GLUCIA DE MARTINI OTOFUJI

VIAS ENVOLVIDAS NO MECANISMO DE AO DO EFEITO GASTROPROTETOR DAS RAZES DA Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Farmacologia do

Departamento de Farmacologia, Setor de Cincias Biolgicas da Universidade Federal do Paran como do requisito de parcial Mestre para em

obteno

Ttulo

Farmacologia

CURITIBA 2005

GLUCIA DE MARTINI OTOFUJI

VIAS ENVOLVIDAS NO MECANISMO DE AO DO EFEITO GASTROPROTETOR DAS RAZES DA Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Farmacologia do

Departamento de Farmacologia, Setor de Cincias Biolgicas da Universidade Federal do Paran como do requisito de parcial Mestre para em

obteno

Ttulo

Farmacologia Profa Dra

Orientadora:

Maria

Consuelo

Andrade Marques Co-orientadora: Dra Sonia Mesia Vela

CURITIBA 2005

AGRADECIMENTOS
Profa. Dr a. Maria Consuelo Andrade Marques, minha orientadora, por me guiar, disponibilizando seu tempo e conhecimentos sem restrio. Agradeo, principalmente, pela confiana mais uma vez depositada no meu trabalho, tendo em vista que me orienta desde o estgio voluntrio, passando pela iniciao cientifica e me aceitando de braos abertos no mestrado. Agradeo tambm pelos puxes de orelha, que foram imprescindveis para meu desenvolvimento, e pelos colos concedidos aps muitas frustraes. Dra. Sonia Mesia-Vela, do trabalho minha com co-orientadora, novas tcnicas e que com possibilitou seus o

aprofundamento

sbios

ensinamentos. Muito obrigada pela pacincia incansvel em me orientar e pelo constante e grande incentivo, sempre indicando a direo a ser tomada e interessada em participar de minhas inquietaes. s minhas amigas Cris Baggio e Cris Setim, que desde o estgio voluntrio sempre tiveram grande disposio para ensinar, ajudar nos experimentos, na pesquisa em geral e foram fundamentais para a concluso deste trabalho. Agradeo tambm por compartilhar os momentos de descontrao, pelas desorientaes por a afora, pelas viagens e s essenciais fugas para Morretes. Ao Dani, meu amigo e namorado, que alm da ajuda dispensada nos experimentos, sempre me incentivou e apoiou com um enorme carinho. Ao Dr. Cirino Correia Jnior pelo fornecimento da planta.

Ao Dr. Cid Ambir de Moraes Santos, mestranda Vanessa Nitta e Dra. Luce Maria Brando Torres pelo auxlio e desenvolvimento da parte qumica. Aos funcionrios Cndido, Luis e Jlio do Biotrio da Universidade Federal do Paran pelo coleguismo e pelo fornecimento dos animais de laboratrio. todos os professores, funcionrios e alunos do Departamento de Farmacologia que, direta ou indiretamente, contriburam para a realizao desta dissertao. Agradeo especialmente Dra. Lia Rieck pela paz e o carinho sempre transmitidos.

Ao Departamento de Bioqumica e Fisiologia pela disponibilizao de equipamentos. Profa. Dra. Rosa Maria Ribeiro do Vale Nicolau (UFSC) e ao Prof. Dr. Jos Eduardo da Silva Santos, que gentilmente aceitaram participar e colaborar com este trabalho fazendo parte da Banca. s minhas queridas amigas Sueli, Cris, Dani, Mari, Th, Li, Ana, ao meu irmo Cle e minha cunhadinha J, e mais uma vez ao Dani e s Crises que me suportaram nos momentos de estresse, apoiaram em fases difceis e proporcionaram tambm momentos de alegria, que indiretamente contriburam para a realizao deste estudo.

E... Especialmente aos meus pais Kenji e Mercedes que sempre me apoiaram em todas as minhas decises e acreditaram na concluso deste trabalho.

SUMRIO
LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................... xiv LISTA DE TABELAS ..................................................................................................... xvii LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS ............................................................. xviii RESUMO .......................................................................................................................... xxii ABSTRACT ..................................................................................................................... xxv

1 INTRODUO...............................................................................................................01 1.1 Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen..................................................................04 1.1.1 Aspectos Botnicos ............................................................................................04 1.1.2 Distribuio ..........................................................................................................05 1.1.3 Sinonmias............................................................................................................06 1.1.4 Constituintes Qumicos ......................................................................................07 1.1.5 Atividades Biolgicas .........................................................................................07 1.1.6 Atividade Anti-lcera...........................................................................................08 1.1.7 Toxicidade............................................................................................................09 1.2 Fisiologia Gstrica ...................................................................................................10

1.3 lcera Pptica............................................................................................................11 1.3.1 Etiologia da lcera Pptica..............................................................................11

1.3.2 Fatores Protetores da Mucosa Gstrica.......................................................12 1.3.2.1 Proteo Pr-epitelial.....................................................................................12 1.3.2.2 Proteo Epitelial............................................................................................13 1.3.2.2a Aspectos Anatmicos da Gastroproteo Epitelial..............................13 1.3.2.2b Aspectos Bioqumicos da Gastroproteo Epitelial.............................14 1.3.2.3 Proteo Sub-epitelial....................................................................................18

1.3.3 Secreo cida gstrica ...................................................................................19 1.3.3.1 Mecanismos Centrais ....................................................................................19 1.3.3.2 Mecanismos Perifricos ................................................................................21

1.3.3.2a Estimulantes da Secreo cida............................................................21 1.3.3.2b Inibidores da Secreo cida .................................................................23 1.3.3.2c Papel do xido Ntrico na Secreo cida Gstrica ...........................25 1.3.3.3 Mecanismos Intracelulares ...........................................................................26 1.4 Justificativa do Estudo ...........................................................................................27

2 OBJETIVOS ...................................................................................................................28 2.1 Objetivo Geral...........................................................................................................29 2.2 Objetivos Especficos ..............................................................................................29 3 MATERIAL E MTODOS.............................................................................................32 3.1 MATERIAL ......................................................................................................................33 3.1.1 Material Botnico ..................................................................................................33 3.1.2 Animais...................................................................................................................33 3.1.3 Drogas, Reagentes, Solventes e Sais ..............................................................34 3.1.4 Equipamentos........................................................................................................34 3.2 MTODOS ......................................................................................................................35 3.2.1 MTODOS FITOQUMICOS .......................................................................................35 3.2.1.1 Preparao dos Extratos Brutos Hidroalcolicos......................................35 3.2.1.2 Fracionamento de EHaP50 ..................................................................35 3.2.1.3 Fracionamento de EHaP70 ..................................................................37 3.2.1.4 Determinao do Peso Seco e do Rendimentos dos Extratos e das Fraes .........................................................................................................................38 3.2.1.5 Anlises Qumicas da FBut(50) e da FE(70)..................................................38 3.2.2 MTODOS FARMACOLGICOS................................................................................39 3.2.2.1 Tratamentos ............................................................................................39 3.2.2.1.1 Clculo da DE80 real e terica ...............................................................41 3.2.2.2 AVALIAO E BIOMONITORAMENTO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA .....42 3.2.2.2.1 Leses Gstricas Induzidas por Etanol................................................42

3.2.2.2.2 Leses Gstricas Induzidas por Indometacina ...................................43 3.2.2.2.3 Leses Gstricas Induzidas por Estresse............................................43 3.2.2.2.4 Avaliao das Leses Gstricas............................................................43

3.2.2.3 AVALIAO TEMPORAL DO EFEITO GASTROPROTETOR DO EHAP50 E FRAES NO MODELO DE INDUO DE LESES GSTRICAS AGUDAS POR ETANOL............................................................................................................44

3.2.2.4 P REPARAO DAS FRAES SUBCELULARES GSTRICAS PARA O ESTUDO

DO MECANISMO DE

AO GASTROPROTETOR DO EHAP50 E DA FBUT(50) .44

3.2.2.4.1 Caracterizao da atividade da NAD(P)H quinona oxidorredutase 1 (NQO1) na regio glandular gstrica.................................................45 3.2.2.4.2 Caracterizao da Atividade da Glutationa S-transferase (GST) na Regio Glandular Gstrica......................................................................46 3.2.2.4.3 Quantificao de Glutationa Reduzida (GSH) Gstrica ...................46 3.2.2.4.4 Quantificao da Atividade Enzimtica da NAD(P)H quinona oxidorredutase 1 (NQO1) Presente na Regio Glandular Gstrica.47 3.2.2.4.5 Quantificao da atividade enzimtica da Glutationa S-

transferase (GST) presente na regio glandular gstrica..................47 3.2.2.5 AVALIAO E BIOMONITORAMENTO DA ATIVIDADE ANTI-SECRETORA CIDA GSTRICA ........................................................................................................47 3.2.2.5.1 Mtodos de Estudo In vivo: Ligadura Pilrica in situ .......................47 3.2.2.5.1a Quantificao da Secreo cida Gstrica ....................................48 3.2.2.5.1b Quantificao de NO2 /NO3 ................................................................48 3.2.2.5.1c Quantificao de Glutationa Reduzida (GSH) Gstrica................49 3.2.2.5.1d Isolamento das Vesculas Gstricas de Ratos...............................49 3.2.2.5.1e Purificao da H+ , K+-ATPase de Ratos..........................................49 3.2.2.5.1f Ensaio de Atividade Enzimtica da H+, K +-ATPase de Ratos ......50 3.2.2.6 E STUDO SOBRE A ATIVIDADE NA H+, K +-ATPASE IN VITRO...........................50 3.2.2.6.1 Isolamento das Vesculas Gstricas de Coelho..................................50 3.2.2.6.2 Purificao da H+ , K+ -ATPase de Coelho ............................................51

3.2.2.6.3 Ensaio de Atividade Enzimtica da H+ , K+ -ATPase de Coelho ........51 3.2.2.7 AVALIAO DA MOTILIDADE GASTRINTESTINAL.............................................51 3.2.2.7.1 Esvaziamento Gstrico de Semi-slidos..............................................51 3.2.2.7.2 Trnsito Intestinal.....................................................................................52 3.2.2.7.3 Diarria Induzida por leo de Rcino ....................................................52 3.2.2.8 DETERMINAO DA DOSE 50% EFETIVA (DE50) E DA CONCENTRAO 50% INIBITRIA (CI50).....................................................................................52 3.2.2.9 ANLISE ESTATSTICA ......................................................................................53

4 RESULTADOS...............................................................................................................54 4.1 R ESULTADOS FITOQUMICOS........................................................................................55 4.1.1 Rendimentos e Propriedades Fsica e Qumicas dos Extratos Brutos Hidroalcolicos das Razes de P. glomerata (EHaPs) ...................................55 4.1.2 Rendimentos e Propriedades Fsicas das Fraes do EHaP50 .......55 4.1.3 Rendimentos e Propriedades Fsica e Qumicas das Fraes do EHaP70...............................................................................................................................57 4.1.4 Resultados das anlises qumicas da FBut(50) e da FE(70) ............................58 4.2 R ESULTADOS FARMACOLGICOS ................................................................................58 4.2.1 Avaliao da Atividade Gastroprotetora ................................................58 4.2.1.1 Comparao dos Efeitos dos Extratos Brutos Hidroalcolicos das Razes de P. glomerata (EHaPs) sobre as Leses Gstricas Induzidas por Etanol......................................................................................58 4.2.2 AVALIAO DO EHAP50 NOS DIFERENTES MODELOS DE LESES GSTRICAS .60 4.2.2a Efeito do EHaP50 em Leses Gstricas Induzidas por Etanol................60 4.2.2b Efeito do EHaP50 em Leses Gstricas Induzidas por Indometacina ...61 4.2.2c Efeito do EHaP50 em Leses Gstricas Induzidas por Estresse............63 4.2.2d Comparao da Potncia (DE50) do EHaP50 nos Diferentes Modelos de Leses Gstricas......................................................................................64

4.2.3 BIOMONITORAMENTO DO FRACIONAMENTO DO EHAP50 EM LESES GSTRICAS INDUZIDAS POR ETANOL ...................................................................65 4.2.3.1 Efeito das Fraes de EHaP50 sobre as Leses Gstricas Induzidas por Etanol........................................................................................................65 4.2.3.1a Comparao das Potncias (DE50) das Fraes do EHaP50 na Gastroproteo contra Leses Induzidas por Etanol.........................67 4.2.3.2 Efeito das Fraes de FBut(50) (Fracionamento A) sobre as Leses Gstricas Induzidas por Etanol....................................................................68 4.2.3.3 Efeito das Fraes da FBut(50) (Fracionamento B) sobre as Leses Gstricas Induzidas por Etanol....................................................................69 4.2.3.3a Comparao das Fraes da FBut(50) (Fracionamento B) na Gastroproteo contra Leses Induzidas por Etanol.........................71 4.2.3.4 Efeito das Fraes de FEB(50) sobre as Leses Gstricas Induzidas por Etanol........................................................................................................72 4.2.4 AVALIAO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DE EHAP50 E FRAES NO MODELO DE LESES GSTRICAS INDUZIDAS POR ETANOL EM DIFERENTES PERODOS ..............................................................................................................73

4.2.5 E STUDO DO MECANISMO DE AO GASTROPROTETOR DE EHAP50 E FBUT(50)74 4.2.5.1 Caracterizao da Atividade de Enzimas Antioxidantes

Presentes no Estmago ...................................................................................................74 4.2.5.1a Caracterizao da Atividade da NAD(P)H Quinona Oxidorredutase 1 (NQO1) na Regio Glandular Gstrica..............................................74 4.2.5.1b Caracterizao da Atividade da Glutationa S-transferase (GST) na Regio Glandular Gstrica......................................................................74

4.2.5.2 Efeito do EHaP50 sobre as Leses Gstricas Induzidas por Etanol.....76 4.2.5.2a Efeito do EHaP50 sobre os Nveis de Glutationa (GSH) Gstricos aps a Induo de Leses por Etanol...................................................77 4.2.5.2b Efeito do EHaP50 sobre a Atividade da Enzima Glutationa Stransferase (GST) Gstrica aps a Induo de Leses por Etanol.77

4.2.5.2c Efeito do EHaP50 sobre a Atividade da Enzima NAD(P)H Quinona Oxidorredutase 1 (NQO1) Gstrica aps a Induo de Leses por Etanol..........................................................................................................79

4.2.5.3 Efeito da FBut(50) sobre as Leses Gstricas Induzidas por Etanol.......80 4.2.5.3a Efeito da FBut(50) sobre os Nveis de Glutationa (GSH) Gstricos aps a Induo de Leses por Etanol...................................................80 4.2.5.3b Efeito da FBut(50) sobre a Atividade da Enzima Glutationa Stransferase (GST) Gstrica aps a Induo de Leses por Etanol.81 4.2.5.3c Efeito da FBut(50) sobre a Atividade da Enzima NADPH Quinona Oxidorredutase 1 (NQO1) Gstrica aps a Induo de Leses por Etanol..........................................................................................................82

4.2.6 Avaliao da Atividade Anti-secretora cida........................................83 4.2.6.1 Comparao dos Efeitos dos Extratos Brutos Hidroalcolicos das Razes de P. glomerata (EHaPs) sobre a Secreo cida Gstrica ....83 4.2.6.1a Determinao da Potncia (DE50) do EHaP70 na Atividade Antisecretora cida Gstrica.........................................................................84 4.2.7 E STUDO DO MECANISMO DE AO ANTI-SECRETOR DE CIDO DE EHAP70......86 4.2.7.1 Efeito do EHaP70 sobre a Secreo cida Gstrica Estimulada por Histamina ........................................................................................................86 4.2.7.2 Efeito do EHaP70 sobre a Secreo cida Gstrica Estimulada por Betanecol ........................................................................................................88 4.2.7.3 Efeito do EHaP70 sobre a Secreo cida Gstrica Estimulada por Pentagastrina .................................................................................................89

4.2.8 E FEITO DAS FRAES DE EHAP70 SOBRE A SECREO CIDA GSTRICA ......91 4.2.81 Determinao da Potncia (DE50) da FE(70) na Atividade Antisecretora cida Gstrica ........................................................................92

4.2.9 ESTUDO DO MECANISMO DE AO ANTI-SECRETOR DE CIDO DA FE(70) ...........94 4.2.9.1 Efeito da FE(70) in vitro sobre a atividade da H+/K+ -ATPase gstrica isolada de coelho ...........................................................................................94 4.2.9.2 Efeito do Omeprazol e da Ouabana in vitro sobre a Atividade da ATPase Gstrica Isolada de Rato...............................................................94
+ 4.2.9.3 Atividade da H /K+-ATPase Isolada da Mucosa Gstrica de Ratos

Tratados com FE(70) ......................................................................................95 4.2.9.4 Caracterizao da H+/K+-ATPase Isolada da Mucosa Gstrica de Ratos Tratados com a FE(70) ......................................................................96 4.2.10 ENVOLVIMENTO DO XIDO NTRICO NO EFEITO GASTROPROTETOR DO EHAP70 E DA FE(70) .......................................................................................98 4.2.10.1 Efeito do EHaP70 sobre a Secreo cida Gstrica e nos Nveis de xido Ntrico (NO) Gstrico .........................................................................98 4.2.10.2 Efeito do EHaP70 e da Indometacina sobre a Secreo cida Gstrica e os Nveis de xido Ntrico (NO) Gstrico...............................99 4.2.10.3 Efeito da FE(70) na Secreo cida Gstrica e nos Nveis de xido Ntrico (NO) Plasmtico e Gstrico...........................................................100 4.2.10.4 Efeito da FE(70) sobre os Nveis de GSH Plasmtico e Gstrico........101 4.2.11 AVALIAO DA MOTILIDADE GASTRINTESTINAL .............................................. 102 4.2.11.1 Efeito dos EHaPs sobre o Esvaziamento Gstrico de Semi-slidos 102 4.2.11.2 Efeito dos EHaPs sobre o Trnsito intestinal....................................... 103 4.2.11.3 Efeito dos EHaP50 sobre a Diarria Induzida por leo de Rcino ... 103 5 DISCUSSO ............................................................................................................... 105 6 CONCLUSES........................................................................................................... 115 7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ....................................................................... 119 8 ANEXO ....................................................................................................................... 138 8.1 Anlises Qumicas da FBut(50) e da FE(70) ........................................................ 139 8.1.1 FBut(50) ............................................................................................................. 139 8.1.2 FE(70) ................................................................................................................. 143

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1 Figura 1.2 -

Razes da Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen................................04 Modelo ilustrando a regulao da secreo cida gstrica hormonal e parcrina, esclarecendo as funes dos receptores de colicistocinina (CCK-1 e CCK-2)......................................................22 Fracionamento Biomonitorado do Extrato Hidroalcolico (50%) das Razes de Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen (EHaP50)......36 Fracionamento Biomonitorado do Extrato Hidroalcolico (70%) das Razes de Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen (EHaP70)......37 Comparao do Efeito dos Extratos Brutos Hidroalcolicos (50, 70 e 90% em etanol) das Razes de P. glomerata (EHaP50, EHaP70 e EHaP90) sobre as leses gstricas induzidas por etanol.........................................................................................................59 Efeito do Extrato Bruto Hidroalcolico (50% em etanol) das Razes de P. glomerata (EHaP50) sobre as leses gstricas induzidas por etanol.................................................................................61 Efeito do Extrato Bruto Hidroalcolico (50% em etanol) das Razes de P. glomerata (EHaP50) sobre as leses gstricas induzidas por Indometacina ...................................................................62 Efeito do Extrato Bruto Hidroalcolico (50% em etanol) das Razes de P. glomerata (EHaP50) sobre as leses gstricas induzidas por estresse ............................................................................64 Efeito das fraes de EHaP50 sobre as leses gstricas induzidas por etanol.................................................................................66 Efeito das fraes de FBut(50) (fracionamento A) sobre as leses gstricas induzidas por etanol...............................................................69

Figura 3.1 -

Figura 3.2 -

Figura 4.1 -

Figura 4.2 -

Figura 4.3 -

Figura 4.4 -

Figura 4.5 -

Figura 4.6 -

Figura 4.7 -

Efeito das fraes de FBut(50) (fracionamento B) sobre as leses gstricas induzidas por etanol...............................................................70 Efeito das fraes de FEB(50) sobre as leses gstricas induzidas por etanol.................................................................................72 Efeito gastroprotetor do EHaP50 e fraes (FBut(50) e FEB(50)) no modelo de induo de leses gstricas agudas por etanol testadas em diferentes perodos ...........................................................73

Figura 4.8 -

Figura 4.9 -

Figura 4.10 - Caracterizao da atividade enzimtica da NAD(P)H quinona oxidorredutase 1 (NQO1) na regio glandular gstrica.....................75 Figura 4.11 - Caracterizao da atividade enzimtica da Glutationa Stransferase (GST) na regio glandular gstrica..................................76 Figura 4.12 - Efeito do EHaP50 sobre as leses gstricas induzidas por etanol.........................................................................................................77 Figura 4.13 - Efeito do EHaP50 sobre os nveis de glutationa (GSH) gstrico, aps a induo de leses gstricas por etanol...................................78 Figura 4.14 - Efeito do EHaP50 sobre a atividade da enzima Glutationa Stransferase (GST) da regio glandular gstrica, aps a induo de leses gstricas por etanol...............................................................78 Figura 4.15 - Efeito do EHaP50 sobre a atividade da enzima NADPH quinona oxidorredutase 1 (NQO1) da regio glandular gstrica, aps a induo de leses gstricas por etanol................................................79 Figura 4.16 - Efeito da FBut(50) sobre as leses gstricas induzidas por etanol...80 Figura 4.17 - Efeito da FBut(50) sobre os nveis de glutationa (GSH) gstrico, aps a induo de leses gstricas por etanol...................................81 Figura 4.18 - Efeito da FBut(50) sobre a atividade da enzima Glutationa Stransferase (GST) da regio glandular gstrica, aps a induo de leses gstricas por etanol...............................................................81

Figura 4.19 - Efeito da FBut(50) sobre a atividade da enzima NADPH quinona oxidorredutase 1 (NQO1) da regio glandular gstrica, aps a induo de leses gstricas por etanol................................................82 Figura 4.20 - Efeito dos Extratos Brutos Hidroalcolicos (50, 70 e 90% em etanol) das Razes de P. glomerata (EHaP50, EHaP70 e EHaP90) sobre a secreo cida gstrica ..........................................84 Figura 4.21 - Efeitos do Extrato Bruto Hidroalcolico (70% em etanol) das Razes de P. glomerata (EHaP70) sobre a secreo cida gstrica ......................................................................................................85 Figura 4.22 - Efeito do EHaP70 sobre a secreo cida gstrica estimulada por histamina ............................................................................................87 Figura 4.23 - Efeito do EHaP70 sobre a secreo cida gstrica estimulada por betanecol............................................................................................88 Figura 4.24 - Efeito do EHaP70 sobre a secreo cida gstrica estimulada por pentagastrina .....................................................................................90 Figura 4.25 - Efeito das fraes de EHaP70 sobre a secreo cida gstrica .....91 Figura 4.26 - Efeito da FE(70) sobre a secreo cida gstrica................................93 Figura 4.27 - Efeito da FE(70) sobre a atividade da H+/K+ - ATPase gstrica isolada de coelho .....................................................................................94 Figura 4.28 - Efeito do Omeprazol e da Ouabana sobre a atividade da ATPase gstrica isolada de ratos..........................................................95 Figura 4.29 - Efeito do Omeprazol e da Ouabana sobre a atividade da ATPase gstrica isolada de rato............................................................95 Figura 4.30 - Efeito da FE(70) sobre a atividade da H+/K+ - ATPase gstrica isolada rato................................................................................................96 Figura 4.31 - Caracterizao da H+ /K+- ATPase Isolada da Mucosa Gstrica de Ratos ....................................................................................................97

Figura 4.32 - Efeito do EHaP70 e da indometacina sobre a secreo cida gstrica e os nveis de xido ntrico (NO) gstrico.............................99 Figura 4.33 - Efeito do EHaP50 e EHaP70 sobre o esvaziamento gstrico....... 102 Figura 4.34 - Efeito do EHaP50 e EHaP70 sobre o trnsito intestinal................. 103 Figura 4.35 - Efeito do EHaP50 sobre a diarria induzida por leo de rcino..... 104 Figura 8.1Figura 8.2 Figura 8.3 Estrutura qumica da ecdisterona e da rubrosterona ...................... 140 Perfil cromatogrfico da FBut(50) em sistema Varian....................... 141 Perfil cromatogrfico da FBut(50) em sistema Dionex...................... 142

Figura 8.4 - Espectro de Ressonncia Nuclear Magntica 1H (com supresso de gua) da frao FBut50 ......................................................................... 143 Figura 8.5 Perfil cromatogrfico da FE(70) em sistema Dionex......................... 145

Figura 8.6 - Espectro de Ressonncia Nuclear Magntica 1H (com supresso de gua) da frao FE70 ............................................................................ 146

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.1- Compostos isolados de espcies de Pfaffia.........................................07 Tabela 4.1 - Propriedades fsica e qumicas e rendimento dos extratos brutos hidroalcolicos das razes de Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen....................................................................................................55 Tabela 4.2 - Propriedades fsicas e rendimento das fraes do EHaP50 .............56 Tabela 4.3 - Propriedades fsica e qumicas e rendimento das fraes A da FBut(50) ........................................................................................................56 Tabela 4.4 - Propriedades fsicas e rendimento das fraes B da FBut(50) ...........57 Tabela 4.5 - Propriedades fsicas e rendimento das fraes do EHaP70 .............57 Tabela 4.6 Comparao da Potncia (DE50) do EHaP50 nos Diferentes Modelos de leses Gstricas ...............................................................65 Rendimentos, DE50s tericas e DE50s reais das fraes do EHaP50 (FAE(50), FBut(50) e FAq(50) ) ...................................................68

Tabela 4.7 -

Tabela 4.8 - Rendimentos, DE50s tericas e DE50s reais das fraes da FBut(50) (FCB(50), FEB(50) e FAqB (50) ) .....................................................71
+ Tabela 4.9 - Caracterizao da H /K+- ATPase Isolada da Mucosa Gstrica de Ratos .....................................................................................................97

Tabela 4.10 - Efeito de EHaP70 na secreo cida gstrica e nos nveis de xido ntrico gstricos...............................................................................98 Tabela 4.11 - Efeito da FE(70) na secreo cida gstrica e nos nveis de xido ntrico plasmtico e gstrico................................................................. 100 Tabela 4.12 - Efeito da FE(70) na secreo cida gstrica e nos nveis de GSH plasmtico e gstrico............................................................................. 101

Tabela 5.1 - Efeito gastroprotetor de extratos da Pfaffia sp.................................. 106

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

OH - radical hidroxil
13 1

C-RNM - ressonncia nuclear magntica de carbono 13

H-RNM - ressonncia nuclear magntica de hidrognio 1

ACh acetilcolina AINEs - antiinflamatrios no esteroidais AMPc adenosina monofosfato cclico ARC - ncleo arqueado ATC - tricloroactico ATP - adenosina trifosfato Ca+2 on clcio CaM - complexo clcio-calmodulina CAT catalase CCK colicistocinina CCK-1 ou CCK-A receptor do tipo 1 ou A de colicistocinina CCK-2 ou CCK-B receptor do tipo 2 ou B de colicistocinina CDNB - 1-cloro 2,4 dinitrobenzeno CGRP - peptdeo relacionado ao gene de calcitonina Cl- - on cloreto CLAE cromatografia lquida de alta eficincia CO2 dixido de carbono COX - ciclooxigenase CRF - fator liberador de corticotropina DAG diacilglicerol DE50 dose 50% efetiva DE80 dose 80% efetiva D2O gua deuterada DTNB - cido 5,5-ditio-bis(2-nitrobenzico) ECL - clulas do tipo enterocromafins EDTA - cido etilenodiaminotetractico EGTA - cido etilenoglicoltetractico EHaP50 - extrato hidroalcolico (50%) de Pfaffia glomerata

EHaP70 - extrato hidroalcolico (70%) de Pfaffia glomerata EHaP90 - extrato hidroalcolico (90%) de Pfaffia glomerata EMATER-PR - Empresa de Assistncia Tcnica e Extenso Rural do Paran eNOS - xido ntrico sintase endotelial ERO espcies reativas do oxignio EUA Estados Unidos da Amrica FAE(50) frao acetato de etila do extrato hidroalcolico 50% FAE(70) frao acetato de etila do extrato hidroalcolico 70% FAq(50) frao aquosa do extrato hidroalcolico 50% FAq(70) frao aquosa do extrato hidroalcolico 70% FAqB(50) - - frao aquosa da frao butanlica do extrato hidroalcolico 50% FBut(50 ) frao butanlica do extrato hidroalcolico 50% FBut(50) frao butanlica do extrato hidroalcolico 50% FBut(70) frao butanlica do extrato hidroalcolico 70% FCB(50) - frao clorofrmica da frao butanlica do extrato hidroalcolico 50% FE(70) frao emulso do extrato hidroalcolico 70% FEB(50) - - frao emulso da frao butanlica do extrato hidroalcolico 50% FEB1, 2, 3 e, 4(50) - frao 1, 2, 3 e 4 da frao emulso da frao butanlica do extrato hidroalcolico 50% FPB(50) frao precipitado da frao butanlica do extrato hidroalcolico 50% FSB(50) - frao sobrenadante da frao butanlica do extrato hidroalcolico 50% GCs - guanilato ciclase solvel GMPc guanidina monofosfato cclico GPx - glutationa peroxidase GR glutationa redutase GSH glutationa na forma reduzida GSSG glutationa na forma oxidada H+ - on hidrognio H-2 - receptor do tipo 2 da histamina H2O2 - perxido de hidrognio HCO3- - on bicarbonato IAP - Instituto Ambiental do Paran IBAMA - Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis id. via intraduodenal

iNOS - xido Ntrico Sintase indutiva IP3 inositol trifosfato KCl cloreto de potssio L-NAME - nitro-L-arginina metil ster M1 - receptor do tipo 1 da acetilcolina M-3 receptor do tipo 3 da acetilcolina MgCl2 cloreto de magnsio NADPH - nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato NaOH hidrxido de sdio NK-2 receptor do tipo 2 de taquicinina nNOS - xido Ntrico Sintase neuronal NO xido Ntrico NO2 - nitrito NO3 nitrato NO-AINEs - antiinflamatrios no esteroidais liberadores de xido ntrico NOS xido Ntrico Sintase NOx nitrito + nitrato NQO1 - NAD(P)H quinona oxidorredutase do tipo 1 O2- - nion superxido p.o. - via oral PAC1 receptor do tipo 1 do peptdeo ativador da adenilato ciclase pituitria PACAP - peptdeo ativador da adenilato ciclase pituitria PCK - protenas quinases clcio dependentes PGs prostaglandinas Pi fsforo inorgnico PKA - protena quinase dependente de AMPc PKG - protena quinase dependente de GMPc PVN - ncleo paraventricular sc. via subcutnea SNE - sistema nervoso entrico SOD - superxido desmutase SSTR receptor de somatostatina TGF- fator de transformao do crescimento-alfa

VR1 - receptores vanilides do tipo 1

RESUMO
Vrias espcies do gnero Pfaffia (famlia Amaranthaceae), conhecidas

popularmente como gingeng-brasileiro, so utilizadas para tratar distrbios do aparelho digestivo (OLIVEIRA, 1986). Dentre os vrios extratos da Pfaffia estudados em nosso laboratrio, o extrato hidroalcolico percolado das razes de P. glomerata foi o que apresentou maior espectro de ao como protetor gstrico. Portanto, o objetivo deste trabalho foi identificar as principais vias envolvidas no mecanismo de ao do efeito protetor gstrico do extrato hidroalcolico das razes de P. glomerata, assim como os princpios ativos responsveis por estas aes, atravs de um fracionamento biomonitorado. Foram preparados extratos com diferentes concentraes de etanol (50, 70 e 90%), denominados de EHaP50, EHaP70 e EHaP90, os quais foram testados em modelos de leses gstricas e no modelo de hipersecreo cida gstrica por ligadura pilrica. O EHaP50 (0,5 g/kg) foi mais efetivo do que o EHaP70 (0,5 g/kg) e o EHaP90 (0,5 g/kg) em proteger a mucosa gstrica contra leses induzidas pelo etanol, reduzindo em 80% as leses na mucosa gstrica. A DE50 do EHaP50 no efeito anti-lcera foi de 314 mg/kg no modelo de leses induzidas por etanol, de 908 mg/kg no modelo de leses induzidas por indometacina, e de 866 mg/kg no modelo de leses induzidas por estresse. O fracionamento sucessivo do EHaP50 forneceu fraes que foram at 95 vezes mais potentes que o extrato de origem. A ltima frao ativa obtida (partio 3) foi a FEB(50), que protegeu a mucosa gstrica contra as leses induzidas por etanol com uma DE50 de 3,3 mg/kg. Entretanto, com o armazenamento do material durante um perodo de 3 a 5 meses, observamos que enquanto o extrato bruto (EHaP50) manteve a atividade protetora gstrica, a FBut(50) apresentou uma reduo da atividade em 44% e a FEB(50) tornou-se inativa, sugerindo que princpios ativos presentes nas razes da P. glomerata perdem a estabilidade na ausncia de compostos importantes para a sua manuteno, que esto presentes no extrato bruto. Neste estudo o etanol reduziu os nveis de GSH gstricos em 37%, aumentou a atividade da GST em 22% e reduziu a atividade da NQO1 em 45%, quando comparado ao grupo no lesado (1198 109 g GSH/g tecido; 129,0 4,1 nmoles/mg/min e 1346 65 nmoles/mg/min; respectivamente). O EHaP50 impediu a queda dos nveis de GSH, impediu o aumento da atividade da GST e impediu a reduo da atividade da NQO1 promovidos pelo etanol, sugerindo que na proteo da mucosa gstrica exercida pelo EHaP50 est envolvida a manuteno de defesas antioxidantes. A FBut(50) impediu a reduo da atividade da NQO1 induzida pelo etanol sem alterar a atividade da GST e os

nveis de GSH, sugerindo a ativao especfica desta enzima (NQO1) no mecanismo gastroprotetor dos constituintes da P. glomerata. No modelo de hipersecreo cida gstrica por ligadura pilrica, o EHaP70 (0,5 g/kg) foi mais efetivo do que o EHaP50 (0,5 g/kg) e o EHaP90 (0,5 g/kg) em reduzir a secreo cida gstrica. O EHaP70 reduziu a secreo cida gstrica basal com uma DE50 de 476 mg/kg, reduziu em 35% a secreo estimulada por histamina, em 24% a secreo estimulada por betanecol, e em 52% quando estimulada por pentagastrina. A FE(70) foi a nica frao ativa do EHaP70 capaz de reduzir a secreo cida gstrica (DE50 = 62 mg/kg), sugerindo que nesta frao esto concentrados os princpios ativos para esta atividade. Alm disso, a FE(70) inibiu a H+,K+ - ATPase in vitro (CI50 = 640 g/ml) e in vivo em microssomos gstricos isolados da mucosa de coelhos e ratos, respectivamente, sugerindo que a principal ao responsvel pelo efeito anti-secretor de cido da P. glomerata seja a inibio da bomba de prtons. A reduo do Vmax sem alterao do Km sugere que a FE(70) produz uma inibio no competitiva da bomba de prtons. O EHaP70 (760 mg/kg) tambm foi capaz de aumentar os nveis de NOx na secreo, no fundo e na regio glandular gstrica em 81, 66 e 66%, respectivamente; e impediu a queda dos nveis de NOx induzido pelo L-NAME no fundo e na regio glandular gstrica. A FE(70) (0,1 mg/kg) aumentou em 2,8 vezes os nveis de NOx tanto no fundo gstrico quanto no plasma e manteve os nveis de GSH em concentraes semelhantes ao grupo controle, sugerindo que este aumento dos nveis de NO induzido pela FE(70) no lesivo s clulas gstricas. O aumento de NOx pelo EHaP70 e a FE(70) pode estar inibindo a bomba de prtons, j que tem sido descrito uma interao entre o aumento da formao de NO e a inibio da atividade da H+,K+-ATPase (BULET et al., 1999). Os extratos que apresentaram as atividades gastroprotetora (EHaP50) e antisecretora cida (EHaP70), na dose de 0,1 mg/kg, inibiram o esvaziamento gstrico, mas no alteraram o trnsito intestinal nem a diarria induzida por leo de rcino, sugerindo que o efeito inibitrio dos constituintes presentes nos extratos da P. glomerata sobre o esvaziamento gstrico no envolve a inibio do tnus parassimptico como um todo. Sugerimos ainda que neste efeito inibitrio possa estar envolvido um mediador gstrico local, tal como o NO. O conjunto de resultados sugere que no extrato hidroalcolico das razes de P. glomerata esto presentes princpios ativos capazes de proteger a mucosa gstrica por mecanismos antioxidantes enzimticos (GST e NQO1) e no enzimticos (GSH) e capazes de inibir a secreo cida gstrica atravs do aumento de NO e atravs da inibio da

bomba de prtons (H+,K + - ATPase). Estudos qumicos por CLAE e 1H-RNM das fraes ativas, indicam a presena de esterides na FBut(50) e de triterpenos na FE(70) como compostos majoritrios, sugerindo que estes compostos possam ser os responsveis pelo efeito gastroprotetor das razes da P. glomerata.

