CROMATOGRAFIA

Trabalho realizado por: Francisco Roque, n 9 11A 27-04-01

INTRODUO
A cromatografia uma tcnica analtica, qualitativa, que permite separar os componentes de uma mistura atendendo a propriedades como a solubilidade, tamanho e massa. Baseia-se nas diferentes velocidades de deslocamento das molculas atravs de um meio poroso fase estacionria -, quando arrastadas por um eluente (lquido ou gasoso) em movimento fase mvel. A separao cromatogrfica est relacionada com o fenmeno de adsoro (aderncia de partculas, molculas ou ies) fase estacionria, que pode ser um papel poroso, slica gel, albumina, etc. Quando misturas gasosas ou lquidas so postas em contacto com um meio slido, as diferentes molculas ou ies que as constituem, so por ele retidas mais ou menos fortemente, consoante as suas caractersticas anteriormente referidas. Depois das partculas aderirem ao suporte, na fase estacionria, possvel separ-las recorrendo a eluentes apropriados. O suporte cromatogrfico pode ser apresentado como camada plana, para a cromatografia de camada plana e enchimento de uma coluna, na cromatografia em coluna. A cromatografia pode ser, quanto ao mtodo de introduo da amostra, zonal, onde a amostra aplicada de uma s vez, numa determinada zona e que permite separar completamente todos os componentes de uma amostra; ou frontal, quando a amostra introduzida de um modo contnuo e cada componente retido pela fase estacionria at saturao desta, aps o que atravessa completamente na fase mvel. As tcnicas cromatogrficas podem ser classificadas como: Cromatografia de partio Esta baseia-se nas diferentes solubilidades dos componentes de uma mistura, em ambas as fases, as quais so as duas lquidas. Pode ser efectuada em papel ou em coluna como suportes. Ambos estes processos vo ser descritos mais frente. O coeficiente de partio independente da concentrao e de outras substncias da mistura. Cromatografia de adsoro Baseia-se nas diferentes afinidades adsorventes da superfcie da fase estacionria. uma cromatografia em que a fase mvel liquida e a fase estacionria slida. O suporte pode ser de alumina ou sacarose para a cromatografia de coluna e vidro ou alumnio para a cromatografia em camada fina. A separao baseia-se nas interaces entre molculas dos solutos da fase mvel liquida e a superfcie da fase estacionria slida. Existem dois tipos de cromatografia de adsoro, em camada fina, onde se faz passar lentamente atravs de uma coluna de material adsorvente uma mistura lquida, cujos componentes se vo depositando em zonas distintas da coluna, devido diferena de velocidade de arrastamento de cada um; e em coluna, que se aplica sobretudo em separao de espcies no-inicas solveis em solventes orgnicos segundo a polaridade, o nmero relativo e a posio do grupo funcional. Esta tcnica tem as desvantagem do aparecimento de caudas nas bandas e na dificuldade de reproduo da actividade da fase estacionria quando se usam agentes desactivadores.

A adsoro pode ser feita quer por substncias apolares (carvo activado), quer por substncias polares (xidos e sais). Alm das molculas do soluto, tambm as molculas do solvente so adsorvidas pela fase slida, sendo necessria a deslocao de molculas adsorvidas de solvente por molculas de soluto, para adsoro destas. Ainda existe tambm a cromatografia de partio inica. Todos estes processos cromatogrficos baseiam-se em alguns princpios como a mudana de fase (adsoro a um suporte slido), partio de gases ou separao em soluo que pode acontecer por efeito de crivo ou efeito elctrico. Ao introduzir uma amostra na coluna, ela arrastada pelo eluente e sofre sempre alguma disperso. As principais causas disto so: - A no existncia de um equilbrio entre as duas fases. - Problemas de transferncia de massas. - A possibilidade de existncia de reaces do soluto com a fase fixa sendo esta mais lenta e por isso limitante, no permitindo que o equilbrio seja atingido. - A existncia de gradientes de concentrao do soluto que originam disperso molecular. Uma boa separao dos diferentes pigmentos depende sempre de: - Selectividade e capacidade de adsoro por parte do material que constitui o enchimento relativamente aos diferentes solutos. - Altura do prato que uma medida da disperso no interior da coluna. Parmetros de reteno Atravs da velocidade com que os componentes da amostra se deslocam em relao ao solvente pode-se efectuar a separao cromatogrfica e determinar a razo de reteno. Esta a razo entre a velocidade mdia da substncia e a velocidade mdia do eluente e est representada a sua frmula em seguida: Rr = velocidade mdia da substncia velocidade mdia do eluente

