aplicao ao estudo da estrutura e dinmica de protenas em

soluo;
2

DQB-Licenciatura em Bioqumica

FTIR (I)
um tipo de espectroscopia de absoro a qual usa a regio do infravermelho do espectro electromagntico da radiao emitida

pelas substncias;
Baseia-se no facto das ligaes qumicas dos compostos possurem frequncias de vibrao especficas, as quais correspondem a nveis de energia da molcula (nveis vibracionais). As frequncias de vibrao dependem: da geometria molecular;

das massas dos tomos.

DQB-Licenciatura em Bioqumica

FTIR (II)
As ligaes podem vibrar de seis modos:

Estiramento Simtrico

Estiramento Assimtrico

Tesoura

Toro

Balano

Rotao

Se a molcula receber radiao eletromagntica com a mesma energia de uma dessas vibraes, ento a luz ser absorvida.
4
DQB-Licenciatura em Bioqumica

Procedimento (FTIR)
Pastilha com KBr Branco

Pastilha com

mioglobina em KBr

Pastilha com -globulina em KBr

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Espectros de FTIR Anlise conformacional

Determinao da estrutura secundria das protenas

KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Espectros de FTIR - Mioglobina

Banda Amida II 1542,78 cm-1 84,9% T Banda Amida A 3301,55 cm-1 87,46% T 3311,19 cm-1 87,53% T CO2 (interferente) Banda Amida I 1656,56 cm-1 82,12% T

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Anlise estrutural - Mioglobina

Banda Amida I 1656,56 cm-1 82,12% T

Estrutura secundria

predominante: hlice

KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Comparao com a literatura Mioglobina

KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Espectros de FTIR -Globulina

Banda Amida II 1536,99 cm-1 27,16% T

Banda Amida B
3085,56 cm-1 39,12% T Banda Amida I 1643,06 cm-1 21,89% T

Banda Amida III

1238,08 cm-1 54,81% T

Banda Amida A
3288,05 cm-1 26,03% T

10

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Anlise estrutural - -Globulina

Banda Amida I 1643,06 cm-1 21,89% T

Estrutura secundria

predominante: folha

KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures

11

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Comparao com a literatura - -Globulina

KONG J. et al.: Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures

12

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Espectroscopia de Fluorescncia
Espectroscopia de Fluorescncia: tipo de espectroscopia electromagntica que analisa a fluorescncia de uma amostra. Ocorre devido presena de molculas aromticas. Molculas no estado excitado Emisso de foto Molculas no estado fundamental

Aparelhos: Espectrofluormetros

Indole Trp Principal fluorforo das protenas: indole dos resduos de Trp
13
DQB-Licenciatura em Bioqumica

Procedimento (Fluorescncia)
Triptofano em tampo

= 350 nm

Triptofano em etanol

= 295 nm

14

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Triptofano - Emisso
Espectro de Emisso do Triptofano em Tampo e em Etanol
Intensidade de Fluorescncia 50 000 000 40 000 000 30 000 000 20 000 000 10 000 000 Trp. Em Tampo Trp. Em Etanol

0
310 330 350 370 390 Comprimento de onda (nm) 410 430 450

Intensidade de Fluorescncia (normalizado)

Espectro de Emisso em Tampo e em Etanol (Normalizado)

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 310 330 350 370 390 Comprimento de onda (nm) 410 430 450 Trp. Em Tampo Trp. Em Etanol

15

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Triptofano - Excitao
Intensidade de Fluorescncia

Espectro de Excitao do Triptofano em Tampo e em Etanol

200000000 100000000 0 -1E+08 -2E+08 -3E+08 Comprimento de onda (nm) 250 260 270 280 290 300 310 320 Trp. Em Tampo Trp. Em Etanol

Intensidade de Fluorescncia (normalizado)

Espectro de Excitao em Tampo e em Etanol (Normalizado)

1
0 -1 -2 -3 Comprimento de onda (nm) 250 260 270 280 290 300 310 320

Pico de Raman

Trp. Em Tampo Trp. Em Etanol

16

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Excitao VS Emisso do Triptofano

Intensidade de Fluorescncia (normalizado)

Espectro de Emisso em Tampo e em Etanol (Normalizado)

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 310 330 350 370 390 Comprimento de onda (nm) 410 430 450 Trp. Em Tampo Trp. Em Etanol

Intensidade de Fluorescncia (normalizado)

Espectro de Excitao em Tampo e em Etanol (Normalizado)

1 0 -1 -2 -3 Comprimento de onda (nm) 250 260 270 280 290 300 310 320 Trp. Em Tampo Trp. Em Etanol

17

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Procedimento (Fluorescncia)
Mioglobina comercial (nativa)