ABSTRACT
Some species of the Pfaffia genus (Amaranthaceae family), popularly known as "Brazilian gingeng", are used to treat digestives disturbances (OLIVEIRA, 1986). Amongst some Pfaffias extracts studied in our laboratory, the percolated hydroalcoholic (70%) extract of P. glomerata roots demonstrated the highest spectrum of action as gastroprotector. Therefore, the aim of this study was to identify the main pathways involved in the mechanism of action of the gastroprotective effect of the hydroalcoholic extract of P. glomerata roots as well as the active principles of this action using bioguided purification. Extracts of P. glomerata roots were prepared with different concentrations of ethanol (50, 70 and 90%), named of EHaP50, EHaP70 and EHaP90, that were evaluated in experimental models of gastric injury and in the model of gastric acid hypersecretion by pylorus ligature in rats. EHaP50 (0.5 g/kg) was more effective than EHaP70 (0.5 g/kg) and EHaP90 (0.5 g/kg) in protecting the gastric mucosa of rats against ethanol injury with an 80% reduction of the gastric lesions. The ED50 of EHaP50 for the anti-ulcer effect against ethanol-, indomethacin- and stress-induced injury was 314 mg/kg, 908 mg/kg, 866 mg/kg, respectively. The successive partition of EHaP50 supplied fractions up to 95 times more potent than the original extract. The more purified active fraction obtained after the third partition was FEB(50), that protected the gastric mucosa of rats against ethanol-induced injury with ED50 of 3.3 mg/kg. However, storage of the material during a period of 3 at 5 months caused loss of the gastroprotective activity in the FBut(50) by 44% while the FEB fraction turned inactive, indicating that the active principles of the P. glomerata roots are instable. In our study, ethanol reduced the gastric levels of GSH in 37%, increased the activity of the GST in 22% and reduced the activity of the NQO1 in 45%, when compared with not injured group (values: 1198 109 g GSH/g of tissue; 129.0 4.1 nmoles/mg/min and 1346 65 nmoles/mg/min; respectively). The EHaP50 reduced GSH levels and the activity of the NQO1 while increased the activity of GST induced by ethanol, indicating that EHaP50 maintain the antioxidant defenses. FBut(50) reduced the activity of NQO1 induced by ethanol without altering GST and GSH, indicating specific activation of this enzyme (NQO1) in the mechanisms of gastroprotection by P. glomerata In the model of gastric acid hypersecretion by pylorus ligature, EHaP70 (0.5 g/kg) was more effective than EHaP50 (0.5 g/kg) and EHaP90 (0.5 g/kg) in reducing the gastric acid secretion. EHaP70 reduced the basal gastric acid secretion with ED50 of 476 mg/kg,

reduced in 35% the stimulated secretion by histamine, in 24% the stimulated secretion by bethanechol, and in 52% when stimulated by pentagastrine. FE(70) was the only active fraction of the EHaP70 maintaining the anti-acid activity (ED50 = 62mg/kg) indicating that this fraction concentrated the active principles for this activity. Furthermore, the FE70 inhibited in vitro (IC 50 = 640g/ml) and in vivo the H+,K+ ATPase isolated from gastric mucosa of rabbits and rats, respectively, indicating that the inhibition of the proton pump is one of the active mechanism for the inhibition of gastric acid secretion by P. glomerata. A reduction of Vmax with no modification of Km indicated a not competitive inhibition of the proton pump by the FE70. EHaP70 (760 mg/kg) also increased the levels of NOx in the gastric secretion, in the forestomach and in the gastric glandular region in 81, 66 and 66%, respectively; and blocked the reduction of NOx levels induced by L-NAME in the forestomach and in the gastric glandular region. FE(70) (0.1 mg/kg) increased the levels of NOx in 2.8 fold in the forestomach and in the plasma and kept the levels of GSH unmodified concentrations to the control group, indicating that circulant levels of NO induced by FE(70) are increased for longer periods and is not harmful to the gastric cells. The extracts that were gastroprotective (EHaP50) and anti-secretor (EHaP70) inhibited the gastric emptying, but did not modified the intestinal transit nor the diarrhea induced by castor-oil, indicating that the inhibitory effect of P. glomerata on gastric emptying does not involve the inhibition of parasympatic tonus as a whole. Instead, it is our hypothesis that this inhibitory effect may be related to a local gastric mediator, such as NO. Overall the results indicate that the active principles contained in the hydroalcoholic extract of P. glomerata roots protect the gastric mucosa through several mechanisms including activation of enzymatic (GST and NQO1) and non-enzymatic (GSH) antioxidant mechanisms as well as inhibition of gastric acid secretion through blockade of H+,K+ - ATPase activity and correlated increase of NO formation. Chemical studies using HPLC and
1

H-RNM of the FBut(50) and FE(70) indicates the presence of steroids and

triterpenes, respectively, as majoritary compounds, indicating these compounds as the active principles of the gastroprotector effect of the P. glomerata roots.

1 INTRODUO

As plantas e os extratos vegetais foram e continuam sendo de grande relevncia na rea farmacutica, tendo em vista a utilizao das substncias ativas isoladas como prottipos para a obteno de frmacos, para a obteno de adjuvantes, ou ainda, de medicamentos elaborados exclusivamente base de extratos vegetais: os medicamentos fitoterpicos (SCHENKEL et al., 2001). No segmento industrial, ntido o ressurgimento do interesse em produtos naturais como fonte de modelos para frmacos e como matria-prima para desenvolvimento de fitoterpicos (SCHENKEL et al. 2001). Nos EUA, ocorreu uma expanso marcante desse mercado. Por exemplo, para produtos contendo kavakava, entre 1997 e 1998, foi registrada uma expanso de 461% e para o hiprico de 190% ( BLUMENTHAL et al., 2000). Dados recentes mostram aumentos na venda de valeriana (+70,5%) e ch-verde (+39,4%), entre 1999 e 2000 (BLUMENTHAL, 2001). Alm disso, tm sido desenvolvidos estudos de farmacoeconomia com matrias-primas vegetais, mostrando seu impacto na melhora da economia de certos pases (De Smet et al., 2000). Segundo NEWMAN (2003), entre o perodo de 1981 a 2002, foram introduzidos, no mundo inteiro, 877 novos frmacos, sendo que 61% foram obtidos ou baseados em produtos naturais. Atualmente o mercado mundial de fitoterpicos gira em torno de aproximadamente 22 bilhes de dlares/ano. Dentro desta perspectiva, seria de se esperar que o Brasil fosse um pas privilegiado, considerando sua extensa e diversificada flora (aproximadamente um tero da flora mundial). No entanto, nosso pas no tem uma atuao destacada no mercado mundial de fitoterpicos, ficando inclusive atrs de pases menos desenvolvidos tecnologicamente (YUNES et al., 2001). Se no forem adotadas polticas de apoio pesquisa, o Brasil corre o risco de, apesar de possuir a maior biodiversidade mundial, tornar-se importador de matrias-primas vegetais e reprodutor de formulaes fitoterpicas, da mesma forma que vem ocorrendo com a produo de medicamentos sintticos. As plantas medicinais brasileiras so consideradas como altamente promissoras, mas so pouco conhecidas sob qualquer ponto de vista. Alm disso, produtos esto sendo consumidos sem que sua eficcia e segurana tenham sido comprovadas. No nosso mercado, a maioria dos produtos constituda por cpsulas contendo ps de plantas rasuradas, para os quais no existem

comprovaes de eficcia e segurana, e algumas vezes nem mesmo tradio de uso (BLUMENTHAL et al., 2000). Como produto final de uma srie de sugestes apresentadas por diferentes segmentos da sociedade, foi estabelecida uma legislao para a rea de fitoterpicos (Portaria 6/SVS de 31/1/1995), que definiu claramente que fitoterpico um medicamento com componentes ativos exclusivamente de origem vegetal, e que deve apresentar comprovao de eficcia, segurana e qualidade. Tambm determinou prazos para a realizao de estudos de eficcia e toxicidade para os produtos j existentes no mercado, estabelecendo bases para uma maior aceitao desses produtos. Essa legislao exerceu um papel educativo importante e foi reformulada, mantendo suas caractersticas essenciais (Resoluo RDC no .17 de 24/2/2000). Tambm importante foi o estabelecimento de uma diviso direcionada especificamente para fitoterpicos no Ministrio da Sade e na Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA). Sem um rgo executivo, o processo no seria completo, qualquer que fosse a legislao estabelecida, pois a legislao por si s no assegura os instrumentos para a melhoria da qualidade dos produtos no mercado. A maioria dos estudos realizados no estado do Paran sobre plantas medicinais pesquisa as suas atividades biolgicas (34%). Dentre as atividades biolgicas estudadas, 60% so na rea de Farmacologia e 17% dos efeitos farmacolgicos estudados so sobre os efeitos das plantas medicinais sobre o trato gastrointestinal (GUIMARES et al., 2004). O Programa de Ps-graduao do Departamento de Farmacologia do Setor de Cincias Biolgicas da UFPR contribui para o uso seguro de plantas medicinais, atravs da pesquisa cientfica com metodologias internacionalmente padronizadas, buscando a validao das plantas medicinais com atividade sobre o trato gastrointestinal. Os estudos realizados em nosso laboratrio visam demonstrar a eficcia, a segurana e o mecanismo de ao das plantas medicinais.

1.1 Pfaffia glomerata (S PRENG) P EDERSEN

Neste trabalho foi utilizado como material de estudo as razes da Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen (Figura 1.1), uma dentre vrias espcies conhecidas como ginseng-brasileiro. O termo ginseng de origem chinesa e

etnologicamente significa Jin = homem e Chen = ternrio; uma aluso ao conjunto: homem fsico, homem espiritual e planta. A forma humanide das razes do ginseng, para muitos, corresponde essncia da reparao da forma fsica e psquica do homem (OLIVEIRA, 1986). Esta planta tambm conhecida como batata-do-mato, corando, corrente sempre-viva e paratudo (SOUZA et al., 1997).

Figura 1.1: Razes da Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen. (Foto reproduzida com autorizao de Cirino Correa Jr).

1.1.1 ASPECTOS BOTNICOS

A P. glomerata pertence famlia Amaranthaceae (CRONQUIST, 1988) e, segundo a descrio botnica feita por VASCONCELOS (1986), caracteriza-se por ser uma erva perene com at 2 metros de altura.

Possui caule ereto, rolio, estriado, muitas vezes oco na parte superior, com ns engrossados e entrens com at 23 cm de comprimento; ramificaes predominantemente dicotmicas, glabra ou pubescente, principalmente nos ramos jovens e ns (VASCONCELOS, 1986). As folhas possuem pecolos muito curtos com at 2 cm de comprimento. As lminas tm forma e tamanhos variveis de linear oblongas at largo-ovaladas, de 1 a 14 cm de comprimento e 0,3 a 4,5 cm de largura. As lminas superiores so sempre menores (VASCONCELOS, 1986). As inflorescncias so capitulares, paleceas, branco-amareladas; com pednculos de 3 a 20 cm de comprimento, pubescentes, simples, dicotmicas ou tricotmicas. So cimosas, com captulos menores que 8 mm de dimetro (VASCONCELOS, 1986). As flores so polgamo-monicas, em espigas bastas, subglobosas, com 4 a 8 cm de dimetro; brcteas e bractolas subiguais, ovadas e mucronadas. As spalas so estreito-elpticas, trinervadas, vilosas na base, com 2 a 3 mm de comprimento (SMITH e DOWNS, 1972). O fruto do tipo aqunico; com sementes no formato codiforme, colorao verde-clara quando imaturas e marrom acastanhado quando maduras, medindo 1 mm de dimetro e cerca de 1,5 mm de comprimento. O embrio envolvido por endosperma farinceo e abundante (VASCONCELOS, 1986). Os rgos subterrneos so compostos por uma raiz tuberosa, que apresenta na parte superior uma parte caulinar de tamanho varivel. No colo ocorrem gemas endgenas e exgenas, utilizadas como material de propagao (VASCONCELOS, 1986). As razes, em 4 a 7 anos, chegam a medir at 2 metros de comprimento e 8 centmetros de espessura (TESKE e TRENTINI, 1995).

1.1.2 D ISTRIBUIO

A famlia Amaranthaceae possui cerca de 60 gneros e 900 espcies, distribudos nos trpicos, subtrpicos e regies temperadas das Amricas e da frica. No Brasil ocorrem 12 gneros com cerca de 86 espcies (BARROSO, 1978).

Temperaturas muito baixas paralisam o crescimento da P. glomerata. uma espcie hidrfita (planta que se desenvolve parcial ou completamente sob a gua, ou em solos muito midos) e helifita (planta que cresce melhor sob plena luz do sol), ocorrendo principalmente beira dos rios e nas orlas das matas de galerias onde parece receber bastante luz (SMITH e DOWNS, 1972). Esta espcie desenvolve-se em altitudes de at 1000 m, ocorrendo principalmente em solos arenosos e ricos em matria orgnica, porm tambm se desenvolve em solos argilosos, no qual apresenta maior produo de razes, porm com maior dificuldade de colheita (CORRA JNIOR e MING, 2004). A P. glomerata vegeta naturalmente na plancie de inundao do alto rio Paran, situada nos municpios de Querncia do Norte e Porto Rico (noroeste do estado do Paran). Entretanto, esta espcie vem sendo reduzida drasticamente pela coleta intensiva de suas razes. Esta ao fez com que vrios rgos, como a Empresa de Assistncia Tcnica e Extenso Rural do Paran (EMATER-PR), o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis (IBAMA), Universidades, Instituto Ambiental do Paran (IAP), produtores rurais, coletores, empresas nacionais e estrangeiras considerassem a domesticao da espcie a melhor estratgia para abastecer o mercado nacional e internacional (CORREA JNIOR e MING, 2004).

1.1.3 S INONMIAS

A espcie P. glomerata

(Spreng) Pedersen possui um marcado

polimorfismo e apresenta as seguintes sinonmias: Althernanthera glauca (Mart.) Hosseus; Gomphrena dunaliana Moq.; Gomphrena glauca (Mart.) Moq.;

Gomphrena luzulaeflora (Mart.) Moq.; Gomphrena stenophylla Spreng.; Irisine luzuliflora (Mart.) Griseb.; Mogiphanes dunaliana (Moq.) Griseb.; Mogiphanes glauca (Mart.) Griseb.; Pfaffia divergens O. Sttzer; Pfaffia dunaliana (Moq.) Schinz; Pfaffia glabrescens Suess.; Pfaffia glauca (Mart.) Spreng.; Pfaffia irisinoides (Kunth) Spreng. var. angustifolia O. Sttzer.; Pfaffia luzulaeflora (Mart.) D. Dietr.; Pfaffia luzulaeflora (Mart.) D. Dietr. f. gracilis O. Sttzer; Pfaffia luzulaeflora (Mart.) D. Dietr. f. virgata O. Sttzer; Pfaffia luzulaeflora (Mart.) D. Dietr. var. microcephala O. Sttzer ex Suess.; Pfaffia luzulaeflora (Mart.) D. Dietr. var. paniculata O. Sttzer;

Pfaffia stenophylla (Spreng.) Stuchlik; Sertuernera glauca Mart.; Sertuernera luzulaeflora Mart (PEDERSEN, 1967).

1.1.4 C ONSTITUINTES QUMICOS As espcies do gnero Pfaffia possuem em sua composio vitaminas A, B, C, D, E e K, sais minerais como fsforo, clcio e potssio, aminocidos e mucilagens (TESKE e TRENTINI, 1995). Como apresentado na Tabela abaixo, os fafosdeos (saponinas

nortriterpnicas derivadas do cido ffico) e os ecdisterides (em especial a ecdisterona) so encontrados em espcies de Pfaffia.

Tabela 1.1: Compostos isolados de espcies de Pfaffia. Espcie Constituintes qumicos cido famrico, cido glomrico, cido oleanlico, ecdisterona, P. glomerata rubrosterona, ?-D-glicopiranosil-oleanolato (SHIOBARA et al., 1993a) P. iresinoides chikusetsusaponina IV, ecdisterona, 25-O-?-D-glicopiranosilecdisterona, iresinosdeo, 25-O-?-glicopiranosil-podecdisona B, polipodina B, pterosterona, 24-O-?-glicopiranosil-pterosterona (NISHIMOTO et al., 1987, 1988) P. paniculata cido ffico, alantona, sitosterol, estigmasterol, fafosdeos A, B, C, D, E, F (TAKEMOTO et al., 1983; NAKAI et al., 1984; NISHIMOTO et al., 1984) P. pulverulenta cido ffico, cido pulvrico, ecdisterona, fafosdeo G,

pulverolactona, rubrosterona (SHIOBARA et al., 1992, 1993b)

1.1.5 ATIVIDADES BIOLGICAS

O ginseng-brasileiro (Pfaffia spp), largamente utilizado como substituto do ginseng-asitico (Panax spp), tem sido empregado como tnico, afrodisaco, cicatrizante; utilizado para aumentar o apetite, reduzir as perturbaes do sono, melhorar a memria, aumentar o estado de nimo, aumentar a sociabilidade, melhorar a turgescncia superficial da pele e a irrigao dos cabelos. Tambm utilizado na diabetes, em distrbios do aparelho digestivo, em labirintites e tremores dos velhos. Alguns afirmam ainda a obteno de bons resultados no tratamento de reumatismo, artrite, artrose e lcera varicosa (OLIVEIRA, 1986). Entretanto, enquanto encontram-se vrios estudos cientficos com as espcies do gnero Panax (ginseng-asitico), os estudos com as espcies da Pfaffia (ginsengbrasileiro) so escassos. MARQUES et. al. (2004) apresentaram dados sobre a ao benfica da P. glomerata na aprendizagem e memria de ratos idosos em modelos crnicos, alm de uma baixa toxicidade. Em estudo clnico, observaram que o extrato promoveu uma melhora significativa na memria de curto prazo e memria declarativa em voluntrios idosos, mas causou prejuzo na praxia e orientao geral desses voluntrios; observaram ainda que o extrato no promoveu nenhum benefcio em voluntrios atletas em termos de aptido e atividade fsica, contrariando o uso popular e a propaganda comercial de diferentes produtos contendo razes de espcies deste gnero. Estudos sobre o sistema nervoso central foram realizados com extrato hidroalcolico de P. glomerata (60%). O extrato, quando administrado pela via intraperitoneal, promoveu uma ao depressora, com efeito amnsico na tarefa de esquiva inibitria, contrariando a utilizao desta espcie como estimulante. No entanto, quando administrado por via oral este efeito no foi observado (DEPARIS et al., 2000). Dando continuidade a este estudo, o fracionamento biomonitorado deste extrato foi iniciado, e a frao orgnica mais apolar apresentou atividade depressora em ambas as vias de administrao (oral e intraperitoneal) (FENNER et al., 2001). Estudos in vitro foram realizados com as razes da P. glomerata, demonstrando que o extrato hidroalcolico no apresentou efeito citotxico sobre

linhagens de clulas tumorais, nem ao anti-viral sobre o vrus do tipo Herpes humano, nem efeito antifngico, nem ao inibitria sobre monoaminoxidases cerebrais (GOSMANN et al., 2002); entretanto, foi observada uma atividade leishmanicida (NETO et al., 2004). Estudos recentes com o extrato hidroalcolico de P. glomerata tambm demonstraram atividade analgsica e antiinflamatria em camundongos (NETO et al., 2005).

1.1.6 ATIVIDADE ANTI-LCERA

Em estudos realizados no Departamento de farmacologia da UFPR foi observado que o extrato hidroalcolico das razes de vrias espcies de Pfaffia sp, quando administrados pela via oral, reduziu a incidncia de lceras induzidas por etanol na mucosa gstrica de ratos, indicando uma ao citoprotetora da Pfaffia. Este extrato tambm reduziu a secreo gstrica basal (no estimulada) e a estimulada com betanecol e com histamina (FREITAS et al., 2003). Dando continuidade aos estudos, escolheu-se apenas uma espcie do gnero Pfaffia, a P. glomerata, que tambm promoveu uma gastroproteo. Segundo FREITAS et al. (2004), o extrato bruto aquoso das razes de P. glomerata protegeu a mucosa gstrica de ratos contra leses induzidas por etanol e estresse, alm de reduzir a secreo cida gstrica com o envolvimento da via histaminrgica e do aumento de xido ntrico gstrico. O extrato aquoso, quando administrado cronicamente, promoveu ainda o aumento da cicatrizao de lceras crnicas induzidas por cido actico (FREITAS et al., 2001). Um terceiro estudo foi realizado com as razes de P. glomerata, onde o extrato hidroalcolico percolado protegeu contra leses induzidas por

indometacina, estresse e etanol, em ratos (OTOFUJI et al., 2003-a) e reduziu a secreo cida gstrica basal, assim como quando estimulada por histamina, pentagastrina e betanecol (OTOFUJI et al., 2003-b).

1.1.7 TOXICIDADE

Pfaffia sp.: A dose letal mediana (DL50) determinada 14 dias aps a

administrao de uma nica dose (via oral) do extrato hidroalcolico de uma mistura de espcies de Pfaffia foi de 7,0 g/kg (PAULA et al., 1997). Pfaffia glomerata: No houve morte de nenhum dos animais aps 14

dias da administrao de uma nica dose (1 a 10 g/kg - via oral) do extrato aquoso das razes de P. glomerata (FREITAS, 2000).

1.2 F ISIOLOGIA GSTRICA

Anatomicamente, o estmago divide-se em 3 pores: fundo, corpo e antro pilrico; sendo limitado por 2 sistemas esfincterianos: o esfncter esofagiano inferior, na parte superior ou proximal do estmago; e o esfncter pilrico ou piloro, na parte inferior ou distal do estmago (HOGBEN et al., 1974). Funcionalmente, a mucosa gstrica pode ser dividida em duas regies glandulares: a mucosa oxntica e a mucosa antral. A mucosa oxntica mais extensa, ocupando o corpo e o fundo, e o stio da secreo de cido clordrico. A mucosa oxntica formada por glndulas oxnticas, que so constitudas por clulas parietais (ou oxnticas), clulas principal, clulas produtoras de

somatostatina (clulas D) e clulas do tipo enterocromafins (ECL). No colo glandular, predominam as clulas produtoras de muco, que protegem a mucosa gstrica da ao corrosiva das secrees originadas pela glndula (LUCEY e YAMADA, 1989; CHUANG et al., 1991; SUNDLER et al., 1991). As glndulas da mucosa antral apresentam os mesmos tipos celulares que as glndulas oxnticas, exceto as clulas parietais (HOGBEN et al., 1974). A inervao do estmago compreende fibras extrnsecas e intrnsecas. A inervao intrnseca constituda por dois plexos principais, o plexo mioentrico que inerva as camadas musculares e regula a funo motora, e o plexo submucoso que inerva a mucosa e regula a absoro e as secrees gastrointestinais (SCHUBERT e SHAMBUREK, 1990). Neurnios de ambos os plexos recebem

aferncias do sistema nervoso central atravs de fibras do sistema nervoso parassimptico e simptico (inervao extrnseca) e de outros neurnios entricos, incluindo neurnios sensoriais e interneurnios. Estes circuitos neuronais permitem regular as funes motoras e secretoras do tubo digestivo (COSTA, 1994). A inervao simptica do trato gastrointestinal realizada principalmente por fibras ps-ganglionares que inervam diretamente os vasos sangneos e o msculo liso, inibindo a motilidade e a atividade secretora do sistema gastrointestinal, porm estimula a contrao da muscularis mucosae e de alguns esfncteres (LONGHURST et al., 1984-a; LONGHURST et al., 1984-b). Em geral, as fibras do parassimptico terminam nos gnglios do plexo mioentrico. As fibras aferentes do vago inervam diretamente a clula parietal e realizam sinapses com as clulas ganglionares do sistema nervoso entrico (SNE), estimulando a atividade motora e secretora do intestino (LONGHURST et al., 1984a; LONGHURST et al., 1984-b).

1.3 LCERA PPTICA

A lcera uma leso profunda da mucosa, onde tanto os componentes do tecido epitelial e conectivo, incluindo miofibroblastos subepiteliais, clulas do musculo liso, vasos e nervos, podem ser destrudos (MILANI e CALABR, 2001). Tanto as lceras localizadas no estmago quanto as do duodeno so referidas como lcera ppticas. Em geral, as lceras ocorrem mais comumente no duodeno (5x), onde 90% esto localizadas a 3 cm da juno do piloro com a mucosa duodenal. No estmago as lceras se localizam mais comumente no antro (60%) e na juno do antro com o corpo na pequena curvatura (25%) (ABITBOL, 2005). Sua incidncia ligeiramente maior nos homens em relao s mulheres (1,3:1) e, apesar de ocorrerem em qualquer idade, a lcera duodenal ocorre com mais freqncia na faixa de 30-55 anos, enquanto a lcera gstrica na faixa de 5070 anos (ABITBOL, 2005).

1.3.1 E TIOLOGIA DA LCERA PPTICA

Segundo a reviso realizada por SZABO (1991), a leso celular ou tecidual da mucosa gstrica pode ocorrer por causas adquiridas ou inatas. As cinco causas mais comuns de leso celular ou tecidual ocorrem por: (1) hipxia e isquemia (resultante da diminuio do fluxo sangneo ou do decrscimo da hemoglobina ou ainda da diminuio das enzimas antioxidantes dos tecidos); (2) por agentes qumicos (como monoaminas, eicosanides, endotelinas, drogas sintticas, e principalmente substncias qumicas ingeridas propositadamente como o etanol); (3) por agentes biolgicos (como vrus, bactrias, fungos, parasitas, levando a reaes imunolgicas que geralmente so desenvolvidas para a defesa do organismo, entretanto produzem radicais livres txicos que contribuem para a injria tecidual); (4) por fatores fsicos (estresse, temperaturas extremas, fora mecnica); e (5) por defeitos genticos. As lceras provavelmente resultam de diferentes mecanismos patognicos e, independente de sua etiologia, esta formada quando ocorre um desequilbrio entre fatores agressores da mucosa, sejam eles endgenos (cido clordrico e pepsina) ou exgenos (etanol, antiinflamatrios esteroidais, fumo), e os fatores protetores da mucosa gstrica (muco, bicarbonato, prostaglandinas, fluxo sanguneo, xido ntrico) (Revisado por GLAVIN e SZABO, 1992; Revisado por WALLACE e NEIL-GRANGER, 1996).

1.3.2 F ATORES PROTETORES DA MUCOSA GSTRICA

A mucosa gstrica possui uma barreira dinmica, permitindo a passagem de certos ons e molculas para o corpo e restringindo a entrada de outros. Esta proteo no realizada apenas por uma barreira anatmica, mas por uma srie de mecanismos de defesa consecutivos que mantm a integridade da mucosa (Revisado por FLEMSTRM e ISENBERG, 2001). A defesa da mucosa gstrica pode ser dividida em fatores pr-epitelial, epitelial e sub-epitelial. Esta diviso arbitrria, pois as funes epiteliais como um todo funcionam em conjunto para prevenir as leses (FLEMSTRM e ISENBERG,

2001). Assim, deve-se ressaltar que esta diviso realizada apenas para fins didticos.

1.3.2.1 Proteo Pr-epitelial

O epitlio gstrico coberto por uma camada aderente e contnua de muco gelatinoso e visco-elstico, que promove uma barreira fsica entre o lmen gstrico e a superfcie das clulas apicais. Um gradiente de pH formado, com um pH consideravelmente maior na superfcie das clulas apicais que na soluo contida no lmem gstrico. Assim, a difuso de macromolculas do lmem para a superfcie epitelial, incluindo as pesinas, prevenida ou restrita (FLEMSTRM et al., 1999). O muco gstrico ocorre em 3 formas: a mucina solvel presente no suco gstrico; o muco (aderente) insolvel cobrindo as clulas da mucosa; e o muco presente nas clulas secretoras de muco, dispostas entre as clulas apicais (MOJZIS et al., 2000). Estudos indicam que a estimulao da secreo cida aumenta a habilidade da mucosa gstrica em resistir s leses. As clulas parietais quando liberam o on H+, simultaneamente transportam o on bicarbonato pela membrana basolateral atravs da troca Cl-/HCO3-, que resulta numa maior disponibilidade de bicarbonato. Alm disso, para cada on H+ secretado pela clula parietal, uma molcula de CO2 convertida em bicarbonato, provocando o que se conhece como mar alcalina aps a secreo de cido gstrico. O papel da mar alcalina em proteger a mucosa gstrica fortemente sustentado por outros estudos que demonstram que a administrao parenteral de bicarbonato in vivo, e a infuso de bicarbonato na mucosa gstrica in vitro protegem a mucosa contra leses (KIVILUOTO et al., 1993; GOEL e BHATTACHARYA, 1991).

1.3.2.2 Proteo Epitelial

As clulas epiteliais gstricas tm propriedades intrnsecas de proteo tanto por sua disposio anatmica quanto por sua constituio bioqumica (Revisado por SZABO, 1991). 1.3.2.2a Aspectos Anatmicos da Gastroproteo Epitelial O mecanismo de proteo de rgos complexos, assim como o estmago, influenciado por sua composio e estruturas histolgicas e anatmicas. Esta proteo pode ser ativada por ao menos 2 mecanismos: preservando as clulas existentes ou repondo o tecido lesionado (Revisado por SZABO, 1991).

Hidrofobicidade da mucosa gstrica e junes intercelulares: As

junes fechadas e outras barreiras intercelulares controlam a passagem de agentes lesivos do lmem para a mucosa gstrica, para espaos intersticiais e submucosos. Agentes que conseguem atravessar estas junes ainda so restritos pela membrana celular das clulas gstricas, que so compostas por elevada concentrao de fosfolipdios, restringindo a difuso de molculas hidroflicas, como o on H+ (Revisado por SZABO, 1991; Revisado por FLEMSTRM e ISENBERG, 2001).

