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Deteco, quantificao e caracterizao dos anticorpos e seu uso como ferramenta para pesquisa e diagnstico
RESPOSTA DE ANTICORPOS
l Especificidade
Habilidade do Ac distinguir seu imungeno de outros Ag.
l Quantidade
N de clulas B x taxa de sntese do Ac x persistncia aps sua produo. l Isotipo Determina a persistncia (meia vida in vivo diferente). A composio determina a funo dos Ac e os locais onde so encontrados.
l Afinidade
Fora de ligao do Ag com o Ac, em um nico stio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac ser necessrio.
l
Avidez x Afinidade
INTERAES
l l
Reaes reversveis.
Ligaes no covalentes: -Pontes de hidrognio -Interaes hidrofbicas -Interaes de Van der Waals -Ligaes inicas
MTODOS
1)
Reagentes no marcados Reao de precipitao Reao de aglutinao Reagentes marcados RIA ELISA Imunofluorescncia Western Blotting
2)
MTODOS
l
PRECIPITAO
APLICAES
- Pesquisa - Diagnstico - Soroepidemiologia
AGLUTINAO
IMUNOENSAIOS
PRECIPITAO X AGLUTINAO
l
Precipitao:
REAES DE PRECIPITAO
l l l l
Interao entre Ac e Ag solvel Ac precisa ser bivalente Ag precisa ser bi ou polivalente A reao pode ser afetada pelo n de stios de ligao que cada Ac possui para seu Ag VALNCIA
PRECIPITADO
importante levar-se em conta como ocorre a ligao Ag-Ac em diferentes concentraes dos mesmos. Observe abaixo: +
+ -
Faz-se em seguida, pequenos orifcios no gel e so adicionadas as solues testes de Ag e Ac, como por exemplo, mostrado abaixo:
Ac
e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalncia, se observa a reao pela formao de uma linha de precipitao: Pode ser visualizada ps lavagem do gel , para remoo das protenas solveis, por colorao dos arcos de precipitao com corante
Utilizao: muito usada em pesquisa e diagnstico de algumas doenas, como cisticercose
Ag
Ag
Ac Ag Ag
Ag
Ag
Ac
Ac
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IMUNODIFUSO RADIAL
l l
Permite a quantificao do antgeno ou do anticorpo. O processo continua at ser atingida a zona de equivalncia, com os complexos precipitandose em um anel (halo) em torno do orifcio.
Utilizao: dosagem de IgG, IgA e IgM e protenas sricas. Agarose contendo anticorpos anti-IgG humana
Poos onde so colocados padres e amostras a serem dosados Halo de precipitao IgG antiIgG
IMUNOELETROFORES E l
Pode-se fazer comparao de misturas complexas de Ag que so separados em gel de agarose, pela aplicao de uma corrente eltrica. l As molculas migram para o plo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas eltricas. l Uma canaleta recortada entre os poos e preenchida com Ac, que se difunde. l Ag e Ac formam arcos de precipitao.
1- Separao de antgenos
A g A g
3- Difuso e precipitao
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REAES DE AGLUTINAO
Ac + Ag multivalente particulado l Ttulo: maior diluio que ainda causa aglutinao (semi-quantitativo) l P-zona: excesso de Ac l Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga eltrica (repulso) l Agregao visvel de partculas = Eritrcitos, bactrias, fungos e ltex
l
AGLUTINAO DIRETA
Clulas ou partculas insolveis + Ac = Aglutinao Exemplo: tipagem sangunea em lminas (sistema ABO)
1) Amostra de sangue na placa teste:
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AGLUTINAO DIRETA
4) Mistura-se:
3) Controle negativo:
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AGLUTINAO DIRETA
5) Leitura do resultado:
negativo
positivo
Um resultado positivo indicado por uma aglutinao visvel (aglomerao dos eritrcitos na placa teste), como ilustrado acima.
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O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diludos, so adicionados aos poos da referida placa.
Se houver Ac especfico contra o Ag, as hemcias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poo. Quando no existe Ac especfico, as clulas formam um boto no fundo do poo. Aglutinao Positiva
Negativa
INIBIO DA AGLUTINAO
Exemplo: presena de hCG na urina (gravidez)
+
Urina Soro anti hCG Adicionamse Partculas revestidas com hCG So incubados e colocados numa placa
Resultado positivo:
(presena de hCG na urina): no ocorre aglutinao. Ac se ligaram no hCG da urina, (ficando bloqueados), na incubao inicial
Resultado negativo: (ausncia de hCG na urina). Ocorre aglutinao, pois os anticorpos anti-hCG no so bloqueados na incubao inicial, porque no havia o hormnio na urina. Livres, podem aglutinar as partculas revestidas de hCG.
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TESTE DE COOMBS
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Ac antiimunoglobulinas (Robert Coombs); DHRN me produz IgG anti-Rh; No aglutinam os eritrcitos; Direto: Ac ligados aos eritrcitos fetais; Indireto: Ac anti-Rh no aglutinantes no soro materno. Permite detectar incompatibilidades Rh, prevenindo contra DHRN.
IMUNOENSAIOS
Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos, istopos) l Tipos:
l
- RIA - ELISA - IFA /
IMUNOFLUORESCNCIA (IFA)
Princpio da tcnica:
l
Anticorpos ou antgenos so conjugados (ligados de modo covalente) a uma substncia (fluorocromo), que, quando excitada por radiaes UV, emite luz no espectro visvel. Assim, como a ligao Ag-Ac especfica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antgeno e vice-versa. A reao feita em lminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observao tem lugar num microcpio com luz UV (microscpio de fluorescncia). Principais fluorocromos: fluorescena (isotiocianato de fluorescena FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduche.
TIPOS DE IMUNOFLUORESCNCIA
APLICAO DA TCNICA
IFA direta:
l Deteco
direta de microrganismos em secrees, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Tambm utilizada na fenotipagem de clulas tumorais.
IFA indireta:
l Diagnstico
sorolgico de vrias doenas infecciosas como a Doena de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenas autoimunes. uma tcnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescncia mais intensa) e especificidade.
IMAGENS
CITOMETRIA DE FLUXO
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Ferramenta que detecta e quantifica clulas individuais passando em uma corrente atravs de um feixe de Laser. Separa as clulas por fluorescncia ativada. Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente. um teste qualitativo e quantitativo.
APLICAES
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O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas.
Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase
O produto final corado surge por ao da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudana de cor de uma substncia indicadora). A quantidade de Ag ou Ac de leitura em fotocolormetro. produto final corado, atravs
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INDIRETO
DIRETO OU SANDUCHE
PLACA UTILIZADA
ELISA Indireto
ELISA Competitivo
Vantagens: Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo
RADIOIMUNOENSAIO - RIA
Marcaes: l I125: emite raios gama l H3: raios beta Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g) Desvantagem a manipulao de istopo radioativo. Aplicaes:
WESTERN BLOTTING
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WESTERN BLOTTING
WESTERN BLOTTING