Na cromatografia plana, define-se geralmente, um outro parmetro de reteno, a razo de retardao Rf. Este valor no coincide exactamente com o anterior pois avalia a distncia percorrida pela substncia e pelo eluente e a velocidade da frente do eluente, deslocando-se no suporte seco, superior velocidade mdia do suporte molhado. A seguinte frmula ilustra esta razo, considerando o mesmo espao de tempo: Rf = distncia percorrida pela substncia distncia percorrida pelo eluente

Pigmentos fotossintticos Os pigmentos fotossintticos so molculas particulares que apenas existem nos seres vivos autotrficos, que realizam a fotossntese, e cuja principal funo captar a energia luminosa e convert-la em energia qumica. Estes pigmentos tm a propriedade de absorver as radiaes luminosas no espectro do visvel (comprimentos de onda entre os 400 e os 700 nm). Esta absoro no eficiente em todo os espectro e por essa razo algumas radiaes so reflectidas, apresentando as molculas essa colorao.

Os trs principais tipos de pigmentos envolvidos na fotossntese so as clorofilas, os carotenides e as ficobilinas. Nem todos tm a mesma importncia para a fotossntese, por isso so classificados como principais (clorofila a) e acessrios (todos os outros). Clorofilas existem quatro tipos de clorofilas (a, b, c e d), cujas diferenas ocorrem apenas na alterao de alguns grupos qumicos (CHO, CH3, CHCH2) nas molculas constituintes. Estas so formadas por duas estruturas fundamentais: um anel porfirnico, ao qual se liga perpendicularmente o fitol, uma molcula linear de hidrocarbonatos. Esta molcula insolvel em gua mas solvel em compostos orgnicos como o ter, o benzeno e a acetona devido s propriedades apolares do fitol. Elas do colorao verde s plantas e quando dissolvidas tambm formam solues com colorao verde intensa. Embora absorvam radiao em todos os comprimentos de onda do espectro do visvel, tm alguns picos de absoro nas regies do azul-violeta (400 nm) e do vermelho (600 nm), o que faz com que surjam com colorao verde, uma vez que a cor que reflectem. A clorofila a est presente em todos os organismos que libertam oxignio na fotossntese; a clorofila b encontra-se junto com a clorofila a em todas as plantas e algas verdes; a clorofila c encontra-se nas diatomceas, dinoflagelados e algas castanhas; a clorofila d encontrase em algumas algas vermelhas. Carotenides constituem outro grupo de pigmentos com actividade fotossinttica, apesar de tambm poderem ser observados nos animais. Apresentam coloraes que vo desde o amarelo ao castanho, passando pelo laranja e pelo vermelho. A sua cor s visvel durante o Outono, pois no resto do anos esto mascarados pelas clorofilas. Diferem muito das clorofilas em termos de composio qumica, pois so formados por longas cadeias lineares hidrocarbonatadas insaturadas, com anis benznicos nas extremidades. Alguns carotenides possuem apenas tomos de carbono e hidrognio nas suas cadeias, sendo designados por carotenos. Os mais comuns na Natureza so o , e -caroteno. Outros carotenides para alm de hidrognio e carbono, possuem tambm tomos de oxignio na sua composio e so designados por xantofilas. A lutena e o fucoxantol so as xantofilas mais comuns. Ambos os carotenides esto presentes nos cloroplastos sob a forma de complexos proteicos insolveis em gua. As suas funes fundamentais so a absoro da energia luminosa e proteco das clorofilas contra os fenmenos de fotoxidao. Estes pigmentos surgem com tonalidades vermelhas e avermelhadas pois absorvem nas regies do azul e do verde. A luz Um feixe de luz branca formado pelo somatrio de uma sucesso contnua de cores: vermelho, laranja, amarelo, verde, azul, anil e violeta. O conjunto formado por esta secesso constitui o espectro visvel. Com o auxlio de um instrumento denominado de espectroscpio ptico, podemos decompor luzes complexas de modo a conhecer as luzes simples que as compem e observar os seus respectivos espectros. Um objecto apresenta-se de uma determinada cor quando incide luz branca sobre eles pois existem na sua constituio substncias com a capacidade de absorver diferencialmente as cores do espectro visvel, reflectindo as restantes. A cor de uma substncia no uma caracterstica fsica desta, depende do tipo de luz