Diviso e migrao celular: Quando as barreiras gstricas so

destrudas e ocorre a morte celular, as clulas necrticas podem ser repostas pela migrao das clulas epiteliais sobreviventes nas bordas da leso ou pela diviso das clulas do colo glandular que migram at o lmem e diferenciam-se em clulas epiteliais superficiais (Revisado por SZABO, 1991; Revisado por WALLACE e GRANGER, 1996). O fator de crescimento epidermal acelera a cicatrizao das lceras tanto por estimular a proliferao e a migrao celular, modular o fluxo sanguneo, assim como por inibir a secreo de cido e pepsinas (ORSINI, 1993; KONTUREK et al., 1984). Recentemente foi demonstrado que a regulao da migrao celular tambm pode ser estimulada pelo fator de crescimento do hepatcito, que tambm

 sintetizado em clulas gstricas. Alm disso, j foi observado o envolvimento da ciclooxigenase induzida (COX-2) na resposta proliferativa das clulas gstricas induzida por fator de crescimento, sugerindo mais um mecanismo de ao do efeito gastroprotetor das prostaglandinas (TAKAHASHI et al., 1996; TERANO et al., 2001). 1.3.2.2b Aspectos Bioqumicos da Gastroproteo Epitelial

Sistema Antioxidante: As espcies reativas do oxignio (ERO) so

geradas constantemente nas clulas durante alguns processos, como na cadeia transportadora de eltrons (na fosforilao mitocondrial), durante o metabolismo de xenobiticos e durante a resposta inflamatria. As ERO, como o nion superxido (O2- ), o radical hidroxil ( OH) e o perxido de hidrognio (H2O2) so molculas altamente reativas que interagem indiscriminadamente com macromolculas essenciais, como o DNA, as protenas e lipdeos. Assim, defesas celulares antioxidantes so necessrias para manter a homeostase celular (Revisado por CNUBBEN et al., 2001). O estresse oxidativo pode ser prevenido tanto por ao enzimtica quanto por defesas antioxidantes qumicas. As enzimas que promovem a primeira linha de defesa contra o O2- e o H2 O2 incluem a superxido desmutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx) (Revisado por CNUBBEN et al., 2001). A SOD remove o O2- do ambiente celular pela converso em H2 O2, que metabolizado pela CAT em oxignio e gua (Revisado por MICHIELS et al., 1994); ou ainda, o H2 O2 pode ser reduzido pela GPx, utilizando a glutationa reduzida (GSH) como substrato (Revisado por DICKINSON e FORMAN, 2002). A segunda linha de defesa antioxidante realizada por alguns compostos de molculas qumicas pequenas, incluindo vitaminas, flavonides da dieta, carotenides, cido rico e o GSH (Revisado por CNUBBEN et al., 2001). O GSH atua como um varredor de radicais livres e substncias txicas ingeridas com a comida ou produzidas diretamente no trato gastrointestinal (SHIRIN et al., 2001). Sob condies de estresse oxidativo, o GSH reduz as espcies reativas do oxignio, sendo liberado na forma oxidada (GSSG). O aumento de GSSG durante o estresse oxidativo geralmente transitrio, pois

reduzido rapidamente pela glutationa redutase (GR) (Revisado por DICKINSON e FORMAN, 2002). A conjugao no-enzimtica do GSH com compostos eletroflicos ocorre apenas quando o eletrfilo muito reativo. Desta forma, a conjugao favorecida pela ao da enzima glutationa S-transferase (GST) (Revisado por DICKINSON e FORMAN, 2002). A GST possui a habilidade de conjugar diversos substratos com o GSH devido a sua natureza relativamente no especfica do stio de ligao para o substrato hidrofbico e pela existncia de inmeras isoformas dessa enzima. Esta enzima capaz de detoxificar compostos endgenos lesivos, como xenobiticos eletroflicos e/ou intermedirios reativos formados durante sua biotransformao (Revisado por CNUBBEN et al., 2001). Foi proposto por WINTERBOURN (1993) outro papel antioxidante do GSH, que depende da sua habilidade em reagir com o radical centralizado de carbono (R ). Nesta hiptese, o GSH atuaria em conjunto com a SOD para prevenir o dano oxidativo. A enzima NAD(P)H quinona oxidorredutase 1 (NQO1) tambm protegem as clulas contra o estresse oxidativo (Revisado por MATS, 2000). A NQO1 uma enzima antioxidante que catalisa a reduo de dois eltrons de quinonas (endgenas e exgenas) formando hidroquinonas, sem que aja a produo de espcies reativas do oxignio, auxiliando na proteo da membrana celular contra os danos oxidativos (Revisado por ROSS et al., 2000).

xido ntrico: O xido ntrico (NO) uma molcula sinalizadora

gerada, atravs de uma srie de etapas de transferncia de eltrons, por uma famlia de enzimas conhecidas como NO sintases (NOS). Trs genes independentes codificam a NOS neuronal (nNOS) (BREDT et al., 1991), a endotelial (eNOS) (SESSA et al., 1992) e a induzida (iNOS) (XIE et al., 1992), as quais possuem a capacidade de gerar o NO por mecanismos regulatrios complementares e distintos. O NO, por sua natureza lipoflica, difunde-se rapidamente, iniciando sinais intercelulares e intracelulares (PALMER et al., 1987). A via melhor caracterizada da sinalizao produzida pelo NO est relacionada com a ativao da guanilato ciclase solvel (GCs), onde o NO liga-se no grupamento heme da enzima,

estimulando a formao de GMPc, que por sua vez ativam protenas quinases G (PKG), iniciando uma cascata de fosforilao para obter a funo efetora (DENNINGER et al., 2001). Entretanto, em condies fisiopatolgicas e provavelmente durante certas condies fisiolgicas, a sinalizao mediada por NO pode ser independente da ativao da GC. O NO, por exemplo, regula diretamente a funo de canais inicos, enzimas e vrias protenas (STAMLER et al., 2001). Esta regulao parece ser, ao menos em parte, pela nitrosilao de grupamentos tiis do resduo de cistena presentes nas protenas (JAFFREY et al., 2001). Recentemente, o xido ntrico tem sido reconhecido como um mediador fundamental nos mecanismos de defesa gstrica. Em vrios estudos, foram demonstrados que as leses na mucosa gstrica induzidas por agentes qumicos so reduzidas pela administrao de NO e agravadas com a sua remoo (LOPEZBELMONTE et al., 1993; ANDREWS et al., 1994; CALATAYUD, 1999). Este efeito pode estar ocorrendo devido ao aumento do fluxo sanguneo da mucosa promovido pelo NO (Revisado por WALLACE e GRANGER, 1996) ou ainda por promover um aumento na liberao de muco gstrico (BROWN et al., 1992). Recentemente tambm foi demonstrado que a administrao de L-NAME (inibidor da NOS) acentua as leses gstricas induzidas por etanol e aumenta a atividade da H+,K+-ATPase, enquanto doadores de NO (nitroprussiato) reparam as leses induzidas por etanol e inibem a atividade ATPsica em ratos (BULUT et al., 1999). Vrios estudos trazem informaes contraditrias a respeito do papel do NO no trato gastrointestinal. TAKEUCHI et al. (1993) demonstrou que o NO inibe a secreo duodenal de bicarbonato. Por outro lado, outros pesquisadores sugeriram que a secreo de bicarbonato estimulada por NO (SABABI et al., 1995; HOLM et al., 1998).

Prostaglandinas: As prostaglandinas (PGs) so sintetizadas a partir

do cido araquidnico, atravs das enzimas ciclooxigenases (COX). Enquanto a isoforma COX-1 (constitutiva) produz a maior parte de prostaglandinas ( Gs) no P estmago normal, a COX-2 (induzida) atua como um fator importante na cicatrizao das lceras. Inicialmente acreditou-se que a COX-2 contribuia para a cicatrizao das lceras unicamente atravs da produo de PGs. Entretanto,

estudos recentes sugerem que a inibio da COX-2 aumenta o tempo de cicatrizao das lceras tanto por via dependente quanto independente de prostaglandinas (Revisado por PERINI et al., 2003). Segundo WALLACE (2001), em pacientes com lceras pr-existentes, tem-se sugerido utilizar derivados de antiinflamatrios no esteroidais (AINEs) que liberam NO ao invs de inibidores seletivos de COX-2, pois estes NO-AINEs no interferem na cicatrizao das lceras e, em alguns casos, pode acelerar sua cicatrizao. As prostaglandinas, especialmente a PGE 2, possuem efeitos citoprotetores na mucosa gstrica como conseqncia de vrios mecanismos indiretos, como o aumento da produo de muco e bicarbonato que recobrem as clulas epiteliais, a inibio da motilidade gstrica, a inibio da secreo cida gstrica, a manuteno do fluxo sanguneo gstrico, a inibio da apoptose, a inibio da ativao de mastcitos, e a diminuio da aderncia leucocitria ao endotlio vascular (Revisado por ATAY et al., 2000).

1.3.2.3 Proteo Sub-epitelial

Microcirculao gstrica: O fluxo sangneo protege a mucosa por

assegurar a chegada de uma quantidade tima de oxignio, nutrientes e bicarbonato. Quando o cido gstrico ou outro agente irritante invade o compartimento subepitelial, neurnios sensoriais aferentes so capazes de disparar um rpido aumento no fluxo sangneo da mucosa que permite o tamponamento do cido e uma rpida remoo de substncias txicas, limitando, desta forma, sua penetrao em camadas mais profundas da mucosa (Revisado por WALLACE e GRANGER, 1996).

Tnus muscular: A modulao farmacolgica do esvaziamento

gstrico, da motilidade duodenal e da mistura cido-base representa mecanismos de defesa gstrica. Os vasos sanguneos gstricos atravessam a muscularis mucosae tanto perpendicularmente quanto obliquamente. Assim, a contrao do msculo liso da parede gstrica comprime os pequenos vasos, favorecendo a leso endotelial e o desenvolvimento de congesto e estase local por drogas como o etanol (Revisado por SZABO e BYNUM, 1988; HOLZER et al., 1994).

Estudos com o NO tambm foram realizados para avaliar sua participao na motilidade gastrointestinal e no fluxo sanguneo gstrico. Enquanto o papel do NO na motilidade gastrointestinal fortemente controlada pela nNOS, os efeitos nas funes vasculares ocorrem, em maior parte, atravs da eNOS (revisado por SHAH et al., 2004). Em estudos em humanos foi observado que inibidores da NOS aumentam a freqncia de contraes gstricas e aumenta o esvaziamento gstrico (TACK et al., 2002), assim como doadores de NO inibem o esvaziamento gstrico e promovem a acomodao da regio proximal do estmago ( ONTUREK et al., K 1995). A maior parte do fluxo sanguneo do trato gastrointestinal entra pela vasculatura mesentrica e regulado, em grande parte, pelas arterolas. O papel do NO neste processo foi evidenciado por inibidores de NO, que reduziram o fluxo sanguneo em artrias mesentricas (SHAH et al., 2002; KUSAYAMA et al., 1996).

Resposta inflamatria aguda: Quando os nveis superficiais da

defesa da mucosa falham ou so inundados por uma leso luminal, o prximo nvel de defesa da mucosa a resposta inflamatria aguda. Resumidamente, os neutrfilos migram da circulao para o local da leso para facilitar o reparo e reduzir a entrada de microorganismos na circulao sistmica (Revisado por WALLACE, 2001).

1.3.3 S ECREO CIDA GSTRICA

Uma das mais importantes funes do estmago a produo de cido. O cido gstrico facilita a digesto de protenas, a absoro de ferro, clcio, vitamina B12, e previne o crescimento bacteriano e a infeco entrica. Entretanto, quando os nveis de cido e pepsina se sobrepem aos mecanismos de defesa da mucosa, h a formao de lceras. Para prevenir estas leses, a secreo cida gstrica pode ser precisamente regulada. A regulao envolve vias aferentes e eferentes do sistema nervoso central e entrico, assim como a atuao de clulas neuroendcrinas e imunes pelas vias autcrina, parcrina, e hormonal (Revisado por SCHUBERT, 2004).

As vias regulatrias convergem em 4 clulas cruciais para a secreo cida: (1) as clulas parietais da mucosa oxntica (corpo e fundo gstrico), que produzem cido clordrico; (2) as clulas do tipo enterocromafins (ECL) da mucosa oxntica, que produzem a histamina (principal estimulante parcrino da secreo cida); (3) as clulas G da mucosa antral, que produzem a gastrina (principal estimulante hormonal da secreo cida); e (4) as clulas D da mucosa oxntica e antral, que produzem a somatostatina (principal inibidor parcrino da secreo cida) (Revisado por SCHUBERT, 2004).

1.3.3.1 Mecanismos Centrais

A fase ceflica da secreo cida ativada por sinais sensoriais reconhecidos pelo cheiro, pelo paladar, pela viso e pelo pensamento nos alimentos, que contribui em aproximadamente 50% para a resposta da secreo cida durante a alimentao. O ncleo dorsal motor do vago (na medula) e o ncleo paraventricular (PVN) (no hipotlamo) so responsveis pela integrao das informaes aferentes e eferentes. O PVN conectado anatomicamente e funcionalmente com o ncleo arqueado (ARC). O neuropeptdeo Y e os neurnios contendo o fator liberador de corticotropina (CRF) esto presentes no ARC e no PVN e inibem a secreo cida. Existe a hiptese de que o neuropeptdeo Y, liberado das projees de neurnios do ARC para o PVN, ativa os neurnios do CRF nesta regio do crebro (TEBBE et al., 2003; Revisado por SCHUBERT, 2004). A neuromedina U tambm est presente no ARC e, quando administrada por injeo intracerebroventricular, inibe a secreo cida gstrica (MONDAL et al., 2003). Este efeito mediado por CRF, pois foi observado que anticorpos de CRF podem bloquear o efeito. O CRF, por sua vez, ativa os neurnios simpticos noradrenrgicos (Revisado por SCHUBERT, 2004). A capsaicina capaz de se ligar nos receptores vanilides (VR1), que j foram localizados nos terminais aferentes vagais, assim como no ncleo do trato solitrio e na rea postrema (PATTERSON et al., 2003). A injeo

intracerebroventricular de capsaicina estimula a secreo cida gstrica em ratos, sendo que esta resposta envolve os receptores VR1 e a liberao de taquicininas e

o peptdeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP), pois este efeito pode ser bloqueado por antagonista VR1, antagonista NK-2 da taquicinina, ou por antagonista CGRP (MINOWA et al., 2004). Estes estudos sugerem que as fibras vagais aferentes podem estar envolvidas na transmisso do estmulo doloroso, e talvez em todo o estmulo fisiolgico do estmago para o sistema nervoso central (SCHICHO et al., 2003; DANZER et al., 2004). O sistema nervoso central interpreta estes sinais e transmite a informao eferente pelo nervo vago, que possui um gradiente de inervao decrescente: a influencia vagal mxima no estmago e no duodeno proximal, diminuindo na poro mediana e final do intestino (Revisado por SCHUBERT, 2003).

1.3.3.2 Mecanismos Perifricos

1.3.3.2a Estimulantes da Secreo cida

Gastrina: A gastrina e a colicistocinina (CCK) possuem a seqncia

pentapeptdica carboxi-terminal idnticas. Existem duas classes de receptores para gastrina/CCK caracterizadas: CCK-1 (ou CCK-A) e o CCK-2 (ou CCK-B). Os receptores CCK-1 so especficos para CCK, enquanto os receptores CCK-2 reconhecem tanto a CCK quanto a gastrina (Figura 1.2) (Revisado por SCHUBERT, 2004). A gastrina o principal mediador da secreo cida estimulada por alimento. Sua estimulao ocorre diretamente via receptores CCK-2 na clula parietal e, principalmente, indiretamente pelos receptores CCK-2 nas clulas ECL (Figura 1.2). As clulas ECL liberam histamina que estimulam a secreo cida ativando os receptores H-2 presentes nas clulas parietais (Revisado por SCHUBERT, 2004). Durante o jejum, ocorre uma via de feedback envolvendo a secreo de somatostatina para atenuar a secreo cida. O cido luminal estimula a secreo de somatostatina antral que, por sua vez, inibe a secreo de gastrina. Quando a secreo de cido reduzida por drogas ou pela gastrite atrfica, a secreo de somatostatina diminuda, e consequentemente a secreo de gastrina estimulada, resultando na hipergastrinemia (Revisado por SCHUBERT, 2004).

Figura 1.2: Modelo ilustrando a regulao da secreo cida gstrica hormonal e parcrina, esclarecendo as funes dos receptores de colicistocinina (CCK-1 e CCK-2). A gastrina estimula a secreo cida gstrica diretamente na clula parietal via receptores CCK-2 e, indiretamente pela ligao aos receptores CCK-2 nas clulas ECL, estimulando a secreo de histamina. A colicistocinina (CCK), liberada de clulas duodenais em resposta aos nutrientes da dieta, interage tanto com o receptor CCK-1 nas clulas D antrais e oxnticas para a liberao de somatostatina, como com o receptor CCK-2 das clulas ECL e parietais. O efeito da ativao do receptor CCK-1 predomina. Assim, o efeito da colicistocinina, fisiologicamente, a inibio da secreo cida. (H2 receptor H de histamina; SST2 receptor de 2 somatostatina do tipo 2; CCK colicistocinina; CCK-1 receptor de colicistocinina do tipo 1; CCK-2 receptor de colicistocinina do tipo 2) (Figura adaptada de SCHUBERT, 2004).

Aps a alimentao, nutrientes da dieta estimulam clulas duodenais a liberar CCK, que interagem com receptores CCK-1 presentes nas clulas D da mucosa antral e oxntica e com receptores CCK-2 presentes nas clulas ECL e parietal. O efeito da ativao do receptor CCK-1 predomina. Assim, o efeito da colicistocinina, fisiologicamente, a inibio da secreo cida (Figura 1.2) (Revisado por SCHUBERT, 2004).

Histamina: No estmago, a histamina estocada em maior

quantidade nas clulas ECL localizadas na terceira poro inferior da glndula oxntica (PRINZ et al., 2003). armazenada em vesculas secretoras, sendo liberada aps estimulao por gastrina, pelo fator de transformao do crescimento-alfa (TGF- ), pelo peptdeo intestinal vasoativo, e pelo peptdeo ativador da adenilato ciclase pituitria (PACAP) (ZHAO et al., 2003; ZHAO et al., 2004). A gastrina liga-se ao receptor CCK-2 da clula ECL promovendo um aumento de Ca+2 intracelular. O aumento de Ca+2 promove a exocitose e a histamina liberada. O TGFliga-se no receptor do fator de crescimento nas

clulas ECL, e o peptdeo ativador da adenilato ciclase pituitria (membro da famlia do peptdeo intestinal vasoativo) est presente nos neurnios da mucosa gstrica e liga-se no receptor PAC1 nas clulas ECL. A gastrina, o TGFe o

peptdeo ativador da adenilato ciclase pituitria estimulam a transcrio e a atividade da histidina descarboxilase (enzima que sintetiza a histamina) (KAZUMORI et al., 2004; McLAUGHLIN et al., 2004). A histamina liberada se difunde para as clulas parietais vizinhas e estimula a secreo de cido pela ligao com os receptores H-2 expressos na superfcie da clula parietal (Revisado por SCHUBERT, 2004).

Acetilcolina: A acetilcolina (ACh), liberada dos neurnios ps-

ganglionares do sistema nervoso entrico, estimula diretamente a secreo de cido atravs da ativao dos receptores M-3 nas clulas parietais. HIRSCHOWITZ (1983) demonstrou que receptores do tipo M1 presentes nas clulas do tipo enterocromafins (ECL), quando bloqueados por antagonista especifico M1, inibem a liberao de histamina, reduzindo a secreo cida gstrica. Grelina: A grelina extensamente expressa em clulas da mucosa

oxntica. Em humanos, a infuso de grelina aumenta o apetite, o consumo de alimentos e a secreo cida gstrica. Ela liberada durante o jejum e inibida pela administrao intragstrica de protenas, carboidratos ou lipdeos, pela CCK, pela somatostatina, e pela infeco de Helicobacter pylori (MURRAY et al., 2003; HOLST et al., 2004; SHIMADA et al., 2003; GOMEZ et al., 2004; SUZUKI et al., 2004; NWOKOLO et al., 2003). 1.3.3.2b Inibidores da Secreo cida

Somatostatina: A somatostatina, presente nas clulas D da mucosa

antral e oxntica, inibe a secreo cida por atuar diretamente nas clulas parietais e indiretamente por inibir a secreo de histamina (das clulas ECL) e a secreo de gastrina (das clulas G). As aes da somatostatina so mediadas via 5 subtipos de receptores acoplados protena G, conhecidos como SSTR1 a SSTR5. Estudos farmacolgicos e moleculares, incluindo estudos com

camundongos SSTR2 knockout, sugerem que o SSTR2 o receptor que est mais envolvido com a regulao da secreo cida gstrica. Embora a secreo cida gstrica nos camundongos knockout seja 10 vezes mais elevada que a secreo cida dos camundongos selvagens, no h nenhuma alterao nos nveis circulantes de gastrina, sugerindo que a inibio da gastrina pela somatostatina pode no envolver o receptor SSTR2 (Revisado por SAMUELSON et al., 2003). Alm disso, foram identificados receptores SSTR2 em clulas parietais e ECL, mas no nas clulas de gastrina (ALLEN et al., 2002).

Peptdeo relacionado ao gene de calcitonina/adrenomedulina: O

peptdeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP) pertence a uma famlia de neuropeptdeos que incluem a calcitonina, a adrenomedulina e a amilina. No estmago, a adrenomedulina est presente nas clulas ECL e o CGRP nos neurnios sensoriais extrnsecos. Seus receptores j foram identificados em clulas D nas glndulas da mucosa antral e oxntica (HAGNER et al., 2002; KAWASHIMA et al., 2002). Ambos CGRP e adrenomedulina estimulam a secreo gstrica de somatostatina e inibem a secreo de histamina, inibindo a secreo cida gstrica (HIRSCH et al., 2003). A amilina est co-localizada com a somatostatina nas clulas endcrinas do fundo gstrico. Em estmagos de ratos e camundongos, a amilina liberada das clulas D, por via autcrina, interage com receptores de amilina, aumentando a secreo de somatostatina, que consequentemente inibe a secreo de histamina e cido gstrico (ZAKI et al., 2002).

Prostaglandinas: As prostaglandinas ( Gs) inibem a secreo de P

cido por ao direta na clula parietal ou indiretamente pela inibio da liberao de gastrina (PRINZ et al., 1992). Nas clulas parietais, as PGs modulam a

secreo cida por inibir o aumento de AMPc induzido por histamina (Revisado por ATAY et al., 2000).

1.3.3.2c Papel do xido Ntrico na Secreo cida Gstrica

Vrios estudos com informaes contraditrias tm demonstrado que o NO tambm interfere na secreo gstrica de cido. Estudos in vitro tm demonstrado que o NO estimula a secreo cida gstrica em camundongos (HASEBE et al., 1998; HASEBE et al., 2001) e em ces (BILSKI et al., 1994). No entanto, outros pesquisadores demonstraram que o NO inibe a secreo cida gstrica em ratos (BROWN et al., 1993; KATO et al., 1998) e em glndulas gstricas isoladas de coelhos (KIM e KIM, 1996). Estudos em humanos indicaram que o NO pode tanto reduzir quanto aumentar o pH intragstrico (HIRSCH et al., 2000; KONTUREK et al., 1999). BROWN et al. (1993) demonstrou, em clulas parietais isoladas de rato, que altas doses de um doador de NO inibe a secreo cida gstrica induzida por histamina, sugerindo que o NO atua diretamente na clula parietal. KATO et al. (1998) demonstrou que a administrao intragstrica de doadores de NO inibe a secreo cida induzida por pentagastrina e inibe a liberao luminal de histamina em ratos anestesiados. O autor sugere que a inibio da secreo cida por NO ocorre pela reduo da liberao de histamina pelas clulas do tipo enterocromafins (ECL). Outros estudos demonstram que doadores de NO, em altas doses, inibem a secreo cida induzida por histamina, por betanecol e por estimulao vagal em estmagos isolados de camundongo. Entretanto, estes mesmos autores observaram um aumento da secreo cida gstrica e um aumento da liberao de histamina quando utilizaram baixas doses do doador de NO (HASEBE et al., 2001; HASEBE et al., 2003). Segundo HASEBE et al. (2003), esta discrepncia do NO em inibir ou estimular a secreo cida gstrica pode ser explicada pela hiptese que a concentrao de NO quem determina se vai ocorrer uma estimulao ou inibio. Foi assumido que baixas concentraes de NO possuem um efeito estimulatrio no contedo celular de histamina, aumentando a secreo cida gstrica, enquanto

uma alta concentrao de NO teria um efeito inibitrio nas clulas parietais, inibindo a secreo cida gstrica.

1.3.3.3 Mecanismos Intracelulares

A interao com os receptores M-3 na clula parietal ativa canais de clcio operados por receptores, produzindo um influxo de clcio. Alm disso, os receptores M-3 e CCK-2 presentes na membrana da clula parietal esto acoplados a fosfolipases que catalisam a quebra dos fosfolipdeos de membrana, formando o inositol trifosfato (IP 3) e o diacilglicerol (DAG). O IP 3 mobiliza o clcio intra e extracelular, elevando sua concentrao em at 10000 vezes. O clcio pode se ligar a calmodulina, formando o complexo clcio-calmodulina (CaM), que ativa as protenas quinases clcio dependentes (PCK). O DAG permanece fixo membrana plasmtica e atua como cofator, junto com o clcio, na ativao da PKC (CHEW, 1987; WILKES et al., 1991). O receptor H-2 presente na clula parietal acoplado ao sistema adenilato ciclase via protena G. A adenilato ciclase estimulada converte a adenosina trifosfato (ATP) em adenosina monofosfato cclico (AMPc). O AMPc formado ativa as protenas quinases dependentes de AMPc (PKA). A estimulao da clula parietal pela histamina tambm produz um aumento de clcio intracelular transitrio, podendo esclarecer porque os antagonistas de receptor H-2 podem inibir parcialmente a secreo cida estimulada por agentes colinrgicos (CHEW, 1987; UEDA e OKADA, 1989; LEWIN e BADO, 1991). A ativao da PKC pelas vias colinrgicas (M-3) e endcrina (CCK-2) ou a ativao da PKA pela via histaminrgica (H-2) faz com que protenas fosforilem as protenas responsveis pela ativao da bomba H+ /K+ ATPase (WILKES et al., 1991). H+,K +-ATPase: H+,K+-ATPase

uma

bomba

de

prtons

responsvel pela secreo cida gstrica. A subunidade

, responsvel pela troca

de H+ por K + custa de ATP, possui 10 segmentos transmembrana. A subunidade uma glicoprotena com sua maior parte no espao extracelular. Esta subunidade contm oligossacardeos, 6 resduos de cistena com 3 pontes

dissulfeto, e dobras proticas intrnsecas que so essenciais para a estabilidade estrutural e funcional da H+ ,K+-ATPase (THANGARAJAH et al.; 2002). As H+ ,K+ATPase so estocadas em tubulovesculas citoplasmticas nas clulas parietais. Quando ocorre um estmulo, as tubulovesculas se fundem com a membrana apical e a H+ ,K+-ATPase se torna ativa para secretar o cido. Quando o estmulo cessado, as bombas so recicladas e voltam para o compartimento citoplasmtico. Os inibidores da bomba de prtons produzem seu efeito por ligar-se apenas nas bombas inseridas na membrana apical (Revisado por SCHUBERT, 2003, SCHUBERT, 2004).

1.4 J USTIFICATIVA DO ESTUDO

As lceras ppticas afetam um nmero considervel de pessoas no mundo. As leses na mucosa gstrica ocorrem quando existe um desequilbrio entre os fatores agressores (como a secreo cida gstrica) e os fatores protetores da mucosa gstrica (como as sulfidrilas endgenas, as prostaglandinas e o xido ntrico) (GLAVIN e SZABO, 1992; WALLACE e GRANGER, 1996). As drogas disponveis atualmente para o tratamento das lceras ppticas desempenham seu efeito por reduzir fatores agressivos da mucosa gstrica (como os anticidos e inibidores da secreo cida gstrica) ou por estimular fatores defensivos (como o anlogo de prostaglandina). As plantas podem fornecer compostos capazes tanto de reduzir fatores agressivos como aumentar a resistncia da mucosa gstrica simultaneamente (em sinergismo), possibilitando o tratamento das ulceraes gstricas com maior eficcia (BORRELI e IZZO, 2000). Alm disso, os produtos naturais tambm podem contribuir para a teraputica dos distrbios gstricos, atravs de tratamentos mais acessveis, atendendo uma grande parcela da populao brasileira (70-80%) que no tem poder aquisitivo suficiente para participar do mercado consumidor (FERREIRA et al., 1998).

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Estudar vias envolvidas no mecanismo de ao do extrato hidroalcolico das razes de Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen responsveis por seu efeito protetor gstrico e os princpios ativos responsveis por estas aes, atravs de um fracionamento biomonitorado.

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

1. Identificar a proporo de etanol (50, 70 ou 90%) ideal para a obteno de extratos das razes da Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen com maior concentrao de princpios ativos capazes de proteger a mucosa gstrica contra leses agudas induzidas por etanol.

2. Escolher um dos modelos de leses induzidas agudamente (por etanol, por indometacina ou por estresse) para monitorar o fracionamento do extrato hidroalcolico das razes da Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen.

3. Identificar a frao mais efetiva do extrato hidroalcolico das razes da Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen (fracionamento biomonitorado) capaz de proteger a mucosa gstrica.

4. Identificar vias envolvidas (alvos subcelulares) na ao protetora gstrica da frao ativa obtida atravs do fracionamento biomonitorado.

5. Identificar a proporo de etanol (50, 70 ou 90%) ideal para a obteno de extratos das razes da Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen com maior concentrao de princpios ativos capazes de inibir a secreo cida gstrica.

6. Identificar a frao mais efetiva do extrato hidroalcolico das razes da Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen (fracionamento biomonitorado) capaz de inibir a secreo cida gstrica.

7. Identificar vias envolvidas na ao anti-secretora cida da frao ativa obtida atravs do fracionamento biomonitorado.

8. Avaliar a participao da via colinrgica na atividade gastroprotetora do extrato hidroalcolico das razes da Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen atravs da alterao na motilidade gastrointestinal.

9. Identificar os princpios ativos presentes nas fraes ativas.

3 MATERIAL E MTODOS

3.1 MATERIAL

3.1.1 M ATERIAL BOTNICO

O p das razes da P. glomerata (Spreng) Pedersen foi fornecida pelo Engenheiro Agrnomo Cirino Corra Jnior (CREA 5729-0 7 a Regio) - EMATER. A P. glomerata foi coletada nas ilhas e margens do Rio Paran, do municpio de Querncia do Norte - PR, em 1998, 2000 e 2001. As razes foram divididas em tamanhos menores, submetidas secagem em estufa com circulao de ar aquecido e posteriormente trituradas em moinho. Um exemplar desta espcie est depositado no Herbrio do Departamento de Botnica da Universidade Federal do Paran, sob registro UPCB n 38.609.

3.1.2 ANIMAIS

Foram utilizados camundongos (Mus musculus, variedade Swiss) adultos, machos e fmeas, com peso variando entre 15 a 30g; ratos (Ratus norvegicus, variedade Wistar) adultos, fmeas, com peso variando entre 150 a 300g; e coelho (Oryctolagus cuniculus) albino adulto, macho, com peso variando de 1 a 2 kg. Os animais foram fornecidos pelo Biotrio da Universidade Federal do Paran (UFPR), onde foram mantidos sob ciclo de 12 h claro/escuro, com acesso gua e rao ad libitum ; em alguns experimentos foi necessrio jejum de 6 a 15 horas. Todos os protocolos experimentais utilizando animais foram aprovados pelo Comit Institucional de tica da Universidade Federal do Paran (nmero 0.105).

3.1.3 D ROGAS , R EAGENTES , SOLVENTES E SAIS

Foram utilizados: acetato de sdio cristalizado, cido clordrico fumegante, cido sulfrico, bicarbonato de sdio, cloreto de sdio, fosfato de potssio (Merck do Brasil, Rio de Janeiro, Brasil), albumina bovina, adenosina 5-trifosfato (ATP), alcian blue, atropina, -naftil-etilenodiamida, -nicotinamida adenina dinucleotdeo

fosfato (NADPH) forma reduzida, betanecol, cimetidina, citocromo C, 1-cloro 2,4 dinitrobenzeno (CDNB), coquetel inibidor de ATPase, cido 5,5-ditio-bis(2nitrobenzico) (DTNB), cido etilenoglicoltetractico (EGTA), glutationa forma reduzida, histamina, indometacina, menadiona, molibdato de amnio, nitrato de sdio, nitrito de sdio, nitro-L-arginina metil ster (L-NAME), omeprazol, ouabana, pentagastrina, sulfanilamida, trizma base, trizma sal (Sigma, Saint Louis, EUA), cido actico glacial, cido L-ascrbico, carbonato de sdio anidro, sacarose (Synth, Diadema, Brasil), cloridrato de ranitidina (Unio Qumica, Embu-Guau, Brasil), lcool metlico (Ecibra, Santo Amaro, Brasil), lcool etlico P.A 95 %, cido tricloroactico P.A., hidrxido de sdio, vermelho de fenol, triton X-100 ( Vetec, Duque de Caxias, Brasil), cido etilenodiaminotetractico (EDTA) (Reagen, Rio de Janeiro, Brasil), carbonato de sdio, carvo ativado, cloreto de magnsio, cloreto de potssio (Carlo Erba, Rodano, Itlia), fenolftalena ( armanilQuima, Curitiba, F Brasil), ter etlico P.A sulfato de Zinco (biotec, So Jos dos Pinhais, Brasil).

3.1.4 E QUIPAMENTOS

Foram utilizados: agitador de tubos (AP56 Phoenix), agitador de ependorfes (Marconi), agitador magntico ( isatom), balanas analticas (AL500 F Marte, AS200 Ohaus, AC210S Sartorius), balana eletrnica (FX-6000 A&D); centrfuga refrigerada ( hrist), concentradores rotatrios (Centrivap 78100-00 e C SK5684 Eberle), dispensador (Boeco), espectrofotmetro (Ultrospec 2000

Pharmacia Biotech), estereoscpio \(SZ40 Olympus), homogeneizador (MA 102 Marconi), estufa (Odontobras), leitor de placas (Tecsan), pHmetro digital (PG2000 Gehaka), pipetas automticas (Eppendorf), titulador automtico (Hirschmann Laborgate), ultra-som (Unique), ultra-centrfuga (HITACHI Himac CP90B).

3.2 MTODOS

3.2.1 MTODOS FITOQUMICOS

Os extratos e fraes das razes da P. glomerata (Spreng) Pedersen inicialmente foram processados e fornecidos pela aluna Vanessa Nitta no laboratrio de Farmacognosia do Departamento de Farmcia da Universidade Federal do Paran, sob orientao do Profo. Dro . Cid Aimbir de Moraes Santos. Para a identificao das vias envolvidas no mecanismo de ao do efeito da P. glomerata foi necessrio refazermos, com orientao do Profo . Dro. Cid Aimbir de Moraes Santos, os extratos e a purificao (devido perda de atividade).