= 330 nm

Mioglobina em hidrocloreto de

guanidina (desnaturada)

= 295 nm

18

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Mioglobina - Emisso
Espectro de Emisso da Mioglobina (nativa e desnaturada)
Intensidade de Fluorescncia

50000000
40000000 30000000

20000000
10000000 0 -10000000

Mio Desnaturada Mio

310

330

350

370

390

410

430

450

Comprimento de Onda (nm)

Intensidade de Fluorescncia (Normalizada)

Espectro de Emisso da Mioglobina (nativa e desnaturada) Normalizado

1 0,8

0,6
0,4 0,2 0 -0,2 310 330 350 370 390 Comprimento de Onda (nm) 410 430 450

Mio Desnaturada
Mio

19

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Mioglobina - Excitao
Espectro de Excitao da Mioglobina (nativa e desnaturada)
Intensidade de Fluorescncia 30 000 000 25 000 000 20 000 000 15 000 000 10 000 000 5 000 000 0 -5 000 000 250 260 270 280 290 Comprimento de Onda (nm) 300 310 320 Mio Desnaturada Mio

Espectro de Excitao da Mioglobina (nativa e desnaturada) Normalizado

Intensidade de Fluorescncia (Normalizada)
1 0,8

0,6
0,4 0,2 0 250 260 270 280 290 300 310 Mio Desnaturada Mio

-0,2

Comprimento de Onda (nm)

20

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Excitao VS Emisso Mioglobina

Intensidade de Fluorescncia (Normalizada)

Espectro de Emisso da Mioglobina (nativa e desnaturada) Normalizado

1
0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 310 330 350 370 390 Comprimento de Onda (nm) 410 430 450 Mio Desnaturada Mio

Espectro de Excitao da Mioglobina (nativa e desnaturada) Normalizado

Intensidade de Fluorescncia (Normalizada)
1 0,8

0,6
0,4 0,2 0 250 260 270 280 290 300 310 Mio Desnaturada Mio

-0,2

Comprimento de Onda (nm)

21

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Emisso Mioglobina VS Triptofano

Espectro de Emisso da Mioglobina (nativa e desnaturada) Normalizado
Intensidade de Fluorescncia (Normalizada) 1
0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 310 330 350 370 390 Comprimento de Onda (nm) 410 430 450 Mio Desnaturada Mio

Intensidade de Fluorescncia (normalizado)

Espectro de Emisso do Triptofano em Tampo e em Etanol (Normalizado)

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 250 260 270 280 290 Comprimento de onda (nm) 300 310 320 Trp. Em Tampo Trp. Em Etanol

22

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Procedimento (Intensidade de Fluorescncia em funo do pH)

Solues de mioglobina (pH 3 8)

Medio da intensidade de fluorescncia em = 330 nm ext = 295 nm

Medio do pH

23

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Intensidade de Fluorescncia em funo do pH

Protena: Mb comercial

24

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Intensidade de Fluorescncia em funo do pH

25

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Intensidade de Fluorescncia em funo do pH

Trp

His

26

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Intensidade de Fluorescncia em funo do pH

Trp

His

Grfico fornecido pela PL 3, cuja soluo de Mb comercial foi filtrada.

27

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Intensidade de Fluorescncia em funo do pH

Trp

His

Irace G, Balestrieri C, Parlato G, Servillo L, Colonna G. Biochemistry. 1981; 792-799

28

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Intensidade de Fluorescncia em funo do pH

Espectro de emisso da Mb de corao de cavalo a pH 7,2 (curva de baixo) e a pH 4,5 (curva de cima).
Gryczynski Z, Lubkowski J and Bucci E. J. Biol. Chem. 1995; 270:19232-19237

29

DQB-Licenciatura em Bioqumica

Concluso
Espectroscopia de Fluorescncia vs FTIR
espectros de excitao e de emisso das amostras

Fluorescncia
intensidade de fluorescncia da amostra

espectro infravermelho da amostra

FTIR
estrutura secundria da protena
30
DQB-Licenciatura em Bioqumica

Referncias
Atkins PW, de Paula J. Physical Chemistry for the Life Sciences. 2006.

Freeman/Oxford;
Jilie KONG et al. Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein Secondary Structures. Institute of Biochemistry and Cell Biology, SIBS, CAS. China, 2007; Gryczynski Z, Lubkowski J and Bucci E. J. Biol. Chem. 1995; 270:1923219237; Warren Gallagher. FTIR Analysis of Protein Structure;

Lakowicz JR. Principles of Fluorescence Spectroscopy. 2006. 3rd edition.

Springer, NY.

31

DQB-Licenciatura em Bioqumica