incidente. O tomate, na presena de luz branca absorve todas as cores excepto o vermelho, que reflectido, se iluminarmos o tomate maduro com luz verde, vmo-lo preto pois esta cor absorvida. Espectros de absoro Os espectros de absoro obtm-se quando se interpe uma amostra de uma soluo entre a fonte emissora de luz e o espectroscpio, que tm como finalidade dispersar a luz que os atinge. Apresentam-se como uma sequncia de bandas coloridas intermeadas por bandas pretas. Considere-se uma amostra de soluo de clorofila obtida por macerao em lcool de folhas verdes. Se colocarmos esta soluo entre uma fonte de luz branca e a janela do espectroscpio, observamos uma sucesso de bandas coloridas intercaladas por bandas pretas. As bandas pretas situam-se nas zonas dos azuis e dos violetas, preferencialmente, e algumas ainda nos vermelhos. Correspondem s cores absorvidas pela clorofila. As cores predominantes neste espectro so o verde e o verde-amarelado; a sobreposio destas cores que confere o tom esverdeado clorofila. Espectros de emisso Os espectros que se observam atravs de um espectroscpio a partir das luzes emitidas, quer pela chama de uma lamparina de lcool ou de um slido incandescente, so, tal como o espectro visvel da luz branca, constitudos por uma sucesso contnua de luzes de diferentes cores, podendo apresentar bandas de cor predominantes s outras, consoante a temperatura a que o corpo de emisso se encontra. Estes so os espectros de emisso contnuos. Existem ainda os espectros de emisso de riscas, sujeitando gases rarefeitos a descargas elctricas. Cada elemento tem o seu espectro de emisso de riscas caracterstico, podendo-se identific-los apenas por isto. Os espectros de emisso de riscas caracterizam um elemento qumico permitindo a sua identificao, tal como os respectivos espectros de absoro.

OBJECTIVOS
Neste trabalho vamos proceder separao de uma soluo desconhecida, comparando a sua razo de retardao com a de outras duas conhecidas, o azul de metileno e o alaranjado de metilo. A tcnica cromatogrfica utilizada ser a cromatografia em camada fina em suporte de slica gel alumnio. Vamos tambm separar os componentes de uma mistura de macerado de plantas recolhidas em acetona, identificando os seus constituintes. Vamos utilizar a tcnica de cromatografia em coluna com suporte de albumina. Vamos tambm observar os espectros das xantofilas e das clorofilas com um espectroscpio.