3.2.1.1 Preparao dos Extratos Brutos Hidroalcolicos

Os constituintes das razes da P. glomerata foram extrados por turblise e, com o objetivo de extrair a maior quantidade possvel de constituintes de diferentes polaridades, foram utilizadas solues hidroalcolicas com diferentes

concentraes de etanol (50, 70 e 90%), obtendo-se trs extratos denominados de EHaP50, EHaP70 e EHaP90.

3.2.1.2 Fracionamento de EHaP50

Partio 1 - Fracionamento de EHaP50: O EHaP50 foi solubilizado

em gua e particionado em funil de separao com acetato de etila. A fase aquosa foi novamente particionada com n-butanol, originando trs fraes com polaridades crescentes: Frao Acetato de etila (FAE(50)), Frao Butanlica (FBut(50)) e Frao Aquosa (FAq(50)) (Figura 3.1).

Partio 2 - Fracionamento A da FBut(50): A FBut(50) foi

solubilizada em metanol, onde foi gotejado ter etlico, obtendo-se um precipitado (FPB(50) ) e sobrenadante (FSB(50)) (Figura 3.1).

Partio 3 - Fracionamento B da FBut(50): A FBut(50) foi

ressuspendida em gua e particionada com clorofrmio em funil de separao, formando 3 fases (fraes): frao clorofrmica (FCB(50)), frao emulso (FEB(50)) e frao aquosa (FAqB(50)) (Figura 3.1). A emulso se formou entre a fase clorofrmica e a fase aquosa, permanecendo estvel aps centrifugao.

Extrato Hidroalcolico (50%) de P. glomerata (EHaP50)

Partio com AcEt

Partio 1 Partio 2 Partio 3 Purificao 4

Frao Acetato de etila (FAE )

Frao Aquosa
Partio com n-Butanol

Frao Butanlica (FBut(50))

Partio com clorofrmio

Frao Aquosa (FAq(50))

Precipitao com ter

Frao Clorofrmica (FCB(50))

Frao Emulso (FEB(50))

Frao Aquosa (FAqB(50) )

Frao Precipitado (FPB(50))

Frao Sobrenadante (FSB(50))

Coluna cromatogrfica Eluio com ciclohexanoclorofrmio (7:3) Eluio com ciclohexanoclorofrmio (1:1) Eluio com clorofrmio Eluio com metanol Eluio com metanolgua (1:1)

(FEB1(50))

(FEB2(50))

(FEB3(50))

(FEB4(50))

(FEB5(50))

Figura 3.1: Fracionamento Biomonitorado do Extrato Hidroalcolico (50%) das Razes de Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen (EHaP50). Os extratos e fraes das razes da Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen foram processados e fornecidos pelo Laboratrio de Farmacognosia do Departamento de Farmcia da Universidade Federal do Paran, sob orientao do Prof o. Dro. Cid Aimbir de Moraes Santos.

Purificao 4 - Fracionamento da FEB(50): A FEB(50) foi eluda em

coluna cromatogrfica, utilizando 5 solventes com polaridade crescente como fase mvel: ciclohexano:clorofrmio (7:3), ciclohexano:clorofrmio (1:1), clorofrmio, metanol e metanol:gua (1:1); obtendo-se 4 fraes denominadas FEB1, 2, 3 e, 4(50) (Figura 3.1).

3.2.1.3 Fracionamento de EHaP70

Partio 1 - Fracionamento de EHaP70: O EHaP70 foi

solubilizado em gua e particionado em funil de separao com acetato de etila, originando as fraes: Acetato de etila (FAE(70)) e Emulso (FE(70)). A fase aquosa foi novamente particionada com n-butanol, originando as fraes: Butanlica (FBut(70)) e Aquosa (FAq(70)) (Figura 3.2).

Extrato Hidroalcolico (50%) de P. glomerata (EHaP50)

Partio com AcEt

Partio 1

Frao Acetato de etila (FAE )

Frao Aquosa
Partio com n-Butanol

Frao Emulso (FE )

Frao Butanlica (FBut(70))

Frao Aquosa (FAq(70))

Figura 3.2: Fracionamento Biomonitorado do Extrato Hidroalcolico (70%) das Razes de Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen (EHaP70). Os extratos e fraes das razes da Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen foram processados e fornecidos pelo Laboratrio de Farmacognosia do Departamento de Farmcia da Universidade Federal do Paran, sob orientao do Prof o. Dro. Cid Aimbir de Moraes Santos.

3.2.1.4 Determinao do Peso Seco e do Rendimento dos Extratos e das Fraes

Alquotas de 200 L dos extratos foram transferidas para 6 bqueres previamente marcados, secos e pesados. O contedo foi evaporado durante 6 horas em estufa, sob ar quente. Os bqueres foram novamente pesados, com o auxlio de uma pina, e ento levados para evaporao durante mais 1 hora. Aps no mais existir variao de peso entre a ltima e penltima pesagem dos bqueres (com intervalos de evaporao de 1 hora), foi determinada a quantidade de resduo seco em cada amostra possibilitando o clculo da quantidade de resduo seco contido em 1 mL. O rendimento dos extratos e das fraes foram calculadas como percentual do peso do extrato ou da frao obtida em relao ao peso do extrato ou frao de origem.

3.2.1.5 Anlises Qumicas da FBut(50) e da FE(70)

As fraes FBut(50) e FE(70) foram analisadas, pela Dra. Luce Maria Brando Torres, por ressonncia magntica nuclear de hidrognio (1H-RMN) e por Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE). Os espectros de 1H-RMN foram obtidos a 500 MHz em espectrofotmetro Brucker (DRX-500), na Central Analtica da Universidade de So Paulo. As amostras foram dissolvidas em gua deuterada (D 2O) e foram analisadas com supresso do solvente. As reas relativas das absorbncias dos picos representam o nmero de hidrognio obtido por integrao eletrnica e suas multiplicidades aparecem como sinal simples, sinal duplo e sinal mltiplo. Os espectros no foram integrados porque foi feito com supresso, que dificulta a integrao. Os cromatogramas por CLAE foram obtidos em dois sistemas: (1) Varian (Pro Star modelo 310) da Seo de Fisiologia do Instituto de Botnica da Secretaria do Meio Ambiente de So Paulo, utilizando um sistema isocrtico MeOH:H2 O 50:50, coluna (RP-C-18 90A) de tamanho 150mn x 4,60 mm ( arianC-307657), V com fluxo constante de 1,0 ml/min, operando a 210 nm; (2) Dionex, Chromeleon, DAD (diode array detector) da Seo de Ficologia do Instituto de Botnica da

Secretaria do Meio Ambiente de So Paulo, utilizando um sistema isocrtico H2O 0,1 % de TFA:ACN0 e 1 % de TFA (50:50), com fluxo constante de 1 ml/min, em coluna RP C-18.

3.2.2 MTODOS FARMACOLGICOS

3.2.2.1 Tratamentos

A) Avaliao da atividade Gastroprotetora: Grupos de animais (n = 6) foram tratados, pela via oral, com o EHaP50, o EHaP70 e o EHaP90 na dose de 500 mg/kg (esta dose foi escolhida com base nos resultados obtidos anteriormente (OTOFUJI et al., 2003)). Foi utilizado a ranitidina (60 mg/kg) como controle positivo.

B) Determinao da potncia (DE50) do EHaP50 nos Diferentes Modelos de Leses Gstricas: Grupos de animais (n = 6) foram tratados, pela via oral, com as doses de 125, 200 e 500 mg/kg de EHaP50 no modelo de leso por etanol; e com doses de 250, 500 e 1000 mg/kg de EHaP50 nos modelos de leso por indometacina e estresse. Foi utilizado a ranitidina (60 mg/kg) como controle positivo.

C) Biomonitoramento do EHaP50 em leses gstricas induzidas por etanol - Fraes do EHaP50: Grupos de animais (n = 6) foram tratados, pela via oral, com as doses de 2,6; 30 e 100 mg/kg de FAE(50); doses de 13, 30 e 100 mg/kg de FBut (50); e doses de 30 e 100 mg/kg de FAq(50) (doses iguais ou maiores que a DE80 terica). Foi utilizado o EHaP50 (500 mg/kg DE80 real) como controle positivo. - Fraes (A) da FBut(50): Grupos de animais (n = 6) foram tratados, pela via oral, com as doses de 5 mg/kg de FPB(50) e 20 mg/kg de FSB(50) (doses prximas a DE80 terica). Foi utilizado a FBut (25 mg/kg DE80 real) como controle positivo. - Fraes (B) da FBut(50): Grupos de animais (n = 6) foram tratados, pela via oral, com as doses de 1 e 3 mg/kg de FCB(50) e de FEB(50) e doses de 6 e 15 mg/kg

de FAqB(50) (doses prximas a DE80 terica). Foi utilizado a FBut (25 mg/kg DE80 real) como controle positivo. - Fraes da FEB(50): Grupos de animais (n = 6) foram tratados, pela via oral, com as doses de 1,95; 1,35; 1,2; e 0,4 mg/kg de FEB1(50), FEB2(50), FEB3 (50) , FEB4(50), respectivamente (doses prximas a DE80 terica). Foi utilizado a FBut (25 mg/kg DE80 real) como controle positivo. D) Estudo do Mecanismo de Ao Gastroprotetor de EHaP50 e FBut(50): Grupos de animais (n = 6) foram tratados, pela via oral, com as doses de 100, 300 e 1000 mg/kg de EHaP50; e doses de 10 e 100 mg/kg de FBut(50). E) Avaliao da Atividade Anti-secretora cida: Grupos de animais (n = 6) foram tratados, pela via intraduodenal, com o EHaP50, o EHaP70 e o EHaP90 em doses iguais (500 mg/kg). Foi utilizado a ranitidina (60 mg/kg) como controle positivo.

F) Determinao da potncia (DE50) do EHaP70 na Atividade Antisecretora cida: Grupos de animais (n = 6) foram tratados, pela via intraduodenal, com as doses de 100, 300 e 1000 mg/kg do EHaP70. Foi utilizado a ranitidina (60 mg/kg) como controle positivo.

G) Estudo do Mecanismo de Ao Anti-secretor de cido de EHaP70 - Estudo do EHaP70 sobre a Secreo cida Estimulada por Histamina, Petagastrina e Betanecol: Grupos de animais (n = 6) foram tratados, pela via intraduodenal, com as doses de 100, 300, e 1000 mg/kg de EHaP70. A secreo cida gstrica foi estimulada, 1 h aps o tratamento, com histamina (20 mg/kg sc.) ou betanecol (2,5 mg/kg sc.) ou pentagastrina (0,4 mg/kg sc.). Como controles positivos foram utilizados a ranitidina (60 mg/kg id.) ou a atropina (3,0 mg/kg sc).

H) Atividade das Fraes do EHaP70: Grupos de animais (n = 6) foram tratados, pela via intraduodenal, com a dose de 4 mg/kg de FAE(70); dose de 30 mg/kg de FBut(70); dose de 325 mg/kg de FAq(70); e dose de 45 mg/kg de FE(70)

(doses iguais ou maiores que a DE80 terica). Foi utilizado o EHaP70 (760 mg/kg DE80 real) como controle positivo. I) Determinao da potncia (DE50) da FE(70) na atividade anti-secretora cida gstrica: Grupos de animais (n = 6) foram tratados, pela via intraduodenal, com as doses de 45, 300, e 500 mg/kg de FE(70). Foi utilizado a ranitidina (60 mg/kg) como controle positivo.

J) Estudo do mecanismo de ao anti-secretor de cido de FE(70) in vitro: Foram utilizadas as concentraes de 10 a 1000 g/ml de FE(70).

L) Estudo do Mecanismo de Ao Anti-secretor de cido da FE(70) in vivo: Grupos de animais (n = 6) foram tratados com FE(70), pela via intraduodenal, com a dose de 100 mg/kg (dose correspondente a DE80). M) Efeito de EHaP70 sobre os Nveis de NO Gstricos: Grupos de animais (n = 6) foram tratados com L-NAME (120 mg/kg v.o.) ou com indometacina (10 mg/kg sc.). Aps 30 min foram tratados com EHaP70 (760 mg/kg id. DE80). N) Avaliao da Motilidade Gastrintestinal: Grupos de animais (n = 6) foram tratados, pela via oral, com a dose de 1000 mg/kg, dose prxima a DE80 do EHaP50 no modelo de leses gstricas induzidas por etanol e prxima a DE80 do EHaP70 no modelo de hipersecreo cida gstrica por ligadura pilrica. No modelo de induo de diarria por leo de rcino, foi utilizado a loperamida como controle positivo (5 mg/kg v.o.).

3.2.2.1.1 Clculo da DE80 real e terica

Para biomonitorar o fracionamento foi utilizado como controle positivo o extrato ou a frao que originou as fraes a serem testadas. Nestes experimentos, para garantir que o efeito seria visualizado, o controle positivo foi testado na DE80 real (calculada a partir da DE50 real, como exemplificado abaixo).

Ex.: Clculo para obteno da DE80 real do EHaP50 em proteger a mucosa gstrica contra as leses induzidas por etanol 70 %.

314 mg/kg do EHaP50 (DE50 real) ------- 50 % de gastroproteo X (DE80 real) ------- 80 % de gastroproteo x (DE80 real) = 502 mg/kg do EHaP50

As doses utilizadas das fraes do EHaP50, bem como todas as fraes utilizadas neste estudo, correspondem s doses prximas DE80 terica. As DE80 tericas foram calculadas considerando a DE80 real do extrato ou frao de origem e o rendimento de cada frao em relao ao extrato ou frao de origem, como demonstrado abaixo:
500 mg/kg do EHaP50 (DE80) x (DE80 terica da FBut(50)) ------------100 % do EHaP50 2,66 % do EHaP50 (rendimento da FBut(50))

x (DE80 terica da FBut(50)) = 13,3 mg/kg

3.2.2.2 Avaliao e Biomonitoramento da Atividade Gastroprotetora

3.2.2.2.1 Leses Gstricas Induzidas por Etanol

Ratos, aps jejum de 15 horas (com acesso gua ad libitum), foram divididos em grupos e foram tratados. Aps 1 hora do tratamento, as leses gstricas foram induzidas pela administrao de etanol 70 % (2,5 ml/kg) pela via oral. Uma hora aps a administrao do etanol, os animais foram sacrificados atravs de deslocamento cervical, os estmagos foram removidos e abertos ao longo da curvatura menor. A mucosa foi lavada com gua destilada fria e esticada para inspeo das leses gstricas, sobre placa de gelo (ROBERT et al, 1979). A quantificao das leses gstricas foi realizada como indicado no item 3.2.2.2.4. Em alguns experimentos, aps a quantificao das leses, os estmagos foram guardados a -70 C, para posterior determinao da atividade de algumas enzimas antioxidantes nas fraes subcelulares gstricas.

3.2.2.2.2 Leses Gstricas Induzidas por Indometacina

Ratos, aps jejum de 15 horas (com acesso gua ad libitum ), foram divididos em grupos e foram tratados. Aps 1 hora do tratamento, as leses gstricas foram induzidas com a injeo de indometacina (20 mg/kg) pela via subcutnea. Seis horas aps a administrao do antiinflamatrio, os animais foram sacrificados atravs de deslocamento cervical, os estmagos foram removidos e abertos ao longo da curvatura menor. A mucosa foi lavada com gua destilada e esticada para inspeo das leses gstricas (DJAHANGURI, 1969). A

quantificao das leses gstricas foi realizada como indicado no item 3.2.2.2.4.

3.2.2.2.3 Leses Gstricas Induzidas por Estresse

Ratos, aps jejum de 15 horas (com acesso gua ad libitum ), foram divididos em grupos e foram tratados. Aps 1 hora do tratamento, os animais foram superficialmente anestesiados com ter e imobilizados em contensores apropriados. Os contensores foram colocados em cmara fria temperatura de 4OC durante 3 horas. Aps este perodo, os animais foram sacrificados atravs de deslocamento cervical, os estmagos foram

removidos e abertos ao longo da curvatura menor. A mucosa foi lavada com gua destilada e esticada para inspeo das leses gstricas (SENAY e LEVINE, 1967). A quantificao das leses gstricas foi realizada como indicado no item 3.2.2.2.4.

3.2.2.2.4 Avaliao das Leses Gstricas

A quantificao das leses gstricas foi realizada com auxlio de uma lupa, e os resultados foram expressos como ndice de leses, ndice de lceras, e ndice total de leses, conforme a padronizao de MESIA (1998): ndice de leses: Foram avaliados alguns parmetros na mucosa gstrica e a intensidade com que eles ocorrem: leve (1 ponto), moderado (2 pontos) ou intenso (3 pontos). Os parmetros avaliados na mucosa gstrica para a obteno do ndice de leses compreendem: a perda de pregas, a descolorao da mucosa

ou hiperemia, a presena de edema, a presena de petquias, o grau de hemorragia, e a perda da camada de muco. O ndice de leses corresponde ao somatrio da intensidade desses parmetros. ndice de lceras: Foi quantificado o nmero de leses menores que 1 mm; e o comprimento (em milmetro) de leses maiores que 1 mm, que foi multiplicado por 1,5. O ndice de lceras corresponde ao somatrio desses valores. ndice Total: Corresponde ao somatrio do ndice de leses e do ndice de lceras.

3.2.2.3 Avaliao Temporal do Efeito Gastroprotetor do EHaP50 e Fraes no Modelo de Induo de Leses Gstricas Agudas por Etanol

O EHaP50, a FBut(50) e a FEB(50) foram armazenados a -20 C em frasco mbar por um perodo de 3 a 5 meses. Este extrato e estas fraes foram testas durante esse perodo no modelo experimental de leses induzidas por etanol, permitindo avaliar a atividade dos mesmos com o passar do tempo. O efeito do EHaP50 foi avaliado em setembro a dezembro de 2003; o efeito da FBut(50) em dezembro de 2003, fevereiro e maro de 2004; e o efeito da FEB(50) em maro e agosto de 2004.

3.2.2.4 Preparao das Fraes Subcelulares Gstricas para o Estudo do Mecanismo de Ao Gastroprotetor do EHaP50 e da FBut(50)

Aps a avaliao das leses gstricas nos modelos de leses agudas induzidas por etanol, as regies glandular (corpo e antro) e no-glandular (fundo) dos estmagos foram separadas, pesadas e homogeneizadas em tampo pH 7,5 (Tris 50 mM, KCl 1,15 %). Em uma parte do homogenato foram quantificados os nveis de glutationa (GSH) (item 3.2.2.4.3); e a outra parte foi centrifugada a 9000 x g durante 20 minutos a 4 C. O sobrenadante foi filtrado atravs de uma gaze e foi submetido ultracentrifugao (105 000 x g por 60 minutos a 4 C). Uma parte do sobrenadante

(citosol) do grupo controle no lesionado (CNL) foi congelado e guardado a -70 C para posterior caracterizao das enzimas NAD(P)H quinona oxidorredutase 1 (NQO1) (item 3.2.4.1) e glutationa S-transferase (GST) (item 3.2.2.4.2). A outra parte do sobrenadante do grupo CNL, assim como de todos os grupos foram congelados e guardados a -70 C para posterior anlise enzimtica da atividade das enzimas NQO1 e GST (item 3.2.2.4.4 e 3.2.2.4.5). O contedo protico do citosol foi quantificado pelo kit de anlise protica BCA - Pierce, em microplacas, por leitura espectrofotomtrica, utilizando a albumina como padro.

3.2.2.4.1

Caracterizao

da

atividade

da

NAD(P)H

quinona

oxidorredutase 1 (NQO1) na regio glandular gstrica

O mtodo para a determinao da atividade da NQO1 presente na mucosa gstrica foi realizado com base no mtodo de JAISWAL et al. (1988). A atividade especfica da NQO1 foi determinada pela reduo do citocromo C, na presena de citosol gstrico, menadiona e NADPH, por leitura espectrofotomtrica a 550 nm. As reaes foram realizadas em tampo fosfato de potssio 50 mM em pH 7,7; contendo Triton X-100 (0,04 %) a temperatura ambiente. Para a caracterizao da atividade da enzima NQO1 na regio glandular gstrica, foi realizada uma curva de atividade de NQO1 dependente de protena (1,8 a 15,0 g/ml), utilizando-se como substrato 10 M de menadiona, 0,5 mM de NADPH e 50 M de citocromo C. A atividade da NQO1 foi quantificada em intervalos de 10 s durante 2 min. Tambm foram realizadas curvas de atividade dependente de tempo (60 a 420 s) e dependente de NADPH (10 M a 1 mM). A atividade especfica da NQO1 foi expressa em nmoles/mg/min, utilizando o coeficiente de extino do citocromo C de 21/mM/cm.

3.2.2.4.2 Caracterizao da Atividade da Glutationa S-transferase (GST) na Regio Glandular Gstrica

O mtodo para a determinao da atividade da GST presente na mucosa gstrica foi realizado com base no mtodo de HABIG et al. (1974). A atividade especfica da GST foi determinada pela conjugao do CDNB com a glutationa reduzida (GSH), na presena de citosol gstrico, por leitura espectrofotomtrica a 340 nm. As reaes foram realizadas em tampo fosfato de potssio 100 mM em pH 6,5 a temperatura ambiente. Para a caracterizao da atividade da enzima GST na regio glandular gstrica, foi realizada uma curva de atividade dependente de protena (3,5 a 145 g/ml), utilizando-se como substrato 1 mM de glutationa reduzida (GSH) e 1 mM de CDNB. A atividade da GST foi quantificada em intervalos de 10 s durante 1min. Tambm foram realizadas curvas de atividade dependente de tempo (1 a 10 min), dependente de GSH (0,25 mM a 4,0 mM), e dependente de CDNB (0,25 mM a 5,0 mM). A atividade especfica da GST foi expressa em nmoles/mg/min, utilizando o coeficiente de extino da glutationa de 9,5/mM/cm.

3.2.2.4.3 Quantificao de Glutationa Reduzida (GSH) Gstrica

O mtodo para a determinao dos nveis de GSH presentes na mucosa gstrica foi realizado baseando-se no mtodo de SEDLAK & LINDSAY (1968). Alquotas de 200 l do homogenato da mucosa gstrica foram misturadas com 250 l de cido tricloroactico (ATC) 12 %, agitados por 10 min e centrifugados a 3000 x g durante 15 minutos. Alquotas de 10 l do sobrenadante foram adicionadas em 290 l de tampo TRIS 0,4 M (pH 8,9), e a reao foi iniciada com a adio de 5 l de 5,5-ditiobis (2-cido nitrobenzico) (DTNB) 0,01 M, 5 min antes da leitura espectrofotomtrica (412nm). Todos os procedimentos foram realizados a 4 C. Os valores individuais foram interpolados numa curva padro de GSH e expressos em g GSH/g tecido.

3.2.2.4.4 Quantificao da Atividade Enzimtica da NAD(P)H quinona oxidorredutase 1 (NQO1) Presente na Regio Glandular Gstrica

O mtodo para a determinao da atividade da NQO1 presente na mucosa gstrica foi realizado com base no mtodo de JAISWAL et al. (1988), como descrito no item 3.2.2.4.1. A quantificao da atividade especfica da NQO1 presente na mucosa gstrica de cada animal foi realizada em duplicata, por leitura espectrofotomtrica a 550 nm, utilizando 7 g/ml de protena citoslica, na presena de 250 M de NADPH. Os resultados foram expressos em nmoles/mg/min, utilizando o coeficiente de extino do citocromo C de 21/mM/cm.

3.2.2.4.5 Quantificao da atividade enzimtica da Glutationa Stransferase (GST) presente na regio glandular gstrica

O mtodo para a determinao da atividade da GST presente na mucosa gstrica foi realizado com base no mtodo de HABIG et al. (1974), como descrito no item 3.2.2.4.2. A quantificao da atividade especfica da GST presente na mucosa gstrica de cada animal foi realizada em duplicata, por leitura espectrofotomtrica a 340 nm, utilizando 10 g/ml de protena citoslica, na presena de 1 mM de GSH. Os resultados foram expressos em nmoles/mg/min, utilizando o coeficiente de extino glutationa de 9,5/mM/cm.

3.2.2.5 Avaliao da Atividade Anti-secretora cida Gstrica

3.2.2.5.1 Mtodos de Estudo In vivo: Ligadura Pilrica In situ

Ratos, aps jejum de 15 horas (com acesso gua ad libitum), foram divididos em grupos, anestesiados com ter e fixados em decbito dorsal em placas de isopor. Atravs de uma inciso de cerca de 2 cm no abdome, localizouse o estmago e procedeu-se a ligadura do piloro com linha cordon. Os animais

foram tratados pela via intraduodenal, a parede abdominal foi suturada e, aps quatro horas da cirurgia, os animais foram sacrificados. O esfago foi pinado, o estmago removido e aberto pela curvatura menor. A mucosa gstrica foi lavada com 3 ml de gua em placa de Petri sobre gelo. O estmago foi guardado a 70 C e o suco gstrico foi centrifugado (1500 rpm x 30 min em centrfuga refrigerada). Foi armazenado 300 l do sobrenadante a 70 C para a quantificao de NO2 /NO3 (item 3.2.2.5.1b), e o restante do sobrenadante foi utilizado para a determinao do volume e da acidez total, como indicado abaixo (SHAY et al, 1945). Em alguns experimentos os animais foram tratados com L-NAME (120 mg/kg v.o.) ou com indometacina (10 mg/kg sc.) 30 min antes da ligadura pilrica.

3.2.2.5.1a Quantificao da Secreo cida Gstrica: O volume secretado foi determinado por medida direta (em provetas), e a acidez total ( Eq[H+ ]/mL/4 h) por titulao com NaOH 0,1 N; utilizando fenolftalena 2 % como indicador (DOMER, 1971).

3.2.2.5.1b Quantificao de NO2/NO3: Para a quantificao de NO2/NO3 (NOx) na secreo gstrica, 150 Mili-Q e desproteinizadas com 30 l das amostras foram diludas (1:1) com gua l de sulfato de zinco 10 %. Aps 10 min de

agitao vigorosa e repouso em banho de gelo por 1 hora, as amostras foram centrifugadas (10 000 rpm/4 oC/15 min). Para a converso do nitrato a nitrito, as amostras foram incubadas por 3 horas a 37C, em 10 l de NaOH 1N, 20 l de formiato de amnia, 20 l de fosfato de sdio e 10 l de cultura de bactria Escherichia coli (obtida em cultivo anaerbico). A bactria expressa a enzima nitrato redutase, responsvel pela reduo de NO3 em NO2. Aps o perodo de incubao, as amostras foram centrifugadas (3 000 rpm/10 min) para a remoo da bactria, e em 100 l do sobrenadante foram adicionados 100 l do reagente de Griess. A quantificao de NOx foi realizada por leitura espectrofotomtrica a 540 nm. Os resultados foram interpolados em uma curva padro de nitrito e nitrato (0 a 150 M), sendo expressos como M de NOx (GRANGER et al, 1990).

O reagente de Griess foi preparado na hora dos experimentos, pela mistura na proporo de 1:1 do reagente 1 (sulfanilaminda 1% (p/v) em H3PO4 10% (v/v)) e do reagente 2 ( -naftil-etilenodiamina 0.1%).

3.2.2.5.1c Quantificao de Glutationa Reduzida (GSH) Gstrica: A quantificao do GSH foi realizada em 200 l de tecido gstrico e em 100 l de plasma, como descrito no item 3.2.2.4.3.

3.2.2.5.1d Isolamento das Vesculas Gstricas de Ratos: Os estmagos dos ratos foram removidos para banho de gelo, aberto pela curvatura menor, lavado e descartado as regies antral e cardial. A mucosa gstrica foi pesada, transferida para o tampo de homogeneizao (Tris.HCl 50 mM (pH 7,4), sacarose 250 mM, MgCl2 10 mM, KCl 5 mM, EDTA 1 mM e coquetel de inibidores de protease 0,01 %) e homogeneizadas (de cada duas mucosas fez-se um homogenato). O homogenato foi centrifugado a 9000 x g por 40 min, o precipitado foi descartado e o sobrenadante novamente centrifugado a 100000 x g por 1 h, obtendo-se um precipitado com as vesculas da membrana apical contendo a H+ , K+-ATPase no purificada (KUBO et al., 1995).

3.2.2.5.1e Purificao da H+, K+-ATPase de Ratos: Foi realizado por centrifugao em gradiente descontnuo de sacarose segundo mtodo de KUBO et al. (1995). O precipitado contendo a H +, K+-ATPase foi ressuspenso em tampo de homogeneizao (Sacarose 250 mM, MgCl2 2 mM, cido etilenoglicol-tetractico (EGTA) 1 mM, e TRIS.HCl 50 mM; pH 7,4) e foi cuidadosamente adicionada uma soluo de sacarose 30 % (1:3). Os tubos foram centrifugados a 100 000 x g por 2 h. Duas bandas e um precipitado foram obtidos. As membranas sedimentadas na superfcie da soluo de sacarose 30 % foram coletadas. Todos os procedimentos foram realizados a 4 C. O material enzimtico foi congelado e guardado a -70 C. A quantificao protica foi realizada atravs do kit de anlise protica BCA Pierce, utilizando albumina bovina como padro.

3.2.2.5.1f Ensaio de Atividade Enzimtica da H +, K +-ATPase: A atividade ATPsica foi determinada mediante a quantificao do fsforo inorgnico (Pi) liberado da hidrlise de ATP exgeno, na presena de K +. A reao foi iniciada pela adio da protena enzimtica a 150 l de tampo Tris.HCl (pH 7,4) contendo cloreto de magnsio 2,5 mM, cloreto de potssio 20 mM e ATP, na ausncia e na presena da FE(70). A reao foi interrompida, aps 20 min de incubao a 37 C, pela adio de 50 l de ATC 50 % e esfriamento rpido em banho de gelo (MURAKAMI et al., 1992). A quantificao do fosfato inorgnico liberado foi realizada atravs da adio de 900 l da soluo reagente (4,7 ml de gua; 0,7 ml de cido sulfrico 10 N; 0,6 ml de molibdato de amnio 2,4 %; e 3 ml de cido ascrbico 10 %) nas amostras, que foram incubadas por 20 min a 37 C. O produto obtido foi quantificado por leitura espectrofotomtrica a 820nm (FISKE e SUBBAROW, 1925; TERSARIOL, 1989). A atividade enzimtica foi calculada utilizando o coeficiente de extino do Pi ( = 11 000/M/cm).

3.2.2.6 Estudo sobre a Atividade na H +, K +-ATPase in vitro

3.1.2.6.1 Isolamento das Vesculas Gstricas de Coelho: O coelho foi morto por concusso cerebral, seguido de sangramento pelas cartidas. O estmago foi removido para banho de gelo, aberto pela curvatura menor, lavado e descartado as regies antral e cardial. A mucosa do corpo gstrico foi rapidamente separada das camadas muscular e submucosa. A mucosa gstrica foi picada em pedaos menores, pesada, transferida para o tampo de homogeneizao (Tris.HCl 50 mM - pH 7,4 -, sacarose 250 mM, MgCl2 10 mM, KCl 5 mM, EDTA 1 mM e coquetel de inibidores de protease 0,01 %) e homogeneizada. O homogenato foi centrifugado a 9000 x g por 40 min, o precipitado foi descartado e o sobrenadante novamente centrifugado a 100000 x g por 1 h, obtendo-se um precipitado com as vesculas da membrana apical contendo a H+, K+-ATPase no purificada (KUBO et al., 1995).

3.2.2.6.2 Purificao da H+, K+-ATPase de Coelho: Foi realizado por centrifugao em gradiente descontnuo de sacarose segundo mtodo de KUBO et al. (1995), como descrito do item 3.2.2.5.1e.

3.2.2.6.3 Ensaio de Atividade Enzimtica da H +, K +-ATPase de Coelho: A atividade ATPsica foi determinada conforme descrito no item 3.2.2.5.1f. A porcentagem de inibio produzida pela FE(70) foi calculada considerando a atividade ATPsica como sendo 100 % na ausncia da frao.

3.2.2.7 Avaliao da Motilidade Gastrintestinal

3.2.2.7.1 Esvaziamento Gstrico de Semi-slidos

Esse mtodo consiste na administrao de um marcador colorido semislido (vermelho de fenol 0,05 % em carboximetilcelulose 1,5 %) e na avaliao da quantidade do marcador que permanece no estmago durante um perodo de tempo. Camundongos, em jejum de 6 horas foram tratados e aps 30 minutos ou 1 hora dos tratamentos, foi administrado o marcador colorido. O grupo controle tempo zero foi sacrificado, por deslocamento cervical, logo aps a administrao do marcador colorido, e os outros grupos aps 20 min da administrao. A cavidade abdominal foi aberta, o piloro e a parte distal do esfago foram pinados, o estmago retirado com seu contedo e ento aberto e lavado com 7 mL de gua destilada. O contedo gstrico coletado foi centrifugado a 1500 x g por 15 min. Foi coletado 1 mL do sobrenadante, no qual foi adicionado 1 mL de NaOH 1N (pH 12). Os resultados foram obtidos por leitura espectrofotomtrica a 560nm, e expressos em porcentagem de esvaziamento gstrico em relao ao grupo controle tempo zero (SCARPIGNATO et al, 1980).

3.2.2.7.2 Trnsito Intestinal

Esse mtodo consiste na administrao de um marcador colorido (vermelho de fenol 0,05 % em carboximetilcelulose 1,5 %) e na avaliao do trajeto do mesmo no intestino delgado durante um perodo de tempo. Camundongos, em jejum de 6 horas, foram tratados e aps 30 minutos ou 1 hora dos tratamentos, foi administrado o marcador colorido. O grupo controle tempo zero foi sacrificado, por deslocamento cervical, logo aps a administrao do marcador colorido, e os outros grupos aps 20 min da administrao. A cavidade abdominal foi aberta e o intestino delgado foi removido. Com auxlio de uma rgua, foi determinado o comprimento total do intestino delgado de cada animal (distncia entre o piloro at a vlvula ileocecal), e a distncia percorrida pelo marcador (at a ltima poro que contenha pelo menos 1 cm contnuo do marcador). Os resultados foram expressos em porcentagem da distncia percorrida pelo marcador em relao ao comprimento total do intestino delgado (STICKNEY e NORTHUP, 1959).

3.2.2.7.3 Diarria Induzida por leo de Rcino

Camundongos, em jejum de 6 horas, foram tratados. Aps 1 hora dos tratamentos, foi administrado o leo de rcino (0,3 mL/animal) por via oral a todos os animais. Durante 90 minutos aps a administrao do indutor da diarria foi observado o tempo percorrido para que cada animal eliminasse o primeiro episdio seco, o primeiro episdio mido, e o nmero e o peso dos episdios midos (AWOUTERS et al, 1978).

3.2.2.8 DETERMINAO DA DOSE 50 % E FETIVA (DE 50) E DA CONCENTRAO 50 % I NIBITRIA (CI50)

As DE50 e CI50 foram calculadas plotanto os dados obtidos na equao Vi/V0 = 1/(1-[I]/DE50, utilizando o programa para Windows, Kaleida Graph (Synergy Software, PA, EUA).

3.2.2.9 ANLISE ESTATSTICA Os resultados foram expressos como mdias erro padro das mdias de cinco a sete animais por grupo. Todos os dados que obedeceram a uma distribuio normal foram submetidos anlise de varincia (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey ou Bonferroni. Um valor de p menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

RESULTADOS

4.1 R ESULTADOS FITOQUMICOS

4.1.1 Rendimentos e Propriedades Fsicas dos Extratos Brutos Hidroalcolicos das Razes de P. glomerata (EHaPs)

Os extratos brutos hidroalcolicos das razes da P. glomerata foram preparados e/ou fornecidos na forma de solues aquosas, com seus respectivos rendimentos, pelo Laboratrio de Farmacognosia do Departamento de Farmcia do Setor de Cincias da Sade da UFPR. Estes extratos apresentaram diferentes pH (de 5 a 7 unidades de pH) e rendimentos (Tabela 4.1).
Tabela 4.1: Propriedades fsicas e rendimento dos extratos brutos hidroalcolicos das razes de Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen

Extrato
EHaP50 EHaP70 EHaP90
UFPR.

Cor marrom claro marrom claro amarelo

pH entre 6 - 7 entre 5 - 6 entre 5 - 6

Solubilidade solvel em gua solvel em gua solvel em gua

Rendimento em relao ao p das razes* 61,25 % 64,14 % 60,90 %

* Dados obtidos e fornecidos pelo Laboratrio de Farmacognosia Departamento de Farmcia; Setor de Cincias da Sade

4.1.2 Rendimentos e Propriedades Fsicas das Fraes do EHaP50

Partio 1: Fraes do EHaP50: As fraes acetato de etila (FAE(50)) e butanlica ( FBut(50)) do extrato bruto hidroalcolico (50%) das razes da P. glomerata foram preparados e/ou fornecidas na forma de p e foram solubilizadas em cremofor 5% em gua. A frao aquosa (FAq(50)) deste extrato foi fornecida na forma de soluo aquosa. Estas fraes apresentaram coloraes (de amarelo-esverdeado marrom escuro) e rendimentos diferentes, e pH similar (Tabela 4.2).

Tabela 4.2: Propriedades fsicas e rendimento das fraes do EHaP50 Frao FAE(50) FBut (50) FAq(50)
UFPR.

Cor amarelo-esverdeado marrom claro marrom escuro

pH entre 5 - 6 entre 5 - 6 entre 5 - 6

Solubilidade insolvel em gua pouco solvel em gua solvel em gua

Rendimento em relao ao EHaP50* 0,52 % 2,66 % 18.39 %

* Dados obtidos e fornecidos pelo Laboratrio de Farmacognosia Departamento de Farmcia; Setor de Cincias da Sade

Partio 2: Fraes A da FBut(50): As fraes precipitado (FPB(50)) e sobrenadante (FSB(50)) da frao butanlica do extrato bruto hidroalcolico (50%) das razes da P. glomerata foram fornecidas, na forma de p e foram solubilizadas em cremofor 5% em gua. Estas fraes apresentaram diferentes coloraes (de amarelo marrom), rendimentos e pH (Tabela 4.3).
Tabela 4.3: Propriedades fsicas e rendimento das fraes A da FBut (50) Frao FPB(50) FSB(50) Cor marrom escuro marrom claro pH entre 6 - 7 entre 6 - 7 Solubilidade insolvel em gua insolvel em gua Rendimento em relao FBut* 19% 81%

* Dados fornecidos e reproduzidos com autorizao do Laboratrio de Farmacognosia Departamento de Farmcia; Setor de Cincias da Sade UFPR.

Partio 3: Fraes B da FBut50 : As fraes clorofrmica (FCB(50)), emulso (FEB(50)) e aquosa (FAqB(50)) da frao butanlica do extrato bruto hidroalcolico (50%) das razes da P. glomerata foram fornecidas, na forma de soluo metanlica. Estas fraes apresentaram diferentes coloraes e rendimentos (Tabela 4.4).

Tabela 4.4: Propriedades fsicas e rendimento das fraes B da FBut (50) Frao FCB (50) FEB(50) FAqB (50) Cor amarelo amarelo marrom pH entre 6 - 7 entre 5 - 6 entre 6 - 7 Solubilidade insolvel em gua insolvel em gua solvel em gua Rendimento em relao FBut* 11% 8,51% 64,49%

* Dados fornecidos e reproduzidos com autorizao do Laboratrio de Farmacognosia Departamento de Farmcia; Setor de Cincias da Sade UFPR.

Partio 4: Fraes da FEB(50): As fraes obtidas a partir de FEB(50) (FEB1(50) , FEB2(50) , FEB3(50) , FEB4(50) ) foram fornecidas, na forma de soluo metanlica.

4.1.3 Rendimentos e Propriedades Fsicas das Fraes do EHaP70

Partio 1: Fraes do EHaP70: As fraes acetato de etila (FAE(70)), emulso (FE(70)), butanlica (FBut(70)) do extrato bruto hidroalcolico (70%) das razes da P. glomerata foram preparadas e/ou fornecidas na forma de p e foram solubilizadas em cremofor 5% em gua. A frao aquosa (FAq(70)) deste extrato foi fornecida na forma de soluo aquosa. Estas fraes apresentaram rendimentos e coloraes (de amarelo-esverdeado marrom escuro) diferentes, e pH similar (Tabela 4.5).
Tabela 4.5: Propriedades fsicas e rendimento das fraes do EHaP70 Frao FAE(70) FBut (70) FE(70) FAq(70)
UFPR.

Cor amareloesverdeado marrom claro amareloesverdeado marrom escuro

pH entre 5 - 6 entre 5 - 6 entre 5 - 6 entre 5 - 6

Solubilidade insolvel em gua pouco solvel em gua pouco solvel em gua solvel em gua

Rendimento em relao ao EHaP70* 0,47 % 4,02 % 5,90 % 42,50 %

* Dados obtidos ou fornecidos pelo Laboratrio de Farmacognosia Departamento de Farmcia; Setor de Cincias da Sade

4.1.4 R ESULTADOS DAS ANLISES QUMICAS DA FBUT(50) E DA FE(70) Os dados de CLAE e 1HRMN (ver anexo) obtidos com a FBut(50) sugerem que a mesma uma mistura contendo trs compostos majoritrios, que podem ser esterides do tipo ecdisterona e rubrosterona (observados pela
1

H-RNM), j

relatados anteriormente para a espcie P. glomerata (SHIOBARA et al., 1993). No entanto, estes resultados precisam ser confirmados com a obteno dos compostos puros e com novas analises. Os dados de CLAE e 1HRMN (ver anexo, item 8) obtidos com a FE(70) sugerem que a mesma uma mistura contendo trs compostos majoritrios. Os dados espectrais e os testes fitoqumicos realizados com as razes da P. glomerata (FREITAS, 2000), na qual foi observado a presena de saponinas, indicam que a FE(70) constituda de triterpenos ligados acar.

4.2 R ESULTADOS FARMACOLGICOS 4.2.1 Avaliao da Atividade Gastroprotetora 4.2.1.1 Comparao dos Efeitos dos Extratos Brutos Hidroalcolicos das Razes de P. glomerata (EHaPs) sobre as Leses Gstricas Induzidas por Etanol

A administrao de etanol 70 % induziu a formao de leses na mucosa gstrica acompanhada pela perda de pregas, aparecimento de edema e hemorragia, com ndices de leses, de lceras e ndice total de leses de 11,7 + 0,4; 117,2 + 3,9; e 128,9 + 4,0; respectivamente (Figura 4.1a, 4.1b e 4.1c). A perda das pregas gstricas e o aparecimento de edema e hemorragia foram menores nos grupos pr-tratados com o EHaP50 (500 mg/kg) e com o EHaP90 (500 mg/kg), podendo ser observado pela reduo do ndice de leses em 37 e 17 %, respectivamente (Figura 4.1a). As ulceraes na mucosa gstrica induzidas pela administrao do etanol foram menores (em tamanho e quantidade) nos grupos pr-tratados com o EHaP50

(500 mg/kg) e com o EHaP90 (500 mg/kg), reduzindo o ndice de lceras em 85 e 48%, respectivamente (Figura 4.1b). Todos os parmetros analisados na mucosa gstrica se resumem no ndice total, que foi reduzido em 80 % no grupo pr-tratado com o EHaP50 (500 mg/kg) e em 51 % no grupo pr-tratado com o EHaP90 (500 mg/kg) (Figura 4.1c).
Grupo C EHaP50 EHaP70 EHaP90 R
15

a)

ndice de Leses 11,7 0,4 7,7 0,2 *** 11,6 0,5 9,7 0,4 ** 8,6 0,5 ***

b)

Grupo C EHaP50 EHaP70 EHaP90 R

150

ndice de lceras 117,2 3,9 17,9 3,9 *** 106,4 14,2 61,3 11,8 *** 70,0 9,5 **

ndice de Leses

12

ndice de lceras

120 90

**
9 6 3 0 C EHaP50 EHaP70 EHaP90

***

***

***
60 30 0

**

***
C EHaP50 EHaP70 EHaP90 R

(500 mg/kg - v.o.) Etanol 70 % (2.5 ml/kg - v.o.)

(500 mg/kg - v.o.) Etanol 70 % (2.5 ml/kg - v.o.)

c)

180

Grupo C EHaP50 EHaP70 EHaP90 R

ndice Total 128,9 4,0 26,1 3,9 *** 118,0 14,4 63,4 11,1 *** 78,6 10,0 ***

ndice Total

144 108 72 36 0 C EHaP50 EHaP70 EHaP90 R

*** ***

***

(500 mg/kg - v.o.) Etanol 70 % (2.5 ml/kg - v.o.)

Figura 4.1: Comparao dos Efeitos dos Extratos Brutos Hidroalcolicos (50, 70 e 90% em etanol) das razes de P. glomerata (EHaP50, EHaP70 e EHaP90) sobre as leses gstricas induzidas por etanol. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam os valores obtidos pela aplicao da tabela de pontuao para leses gstricas agudas (MESIA, 1998), 1 hora aps a induo das leses. a) ndice de leses; b) ndice de lceras; c) ndice total de leses. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Tukey. ** Diferente do grupo controle para p < 0.01; e *** para p < 0,001.

A ranitidina, controle positivo do teste, reduziu os ndices de leses, de lceras e o ndice total em 26, 40 e 39 %, respectivamente (Figura 4.1a, 4.1b e 4.1c).

4.2.2 AVALIAO DO EHAP50 NOS DIFERENTES MODELOS DE LESES GSTRICAS

4.2.2a Efeito do EHaP50 em Leses Gstricas Induzidas por Etanol

A administrao de etanol 70 % induziu a produo de leses na mucosa gstrica, acompanhada pela perda de pregas, aparecimento de edema e hemorragia, com ndices de leses, de lceras e ndice total de 12,0 + 0,5; 123,8 + 12,4; e 135,8 + 12,8; respectivamente (Figura 4.2a, 4.2b e 4.2c). A perda das pregas gstricas e o aparecimento de edema e hemorragia foram menores nos grupos pr-tratados com o EHaP50 em doses de 125, 250 e 500 mg/kg, podendo ser observado pela reduo do ndice de leses em 28, 32 e 55 %, respectivamente (Figura 4.2a). As ulceraes na mucosa gstrica induzidas pela administrao do etanol foram menores (em tamanho e quantidade) nos grupos pr-tratados com o EHaP50 em doses de 250 e 500 mg/kg, reduzindo o ndice de lceras em 41 e 85 %, respectivamente (Figura 4.2b). Todos os parmetros analisados na mucosa gstrica se resumem no ndice total, que foi reduzido em 40 % no grupo pr-tratado com o EHaP50 (250 mg/kg) e em 82 % no grupo pr-tratado com o EHaP50 (500 mg/kg) (Figura 4.2c).

a)

Grupo C EHaP50 (125 mg/kg) EHaP50 (250 mg/kg) EHaP50 (500 mg/kg)
15

ndice de Leses 12,0 0,5 8,7 0,6 ** 8,2 0,5 *** 5,4 0,4 ***

b)

Grupo C EHaP50 (125 mg/kg) EHaP50 (250 mg/kg) EHaP50 (500 mg/kg)
150

ndice de lceras 123,8 12,4 114,6 8,3 73,1 11,7 ** 18,8 1,8 ***

ndice de Leses

12 9 6 3 0 C 125 250 500

ndice de lceras

120 90 60 30 0 C 125 250 500

**

*** ***

**

***

EHaP50 (mg/kg - v.o.) Etanol 70 % (2.5 ml/kg - v.o.)

EHaP50 (mg/kg - v.o.) Etanol 70 % (2.5 ml/kg - v.o.)

c)

180 144 108 72 36 0

Grupo C EHaP50 (125 mg/kg) EHaP50 (250 mg/kg) EHaP50 (500 mg/kg)

ndice Total 135,8 12,8 123,2 8,5 81,2 11,9 ** 24,2 1,7 ***

ndice Total

**

***
C 125 250 500

EHaP50 (mg/kg - v.o.) Etanol 70 % (2.5 ml/kg - v.o.)

Figura 4.2: Efeito do Extrato Bruto Hidroalcolico (50% em etanol) das razes de P. glomerata (EHaP50) sobre as leses gstricas induzidas por etanol. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam os valores obtidos pela aplicao da tabela de pontuao para leses gstricas agudas (MESIA, 1998), 1 hora aps a induo das leses. a) ndice de leses; b) ndice de lceras; c) ndice total de leses. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Tukey. ** Diferente do grupo controle para p < 0.01; e *** para p < 0,001

4.2.2b

Efeito

do

EHaP50

em

Leses

Gstricas

Induzidas

por

Indometacina

A administrao de indometacina (20 mg/kg) induziu a produo de leses na mucosa gstrica, acompanhada pelo aparecimento de edema e hemorragia,

com ndices de leses, de lceras e ndice total de 8,5 + 0,3; 43,5 + 6,3; e 52,0 + 6,2; respectivamente (Figura 4.3a, 4.3b e 4.3c). O pr-tratamento com o EHaP50 (250, 500 e 1000 mg/kg) no protegeu a mucosa gstrica contra o aparecimento de edema e hemorragia promovidos pela indometacina (Figura 4.3a).

a)

Grupo C EHaP50 (250 mg/kg) EHaP50 (500 mg/kg) EHaP50 (1000 mg/kg) R
10

ndice de Leses 8,5 0,3 8,4 0,2 8,4 0,2 8,0 0,3 5,2 0,4 ***

b)

Grupo C EHaP50 (250 mg/kg) EHaP50 (500 mg/kg) EHaP50 (1000mg/kg) R

60

ndice de lceras 43,5 6,3 29,4 3,8 26,0 4,8 18,0 5,0 ** 3,5 0,8 **

ndice de Leses

ndice de lceras

8 6 4 2 0 C 250 500 1000 R

48 36 24 12

***

** ***

0 C 250 500 1000 R

EHaP50 (mg/kg - v.o.) Indometacina (20 mg/kg - sc.)

EHaP50 (mg/kg - v.o.) Indometacina (20 mg/kg - sc.)

c) Grupo C EHaP50 (250 mg/kg) EHaP50 (500 mg/kg) EHaP50 (1000mg/kg) R ndice Total 52,0 6,2 37,8 3,8 34,4 5,0 26,0 5,1 ** 8,7 1,1 ***

75

ndice Total

60

45

30

** ***
C 250 500 1000 R

15

0 EHaP50 (mg/kg - p.o. ) I n d o m e t a c i n a ( 2 0 m g / k g - sc.)

Figura 4.3: Efeito do Extrato Bruto Hidroalcolico (50% em etanol) das razes de P. glomerata (EHaP50) sobre as leses gstricas induzidas por Indometacina. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam os valores obtidos pela aplicao da tabela de pontuao para leses gstricas agudas (MESIA, 1998), 6 horas aps a induo das leses. a) ndice de leses; b) ndice de lceras; c) ndice total de leses. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Tukey. ** Diferente do grupo controle para p < 0.01; e *** para p < 0,001.

As ulceraes na mucosa gstrica induzidas pela administrao da indometacina foram menores (em tamanho e quantidade) somente no grupo prtratado com a dose de 1000 mg/kg do EHaP50, reduzindo o ndice de lceras em e 59 % (Figura 4.3b). Todos os parmetros analisados na mucosa gstrica se resumem no ndice total, que foi reduzido em 50 % no grupo pr-tratado com o EHaP50 (1000 mg/kg) (Figura 4.3c). A ranitidina, controle positivo do teste, reduziu os ndices de leses, de lceras e o ndice total em 39, 92 e 83 %, respectivamente (Figura 4.3a, 4.3b e 4.3c).

4.2.2c Efeito do EHaP50 em Leses Gstricas Induzidas por Estresse

O estresse (contenso a 4 C/3 h) induziu a produo de leses na mucosa gstrica, acompanhada pela perda de pregas, o aparecimento de edema e hemorragia, com ndices de leses, de lceras e ndice total de 9,7 + 0,2; 20,0 + 1,6; e 29,7 + 1,6; respectivamente (Figura 4.4a, 4.4b e 4.4c). O pr-tratamento com o EHaP50 (250, 500 e 1000 mg/kg) no protegeu a mucosa gstrica contra a perda das pregas, nem contra o aparecimento de edema e hemorragia promovidos pelo estresse (Figura 4.4a). As ulceraes na mucosa gstrica induzidas pelo estmulo estressante foram menores (em quantidade) nos grupos pr-tratados com o EHaP50 em doses de 250, 500 e 1000 mg/kg, reduzindo o ndice de lceras em 55, 57 e 59 %, respectivamente (Figura 4.4b). Todos os parmetros analisados na mucosa gstrica se resumem no ndice total, que foi reduzido em 36, 38 e 42 % nos grupos pr-tratado com o EHaP50 em doses de 250, 500 e 1000 mg/kg, respectivamente (Figura 4.4c). A ranitidina, controle positivo do teste, reduziu o ndice de lceras e o ndice total em 67 e 53 %, respectivamente (Figura 4.4b e 4.4c).

a)

Grupo C EHaP50 (250 mg/kg) EHaP50 (500 mg/kg) EHaP50 (1000mg/kg) R

12

ndice de Leses 9,7 0,2 10,0 0,7 9,2 0,9 9,0 0,8 7,5 0,5

b)

Grupo C EHaP50 (250 mg/kg) EHaP50 (500 mg/kg) EHaP50 (1000mg/kg) R

25

ndice de lceras 20,0 1,6 8,9 1,8 *** 8,6 2,0 *** 8,2 0,9 *** 6,5 2,5 ***

ndice de lceras

ndice de Leses

20 15 10 5 0

***

***

***

***

0 C 250 500 1000 R

250

500

1000

EHaP50 (mg/kg - v.o.) Estresse (contenso 4 0 C/3 h)

EHaP50 (mg/kg - v.o.) Estresse (contenso 4 0C/3 h)

c)

35

Grupo C EHaP50 (250 mg/kg) EHaP50 (500 mg/kg) EHaP50 (1000mg/kg) R

ndice Total 29,7 1,6 18,9 1,8 * 18,2 3,0 ** 17,2 1,6 *** 14,0 2,8 ***

ndice Total

28 21 14 7 0 C 250 500 1000 EHaP50 (mg/kg - v.o.) Estresse (contenso 4 0 C /3 h) R

**

***

***

Figura 4.4: Efeito do Extrato Bruto Hidroalcolico (50% em etanol) das razes de P. glomerata (EHaP50) sobre as leses gstricas induzidas por estresse. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam os valores obtidos pela aplicao da tabela de pontuao para leses gstricas agudas (MESIA, 1998), 6 horas aps a induo das leses. a) ndice de leses; b) ndice de lceras; c) ndice total de leses. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Tukey. * Diferente do grupo controle para p < 0.05; ** para p < 0.01; e *** para p < 0,001.

4.2.2d Comparao da Potncia (DE50) do EHaP50 nos Diferentes Modelos de Leses Gstricas

As doses 50 % efetivas (DE50) do EHaP50 na gastroproteo contra as leses induzidas pela administrao oral de etanol (70 %), pelo estmulo

estressante (contenso 4 C/3 h) e pela administrao subcutnea de indometacina (20 mg/kg) foram calculadas utilizando as porcentagens de leses produzidas na mucosa gstrica dos grupos pr-tratados com o EHaP50, em relao s porcentagens das leses produzidas na mucosa gstrica dos grupos controles (mucosas 100 % lesionadas) (Tabela 4.6). Ao comparar as DE50 do EHaP50 nos trs modelos de leses induzidas agudamente (por etanol, por indometacina e por estresse), pode-se observar que o extrato foi mais efetivo em proteger a mucosa gstrica contra as leses induzidas por etanol (Tabela 4.6).
Tabela 4.6: Comparao da Potncia (DE 50) do EHaP50 nos Diferentes Modelos de Leses Gstricas Modelo de Leses Gstricas Etanol 70 % Indometacina (20 mg/kg sc.) Estresse (contenso 4 C/3 h) DE50 do EHaP50 em Proteger a Mucosa Gstrica (mg/kg v.o.) 314 130 908 89 866 237

As DE50 foram calculadas pela equao y = (m1x100)/(m1+m0), utilizando o programa Kaleida Graph for Windows (Synergy Software-Pennsylvania).

4.2.3 BIOMONITORAMENTO DO FRACIONAMENTO DO EHAP50 EM LESES GSTRICAS INDUZIDAS POR ETANOL

4.2.3.1 Efeito das Fraes de EHaP50 sobre as Leses Gstricas Induzidas por Etanol

A administrao de etanol 70 % induziu a produo de leses na mucosa gstrica, acompanhada pela perda de pregas, aparecimento de edema e hemorragia, com ndices de leses, de lceras e ndice total de 9,9 0,4; 107,9 4,2; e 117,8 4,4; respectivamente (Figura 4.5a, 4.5b e 4.5c). A perda das pregas gstricas e o aparecimento de edema e hemorragia foram menores nos grupos pr-tratados com a FAE(50) (100 mg/kg) e com a FBut(50) (100 mg/kg), podendo ser observado pela reduo do ndice de leses de ambos em 29 % (Figura 4.5a).

a)

Grupo C FAE(50) (2,6 mg/kg) FAE(50) (30 mg/kg) FAE(50) (100 mg/kg) FBut(50) (13 mg/kg) FBut(50) (30 mg/kg) FBut(50) (100 mg/kg) FAq(50) (30 mg/kg) FAq(50) (300 mg/kg) EHaP50 (500 mg/kg)
15 12

ndice de Leses 9,9 0,4 9,2 0,5 8,7 0,8 7,0 0,4 *** 8,7 0,7 9,2 0,7 7,0 0,2 *** 9,0 0,4 10,3 0,3 6,5 0,3***

b)

Grupo C FAE(50) (2,6 mg/kg) FAE(50) (30 mg/kg) FAE(50) (100 mg/kg) FBut(50) (13 mg/kg) FBut(50) (30 mg/kg) FBut(50) (100 mg/kg) FAq(50) (30 mg/kg) FAq(50) (300 mg/kg) EHaP50 (500 mg/kg)
120 96

ndice de lceras 107,9 4,2 87,2 15,1 51,5 12,3 *** 7,7 4,2 *** 61,7 14,7 ** 18,4 2,9 *** 6,8 2,6 *** 81,7 10,6 59,2 14,2 ** 3,9 1,4 ***

ndice de Leses

ndicedelceras

72 48 24 0 C

** ***

**

**
6 3 0 C 2,6 30 100 13 30

**

***

***
2,6 30 100 13 F E(50) A

*** ***
FBut(50)

***
F q(50) EHaP50 A

100

30

300 500 mg/kg - v.o.

30 100 30 300 500 mg/kg - v.o.

F E(50) A

FBut (50)

F q(50) EHaP50 A

Etanol 70 % (2.5 ml/kg -v.o.)

Etanol 70 % (2.5 ml/kg -v.o.)

c)

150

Grupo C FAE(50) (2,6 mg/kg) FAE(50) (30 mg/kg) FAE(50) (100 mg/kg) FBut(50) (13 mg/kg) FBut(50) (30 mg/kg) FBut(50) (100 mg/kg) FAq(50) (30 mg/kg) FAq(50) (300 mg/kg) EHaP50 (500 mg/kg)

ndice Total 117,8 4,4 96,4 14,9 60,8 13,1 *** 14,7 4,5 *** 70,3 14,7 ** 27,0 3,0 *** 13,8 2,8 *** 90,7 10,9 69,5 14,4 ** 10,5 1,5 ***

120

ndice Total

90

***
60 30

**

**

***
C 2,6 30 100 FAE (50) 13

*** ***
30 100 FBut(50) 30 300 FAq(50)

***
500 mg/kg - v.o. EHaP50

Etanol 70 % (2.5 ml/kg) - p.o.

Figura 4.5: Efeito das fraes de EHaP50 sobre as leses gstricas induzidas por etanol. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam os valores obtidos pela aplicao da tabela de pontuao para leses gstricas agudas (MESIA, 1998), 1 hora aps a induo das leses. a) ndice de leses; b) ndice de lceras; c) ndice total de leses. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Tukey. ** Diferente do grupo controle para p < 0.01; e *** para p < 0,001.

As ulceraes na mucosa gstrica induzidas pela administrao do etanol foram menores (em tamanho e quantidade) nos grupos pr-tratados com as fraes do EHaP50. O ndice de lceras foi reduzido em 52 e 93 % nos grupos prtratados com 30 e 100 mg/kg da FAE(50), respectivamente; reduzido em 57, 83 e 94 % nos grupo pr-tratados com 13, 30 e 100 mg/kg da FBut(50), respectivamente; e reduzido em 45 % no grupo pr-tratado com 300 mg/kg da FAq(50) (Figura 4.5b). Todos os parmetros analisados na mucosa gstrica se resumem no ndice total, utilizado para calcular as DE50 das fraes, que foi de 17,64 4,1 mg/kg para a FAE(50) ; de 14,81 3,16 mg/kg para a FBut(50); e de 320 154 mg/kg para a FAq(50) (Figura 4.5c). O EHaP50 (500 mg/kg), controle positivo do teste, reduziu os ndices de leses, de lceras e o ndice total em 34, 96 e 91 %, respectivamente (Figura 4.5a, 4.5b e 4.5c).

4.2.3.1a Comparao das Potncias (DE50) das Fraes do EHaP50 na Gastroproteo contra Leses Induzidas por Etanol

A determinao da frao do EHaP50 mais ativa foi realizada atravs da comparao da DE50 terica com a DE50 real (experimental) capazes de proteger a mucosa gstrica contra as leses induzidas por etanol. As DE50 tericas foram calculadas correlacionando a DE50 real do extrato de origem (DE50 do EHaP50 = 314 mg/kg) com os rendimentos obtidos de cada frao. As DE50 reais foram calculadas experimentalmente, utilizando as porcentagens de leses produzidas na mucosa gstrica dos grupos pr-tratados com as fraes do EHaP50, em relao s porcentagens das leses produzidas na mucosa gstrica dos grupos controles (100% lesionadas) (Tabela 4.7). A FBut(50) e a FAE(50) foram as mais efetivas na gastroproteo, com DE50 reais similares e cerca de 20 vezes mais potente que a FAq(50). No entanto, a DE50 real da FBut(50) aproxima-se da DE50 esperada (DE50 terica), o que no ocorreu com as outras fraes (Tabela 4.7).

Tabela 4.7: Rendimentos, DE 50 tericas e DE 50 reais das fraes do EHaP50 (FAE(50), FBut (50) e FAq(50)). Fraes do EHaP50 FAE(50) FBut(50) FAq(50) Rendimento em relao ao EHaP50 (%)* 0,52 2,66 18,39 DE50 terica (mg/kg v.o.) 1,63 8,35 57,74 DE50 real (mg/kg v.o.) 17,64 4,1 14,81 3,16 320 154

As DE50 foram calculadas pela equao y = (m1x100)/(m1+m0), utilizando o programa Kaleida Graph for Windows (Synergy Software-Pennsylvania). * Dados fornecidos pelo Laboratrio de Farmacognosia Departamento de Farmcia; Setor de Cincias da Sade UFPR.

4.2.3.2 Efeito das Fraes de FBut(50) (Fracionamento A) sobre as Leses Gstricas Induzidas por Etanol

A administrao de etanol 70 % induziu a produo de leses na mucosa gstrica, acompanhada pela perda de pregas, aparecimento de edema e hemorragia, com ndices de leses, de lceras e ndice total de 10,6 0,3; 98,5 5,8; e 109,1 5,8; respectivamente (Figura 4.6a, 4.6b e 4.6c). O pr-tratamento com a FPB(50) (5,0 mg/kg) e a FSB(50) (20,0 mg/kg) no protegeu a mucosa gstrica contra a induo das ulceraes, nem contra a perda de pregas e o aparecimento de edema e hemorragia (Figura 4.6a, 4.6b e 4.6c). O FBut(50) (25 mg/kg), controle positivo do teste, reduziu o ndice de lceras e o ndice total em 36,4 e 33,7 %, respectivamente (Figura 4.6b e 4.6c).

a)

15 12

Grupo C FPB(50) (5 mg/kg) FSB(50) (20 mg/kg) FBut(50) (25 mg/kg)

ndice de Leses 10,6 0,3 9,9 0,3 10,5 0,2 9,6 0,5

b)

150 120

Grupo C FPB(50) (5 mg/kg) FSB(50) (20 mg/kg) FBut(50) (25 mg/kg)

ndice de lceras 98,5 5,8 80,2 12,3 86,7 7,1 62,7 10,1 *

9 6 3 0 C 5 F B(50) P 20 F B(50) S 25 FBut(50)

ndice de lceras

ndice de Leses

90

*
60 30 0

mg/kg - v.o.

5 F B(50) P

20 F B(50) S

25 FBut(50)

mg/kg - v.o.

Etanol 70 % (2.5 ml/kg - v.o.)

Etanol 70 % (2.5 ml/kg - v.o.)

c)

150 120

Grupo C FPB(50) (5 mg/kg) FSB(50) (20 mg/kg) FBut(50) 25 mg/kg)

ndice Total 109,1 5,8 90,0 12,4 97,3 7,2 72,4 10,4 *

ndice Total

90 60 30 0 C 5 FPB(50) 20 FSB(50)

25 mg/kg - v.o. FBut(50)

Etanol 70 % (2.5 ml/kg - v.o.)

Figura 4.6: Efeito das fraes de FBut(50) (fracionamento A) sobre as leses gstricas induzidas por etanol. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 6 a 10 animais e representam os valores obtidos pela aplicao da tabela de pontuao para leses gstricas agudas (MESIA, 1998), 1 hora aps a induo das leses. a) ndice de leses; b) ndice de lceras; c) ndice total de leses. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Tukey. * Diferente do grupo controle para p < 0.05.

4.2.3.3 Efeito das Fraes da FBut(50) (Fracionamento B) sobre as Leses Gstricas Induzidas por Etanol

A administrao de etanol 70 % induziu a produo de leses na mucosa gstrica, acompanhada pela perda de pregas, aparecimento de edema e

hemorragia, com ndices de leses, de lceras e ndice total de 11,1 + 0,4; 105,3 + 5,5; e 114,0 + 5,7; respectivamente (Figura 4.7a, 4.7b e 4.7c).

a)

15 12

Grupo C FCB (50) (1,0 mg/kg) FCB (50) (3,0 mg/kg) FEB(50) (1,0 mg/kg) FEB(50) (3,0 mg/kg) FAqB(50) (6,0 mg/kg) FAqB(50) (15,0 mg/kg) FBut(50) 25,0 mg/kg)

ndice de Leses 11,1 0,4 10,6 0,6 10,1 0,3 9,5 0,4 9,6 0,4 10,7 0,8 10,0 0,6 9,5 0,5

b)
150

100

50

150 120

Grupo C FCB (50) (1,0 mg/kg) FCB (50) (3,0 mg/kg) FEB(50) (1,0 mg/kg) FEB(50) (3,0 mg/kg)** FAqB(50) (6,0 mg/kg) FAqB(50) (15,0 mg/kg) FBut(50) 25,0 mg/kg) 1 3 1 3
FCB (50) FEB (50)

ndice de lceras 105,3 5,5 113,1 11,6 94,2 11,9 84,1 11,2 * 44,5 4,5 ** 129,3 14,93 76,0 11,0 52,0 8,1mg/kg - p.o. * 6 15 25
FAqB(50) FBut(50)

ndice de lceras

Etanol 70 % (2.5 ml/kg) - p.o .

ndice de Leses

9 6 3 0 C 1 3 F B(50) C 1 3 FEB(50) 6 15 FAqB (50) 25 mg/kg - v.o. FBut (50)

ndice de lceras

90 60 30 0 C 1 3 FCB (50) 1 3 FEB (50) 6 15 FAqB (50) 25 mg/kg-v.o. FBut(50)

**

Etanol 70 % (2.5 ml/kg - v.o.)