MATERIAL
1- CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA - cmara cromatogrfica - placa cromatogrfica de slica gel 60,0,2 mm de espessura em alumnio - mistura desconhecida - soluo de azul de metileno - soluo de alaranjado de metilo - soluo eluente 2- propanol / ac. actico 15:2 v/v 2- CROMATOGRAFIA EM COLUNA - folhas e plantas recolhidas no exterior - acetona - alumina - ter de petrleo - coluna de vidro

PROCEDIMENTOS
1- CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA 1- Preparar uma cmara cromatogrfica com a soluo eluente. 2- Numa placa cromatogrfica 4x8cm traar a 2cm da base uma linha a lpis e colocar uma gota de cada um dos corantes e da mistura na linha. 3- Secar as gotas com um secador. 4- Colocar a placa na cmara e aguardar 10 min. 2- CROMATOGRAFIA EM COLUNA 1- Preparar um extracto de folhas com acetona e decantar. 2- Preparar uma mistura de alumina e ter de petrleo e encher a coluna de vidro. 3- Verter a mistura dos extractos e passar ter de petrleo pela mistura para a separao dos constituintes.

RESULTADOS
1- CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA Distncia percorrida pelo eluente 4,2 cm Distncia percorrida pelo azul de metileno 0,9 cm Distncia percorrida pelo alaranjado de metilo 3,2 cm Distncia percorrida pela substncia azul da mistura 0,9 cm Distncia percorrida pela substncia laranja da mistura 3,2 cm 0,9 Rf azul metileno = 4,2 = 0,214 3,2 Rf alaranjado metilo = 4,2 = 0,761 0,9 Rf azul mistura = 4,2 = 0,214 3,2 Rf laranja mistura = 4,2 = 0,761

2- CROMATOGRAFIA EM COLUNA Ao introduzir os pigmentos na coluna j preparada em alumina, observou-se a sada de um pigmento alaranjado, o depsito de pigmentos esverdeados em baixo e o depsito de pigmentos acastanhados no topo da coluna. Estes ltimos no desceram pela albumina. Ao observar os espectros dos pigmentos, verificou-se que o espectro dos pigmentos amarelados apresenta coloraes na ordem dos amarelos e vermelhos e que o espectro dos pigmentos esverdeados apresentava coloraes nos vermelhos, verdes e azuis.

CONCLUSES
1- CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA Com este trabalho experimental pude verificar que com a cromatografia posso descobrir os componentes de uma mistura atravs da sua razo de retardao. Ao analisar os valores desta razo posso concluir que a mistura utilizada no mais do que a mistura entre o azul de metileno e o alaranjado de metilo visto que coincidem exactamente com os destas substncias. A mistura inicial apresentava uma cor azul e aps a separao dos pigmentos verificou-se uma faixa azul e uma alaranjada; a primeira corresponde ao azul de metileno pois tem o mesmo Rf e a segunda corresponde ao alaranjado de metilo pela mesma razo. Ao fazer subir o eluente pelo suporte acima, verifiquei que os pigmentos eram arrastados por ele e devido s diferentes afinidades adsorventes, os pigmentos iguais eram arrastados com a mesma velocidade e os pigmentos diferentes eram arrastados com velocidades diferentes. Nesta cromatografia lquido slido, a fase mvel lquida, e a fase estacionria slida.

2- CROMATOGRAFIA EM COLUNA Os pigmentos vertidos na coluna foram arrastados pelo eluente, separando-se devido s suas diferentes afinidades adsorventes pelo suporte. Os pigmentos que saram da coluna eram as xantofilas, amareladas; os pigmentos que se depositaram no meio da coluna eram as clorofilas, esverdeadas; e os que ficaram no topo eram os carotenos, acastanhados. Ao observar as xantofilas e os carotenos no espectroscpio, verifiquei que as clorofilas apresentam um espectro de riscas, onde aparecem cores na regio dos vermelhos, verdes e azuis, que so as cores emitidas, tendo riscas pretas nas zonas dos amarelos e alaranjados, que so as cores absorvidas. por isto que as clorofilas apresentam colorao esverdeada. O espectro das xantofilas apenas apresenta colorao nas zonas dos amarelos e dos vermelhos, que so emitidos e riscas pretas em todas as outras cores, que so absorvidas. por esta razo que as xantofilas apresentam coloraes amareladas. S pude observar as clorofilas de um outro grupo pois saram da coluna. Os carotenos no puderam ser observados pois no passaram do topo da coluna.

BIBLIOGRAFIA
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