Etanol 70 % (2.5 ml/kg - v.o.)

c) Grupo C FCB(50) (1,0 mg/kg) FCB(50) (3,0 mg/kg) FEB(50) (1,0 mg/kg) FEB(50) (3,0 mg/kg) FAqB(50) (6,0 mg/kg) FAqB(50) (15,0 mg/kg) FBut(50) 25,0 mg/kg)

ndice Total 114,0 5,7 123,6 12,1 105,1 11,9 93,6 11,1 54,9 4,8 ** 140,0 14,8 86,0 11,3 61,5 7,7 *

180 144

ndice Total

108 72 36 0 C 1 3 FCB(50) 1 3 FEB(50) 6 15 FAqB(50) 25 mg/kg - v.o. FBut(50)

**

Etanol 70 % (2.5 ml/kg - v.o.)

Figura 4.7: Efeito das fraes de FBut(50) (fracionamento B) sobre as leses gstricas induzidas por etanol. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam os valores obtidos pela aplicao da tabela de pontuao para leses gstricas agudas (MESIA, 1998), 1 hora aps a induo das leses. a) ndice de leses; b) ndice de lceras; c) ndice total de leses. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Tukey. ** Diferente do grupo controle para p < 0.01.

O pr-tratamento com as fraes de FBut(50), nas doses testadas, no protegeu a mucosa gstrica contra a perda de pregas, nem contra o aparecimento de edema e hemorragia promovidos pelo etanol (Figura 4.7a). As ulceraes na mucosa gstrica induzidas pela administrao do etanol foram menores (em tamanho e quantidade) no grupo pr-tratado com a FEB(50) (3,0 mg/kg), reduzindo o ndice de lceras em 58 %. O pr-tratamento com a FEB(50) (1,0 mg/kg), a FCB(50) (1,0 e 3,0 mg/kg), e a FAqB(50) (3,0 e 6,0 mg/kg) no protegeu a mucosa gstrica contra a induo das ulceraes (Figura 4.7b). Todos os parmetros analisados na mucosa gstrica se resumem no ndice total, que foi reduzido em 52 % no grupo pr-tratado com FEB(50) (3,0 mg/kg) (Figura 4.7c). O FBut(50) (25 mg/kg), controle positivo do teste, reduziu o ndice de lceras e o ndice total em 51 e 46 %, respectivamente (Figura 4.7b e 7.9c).

4.2.3.3a Comparao das Fraes da FBut(50) (Fracionamento B) na Gastroproteo contra Leses Induzidas por Etanol

Dentre as fraes de FBut(50) testadas (FCB(50), FEB(50) e FAqB (50) ), a FEB(50) foi a nica frao ativa contra as leses induzidas pelo etanol, apresentando uma DE50 real de 3,3 mg/kg (dose prxima a esperada DE50 terica) (Tabela 4.8).
Tabela 4.8: Rendimentos, DE 50 tericas e DE 50 reais das fraes da FBut (50) (FCB (50), FEB(50) e FAqB (50)). Fraes da FBut(50) FCB (50) FEB(50) FAqB (50) Rendimento em relao FBut(50) (%)* 11% 8,51% 64,49% DE50 terica (mg/kg v.o.) 1,63 1,26 9,55 DE50 real (mg/kg v.o.) No foi possvel calcular 3,3 No foi possvel calcular

As DE50 foram calculadas pela equao y = (m1x100)/(m1+m0), utilizando o programa Kaleida Graph for Windows (Synergy Software-Pennsylvania). * Dados fornecidos pelo Laboratrio de Farmacognosia Departamento de Farmcia; Setor de Cincias da Sade UFPR.

4.2.3.4 Efeito das Fraes de FEB(50) sobre as Leses Gstricas Induzidas por Etanol

A administrao de etanol 70 % induziu a produo de leses na mucosa gstrica, acompanhada pela perda de pregas, aparecimento de edema e hemorragia, com ndices de leses, de lceras e ndice total de 11,7 0,4; 126,6 9,8; e 138,7 9,9; respectivamente (Figura 4.8a, 4.8b e 4.8c).
Grupo C FEB1(50) (1,95 mg/kg) FEB2(50) (1,35 mg/kg) FEB4(50) (1,20 mg/kg) FEB5(50) (0,40 mg/kg) FEBut(50) 25,0 mg/kg) ndice de Leses 11,7 0,4 11,0 0,6 11,5 0,2 10,5 0,4 11,0 0,4 11,5 0,7

b)

a)

Grupo C FEB1(50) (1,95 mg/kg) FEB2(50) (1,35 mg/kg) FEB4(50) (1,20 mg/kg) FEB5(50) (0,40 mg/kg) FEBut(50) 25,0 mg/kg)

ndice de lceras 126,6 9,8 128,7 11,2 137,7 9,3 115,1 21,0 139,0 5,9 124,7 9,2

15 12 150

ndicedeLeses

9 6 3 0 C 1,95 1,35 1,20 0,40 Fraes de FEB(50) 1-4 (mg/kg - v.o.) Etanol 70 % (2.5 ml/kg) - v.o.)

ndicedelceras
5,30 mg/kg - v.o. F B(50) E

100

50

0 C 1,95 1,35 1,20 0,40 FraesdeFEB(50) 1-4 (mg/kg - v.o.) Etanol 70 % (2.5 ml/kg) - v.o.)

5,30 mg/kg - v.o. F B(50) E

c)

180 144

Grupo C FEB1(50) (1,95 mg/kg) FEB2(50) (1,35 mg/kg) FEB4(50) (1,20 mg/kg) FEB5(50) (0,40 mg/kg) FEBut(50) 25,0 mg/kg)

ndice Total 138,7 9,9 139,7 10,8 149,2 9,4 125,6 20,8 150,0 6,2 134,0 10,0

ndice Total

108 72 36 0 C 1,95 1,35 1,20 0,40 5,30 FEB(50) mg/kg - v.o. Fraes de FEB(50) 1-4 (mg/kg - v.o.) Etanol 70 % (2.5 ml/kg) - v.o.)

Figura 4.8: Efeito das fraes de FEB (50) sobre as leses gstricas induzidas por etanol. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 6 animais e representam os valores obtidos pela aplicao da tabela de pontuao para leses gstricas agudas (MESIA, 1998), 1 hora aps a induo das leses. a) ndice de leses; b) ndice de lceras; c) ndice total de leses. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Tukey.

O pr-tratamento com a FEB1(50) (1,95 mg/kg), FEB2(50) (1,35 mg/kg), FEB3(50) (1,20 mg/kg) e FEB4(50) (0,40 mg/kg) no protegeu a mucosa gstrica contra a induo das ulceraes, nem contra a perda de pregas e o aparecimento de edema e hemorragia (Figura 4.8a, 4.8b e 4.8c). O FEB(50) (5,3 mg/kg), controle positivo do teste, no protegeu a mucosa gstrica contra a induo das ulceraes, nem contra a perda de pregas e o aparecimento de edema e hemorragia (Figura 4.8a, 4.8b e 4.8c).

4.2.4 A VALIAO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DE EHAP50 E FRAES NO MODELO DE LESES GSTRICAS INDUZIDAS POR ETANOL EM DIFERENTES PERODOS

A atividade gastroprotetora do EHaP50 (500 mg/kg) se manteve durante os 3 meses analisados (Figura .4.9a).

Proteo Gstrica contra Leses por Etanol (%)

a)

EHaP50 (500 mg/kg - v.o.) 100 80 60 40 20 0 0 Set/03 Out/03 Nov/03 Dez/03

Perodos Analisados

b)
100 FBut (50) (25 mg/kg - v.o.)

c)
100 FEB (3,4 mg/kg - p.o.) (50) FEB (5,3 mg/kg - p.o.) (50)

Proteo Gstrica contra Leses por Etanol (%)

Proteo Gstrica contra Leses por Etanol (%)

Dez/03 Fev/04 Mar/04

75

75 50 25 0 Mar/04 Ago/04

50

25

Perodos Analisados

Perodos Analisados

Figura 4.9: Efeito gastroprotetor do EHaP50 e fraes (FBut(50) e FEB(50)) no modelo de induo de leses gstricas agudas por etanol testadas em diferentes perodos . Os resultados esto expressos como % de proteo gstrica em relao ao grupo lesionado, 1 hora aps a induo das leses por etanol. a) Efeito do EHaP50; b) Efeito da FBut(50); c) Efeito da FEB (50).

A atividade da FBut(50) (25 mg/kg) reduziu em 44 % ao longo dos 3 meses, e a FEB(50) (3,4 mg/kg, 5,3 mg/kg) tornou-se inativa (Figura 4.92b e 4.9c).

4.2.5 E STUDO DO MECANISMO DE AO GASTROPROTETOR DE EHAP50 E FBUT(50)

4.2.5.1

Caracterizao

da

Atividade

de

Enzimas

Antioxidantes

Presentes no Estmago

4.2.5.1a

Caracterizao

da

Atividade

da

NAD(P)H

Quinona

Oxidorredutase 1 (NQO1) na Regio Glandular Gstrica

A atividade especfica da NQO1 foi determinada atravs da taxa do consumo de citocromo C. A atividade da NQO1 dependente de protena (1,8 a 15,0 g/ml) foi linear, variando de 1,16 a 8,58 nmoles/min. Desta forma optamos pela concentrao protica do citosol de 7g/ml para a realizao dos experimentos (Figura 4.10a). A atividade da NQO1 dependente de tempo (60 a 420 s) foi linear, variando de 10613 a 13281 nmoles/mg/min. Optamos pelo tempo de 180 s para a realizao dos ensaios enzimticos (Figura 4.10b). A cintica de reao da NQO1 avaliada na dependncia de NADPH (0,01 a 1,0 mM) mostrou uma velocidade mxima de reao (V mx) de 1702 75 e uma constante de Michaelis-Menten (K m) de 59,8 11,4 M. Desta forma, optamos pela concentrao de 250 4.10c). M de NADPH para a realizao dos experimentos (Figura

4.2.5.1b Caracterizao da Atividade da Glutationa S-transferase (GST) na Regio Glandular Gstrica

A atividade especfica da GST presente na regio glandular gstrica foi determinada pela conjugao do CDNB com a glutationa reduzida (GSH). A atividade da GST dependente de protena (3,5 a 150,0 g/ml) foi linear, variando de

2,6 a 21,5 nmols de GSH conjugado/ min. Desta forma optamos pela concentrao protica do citosol de 10 g/ml para a realizao dos experimentos (Figura 4.11a). A atividade da GST dependente de tempo (1 a 10 min) foi linear at o tempo de reao de 5 min, variando de 175 a 198 nmoles/mg/min. Optamos pelo tempo de 1min e 30s para a realizao dos ensaios enzimticos (Figura 4.11b). A cintica de reao da GST avaliada na dependncia de GSH (0,25 a 4,0 mM) mostrou uma velocidade mxima de reao ( mx) de 197,4 10,0; e uma V constante de Michaelis-Menten (K m) de 346 78 4.11c). M. Desta forma, optamos pela concentrao de 1,0 mM de GSH para a realizao dos experimentos (Figura

a) Atividade de NQO1 (nmoles/min)

10.0

b) Atividade da NQO1 (nmoles /mg /min)

14000 13000

7.5

5.0

12000

2.5

11000

0.0 0 3 6 9 12 15

10000 0 60 120 180 240 300 360 420

[Protena] - mg/ml

Tempo (s)

c)
Atividade de NQO1 (nmoles/mg /min)

2000

1500

1000

VMAX KM

1702 0.05984

500

0 0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

[NADPH] (mM)

Figura 4.10: Caracterizao da atividade enzimtica da NAD(P)H quinona oxidorredutase 1 (NQO1) na regio glandular gstrica. a) Curva de atividade em funo da concentrao protica; b) Curva de atividade em funo do tempo de reao; c) Curva de atividade de NQO1, determinando o Vmx e o Km. Os resultados esto expressos como a taxa de consumo de citocromo C pela NQO1 citoslica da regio glandular gstrica.

a) Atividade de GST (nmoles/min)

25 20 15 10 5 0 0 30 60 90 120 150

b) Atividade de GST
(nmoles/ mg/ min)

210 200 190 180 170 160 0 1 2 3 4 5

[Protena] - g/ml

Tempo (min)

c)
Atividade de GST (nmoles/mg /min)

200

160

120

80

VMAX 197.4 KM 0.3462

40

0 0.0

0.8

1.6

2.4

3.2

4.0

[GSH] - mM Figura 4.11: Caracterizao da atividade enzimtica da Glutationa S-transferase (GST) na regio glandular gstrica. a) Curva de atividade em funo da concentrao protica; b) Curva de atividade em funo do tempo de reao; c) Curva de atividade de GST em funo de GSH, determinando o Vmx e o Km. Os resultados esto expressos como a taxa de conjugao de GSH pela GST citoslica da regio glandular gstrica.

4.2.5.2 Efeito do EHaP50 sobre as Leses Gstricas Induzidas por Etanol

A administrao de etanol 70 % induziu a formao de leses na mucosa gstrica acompanhada pela perda de pregas, aparecimento de edema e hemorragia, com ndice total de 111,4 6,1. No foram observados leses significantes no grupo de animais que no recebeu etanol (CNL: controle no lesado) (Figura 4.12). O EHaP50 protegeu a mucosa gstrica contra as leses induzidas por etanol de forma dose-dependente, com uma DE50 de 301 170 mg/kg (Figura 4.12).

175

Grupo

ndice Total 10,5 0,5 111,4 6,1 117,0 10,5 39,0 3,9 *** 13,7 1,7 ***

ndice Total

140 105 70 35 0 CNL

C NL C EHaP50 (100 mg/kg) EHaP50 (300 mg/kg) EHaP50 (1000 mg/kg) *** ***

CL

100 300 1000 EHaP50 (mg/kg - v.o.)

Etanol 70% (0.5ml/animal - v.o.)

Figura 4.12: Efeito do EHaP50 sobre as leses gstricas induzidas por etanol. Os resultados esto expressos

como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam os ndices total de leses, obtidos pela aplicao da tabela de pontuao para leses gstricas agudas (MESIA, 1998), 1 hora aps a induo das leses. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida de Bonferroni. Diferente do grupo controle no lesado (CNL) para p < 0,001. *** Diferente do grupo controle lesado (CL) para p < 0.001.

4.2.5.2a Efeito do EHaP50 sobre os Nveis de Glutationa (GSH) Gstricos aps a Induo de Leses por Etanol

Os nveis de GSH gstricos no grupo de animais que no recebeu etanol (CNL: controle no lesado) foram de 1198 109 g GSH/g tecido (Figura 4.13).

A administrao de etanol 70% (CL: controle lesado) reduziu os nveis de GSH gstricos em 37 % (Figura 4.13). O EHaP50 (300 e 1000 mg/kg) impediu a queda dos nveis de GSH gstricos, mantendo os nveis em 896 112 e 1127 146 respectivamente (Figura 4.13). g GSH/g tecido,

4.2.5.2b Efeito do EHaP50 sobre a Atividade da Enzima Glutationa Stransferase (GST) Gstrica aps a Induo de Leses por Etanol

A atividade da GST presente na regio glandular gstrica do grupo de animais que no recebeu etanol (CNL:controle no lesado) foi de 129,0 4,1 nmoles/mg/min (Figura 4.14). A administrao de etanol 70 % (CL: controle lesado) aumentou a atividade da GST em 22 % (Figura 4.14).

O EHaP50, na dose de 100 mg/kg, impediu o aumento da atividade da GST (induzido pelo etanol) e reduziu a atividade da enzima em 24 % quando comparado ao grupo controle no lesado (CNL). Nas doses de 300 e 1000 mg/kg, impediu o aumento da atividade da GST, mantendo a atividade em 129,4 6,7 e 133,0 5,3 nmoles/mg protena/min (Figura 4.14).
GSH ( g/ g tecido) 1198 109 750 134 708 42 896 112 1127 146

1500

Grupo C NL C EHaP50 (100 mg/kg) EHaP50 (300 mg/kg) EHaP50 (1000 mg/kg)

GSH (ug/ g de tecido)

1200 900 600 300 0 CNL CL 100 300 1000 EHaP50 (mg/kg - v.o.) Etanol 70% (0.5ml/animal - v.o.)

Figura 4.13: Efeito do EHaP50 sobre os nveis de glutationa (GSH) gstrico, aps a induo de leses gstricas por etanol. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam os nveis de GSH gstricos, aps a induo de leses por etanol. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Bonferroni. Diferente do grupo controle no lesado para p < 0.05 e para p < 0,01.

Grupo C NL C EHaP50 (100 mg/kg) EHaP50 (300 mg/kg) EHaP50 (1000 mg/kg)

100

Atividade de GST (nmoles/mg prot/min)

75

Atividade de GST (nmols/mg protena/min) 129,0 4,1 157,3 8,4 98,0 6,6 *** 129,4 6,7 * 133,0 5,3 *

50

***

25

0 CNL CL 100 300 1000 EHaP50 (mg/kg - v.o.) Etanol 70% (0.5ml/animal - v.o.) Figura 4.14: Efeito do EHaP50 sobre a atividade da enzima Glutationa S-transferase (GST) da regio glandular gstrica, aps a induo de leses gstricas por etanol. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam a taxa de conjugao com GSH. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Bonferroni. Diferente do grupo controle no lesado (CNL) para p < 0.01. * Diferente do grupo controle lesado (CL) para p < 0,05; e *** para p < 0,001.

4.2.5.2c Efeito do EHaP50 sobre a Atividade da Enzima NAD(P)H Quinona Oxidorredutase 1 (NQO1) Gstrica aps a Induo de Leses por Etanol

A atividade da NQO1 presente na regio glandular gstrica do grupo de animais que no recebeu etanol (CNL: controle no lesado) foi de 1346 65 nmoles/mg/min (Figura 4.15). A administrao de etanol 70 % (CL: controle lesado) reduziu a atividade da NQO1 em 45 % (Figura 4.15). O EHaP50, nas doses de 300 e 1000 mg/kg, impediu a reduo da atividade da NQO1, mantendo a atividade em 1187 19 e 1186 136 nmoles/mg/ min (Figura 4.15).

Grupo C NL C EHaP50 (100 mg/kg) EHaP50 (300 mg/kg) EHaP50 (1000 mg/kg)

Atividade de NQO1 (nmoles/mg prot/min)

1500 1200 900 600 300 0 CNL CL 100 300

Atividade de NQO1 (nmols/mg protena/min) 1346 65 704 119 803 114 1187 19 * 1186 136 *

1000

EHaP50 (mg/kg - v.o.) Etanol 70% (0.5ml/animal - v.o.) Figura 4.15: Efeito do EHaP50 sobre a atividade da enzima NADPH quinona oxidorredutase 1 (NQO1) da regio glandular gstrica, aps a induo de leses gstricas por etanol. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam a taxa de consumo de Citocromo C. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Bonferroni. Diferente do grupo controle no lesado (CNL) para p < 0.01; para p < 0,001. * Diferente do grupo controle lesado (CL) para p < 0,05.

4.2.5.3 Efeito da FBut(50) sobre as Leses Gstricas Induzidas por Etanol

A administrao de etanol 70 % induziu a formao de leses na mucosa gstrica acompanhada pela perda de pregas, aparecimento de edema e hemorragia, com ndice total de 111,4 6,1. No foram observados leses significantes no grupo de animais que no recebeu etanol (CNL: controle no lesado) (Figura 4.16). A FBut(50) (100 mg/kg) protegeu a mucosa gstrica contra o aparecimento de lees, reduzindo o ndice total em 71 % (Figura 4.16).

175

ndice Total

140 105 70 35 0 CNL

Grupo C NL C FBut(50) (10 mg/kg) FBut(50) (100 mg/kg)

ndice Total 10,5 0,5 111,4 6,1 133,3 12,4 32,5 8,1 ***

***
CL 10 100

FBut( 5 0 ) ( m g / k g - v . o . ) Etanol 70% (0.5ml/animal - v.o.)

Figura 4.16: Efeito da FBut(50) sobre as leses gstricas induzidas por etanol. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam os ndices total de leses, obtidos pela aplicao da tabela de pontuao para leses gstricas agudas (MESIA, 1998), 1 hora aps a induo das leses. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida de Bonferroni. Diferente do grupo controle no lesado (CNL) para p < 0,001. *** Diferente do grupo controle lesado (CL) para p < 0.001.

4.2.5.3a Efeito da FBut(50) sobre os Nveis de Glutationa (GSH) Gstricos aps a Induo de Leses por Etanol

Os nveis de GSH gstricos no grupo de animais que no recebeu etanol (CNL: controle no lesado) foram de 1198 109 g GSH/g tecido (Figura 4.17).

A administrao de etanol 70 % (CL: controle lesado) reduziu os nveis de GSH gstricos em 37 % (Figura 4.17). A FBut(50) no foi capaz de impedir a queda dos nveis de GSH gstricos induzida pela administrao de etanol (Figura 4.17).

GSH (ug/ g de tecido)

1500 1200 900 600 300 0 CNL CL 10 100 F B u t ( 5 0 ) (mg/kg - v.o.) Etanol 70% (0.5ml/animal - v.o.)

Grupo C NL C FBut(50) (10 mg/kg) FBut(50) (100 mg/kg)

GSH ( g/g tecido) 1198 109 750 134 893 101 631 63

Figura 4.17: Efeito da FBut(50) sobre os nveis de glutationa (GSH) gstrico, aps a induo de leses gstricas por etanol. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam os nveis de GSH gstricos, aps a induo de leses por etanol. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Bonferroni. Diferente do grupo controle no lesado para p < 0.05; e para p < 0,01.

4.2.5.3b Efeito da FBut(50) sobre a Atividade da Enzima Glutationa Stransferase (GST) Gstrica aps a Induo de Leses por Etanol

A atividade da GST presente na regio glandular gstrica do grupo de animais que no recebeu etanol (CNL: controle no lesado) foi de 129,0 4,1 nmoles/mg/min (Figura 4.18).

200

Grupo

Atividade de GST (nmoles/mg /min)

150

C NL C FBut(50) (10 mg/kg) FBut(50) (100 mg/kg)

Atividade de GST (nmols/mg protena/min) 129,0 4,1 157,3 8,4 164,4 6,7 147,4 7,0

100

50

0 CNL CL 10 100 FBut(50) (mg/kg - v.o.) Etanol 70% (0.5ml/animal - v.o.) Figura 4.18: Efeito da FBut(50) sobre a atividade da enzima Glutationa S-transferase (GST) da regio glandular gstrica, aps a induo de leses gstricas por etanol. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam a taxa de conjugao com GSH. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Bonferroni. Diferente do grupo controle no lesado (CNL) para p < 0.05.

A administrao de etanol 70 % (CL: controle lesado) aumentou a atividade da GST em 22 % (Figura 4.18). A FBut(50) no foi capaz de impedir o aumento da atividade da GST induzido pela administrao de etanol (Figura 4.18).

4.2.5.3c Efeito da FBut(50) sobre a Atividade da Enzima NADPH Quinona Oxidorredutase 1 (NQO1) Gstrica aps a Induo de Leses por Etanol

A atividade da NQO1 presente na regio glandular gstrica do grupo de animais que no recebeu etanol (CNL:controle no lesado) foi de 1346 65 nmoles/mg/min (Figura 4.19). A administrao de etanol 70 % (CL: controle lesado) reduziu a atividade da NQO1 em 45 % (Figura 4.19). A FBut(50), na dose de 100 mg/kg, impediu a reduo da atividade da NQO1, mantendo a atividade em 1104 46 nmols/mg/min (Figura 4.19).

Grupo C NL C FBut(50) (10 mg/kg) FBut(50) (100 mg/kg)

1500

Atividade de NQO1 (nmols/mg protena/min) 1346 65 704 119 1006 84 1104 46 *

Atividade de NQO1 (nmoles/mg/min)

1200 900 600 300 0

CNL

CL

10

100

FBut(50) (mg/kg - v.o.) Etanol 70% (0.5ml/animal - v.o.)

Figura 4.19: Efeito da FBut(50) sobre a atividade da enzima NADPH quinona oxidorredutase 1 (NQO1) da regio glandular gstrica, aps a induo de leses gstricas por etanol. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam a taxa de consumo de Citocromo C. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Bonferroni. Diferente do grupo controle no lesado (CNL) para p < 0.001. * Diferente do grupo controle lesado (CL) para p < 0,05.

4.2.6 Avaliao da Atividade Anti-secretora cida 4.2.6.1 Comparao dos Efeitos dos Extratos Brutos Hidroalcolicos das Razes de P. glomerata (EHaPs) sobre a Secreo cida Gstrica

No grupo controle, o volume de suco gstrico secretado foi de 7,5 + 1,1 ml; o pH de 1,6 + 0,1; e a acidez total de 76,7 + 7,1 Eq[H +]/ml, aps 4 horas da ligadura pilrica (Figura 4.20a, 4.20b e 4.20c). O EHaP50 (500 mg/kg) no alterou o volume, o pH, nem a acidez total do contedo gstrico (Figura 4.20a, 4.20b e 4.20c). O EHaP70 (500 mg/kg) reduziu o volume e a acidez total do contedo gstrico em 53 e 60 %, respectivamente, e aumentou o pH em 1,4 unidades (Figura 4.20a, 4.20b e 4.20c). O EHaP90 (500 mg/kg) reduziu em 38 % o volume e a acidez total do contedo gstrico (Figura 4.20a e 4.20c). A administrao da ranitidina, controle positivo do teste, reduziu o volume e a acidez total do contedo secretado em 37 e 66 %, respectivamente; e aumentou o pH em 1,4 unidades (Figura 4.20a, 4.20b e 4.20c).

a)

Grupo C EHaP50 EHaP70 EHaP90 R

10.0

Volume (ml) 7,51 1,07 5,37 0,54 3,50 0,23 *** 4,66 0,37 ** 4,75 0,38 *

b)

Grupo C EHaP50 EHaP70 EHaP90 R

4

Unidade de pH 1,61 0,12 1,98 0,13 2,95 0,30 *** 2,28 0,16 2,97 0,32 **

Volume (ml)

7.5

Unidades de pH

***
3 2

**

5.0

** ***

2.5

c)
0.0 C EHaP50 EHaP70EHaP90 500 mg/kg -id. R 0 C EHaP50 EHaP70 EHaP90 500 mg/kg - id. R

c) Grupo C EHaP50 EHaP70 EHaP90 R Acidez Total 76,71 + 7,12 59,99 + 7,18 30,73 + 4,35 *** 47,45 + 5,78 *** 25,98 + 1,41 ***

Acidez Total Eq [H ] / ml) (

100

75

50

** *** ***

25

0 C EHaP50 EHaP70 EHaP90 500 mg/kg - id. R

Figura 4.20: Efeito dos Extratos Brutos Hidroalcolicos (50, 70 e 90% em etanol) das razes de P. glomerata (EHaP50, EHaP70 e EHaP90) sobre a secreo cida gstrica. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 6 a 7 animais e representam o a) volume; b) pH; e c) acidez total da secreo gstrica, aps 4 horas da ligadura de piloro. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Tukey. * Diferente do grupo controle para p < 0,05; ** para p< 0,01; e *** para p, 0,001.

4.2.6.1a Determinao da Potncia (DE50) do EHaP70 na Atividade Anti-secretora cida Gstrica

No grupo controle, o volume de suco gstrico secretado foi de 7,7 0,4 ml; o pH de 1,8 0,1; e a acidez total de 68,4 3,7 Eq[H +]/ml, aps 4 horas da ligadura pilrica (Figura 4.21a, 4.21b e 4.21c).

O EHaP70 em doses de 100, 300 e 1000 mg/kg reduziu o volume do contedo gstrico em 36,4 42,9 e 50,6 %; respectivamente (Figura 4.21a). O EHaP70 em doses de 300 e 1000 mg/kg aumentou o pH do contedo gstrico em 0,7 e 1,5, respectivamente (Figura 4.21b).

a)

Grupo C EHaP70 (100 mg/kg) EHaP70 (300 mg/kg) EHaP70 (1000 mg/kg) R
9

Volume (ml) 7,7 0,4 4,9 0,3 4,4 0,2 *** 3,9 0,2 *** 4,9 0,3 ***

b)

Grupo C EHaP70 (100 mg/kg) EHaP70 (300 mg/kg) EHaP70 (1000 mg/kg) R
4

Unidade de pH 1,8 0,1 2,1 0,1 2,5 0,1 ** 3,3 0,2 *** 2,8 0,2 ***

Unidades de pH

***
3

Volume (mL)

*** *** ***

***

***

**

0 C 100 300 1000 EHaP70 (mg/kg - id.) R

0 C 100 300 1000 EHaP70 (mg/kg - id.) R

c)

Grupo C EHaP70 (100 mg/kg) EHaP70 (300 mg/kg) EHaP70 (1000 mg/kg) R

Acidez Total 68,4 3,7 64,4 3,3 36,0 3,5 *** 23,2 3,2 *** 34,2 2,9 ***

75

Acidez Total ( Eq [H +]/mL)

50

***
25

*** ***

0 C 100 300 1000 EHaP70 (mg/kg - id.) R

Figura 4.21: Efeitos do Extrato Bruto Hidroalcolico (70% em etanol) das razes de P. glomerata (EHaP70) sobre a secreo cida gstrica. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 6 a 7 animais e representam o a) volume; b) pH; e c) acidez total da secreo gstrica, aps 4 horas da ligadura de piloro. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Bonferroni. ** Diferente do grupo controle para p < 0,01; e *** para p, 0,001.

O EHaP70 em doses de 300 e 1000 mg/kg reduziu a acidez total do contedo gstrico secretado em 47,4 e 66,1 %; respectivamente (Figura 4.21c), com uma DE50 de 476 mg/kg. A administrao da ranitidina, controle positivo do teste, reduziu o volume e a acidez total do contedo secretado em 36,4 e 50 %, respectivamente; e aumentou o pH em 1,0 unidade (Figura 4.21a, 4.21b e 4.21c).

4.2.7 E STUDO DO MECANISMO DE AO ANTI-SECRETOR DE CIDO DE EHAP70

4.2.7.1 Efeito do EHaP70 sobre a Secreo cida Gstrica Estimulada por Histamina

No grupo controle, o volume de suco gstrico secretado foi de 6,7 0,1 ml; o pH de 1,79 0,3; e a acidez total de 67,7 7,5 Eq[H+ ]/ml (Figura 4.22a, 4.22b e 4.22c). A histamina (20 mg/kg), administrada pela via subcutnea (sc.) estimulou a liberao da secreo cida gstrica, secretado durante 4 h aps a ligadura do piloro, aumentando o volume e a acidez total do contedo gstrico em 43,0 e 44,6 %; respectivamente. A histamina tambm reduziu o pH do contedo gstrico em 0,6 unidades (Figura 4.22a, 4.22b e 4.22c). O EHaP70 (1000 mg/kg), administrado pela via intraduodenal (id.) uma hora antes da estimulao da secreo gstrica por histamina, impediu o aumento do volume e da acidez total do contedo gstrico em 52,2 e 34,7 %; respectivamente. A mesma dose de EHaP70 impediu a reduo do pH em 0,8 unidades (Figura 4.22a, 4.22b e 4.22c). A administrao da ranitidina, antagonista dos receptores H2 , impediu o aumento do volume e da acidez total do contedo gstrico secretado em 55,4 e 64,9 %; respectivamente; e impediu a queda do pH da secreo cida gstrica em 1,2 unidades (Figura 4.22a, 4.22b e 4.22c).

a)

Grupo Controle EHaP70 (100 mg/kg) + Histamina EHaP70 (300 mg/kg) + Histamina EHaP70 (1000 mg/kg) + Histamina Ranitidina (60 mg/kg) + Histamina Histamina (20 mg/kg)

Volume (ml) 6,7 0,1 8,7 1,2 8,3 1,2 5,1 1,4 +++ 4,7 0,3 +++ 10,6 0,4 **

b)

Grupo Controle EHaP70 (100 mg/kg) + Histamina EHaP70 (300 mg/kg) + Histamina EHaP70 (1000 mg/kg) + Histamina Ranitidina (60 mg/kg) + Histamina Histamina (20 mg/kg)
3

Unidade de pH 1,79 0,03 1,46 0,09 1,59 0,18 2,0 0,17 +++ 2,43 0,18 +++ 1,23 0,02 ** +++

12

**
Unidades de pH

Volume (ml)

+++
2

+++

+++

***
1

0 C H 100 300 1000 R EHaP70 (mg/kg - id.) Histamina (20 mg/kg - sc.)

0 C H 100 300 1000 R EHaP70 (mg/kg - id.) Histamina (20 mg/kg - sc.)

c)

Grupo Controle EHaP70 (100mg/kg) + Histamina EHaP70 (300mg/kg) + Histamina EHaP70 (1000mg/kg) + Histamina Ranitidina (60mg/kg) + Histamina Histamina (20mg/kg) 125

Acidez Total 67,7 7,5 94,9 4,5 ** 98,2 8,2 ** 68,7 0,1 +++ 36,9 3,7 +++ 105,2 2,6 ***

***
Acidez Total + ( Eq[H ]/ml)
100 75 50 25 0 C H

**

**
+++

+++

100

300

1000

EHaP70 (mg/kg - id.) Histamina (20 mg/kg - sc.)

Figura 4.22: Efeito do EHaP70 sobre a secreo cida gstrica estimulada por histamina. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 6 animais e representam: a) volume; b) pH; e c) acidez total da secreo gstrica, aps 4 horas da ligadura de piloro. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Bonferroni. ** Diferente do grupo controle para p < 0,01 e *** para p< 0,001.

4.2.7.2 Efeito do EHaP70 sobre a Secreo cida Gstrica Estimulada por Betanecol

No grupo controle, o volume de suco gstrico secretado foi de 8,0 0,7 ml; o pH de 1,79 0,3; e a acidez total de 64,2 5,2 Eq[H+ ]/ml (Figura 4.23a, 4.23b e 4.23c).

a)

Grupo Controle EHaP70 (100 mg/kg) + Betanecol EHaP70 (300 mg/kg) + Betanecol EHaP70 (1000 mg/kg) + Betanecol Atropina (3,0 mg/kg) + Betanecol Betanecol (2,5 mg/kg)
15

Volume (ml) 8,0 0,7 10,9 0,4 ** 10,5 0,7 * 7,0 0,3 +++ 3,3 0,1 +++ 12,14 0,7 ***

b)

Grupo Controle EHaP70 (100 mg/kg) + Betanecol EHaP70 (300 mg/kg) + Betanecol EHaP70 (1000 mg/kg) + Betanecol Atropina (3,0 mg/kg) + Betanecol Betanecol (2,5 mg/kg)
4

Unidade de pH 1,79 0,03 1,55 0,06 1,51 0,08 1,87 0,12 +++ 3,46 0,38 +++ 1,37 0,05 ***
+++

Volume (ml)

**
10

*
+++

Unidades de pH

***

+++

***
1 0

+++

0 C B 100 300 1000 EHaP70 (mg/kg - id.) Betanecol (2,5 mg/kg - sc.) Atrop

100

300

1000

Atrop

EHaP70 (mg/kg - id.) Betanecol (2,5 mg/kg - sc.)

c)

125

Grupo Controle EHaP70 (100 mg/kg) + Betanecol EHaP70 (300 mg/kg) + Betanecol EHaP70 (1000 mg/kg) + Betanecol Atropina (3,0 mg/kg) + Betanecol Betanecol (2,5 mg/kg)

Acidez Total 64,2 5,2 66,4 5,4 70,2 4,8 63,2 6,2 + 18,0 1,9 +++ 83,3 3,7 ***

Acidez Total + (Eq[H ]/ml)

100

***
75 50 25 0 C B 100 300 1000 Atrop EHaP70 (mg/kg - id.) Betanecol (2,5 mg/kg - sc.)

+++

Figura 4.23: Efeito do EHaP70 sobre a secreo cida gstrica estimulada por betanecol. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 6 animais e representam: a) volume; b) pH; e c) acidez total da secreo gstrica, aps 4 horas da ligadura de piloro. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Bonferroni. * Diferente do grupo controle para p < 0,05; ** para p < 0,01; e *** para p< 0,001. +Diferente do grupo betanecol para p < 0,05; e +++ para p < 0,001.

O betanecol (2,5 mg/kg), administrada pela via subcutnea (sc.) estimulou a liberao da secreo cida gstrica, secretado durante 4 h aps a ligadura do piloro, aumentando o volume e a acidez total do contedo gstrico em 49,1 e 70,2 %; respectivamente. O betanecol tambm reduziu o pH do contedo gstrico em 0,4 unidades (Figura 4.23a, 4.23b e 4.23c). O EHaP70 (1000 mg/kg), administrado pela via intraduodenal (id.) uma hora antes da estimulao da secreo gstrica por betanecol, impediu o aumento do volume e da acidez total do contedo gstrico em 42,3 e 24,1 %; respectivamente. A mesma dose de EHaP70 impediu a reduo do pH em 0,5 unidades (Figura 4.23a, 4.23b e 4.23c). A administrao da atropina, antagonista dos receptores muscarnicos, impediu o aumento do volume e da acidez total do contedo gstrico secretado em 77,4 e 78,4 %; respectivamente; e impediu a queda do pH da secreo cida gstrica em 2,1 unidades (Figura 4.23a, 4.23b e 4.23c).

4.2.7.3 Efeito do EHaP70 sobre a Secreo cida Gstrica Estimulada por Pentagastrina

No grupo controle, o volume de suco gstrico secretado foi de 7,0 0,3 ml; o pH de 1,79 0,3; e a acidez total de 57,6 3,2 Eq[H+ ]/ml (Figura 4.24a, 4.24b e 4.24c). A pentagastrina (0,4 mg/kg), administrada pela via subcutnea (sc.) estimulou a liberao da secreo cida gstrica, secretado durante 4 h aps a ligadura do piloro, aumentando o volume e a acidez total do contedo gstrico em 41,3 e 54,7 %; respectivamente. A pentagastrina tambm reduziu o pH do contedo gstrico em 0,5 unidades (Figura 4.24a, 4.24b e 4.24c). O EHaP70 (1000 mg/kg), administrado pela via intraduodenal (id.) uma hora antes da estimulao da secreo gstrica por pentagastrina, impediu o aumento da acidez total e a reduo do pH do contedo gstrico em 52,2 % e 1,3 unidades; respectivamente (Figura 4.24b e 4.24c). As doses de 300 e 1000 mg/kg de EHaP70 impediram o aumento do volume do contedo gstrico secretado em 30,3 e 64,0 %; respectivamente (Figura 4.24a).

a)
Grupo Controle EHaP70 (100mg/kg) + Pentagastrina EHaP70 (300mg/kg) + Pentagastrina EHaP70 (1000mg/kg) + Pentagastrina Pentagastrina (0,4g/kg)
12

b)
Volume (ml) 7,0 0,3 10,0 0,7 *** 7,7 0,6 +++ 4,0 0,2 ***+++ 11,1 0,5 *** Grupo Controle EHaP70 (100mg/kg) + Pentagastrina EHaP70 (300mg/kg) + Pentagastrina EHaP70 (1000mg/kg) + Pentagastrina Pentagastrina (0,4g/kg)
3

Unidade de pH 1,79 0,03 1,38 0,06 ** 1,58 0,10 2,63 0,15 ***+++ 1,29 0,05 ***
+++

***

+++

Unidades de pH

***

***

Volume (mL)

+++

***
1

**

***
3

0 C P 100 300 1000

0 C P 100 300 1000

EHaP70 (mg/kg - i d .) Pentagastrina (0.4 mg/kg - sc.)

EHaP70 (mg/kg - po. ) Pentagastrina (0.4 mg/kg - sc.)

c)

Grupo Controle EHaP70 (100mg/kg) + Pentagastrina EHaP70 (300mg/kg) + Pentagastrina EHaP70 (1000mg/kg) + Pentagastrina Pentagastrina (0,4g/kg)
100

Acidez Total 57,6 3,2 89,0 4,6 *** 85,7 4,8 ** 37,5 1,9 * +++ 83,7 8,1 ***

+ A c i d e z T o t a l ( q [ H ] / m L ) E

***

***

**

75

50

+++

*
25

0 C P 100 300 1000

E H a P 7 0 ( m g / k g - p o .) P e n t a g a s t r i n a ( 0 . 4 m g / k g - sc. ) Figura 4.24: Efeito do EHaP70 sobre a secreo cida gstrica estimulada por pentagastrina. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 6 animais e representam: a) volume; b) pH; e c) acidez total da secreo gstrica, aps 4 horas da ligadura de piloro. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Bonferroni. * Diferente do grupo controle para p < 0,05; ** para p < 0,01; e *** para p< 0,001. +++ Diferente do grupo pentagastrina para p < 0,001.

4.2.8 E FEITO DAS FRAES DE EHAP70 SOBRE A SECREO CIDA GSTRICA No grupo controle, o volume de suco gstrico secretado foi de 9,6 0,1 ml; o pH de 1,45 0,01; e a acidez total de 81,5 2,2 Eq[H+]/ml, aps 4 horas da ligadura pilrica (Figura 4.25a, 4.25b e 4.25c).

a)

Grupo C FAE(70) (4 mg/kg) FBut(70) (30 mg/kg) FAq(70) (325 mg/kg) FE(70) (45 mg/kg) EHaP(70) (760 mg/kg)
12

Volume (ml) 9,6 0,1 9,4 0,3 9,7 0,5 7,6 0,7 4,6 0,2 *** 5,2 0,4 ***

b)

Grupo C FAE(70) (4 mg/kg) FBut(70) (30 mg/kg) FAq(70) (325 mg/kg) FE(70) (45 mg/kg) EHaP(70) (760 mg/kg)

Unidade de pH 1,45 0,01 1,51 0,04 1,45 0,04 1,63 0,09 2,11 0,09 *** 1,99 0,14 ***

2.20 1.76

***

***

Unidades de pH

Volume (ml)

1.32 0.88 0.44 0.00

***
3

***

0 C 4 30 325 45 FE(70) FAE(70) FBut(70) FAq(70) 760 mg/kg - id. EHaP70

30

325

A FAE(70) FBut(70) F q(70)

45 760 mg/kg - id. FE(70) EHaP70

c) Grupo C FAE(70) (4 mg/kg) FBut(70) (30 mg/kg) FAq(70) (325 mg/kg) FE(70) (45 mg/kg) EHaP(70) (760 mg/kg) Acidez Total 81,5 2,2 81,8 2,7 81,5 4,3 78,6 5,6 45,7 5,2 *** 51,7 7,6 **

100 Acidez Total ( Eq[H + ]/ml)

75

50

***

**

25

0 C 4 30 325 FAE(70) FBut (70) FAq(70) 45 760 mg/kg - id. FE(70) EHaP70

Figura 4.25: Efeito das fraes de EHaP70 sobre a secreo cida gstrica. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam: a) volume; b) pH; e c) acidez total da secreo gstrica, aps 4 horas da ligadura de piloro. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Tukey. ** Diferente do grupo controle para p < 0,01 e *** para p< 0,001.

Dentre as fraes de EHaP70 testadas, a FE(70) foi a nica ativa. A FE(70), na dose de 45 mg/kg reduziu o volume em 52,4 %; aumentou o pH em 0,66 unidades; e reduziu a acidez total em 43,9 % (Figura 4.25a, 4.25b e 4.25c).
A administrao de EHaP70 (760 mg/kg), utilizado como controle positivo do teste, reduziu o volume e a acidez total do contedo secretado em 46,4 e 36,5 %, respectivamente; e aumentou o pH em 0,55 unidades (Figura 4.25a, 4.25b e 4.25c).

4.2.8.1 Determinao da Potncia (DE50) da FE(70) na Atividade Antisecretora cida Gstrica No grupo controle, o volume de suco gstrico secretado foi de 7,7 0,6 ml; o pH de 1,68 0,07; e a acidez total de 67,9 3,9 Eq[H+]/ml, aps 4 horas da ligadura pilrica (Figura 4.26a, 4.26b e 4.26c). A FE(70) em doses de 45, 300 e 500 mg/kg reduziu o volume do contedo gstrico em 40,1; 60,9 e 62,4 %; respectivamente (Figura 4.26a); aumentou o pH em 0,44; 2,1 e 3,2 unidades; respectivamente; e reduziu a acidez total em 32,7; 80,5 e 87,0 %; respectivamente (Figura 4.26a, 4.26b, 4.26c); com uma DE50 de 62,4 5,4 mg/kg. A administrao de ranitidina (60 mg/kg), utilizada como controle positivo do teste, reduziu o volume e a acidez total do contedo secretado em 19,8 e 38,7 %, respectivamente; e aumentou o pH em 0,65 unidades (Figura 4.26a, 4.26b e 4.26c)

a)

10 8 6 4 2 0

Grupo C FE(70) (45 mg/kg) FE(70) (300 mg/kg) FE(70) (500 mg/kg) Ranitidina (60 mg/kg)

Volume (ml) 7,7 0,6 4,6 0,2 *** 3,0 0,1 *** 2,9 0,1 *** 6,1 0,5

b)

6.0

Grupo C FE(70) (45 mg/kg) FE(70) (300 mg/kg) FE(70) (500 mg/kg) Ranitidina (60 mg/kg)

Unidade de pH 1,68 0,07 2,11 0,09 3,77 0,17 *** 4,86 0,31 *** 2,33 0,09

Unidades de pH

Volume (ml)

4.8 3.6 2.4 1.2 0.0 C 45 300

*** ***

*** *** ***

45

300

500

500

F E(70) (mg/kg - id.)

F E(70) (mg/kg - id.)

c)

75

Grupo C FE(70) (45 mg/kg) FE(70) (300 mg/kg) FE(70) (500 mg/kg) Ranitidina (60 mg/kg)

Acidez Total 67,9 3,9 45,7 5,3 ** 13,2 1,9 *** 8,8 1,8 *** 45,7 5,3 ***

Acidez Total

( Eq[H ]/ml)

60

**
45 30 15 0 C 45 300 500

***

***

***
R

F E (70) (mg/kg - id.)

Figura 4.26: Efeito da FE(70) sobre a secreo cida gstrica. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam: a) volume; b) pH; e c) acidez total da secreo gstrica, aps 4 horas da ligadura de piloro. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Tukey. ** Diferente do grupo controle para p < 0,01 e *** para p< 0,001.

4.2.9 E STUDO DO MECANISMO DE AO ANTI-SECRETOR DE CIDO DA FE(70) 4.2.9.1 Efeito da FE(70) in vitro sobre a atividade da H+/K +-ATPase gstrica isolada de coelho A Atividade da H+ /K+-ATPase, na ausncia da FE(70) foi de 3,96 0,20 M Pi/mg/min (Figura 4.27) A FE(70) inibiu a Atividade da H+/K+-ATPase de forma dependente da concentrao, com uma CI50 de 640 155
120

g/ml (Figura 4.27).

110

100

y = (m1*100)/(m1+m0) Value Error IC50 639.89 155.08 Chisq 367.78 NA R 0.93169 NA

90

80

70

60

50 0 100 200 300 400 500 600 700

FE(70) (g/ml)
Figura 4.27: Efeito da FE(70) sobre a atividade da H+/K+- ATPase gstrica isolada de coelho. Os resultados esto expressos em % da Atividade ATPsica, considerando 100% de atividade da H+/K+ - ATPase na ausncia da FE(70). As CI50 s foram calculadas pela equao y = (m1x100)/(m1+m0), utilizando o programa Kaleida Graph for Windows (Synergy Software-Pennsylvania).

4.2.9.2 Efeito do Omeprazol e da Ouabana in vitro sobre a Atividade da ATPase Gstrica Isolada de Rato

A Atividade da ATPase isolada da mucosa gstrica de ratos foi de 3,3 0,1 M Pi/mg/min (Figura 4.28a e 4.28b). A ouabana (0,1 a 1,0 mM) no alterou a atividade ATPsica (Figura 4.37a), enquanto o omeprazol nas concentraes de 1,0 e 1,5 mM inibiu a

atividade da ATPase em 49,4 e 61,5 %, respectivamente (Figura 4.28b); com uma CI50 de 1,2 mM (Figura 4.29).

a)
Atividade H , K - ATPase ( M Pi/mg/min)

b)
Atividade H+, K+ - ATPase ( M Pi/mg/min)

** **

0 0 0,10 0,25 0,50 0,75 1,00

0 0 0,10 0,25 0,50 1,00 1,50

Ouabana (mM)

Omeprazol (mM)

Figura 4.28: Efeito do Omeprazol e da Ouabana sobre a atividade da ATPase gstrica isolada de ratos. Os resultados esto expressos como mdia erro padro das mdias de 3 microssomos gstricos, isolados do grupo sham da ligadura pilrica. A correlao da atividade ATPsica entre a presena e a ausncia de inibidores foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Bonferroni. ** Diferente da atividade ATPsica na ausncia de inibidor para p < 0,01.

110

100

Omeprazol Ouabana

Atividade ATPsica (%)

90

80

70

60

y = (m1*100)/(m1+m0) = (m1*100)/(m1+m0)

50

Omeprazol IC50 Chisq

m1

Value Value Error 90 389.27

Error

40

Chisq R R

1.1803 NA 0.14749 209.28 149.03 NA NA 1.79e+308 0.97554

0.3

NA
0.6 0.9 1.2 1.5

30 0

Inibidor de ATPase (mM)

Figura 4.29: Efeito do Omeprazol e da Ouabana sobre a atividade da ATPase gstrica isolada de rato. Os resultados esto expressos em % da Atividade ATPsica, considerando 100% de atividade da ATPase na ausncia dos inibidores. As CI50 s foram calculadas pela equao y = (m1x100)/(m1+m0), utilizando o programa Kaleida Graph for Windows (Synergy Software-Pennsylvania).

4.2.9.3 Atividade da H+/K +-ATPase Isolada da Mucosa Gstrica de Ratos Tratados com FE(70) A atividade da H+/K+-ATPase gstrica isolada do grupo sham foi de 1,6 0,2 M Pi / mg/ min (Figura 4.30).

A atividade da H +/K+-ATPase gstrica do grupo de animais submetidos s 4 h de ligadura pilrica aumentou em 1,9 vezes, quando comparados ao grupo sham (Figura 4.30). A atividade da H+/K+-ATPase gstrica do grupo tratado com a FE(70) (100 mg/kg) pela via intraduodenal, aps 4 h de ligadura pilrica, foi inibida em 35,9 % (Figura 4.30). A cimetidina, antagonista dos receptores H2 , no alterou significativamente a atividade ATPsica (Figura 4.30).

Atividade H , K - ATPase ( M Pi/mg/min)

*
2

0 Sham C FE70 100 mg/kg Cimetidina 80 mg/kg id.

Ligadura pilrica (4h) Figura 4.30: Efeito da FE(70) sobre a atividade da H+/K+- ATPase gstrica isolada rato. Os resultados esto expressos como mdia erro padro das mdias da atividade ATPsica de 3 a 4 microssomos gstricos isolados dos animais, aps 4 h de ligadura pilrica. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Bonferroni. * Diferente do grupo controle para p < 0,05. Diferente do grupo sham para p < 0,01.

4.2.9.4 Caracterizao da H+/K +-ATPase Isolada da Mucosa Gstrica de Ratos Tratados com a FE(70) A cintica enzimtica da H+/K+ -ATPase gstrica de todos os grupos est ilustrada na tabela 4.11 e figura 4.31. A Vmx e o Km da H+/K+-ATPase gstrica isolada do grupo sham foi de 2,65 0,11 M Pi/mg/min e 4,9 2,1 M de ATP, respectivamente (Tabela 4.9).

A Vmx da atividade da H+ /K+-ATPase gstrica do grupo de animais submetidos s 4 h de ligadura pilrica aumentou em 28,0 %, quando comparados ao grupo sham (Tabela 4.9). A Vmx da atividade da H+ /K+-ATPase gstrica do grupo tratado com a FE(70) (100 mg/kg) pela via intraduodenal, reduzida em 13,6 % (Tabela 4.9). A Vmx da atividade da H+ /K+-ATPase gstrica do grupo tratado com a cimetidina, antagonista dos receptores H2, foi reduzida em 7,4 % (Tabela 4.9). Nenhuma diferena foi observada entre as Km e a eficincia da enzima (Vmx/Km) dos diferentes grupos (Tabela 4.9).
3.5

aps 4 h de ligadura pilrica, foi

Atividade H/K -ATPase (M Pi/mg/min)

3.0

Controle Cimetidina FE Sham

2.5

2.0

1.5 0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

ATP - mM
Figura 4.31: Caracterizao da H/K - ATPase Isolada da Mucosa Gstrica de Ratos. Os resultados esto expressos como mdia erro padro das mdias da atividade da H+/K+- ATPase de 3 a 4 microssomos gstricos isolados dos animais, aps 4 h de ligadura pilrica:
+ +

Tabela 4.9: Caracterizao da H /K -ATPase Isolada da Mucosa Gstrica de Ratos Grupo

(M Pi formado.mg-1.min -1)

Vmx

Km
(M ATP)

(M Pi formado.mg-1.min -1/ M ATP) 0,543

Vmx/km

Sham

2,652 0,113

4,89 2,1

Controle FE(70) (100 mg/kg id.) Cimetidina

(80 mg/kg id.)

3,396 0,104

6,78 1,63

0,501

2,933 0,127 ** 3,145 0,083 *

5,33 1,33

0,550

5,57 1,63

0,565

Diferente do grupo Sham para p < 0,001. * Diferente do grupo controle para p < 0,05; e ** para p < 0,01.

4.2.10 ENVOLVIMENTO DO XIDO NTRICO NO EFEITO GASTROPROTETOR DO EHAP70 E

DA FE(70)

4.2.10.1 Efeito do EHaP70 sobre a Secreo cida Gstrica e nos Nveis de xido Ntrico (NO) Gstrico

O volume e a acidez total do contedo gstrico secretado durante 4 h, assim como os nveis de NO na secreo, no fundo e na regio glandular gstrica de todos os grupos esto descritos na tabela 4.10. O EHaP70 (760 mg/kg), administrado pela via intraduodenal, reduziu o volume de cido secretado em 36,8 %; reduziu a acidez do contedo gstrico em 34,8 %; aumentou os nveis de NO liberado na secreo cida gstrica em 80,9 %; e ainda aumentou os nveis de NO presente no fundo e na regio glandular gstrica em 66,1 e 66,3 %, respectivamente, quando comparados ao grupo controle (Tabela 4.10). O L-NAME (120 mg/kg), administrado pela via oral, reduziu os nveis de NO liberado na secreo cida gstrica em 67,2 %, mas no alterou os nveis de NO do tecido gstrico (fundo e regio glandular gstrica) (Tabela 4.10).
Tabela 4.10: Efeito de EHaP70 na secreo cida gstrica e nos nveis de xido ntrico gstricos. Secreo gstrica Grupo Volume
(ml) ( Eq[H+]/ml)

[NOx ] Secreo
( g)

gstrico Regio glandular

(ug/g tecido)

Acidez

Fundo
(ug/g tecido)

Controle EHaP70
(760 mg/kg id.)

7,6 1,9

75,0 17,5

97,0 15,8

12,1 1,4

20,7 1,4

4,8 1,1 /* 2,8 0,3 / ***

48,9 15,5 /* 15,7 5,3 / ***

175,5 23,6 ** 52,9 8,9 * 31,8 14,4 *

20,1 2,0 * 14,9 2,6

33,8 3,4 * 27,3 3,4

EHaP70 + L-NAME L-NAME

(120 mg/kg v.o.)

8,7 1,1

83,3 5,3

6,4 1,6

15,1 3,5

* Diferente do grupo controle para p < 0,05; ** para p < 0,01; e *** para p < 0,001. Diferente do grupo L-NAME para p < 0,05; e para p < 0,001.

O EHaP70 no impediu a queda dos nveis de NO na secreo cida gstrica induzida pelo L-NAME. No fundo e na regio glandular gstrica, manteve os nveis em 14,9 2,6 e 27,3 3,4 4.10). g NO/g tecido; respectivamente (Tabela

4.2.10.2 Efeito do EHaP70 e da Indometacina sobre a Secreo cida Gstrica e os Nveis de xido Ntrico (NO) Gstrico

A acidez do contedo gstrico e os nveis de NO na regio glandular gstrica do grupo controle foram de 75,1 17,5 Eq[H+]/ml e 20,7 1,4 ug de NO/g tecido, respectivamente (Figuras 4.32a e 4.32b). A indometacina (10 mg/kg), administrada pela via subcutnea (sc.), no alterou a acidez da secreo cida gstrica, mas reduziu os nveis de NO da regio glandular gstrica em 48,5 % (Figuras 4.32a e 4.32b). O EHaP70 (760 mg/kg) reduziu a acidez da secreo cida gstrica e aumentou os nveis de NO em 34,9 e 63,0 %, respectivamente, quando comparado ao grupo controle (Figuras 4.32a e 4.32b).

a)
100

Secreo gstrica

b)
40

Regio glandular gstrica

NOx g NOx/mg tecido) (

**
lll

30

Acidez Total ( Eq[H+]/ml)

75

50

20

25

*
10 0

0 C EHaP70 Indo + EHaP70 Indo EHaP70 (760 mg/kg - id.) Indometacina (10 mg/kg - sc.) Ligadura Pilrica (4h)
C EHaP70 EHaP70+ Indo Indo

EHaP70 (760 mg/kg - id.) Indometacina (10 mg/kg - sc.) Ligadura Pilrica (4h)

Figura 4.32: Efeito do EHaP70 e da indometacina sobre a secreo cida gstrica e os nveis de xido ntrico (NO) gstrico.Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam: a) acidez total da secreo cida gstrica; e b) nveis de NOx na regio glandular gstrica; aps 4 horas da ligadura de piloro. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Bonferroni. * Diferente do grupo controle para p < 0,05; e ** para p < 0,01. Diferente do grupo Indometacina para p < 0,001.

O EHaP70 impediu a queda dos nveis de NO, na regio glandular gstrica, induzida pela indometacina e aumentou os nveis em 2,8 vezes (Figura 4.32b).

4.2.10.3 Efeito da FE(70) na Secreo cida Gstrica e nos Nveis de xido Ntrico (NO) Plasmtico e Gstrico

O volume e a acidez total do contedo gstrico secretado durante 4 h, assim como os nveis de NO na secreo, no fundo, na regio glandular gstrica e no plasma de todos os grupos esto descritos na tabela 4.11. A FE(70) (100 mg/kg), administrada pela via intraduodenal, reduziu o volume e a acidez do cido secretado em 41,5 e 43,8 %; respectivamente (Tabela 4.11). A cirurgia da ligadura pilrica no alterou significativamente os nveis de NO na secreo, no fundo, na regio glandular gstrica e no plasma dos animais, quando comparamos o grupo sham com o grupo controle (Tabela 4.11).
Tabela 4.11: Efeito da FE(70) na secreo cida gstrica e nos nveis de xido ntrico plasmtico e gstrico. Secreo gstrica Grupo Volume
(ml) ( Eq[H+]/ml)

[NOx ] Secreo
( g)

gstrico Regio glandular

(ug/g tecido) 10,3 5,7

[NOx ] Plasmtico
(ug/ml plasma)

Acidez

Fundo
(ug/g tecido)

Sham

-- x --

-- x --

-- x --

12,1 2,5

2,97 0,32

Controle FE(70) (100 mg/kg id.) Cimetidina

(80 mg/kg id.)

5,3 0,3

52,5 2,4

97,1 6,5

10,1 1,9

23,8 7,6

1,86 0,35

3,1 0,2 *** 3,1 0,1 ***

22,9 4,9 *** 17,3 2,0 ***

106,6 12,0

28,5 3,9 ** 19,0 3,2

31,2 4,1

5,15 0,75 ***

73,2 13,8

44,0 12,5

1,55 0,40

-- x -- no quantificado ** Diferente do grupo controle para p < 0,01; e *** para p < 0,001.

A administrao de cimetidina (80 mg/kg), utilizada como controle positivo do teste, reduziu o volume e a acidez total do contedo secretado em 41,5 e 67,0 %, respectivamente, mas no alterou os nveis de NO no plasma e nas regies gstricas (Tabela 4.11).

A FE(70) (100 mg/kg), administrada pela via intraduodenal, aumentou em 2,8 vezes os nveis de NO tanto fundo gstrico quanto no plasma dos animais (Tabela 4.11).

4.2.10.4 Efeito da FE(70) sobre os Nveis de GSH Plasmtico e Gstrico

Os nveis de GSH do fundo, da regio glandular gstrica e do plasma de todos os grupos, aps 4 h de ligadura pilrica, esto descritos na tabela 4.12. A cirurgia da ligadura pilrica aumentou os nveis de GSH na regio glandular gstrica em 95,7 % (Tabela 4.12). A FE(70) (100 mg/kg), administrada pela via intraduodenal, no alterou os nveis de GSH gstricos e plasmtico, quando comparados ao grupo controle (Tabela 5.12). A administrao de cimetidina (80 mg/kg), utilizada como controle positivo do teste, reduziu os nveis de GSH na regio glandular gstrica em 48,3 % (Tabela 4.12).
Tabela 4.12: Efeito da FE(70) na secreo cida gstrica e nos nveis de GSH plasmtico e gstrico. GSH Grupo Sham Fundo
(ug/g tecido) 733 40

Regio glandular
(ug/g tecido) 513 89

Plasmtico
(ug/ml plasma) 536 76

Controle

650 32

1004 95

598 60

FE(70) (100 mg/kg id.) Cimetidina

(80 mg/kg id.)

604 23

1197 91

628 100

712 61

519 57 ***

643 65

Diferente do grupo Sham para p < 0,001. *** Diferente do grupo controle para p < 0,001.

4.2.11 AVALIAO DA MOTILIDADE GASTRINTESTINAL

4.2.11.1 Efeito dos EHaPs sobre o Esvaziamento Gstrico de Semislidos

O esvaziamento gstrico do grupo controle (veculo), 30 minutos e 1 hora antes da administrao vermelho de fenol (marcador), foi de 77,6 2,7 e 76,7 2,2 %, respectivamente (Figura 4.33). O tratamento com o EHaP50 (1000 mg/kg), 30 minutos antes da administrao do vermelho de fenol, inibiu o esvaziamento gstrico em 63 %. O tratamento com o EHaP50 (1000 mg/kg), 1 hora antes da administrao do vermelho de fenol, no alterou o esvaziamento gstrico (Figura 4.33). O tratamento com o EHaP70 (1000 mg/kg), 30 minutos e 1 hora antes da administrao do vermelho de fenol, inibiu o esvaziamento gstrico em 29 e 37 %, respectivamente (Figura 4.33).

Esvaziamento Gstrico (%) Tempo entre o tratamento e o marcador (min) 30 60

100

Controle
(gua)

EHaP50
(1000 mg/kg v.o.)

EHaP70
(1000 mg/kg v.o.)

77,6 2,7 76,7 2,2

28,6 5,4 *** 71,2 6,9

100

55,0 5,2 *** 48,0 5,1 ***

Esvazimento Gstrico (%)

75

Esvazimento Gstrico (%)

Controle (veculo) EHaP50 (1000 mg/kg - v.o.)

Controle (veculo) EHaP70 (1000 mg/kg - v.o.)

75

***
50

50

***

***
25

25

0 30 60

0 30 60

Tempo (min)

Tempo (min)

Figura 4.33: Efeito do EHaP50 e EHaP70 sobre o esvaziamento gstrico. Os resultados esto expressos como mdia erro padro da mdia de 6 a 8 animais e correspondem as porcentagens de esvaziamento gstrico. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Bonferroni. *** Diferente do grupo controle para p < 0,001.

4.2.11.2 Efeito dos EHaPs sobre o Trnsito intestinal

O trnsito intestinal (distancia percorrida pelo marcador em relao ao comprimento total do intestino delgado) do grupo controle, 30 minutos e 1 hora antes da administrao do marcador, foi de 58,4 3,6 e 58,0 3,6 %, respectivamente (Figura 4.34). O EHaP50 (1000 mg/kg) e o EHaP70 (1000 mg/kg), administrados 30 minutos e 1 hora antes do marcador, no alteraram o transito intestinal (Figura 4.34).

Distncia Tempo entre o tratamento e o marcador (min) 30 60 Controle

(gua)

Percorrida pelo EHaP50

(1000 mg/kg v.o.)

Marcador (%) EHaP70

(1000 mg/kg v.o.)

58,4 3,6 58,0 3,6

47,7 7,2 68,3 4,5

51,9 11,2 64,2 3,4

Trnsito intestinal (%)

75

Trnsito intestinal (%)

100

Controle (veculo) EHaP50 (1000 mg/kg - v.o.)

100

Controle (veculo) EHaP70 (1000 mg/kg - v.o.)

75

50

50

25

25

0 30 60

0 30 60

Tempo (min)

Tempo (min)

Figura 4.34: Efeito do EHaP50 e EHaP70 sobre o trnsito intestinal. Os resultados esto expressos como mdia erro padro da mdia de 5 a 6 animais e correspondem as porcentagens da distncia percorrida pelo marcador em relao ao comprimento total do intestino delgado. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Bonferroni. *** Diferente do grupo controle para p < 0,001.

4.2.11.3 Efeito dos EHaP50 sobre a Diarria Induzida por leo de Rcino
O grupo controle apresentou um tempo de induo de episdios secos de 6,2 0,6 min, tempo de induo de episdios midos de 42,7 7,0 min, totalizando um nmero de 12,5 2,1 ocorrncias de episdios midos, com um peso total (episdios secos e midos) de 474 23 mg (Figura 4.35a, 4.35b, 4.35c e 4.35d).

O EHaP50, nas doses administradas, no alterou o tempo de induo de episdios secos e midos, nem o nmero e o peso dos episdios (Figura 4.35a, 4.35b, 4.35c e 4.35d). A loperamida, controle positivo do teste, reduziu em 80,0 % a ocorrncia dos episdios midos e em 61,0 % o peso total dos episdios (secos e midos) (Figura 4.35c e 4.35d).

a)
Grupo CONTROLE (0,1ML/KG) EHaP50 (250 mg/kg) EHaP50 (500 mg/kg) Loperaminda (5 mg/kg)
50 40 30 20 10 0 C

Tempo de induo de episdios secos (min) 6,2 0,6 9,5 5,3 8,6 5,3 30,2 14,02

b)
Grupo CONTROLE (0,1ML/KG) EHaP50 ( 250 mg/kg) EHaP50 (500 mg/kg) Loperaminda (5 mg/kg)
60

Tempo de induo de episdios midos (min) 42,7 7,0 41,7 4,0 38,0 3,7 50,0 5,6

Tempo de induo de episdios midos (min)

250 500 EHaP50 -mg/kg- v.o. L

Tempo de induo de episdios secos (min)

48 36 24 12 0 C 250 500 EHaP50 -mg/kg- v.o. L

c)
Grupo CONTROLE (0,1ML/KG) EHaP50 (250 mg/kg) EHaP50 (500 mg/kg) Loperaminda (5 mg/kg)
15 12 9 6 3 0 C 250 500 EHaP50 -mg/kg- v.o. L

d)
Quantidade de episdios midos 12,5 2,1 10,3 1,3 12,8 1,7 2,5 0,8 *** Grupo CONTROLE (0,1ML/KG) EHaP50 (250 mg/kg) EHaP50 (500 mg/kg) Loperaminda (5 mg/kg)
750

Peso total de episdios secos e midos (mg) 474 23 561 72 524 60 185 38 **

Peso total de episdios secos e midos (mg)

Quantidade de episdios midos

600 450 300

***

**
150 0 C 250 500 EHaP50 -mg/kg- v.o. L

Figura 4.35: Efeito do EHaP50 sobre a diarria induzida por leo de rcino. Os resultados esto expressos como mdias erro padro das mdias de 5 a 6 animais e representam: a) tempo para a induo de episdios secos b) tempo para a induo de episdios midos; c) quantidade de episdios midos; e d) peso total de episdios secos e midos. A correlao entre os grupos foi verificada atravs da anlise da varincia (ANOVA) seguida do Teste de Tukey. ** Diferente do grupo controle para p < 0,01 e *** para p< 0,001.

5 DISCUSSO

No Brasil, vrias espcies do gnero Pfaffia (famlia Amaranthaceae) so utilizadas em substituio ao ginseng (Panax ginseng), sendo conhecidas como gingeng-brasileiro. Entre essas espcies so citadas: a P. glomerata (Spreng) Pedersen, a P. iresinoides Sprengel e a P. paniculata (Mart) Kuntze (SHIOBARA et al., 1992). Assim como ocorre com o ginseng, o uso da Pfaffia tornou-se uma panacia, sendo popularmente denominada como paratudo. Dentre as vrias indicaes teraputicas, o ginseng-brasileiro tambm utilizado para tratar distrbios do aparelho digestivo (OLIVEIRA, 1986). Em nosso laboratrio foram realizados estudos com diferentes extratos obtidos da Pfaffia sp (Tabela 5.1), validando esta indicao popular. Tabela 5.1: Efeito gastroprotetor de extratos da Pfaffia sp.
Efeito anti-secretor de cido gstrico Estimulado por Basal etanol indometacina estresse Hidroalcolico (Pfaffia sp)
(FREITAS et al., 2003)

Efeito anti-lcera contra Extrato

Histamina

Betanecol Pentagastrina

Aquoso (P. glomerata)

(FREITAS et al., 2004)

Hidroalcolico (P. glomerata)

(OTOFUJI et al., 2003) Efeito positivo Efeito negativo

Dentre os estudos realizados (Tabela 5.1), o extrato hidroalcolico das razes da P. glomerata apresentou maior espectro de ao nos diferentes modelos experimentais utilizados. Entretanto, os mecanismos de ao e os constituintes qumicos responsveis pelas atividades anti-secretora e protetora gstrica ainda

no foram determinados. Portanto, o objetivo deste estudo foi identificar vias envolvidas no mecanismo de ao do extrato hidroalcolico das razes de Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen responsveis por seu efeito protetor gstrico e identificar os princpios ativos responsveis por estas aes, atravs de um fracionamento biomonitorado. As aes anti-lcera e anti-secretora das razes da P. glomerata parecem estar relacionadas a compostos de polaridades diferentes, pois dentre os trs extratos brutos (EHaP50, EHaP70 e EHaP90), o EHaP50 foi o mais efetivo contra as leses induzidas pelo etanol, porm no foi capaz de reduzir a secreo cida gstrica no modelo da ligadura pilrica. J o EHaP70 foi o mais efetivo em reduzir a secreo cida gstrica, mas no foi capaz de proteger a mucosa gstrica contra as leses induzidas por etanol. Com estes resultados foi ento determinado que os processos de purificao e os estudos dos mecanismos de ao seriam realizados a partir dos extratos mais ativos em cada modelo. Antes de iniciar a purificao dos extratos, a atividade protetora gstrica do EHaP50 foi caracterizada nos modelos de induo de leses por agente necrosante (etanol), por estresse (imobilizao e frio) e por antiinflamatrio no esteroidal (indometacina). Estes modelos clssicos de leso gstrica aguda que utilizam etanol, indometacina e estresse para a induo de lceras no representam integralmente a patologia humana, uma vez que as leses gstricas em roedores so superficiais, mltiplas e induzidas por diferentes mecanismos. No entanto, estes modelos experimentais fornecem importantes indicativos da ao de produtos sobre o trato gastrointestinal, j que o uso abusivo de lcool, o estresse excessivo e contnuo e o uso crnico de AINEs so as causas mais freqentemente envolvidas na etiologia das patologias gstricas no homem (LEVENSTEIN et al, 1998; RAIHA et al, 1998; SCHMASSMANN, 1998). O EHaP50 foi efetivo em proteger a mucosa gstrica nos trs modelos utilizados (etanol, indometacina e estresse), sugerindo que nas razes da P. glomerata existem princpios ativos capazes de aumentar os fatores de proteo gstrica. Como o EHaP50 foi 2,8 vezes mais potente em proteger contra leses induzidas por etanol (DE50 = 314mg/kg) do que leses induzidas por indometacina (DE50 = 908mg/kg) e por estresse (866mg/kg), passamos a utilizar a metodologia de leso induzida por etanol para monitorar o fracionamento do EHaP50.

Apesar das trs fraes do EHaP50 (FAE(50), FBut(50) e FAq(50) ) terem protegido a mucosa contra as leses induzidas por etanol, a DE50 real da FBut(50) foi a que mais se aproximou da DE50 terica, sugerindo que os princpios ativos gastroprotetores do EHaP50 foram melhor purificados com este solvente (nbutanol). Alm disso, a FBut(50) (DE50 = 14,8 mg/kg) protegeu a mucosa gstrica contra as leses induzidas por etanol com uma potncia 20 vezes maior do que o extrato que lhe deu origem (DE50 de EHaP50 = 314 mg/kg). Portanto, escolhemos esta frao (FBut(50)) para dar continuidade aos estudos. Estudos recentes demonstraram que a purificao com n-butanol de extratos hidroalcolicos das razes de P. glomerata, coletadas em diferentes regies, apresentaram um teor de 13,5 2,0% de saponinas totais (VIGO et al, 2003). Para verificar se a proteo da mucosa gstrica demonstrada pela FBut(50) estava ocorrendo devido a presena de saponinas nesta frao, saponinas foram precipitadas com ter (fracionamento A), obtendo as fraes precipitado (FPB(50)) e sobrenadante (FSB(50)) de FBut(50). Entretanto, nenhuma dessas fraes protegeu a mucosa gstrica contra as leses induzidas por etanol, sugerindo que a gastroproteo produzida pela P. glomerata no esteja ocorrendo apenas pela presena destas saponinas nas razes, mas pela interao de e/ou com outros grupos qumicos presentes na frao. Como as fraes obtidas por precipitao com ter no apresentaram atividade, a FBut(50) foi particionada com clorofrmio (fracionamento B), obtendo-se: a frao clorofrmica (FCB(50)), a frao aquosa ( AqB(50)) e a frao emulso F (FEB(50) ). A FEB(50) foi a nica ativa com uma DE50 de 3,3 mg/kg. Esta frao protegeu a mucosa gstrica contra as leses induzidas pelo etanol com uma potncia 95 vezes maior do que o EHaP50, sugerindo que o efeito gastroprotetor no esteja ocorrendo apenas pela formao de uma barreira mecnica (j que a concentrao da FEB(50) administrada foi baixa), e que existe no EHaP50 um princpio ativo capaz de proteger a mucosa gstrica contra as leses agudas induzidas por etanol atravs de um mecanismo de ao mais especfico. Na seqncia, a frao emulso (FEB(50)) foi fracionada em coluna cromatogrfica, originando 4 fraes (FEB1(50), FEB2(50), FEB3 (50) e FEB4(50) ). Nenhuma dessas fraes protegeu a mucosa gstrica contra as leses induzidas por etanol. Neste experimento, foi testada tambm, como controle positivo, a frao de origem (FEB(50)), na dose que foi efetiva em 80%. Entretanto, essa dose de

FEB(50) no protegeu mais a mucosa gstrica contra as leses como havia feito antes. Fomos ento verificar, em experimentos anteriores, a porcentagem de proteo gstrica obtida com o extrato da P. glomerata e com suas fraes durante os ltimos 3 a 5 meses. Observamos que o extrato bruto teve sua atividade protetora gstrica preservada, enquanto a FBut(50) perdeu 44% de sua atividade e a FEB(50) tornou-se inativa. Esses resultados sugerem que o princpio ativo das razes da P. glomerata, ao ser fracionado, pode perder a estabilidade qumica, levando a diminuio da atividade gastroprotetora. Como as fraes de EHaP50 perderam a atividade conforme descrito anteriormente, ao invs de prosseguir at obter um principio ativo isolado, preparamos um novo lote do extrato bruto e da frao butanlica. Para verificar a atividade deste novo lote, o EHaP50 e a FBut(50) foram testados novamente no modelo de leses induzidas por etanol. Este EHaP50 protegeu a mucosa gstrica com uma potencia semelhante (DE50 = 301 170 mg/kg) ao EHaP50 obtido anteriormente (DE50 = 314 130 mg/kg). As fraes butanlicas (FBut(50)) do lote atual e do anterior, com a dose de 100 mg/kg, protegeram a mucosa gstrica na mesma proporo (71- e 88%). Com a atividade gastroprotetora de EHaP50 e da FBut(50) confirmada, partimos para a investigao do mecanismo de ao. Como os agentes necrosantes, tais como o etanol, aumentam os nveis de peroxidao lipdica e reduzem os nveis de glutationa reduzida na mucosa gstrica (SALIM, 1990; KWIECIE et al., 2002), fomos verificar se a gastroproteo promovida pelos constituintes da P. glomerata estava ocorrendo por alteraes em enzimas antioxidantes. Para isso, preparamos citosis de tecido gstrico de ratos e caracterizamos as enzimas glutationa S-transferase (GST) e a NADP(H):quinona oxidorredutase-1 (NQO1) gstricas. Os dados obtidos mostraram uma cintica de reao similar s obtidas por outros pesquisadores em outros tecidos (SANCHEZ et al., 2003). Com as enzimas j caracterizadas, induzimos as leses gstricas em animais pr-tratados com o EHaP50 e com a FBut(50), quantificamos os nveis de GSH e a atividade das enzimas NQO1 e GST gstricas desses animais. Na literatura existem alguns trabalhos demonstrando que o etanol reduz os nveis de GSH assim como a atividade da GST (SALIM, 1990; PUSHPAKIRAN et al., 2004). Em nossos experimentos o etanol induziu um pequeno aumento da atividade da GST e a reduo dos nveis de GSH, sugerindo que o etanol estava efetivamente

reagindo com a GST, pois esta enzima promove a detoxificao de substncias atravs da conjugao com o GSH (Revisado por CNUBBEN, 2001). O EHaP50 impediu a reduo dos nveis de GSH e o aumento da atividade da GST induzido pelo etanol, sugerindo que o EHaP50 protege a mucosa gstrica por manter fatores de defesas antioxidantes (GSH), tornando-se desnecessria a elevao da atividade da GST. O GSH, alm de agir como seqestrador de radicais livres, ainda interage com outras enzimas antioxidantes, assim como a NQO1 (Revisado por CNUBBEN et al., 2001). Neste estudo, a administrao de etanol reduziu a atividade da NQO1 gstrica. Na literatura no existem dados que indiquem como o etanol afeta a atividade da NQO1. No entanto, na padronizao dos ensaios enzimticos verificamos que a atividade especfica da NQO1 10 vezes maior que a da GST, sugerindo que o envolvimento da NQO1 importante na proteo da mucosa gstrica como sistema antioxidante. Essa enzima catalisa a reduo de dois eltrons de quinonas (endgenas e exgenas) formando hidroquinonas, sem que haja a produo de espcies reativas do oxignio, auxiliando na proteo da membrana celular contra os danos oxidativos (Revisado por ROSS et al., 2000). O EHaP50 protegeu a mucosa gstrica contra as leses induzidas pelo etanol e aumentou a atividade da NQO1. A dose de FBut(50) que protegeu a mucosa gstrica contra as leses induzidas por etanol no interferiu com o sistema antioxidante GSH e GST, mas impediu a reduo da atividade da NQO1 gstrica promovida pelo etanol; sugerindo que a manuteno da atividade da NQO1 seja um dos mecanismos mais importantes para o efeito gastroprotetor da P. glomerata. Vrios triterpenides e esterides tem demonstrado possuir atividade antilcera (BORRELLI & IZZO, 2000; LEWIS & HANSON, 1991; NAVARRETE et al., 2002). J foi proposto que necessria a presena do grupamento hidroxila na posio C-3 de esterides e de triterpenos para que exeram a atividade antilcera (NAVARRETE et al., 2002). Dentre os compostos presentes na FBut(50), trs esto em maior concentrao, que podem ser esterides do tipo ecdisterona e rubrosterona. J foi relatado que estes compostos esto presentes na espcie P. glomerata (SHIOBARA et al., 1993) e ambos possuem o grupamento hidroxila em C-3 responsvel pela atividade anti-lcera. Em estudos anteriores realizados em nosso laboratrio (FREITAS et al., 2004) demonstramos que o extrato aquoso da P. glomerata reduziu a secreo

cida estimulada por histamina, mas no por betanecol e pentagastrina. No estudo atual, o EHaP70 inibiu a secreo estimulada tanto por histamina, como por betanecol e por pentagastrina. Esta diferena entre os efeitos obtidos com o extrato aquoso e com o etanlico (EHaP70) pode ser explicada pela diferena da polaridade dos solventes utilizados. Esta hiptese foi reforada pela atividade antisecretora cida da frao ativa do EHaP70 (a FE(70)), que foi extrada por partio com acetato de etila:gua. A FE(70) corresponde emulso intermediria formada entre a fase aquosa e a fase acetato de etila, consequentemente, esta frao ativa apresenta uma polaridade intermediria. Como o EHaP70 inibiu a secreo cida gstrica estimulada pelas trs vias (histaminrgica, colinrgica e endcrina), e como a regulao da secreo de cido no estmago um processo complexo (envolvendo muitos tipos celulares, hormnios e mediadores) que converge para uma etapa final comum envolvendo a enzima H+, K+-ATPase (SACHS, 1997), levantamos a hiptese de que os constituintes da P. glomerata poderiam estar inibindo a atividade da H +,K+-ATPase. A FE(70) inibiu a atividade in vitro da H+, K+-ATPase isolada da mucosa gstrica de coelho. No entanto, no podemos relacionar a dose que promoveu o efeito anti-secretor de cido obtido in vivo com a concentrao inibitria da FE(70) que inibiu a atividade da H+, K +-ATPase in vitro. Para verificar a relao entre estas quantidades (dose e concentrao), quantificamos a atividade da bomba de prtons (H+, K +-ATPase) presentes em microssomos gstricos isolados da mucosa de ratos tratados com a FE(70) (100 mg/kg). A reduo da acidez (44%) da secreo cida gstrica promovida pela FE(70) (ligadura pilrica) no foi quantitativamente diferente da reduo da atividade da H+, K+-ATPase (36%). No foi observado alterao entre os valores do Km das H+, K+-ATPases dos diferentes grupos, entretanto houve uma reduo no Vmx das H+, K +-ATPase isoladas da mucosa gstrica dos animais tratados com a FE(70), sugerindo que a FE(70) produz uma inibio no competitiva da bomba de prtons. Estes ensaios com a bomba de prtons foram realizados aps a padronizao da metodologia e a caracterizao da enzima. Foi sempre confirmado que a hidrlise do ATP no foi produzida pela presena da Na + , K+ATPase da membrana celular uma vez que a ouabana, um inibidor seletivo desta isoforma, no afetou a atividade ATPsica na preparao. Como controle positivo,

foi utilizado o omeprazol (inibidor especfico no competitivo da H+, K+ -ATPase) que inibiu a atividade ATPsica. Em estudos anteriores tambm foi observado a participao da via Larginina-NO no efeito gastroprotetor do extrato aquoso das razes da P. glomerata (FREITAS et al., 2004). A dose de 1 g/kg inibiu a secreo cida gstrica e aumentou os nveis de xido ntrico liberados na secreo, mas no foi observada uma correlao entre a dose e o efeito, sugerindo que outros mecanismos estariam interferindo na inibio da secreo acida gstrica pelo extrato. No estudo atual, o EHaP70 inibiu a secreo cida e aumentou os nveis de NOx quantificados na secreo. A inibio da NO sintase (por L-NAME) impediu o aumento de NOx na secreo induzido pelo EHaP70, mas no impediu o aumento do NOx no tecido gstrico, sugerindo que o NO ainda estava sendo liberado. importante notar que o NOx plasmtico permaneceu elevado na hora da morte dos animais tratados com a FE(70), o que refora a hiptese da contnua ativao da formao de NO pelos constituintes da P. glomerata, possibilitando sua ao em alvos importantes da secreo cida gstrica. O aumento de NOx pelo EHaP70 e a FE(70) pode estar inibindo a bomba de prtons, j que tem sido descrito uma interao entre o aumento da formao de NO e a inibio da atividade da H+,K+-ATPase (BULUT et al., 1999). No entanto, neste estudo no foi possvel identificar como ocorre esta interao. O aumento de NOx pelos constituintes da P. glomerata tambm pode estar favorecendo a ativao de mecanismos de proteo tanto epiteliais quanto subepiteliais, como o aumento da liberao de muco e a manuteno do fluxo sanguneo gstrico (efeitos j descritos como conseqncia do aumento de NO) (Revisado por MARTIN et al., 2001). Estes efeitos ainda podem estar sendo favorecidos pelo aumento da sntese das prostaglandinas induzido pela P. glomerata, pois j sabe-se que o NO pode aumentar a atividade da COX (SALVEMINI et al., 1993). No entanto, mais estudos devem ser realizados para verificar o envolvimento das prostaglandinas no efeito gastroprotetor da P. glomerata. Esta relao entre as vias COX/NOS foi observada em nosso estudo com a administrao de indometacina (inibidor da COX), que reduziu em 48% os nveis de NOx gstricos. O EHaP70 reverteu a reduo de NOx induzida pela indometacina,

sugerindo que os constituintes da P. glomerata possam estar estimulando vias comuns da NOS e da COX. No entanto, nossos experimentos no possibilitaram saber em que ponto da via o EHaP70 pode estar atuando. Neste estudo tambm foi observado um aumento de NOx no fundo gstrico de animais tratados com a FE(70). Em condies patolgicas, as enzimas COX-2 e iNOS so expressas e catalisam a formao de prostanides (principalmente PGE 2), NO e intermedirios oxigenados, como o peroxinitrito (ONNO.) (VANE et al., 1994). O ONNO. tem a capacidade de oxidar protenas, lipdeos e cido nuclico, alm de interagir com grupos tiis (SH) e resduos de tirosina (WISEMAN e HALLIWELL, 1996; STAMLER, 1994) lesionando no s a clula, mas todo o material gentico. Para avaliar se o aumento de NO induzido pela FE(70) favorece a formao de molculas citotxicas, como o ONNO., quantificamos os nveis de GSH no plasma e no estmago destes animais. A dose de FE(70) que induziu o aumento de NO no fundo gstrico, tambm manteve o GSH em nveis semelhantes ao grupo controle, sugerindo que este aumento dos nveis de NO induzido pela FE(70) no lesivo s clulas. Analisando nossos dados, a frao FE(70) parece ser constituda de diferentes triterpenos ligados acar, sugerindo que estes sejam os responsveis pelo efeito anti-secretor de cido e pela gastroproteo (via xido ntrico) da P. glomerata. Para verificar se os extratos que apresentaram efeitos gastroprotetor (EHaP50) e anti-secretor de cido (EHaP70) alteravam a motilidade gastrintestinal, estes foram testados nos modelos experimentais que avaliam o esvaziamento gstrico de semi-slidos e o transito intestinal, e no modelo de diarria induzida por leo de rcino. Ambos os extratos inibiram o esvaziamento gstrico. No entanto, o efeito pelo EHaP50 foi evidente em 30 minutos aps o tratamento, desaparecendo em 1 hora. J a inibio do esvaziamento gstrico produzido pelo EHaP70 foi observada tanto em 30 minutos quanto em 1 hora aps a sua administrao, o que refora a idia de que os extratos possuem diferentes grupos qumicos e/ou diferentes concentraes de princpios ativos. Os extratos inibiram o esvaziamento gstrico, mas no alteraram o transito intestinal nem a diarria induzida por leo de rcino, sugerindo que o efeito inibitrio dos constituintes presentes nos extratos da P. glomerata sobre a motilidade

gastrintestinal no envolve a inibio do tnus parassimptico como um todo. Sugerimos ainda que neste efeito inibitrio sobre o esvaziamento gstrico pode estar envolvido um mediador gstrico local, tal como o NO, pois estudos demonstram que inibidores da NOS aumentam a freqncia de contraes gstricas e aumentam o esvaziamento gstrico (TACK et al., 2002), assim como doadores de NO inibem o esvaziamento gstrico e promovem a acomodao da regio proximal do estmago (KONTUREK et al., 1995).

O conjunto de resultados descritos permite sugerir que as razes da P. glomerata um potencial fitoterpico para o tratamento de algumas dispepsias, como lceras e gastrites, pois enquanto as drogas disponveis atualmente para o tratamento das lceras ppticas desempenham seu efeito apenas por reduzir fatores agressivos da mucosa gstrica (como os anticidos e inibidores da secreo cida gstrica) ou por estimular fatores defensivos (como o anlogo de prostaglandina), as razes da P. glomerata possuem diferentes compostos que agem em conjunto na ativao de fatores defensores e na reduo de fatores agressores da mucosa gstrica. Alm disso, os produtos naturais tambm podem contribuir para a teraputica dos distrbios gstricos, fornecendo um tratamento talvez mais acessvel para atender uma grande parcela da populao brasileira (70-80%) que no tem poder aquisitivo suficiente para participar do mercado consumidor (FERREIRA et al., 1998).

6 CONCLUSES

Os principais resultados obtidos mostraram que:

Quando comparamos doses equivalentes (500 mg/kg) dos extratos hidroalcolicos (50, 70 e 90 %) da P. glomerata, observamos que o extrato obtido com 50 % de etanol (EHaP50) foi mais efetivo em proteger a mucosa gstrica contra leses induzidas pelo etanol, e o extrato obtido com 70 % de etanol (EHaP70) foi mais efetivo em reduzir a secreo cida gstrica no modelo de ligadura pilrica. Estes resultados sugerem a presena de diferentes princpios ativos nestes extratos. A partio do EHaP50 foi biomonitorado atravs do modelo de leses induzidas por etanol, porque a atividade anti-lcera do EHaP50 foi 2,8 vezes maior neste modelo (DE50 = 314 mg/kg) do que no modelo de leses induzidas por indometacina (DE50 = 908 mg/kg) e estresse (DE50 = 866 mg/kg). Com o armazenamento do material durante um perodo de 3 a 5 meses, observamos que enquanto o extrato bruto (EHaP50) manteve a atividade protetora gstrica, a frao do EHaP50 (FBut(50)) apresentou uma reduo da atividade (44 %) e a frao da FBut(50) (FEB(50)) perdeu totalmente a sua atividade, sugerindo que princpios ativos presentes nas razes da P. glomerata perdem a estabilidade na ausncia de compostos importantes para a sua manuteno, que esto presentes no extrato bruto. Como as mesmas doses do EHaP50 (0,3 e 1,0 g/kg) que protegeram a mucosa gstrica contra as leses induzidas por etanol, tambm foram capazes de impedir a queda dos nveis de GSH gstricos, o aumento da atividade da GST presente na regio glandular gstrica e a reduo da atividade da NQO1 promovidos pelo etanol, e como a dose da FBut(50) (100 mg/kg) que protegeu a mucosa gstrica contra as leses induzidas por etanol no interferiu com o sistema antioxidante GSH e GST, mas impediu a reduo da atividade da NQO1 gstrica promovida pelo etanol; sugerimos que a manuteno da atividade da NQO1 seja um dos mecanismos mais importantes para o efeito gastroprotetor das razes de P. glomerata. O EHaP70 inibiu a secreo cida e aumentou os nveis de NOx quantificados na secreo. A inibio da NO sintase (por L-NAME) impediu o aumento de NOx na secreo induzido pelo EHaP70, mas no impediu o aumento do NOx no tecido gstrico, sugerindo que o EHaP70 ainda estava induzindo a

formao do NO, e que o seu aumento (NO) poderia estar inibindo a atividade da H+,K+-ATPase. Como a indometacina reduziu em 48 % os nveis de NOx e o EHaP70 reverteu esta reduo, sugerimos que os princpios ativos presentes neste extrato podem estar estimulando vias comuns da NOS e da COX, contribuindo para o aumento de fatores protetores da mucosa gstrica. A frao FE(70) originada do EHaP70 foi 8 vezes mais potente (DE50 = 62 mg/kg) em reduzir a secreo cida gstrica que o extrato de origem (DE50 = 476 mg/kg), e como a FE(70) inibiu a H+,K+ -ATPase in vitro (CI50 = 640 g/ml) em microssomos isolados da mucosa gstrica de coelho e in vivo em microssomos gstricos isolados da mucosa de ratos tratados com a FE(70) (100 mg/kg), sugerimos que esta seja a ao principal responsvel pelo efeito anti-secretor de cido observado com o EHaP70, que reduziu a secreo cida gstrica basal e impediu o aumento da secreo cida induzido por histamina (35 %), por betanecol (24 %) e por pentagastrina (52 %). No foi observado alterao entre os Km das H+ , K+ -ATPases dos diferentes grupos tratados in vivo, entretanto observamos a reduo de 14 % no Vmx das H+ , K+ -ATPase isoladas da mucosa gstrica dos animais tratados com a FE(70) , sugerindo que a FE(70) produz uma inibio no competitiva da bomba de prtons. O EHaP50 e o EHaP70 inibiram o esvaziamento gstrico, mas no alteraram o trnsito intestinal nem a diarria induzida pelo leo de rcino, sugerindo que este efeito inibitrio sobre o esvaziamento gstrico possa estar ocorrendo atravs de um mediador gstrico local, como o NO, no envolvendo a ativao do tnus parassimptico como um todo. O conjunto de nossos resultados permite sugerir que no mecanismo de ao do efeito gastroprotetor das razes da P. glomerata esto envolvidos o aumento de fatores protetores da mucosa gstrica, como a ativao de mecanismos antioxidantes, tanto enzimticos (envolvendo a NQO1), quanto no enzimtico (atravs do GSH), e a reduo de fatores agressores, tais como a inibio da secreo cida gstrica atravs do aumento de xido ntrico e da inibio da H+,K+-ATPase. Estudos qumicos por CLAE e
1

H-RNM indicam a

presena de triterpenos na FE(70) e esterides na FBut(50) como compostos

majoritrios, sugerindo que estes compostos possam ser os responsveis pelo efeito gastroprotetor das razes da P. glomerata.

7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ABITBOL, R.A. Doena ulcerosa pptica. In: Medstudents: Rotinas de Clnica Mdica. Disponvel em: http://www.medstudents.com.br/rotinas/clinmed/dup.htm. Acesso em: 20 jan. 2005.

ALLEN, E.; GARNER, A. Mucus and bicarbonate secretion in the stomach and their possible role in mucosal protection. Gut., v. 21, p. 249-62, 1980.

ALLEN, J.P.; CANTY, A.J.; SCHULZ, S. Identification of cells expressing somatostatina receptor 2 in the gastrointestinal tract of Sstr2 knockout/lacZ knockin mice. J. Comp. Neurol., v. 454, p. 32940, 2002.

ANDREWS, F.J.; MALCONTENTI-WILSON, C.; O'BRIEN, P.E. Protection against gastric ischemia-reperfusion injury by nitric oxide generators. Dig. Dis. Sci., v. 39, p. 366-73, 1994.

ATAY, S.; TARNAWSKI, A. S.; DuBOIS, A.

Eicosanoids and the stomach.

Prostaglandins & Other Lipid Mediators, v. 61, n. 3-4, p. 105-124, 2000.

AWOUTERS, F.; NIEMEGEERS, C.J.E.; LENAERTS, F.M.; JANSEEN, P.A.J. Delay of castor oil diarrhoea in rats: A new way to evaluate inhibitors of prostaglandin synthesis. Journal of Pharmacy and Pharmacology, v. 30, p. 41 45, 1978.

BARROSO, G.M. Sistemtica de Angiospermas do Brasil. So Paulo: Editora da Universidade de So Paulo, 1978. 255p.

BILSKI,

J.;

KONTUREK,

P.C.;

KONTUREK,

S.J.;

CIESZKOWSKI,

M.;

CZARNOBILSKI, K. Role of endogenous nitric oxide in the control of gastric acid secretion, blood flow and gastrin release in conscious dogs. Regulatory Peptides, v. 53, p. 175-84, 1994.

BLUMENTHAL, M.; GOLDBERG, A.; BRINCKMANN, J. Herbal medicine Expanded Comission e Monographs. Austin: American Botanical Council, 2000.

BORRELLI, F.; IZZO, A.A. The plant kingdom as a source of anti-ulcer remedies. Phytotherapy Research, v. 14, p. 581-91, 2000.

BREDT, D.S.; HWANG, P.M.; GLATT, C.E.; LOWENSTEIN, C.; REED, R.R.; SNYDER, S.H. Cloned and expressed nitric oxide synthase structurally resembles cytochrome P-450 reductase. Nature, v. 351, p. 71418, 1991.

BROWN, J.F.; HANSON, P.J.; WHITTLE, B.J. Nitric oxide donors increase mucus gel thickness in rat stomach. Eur. J. Pharmacol. , v. 223, p. 103-4, 1992.

BROWN, J. F.; HANSON, P. J.; WHITTLE, B. J. R. The nitric oxide donor, Snitroso-N-acetyl-penicillamine, inhibits secretory activity in rat isolated parietal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 195, p. 1354-59, 1993.

BULUT, R.; UNLUCERCI, Y.; BEKPINAR, S.; KUNTSAL, L. Nitric oxide-mediated regulation of gastric H+, K+ -ATPase and alcohol dehydrogenase following ethanolinduced injury in rats. Dig. Dis. Sci., v. 7, p. 1417-22, 1999.

CALATAYUD, S.; SANZ, M.J.; CANET, A.; BELLO, R.; DE ROJAS, F.D.; ESPLUGUES, J.V. Mechanisms of gastroprotection by transdermal nitroglycerin in the rat. British Journal of Pharmacology, v. 127, p. 1111-18, 1999.

CHEW, C. S. Cholecystokinin, cabachol, gastrin, histamine, and forskolin increase (Ca +2) in gastric. American Journal of Physiology, v. 250, p. 814-823, 1987.

CHUANG, C.N. CHEN, M.C.Y.; SOLL, A.H. gastrin-Histamine interections: direct and paracrine elements. Scand. J. Gastroenterol., v. 26, p. 95-103, 1991.

CNUBBEN, N.H.P.; RIETJENS, I.M.C.M.; NORTELBOER, H.; ZANDER, J.; BLADERSEN, P.J. The interplay of glutathione-related processes in antioxidant defense. Environmental Toxicology and Pharmacology, v. 10, p. 141-52, 2001.

CORRA JNIOR, C.; MING, L.C. Ffia [Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen]: O ginseng brasileiro. In: ALEXIADES, M.N.; SHANLEY, P. (Ed.). Productos Forestales, Mdios de Subsistncia y Concervacin: Estudios de Caso sobre Sistemas de Manejo de Productos Forestales No Maderables. Indonsia: Cifor, 2004. p.349-64.

COSTA, M. e BROOKES, S. J. H. The enteric nervous system. American Journal of Gastroenterology, v. 89, p. S129-S137, 1994.

CRONQUIST, A. The evolution and classification of flowering plants. New York. The New York Botanical Garden, 1988.

DANZER, M.; JOCIC, M.; SAMBERGER, C. Stomach-brain communication by vagal afferents in response to luminal acid backdiffusion, gastrin, and gastric acid secretion. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., v. 286, p. G403G411, 2004.

DE SMET, P.A.G.M.; BONSEL, G.; VAN DER KUY, A.; HEKSTER, Y.A.; PRONK, M.H.; BRORENS, M.J.A.; LOCKFEER, J.H.M.; NUIJTEN, M.J.C. Introduction to the pharmacoeconomics of herbal medicines. Pharmacoeconomics. v.18, n.1, p.:1-7, 2000.

DENNINGER, J.; MARLETTA, M. Guanylate cyclase and the NO/cGMP signaling pathway. Biochim Biophys Acta 1999;1411:334350.7. Stamler J, Lamas S, Fang F. Nitrosylation: the prototypic redoxbased signaling mechanism. Cell, v. 106, p. 67583, 2001.

DE-PARIS, F.; NEVES, G.; SALGUEIRO, J.B.; QUEVEDO, J.; LZQUIERDO, I.; RATES, S.M. -Psychophamacological screening of Pfaffia glomerata Spreng. (Amarathanceae) in rodents. J. Ethnopharmacol., v. 73, p. 261-269, 2000.

DICKINSON, D.A.; FORMAN, H.J. Cellular glutathione and thiols metabolism. Biochemical Pharmacology, v. 64, p. 1019-26, 2002.

DJAHANGUIRI, B. The production of acute gastric ulceration by indomethacin in the rat. Scandinavian Journal of Gastroenterology, v. 4, p. 265, 1969.

DOMER, F.R. Animail experiments in pharmacological analysis. Charles C. Thomas Publisher, 1971, 669p.

FAILLI, P.; CECCHI, E.; TOSTI-GUERRA, C.; MUGELLI, A.; LAFFI, G.; ZILLETTI, L.; GIOTTI, A. Effect of some cyclooxygenase inhibitors on the increase in guanosine 3':5'-cyclic monophosphate induced by NO-donors in human whole platelets. Br. J. Pharmacol., v. 123, n. 7, p. 1457-63, 1998.

FENNER, R.; HECKLER, A.; PRIETSCH, F.L.; NEVES, G.; PACHECO, E.F.; GOSMANN, G.; RATES, S.M.K. Efeito depressor do Sistema Nervoso Central (SNC) do extrato orgnico de Pfaffia glomerata Spreng (Amaranthaceae). In: IX Jornada de Jvenes Investigadores de la AUGM. Rosrio, Argentina, 2001. Anales, p. 234.

FERREIRA, S.H. (org.) Medicamentos a partir de plantas medicinais no Brasil. Rio de Janeiro: Academia Brasileira de Cincias, 1998.

FISKE , C.H.; SUBBAROW, Y. The colorimetric determination of phosphorus. J. Biol. Chem., v. 66, p. 375-400, 1925.

FLEMSTRM,

G.;

HLLGREN,

A.;

NYLANDER,

O.;

ENGSTRAND,

L.;

WILANDER, E.; ALLEN, A. Adherent surface mucus gel restrict diffusion of

macromolecules in rat duodenum in vivo. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., v. 277, p. G375-G382, 1999.

FLEMSTRM, G.; ISENBERG, JI. Gastroduodenal Mucosal Alkaline Secretion and Mucosal Protection. News Physiol. Sci., v. 16, p. 23-28, 2001.

FREITAS, C.S. Aes Farmacolgicas do Extrato Bruto Aquoso da Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen Amaranthaceae sobre o trato gastrointestinal. Curitiba, 2000. 121f. Monografia (Especializao em Farmacologia) Setor de Cincias Biolgicas, Universidade Federal do Paran.

FREITAS, C.S.; BAGGIO, C. H.; RIECK, L.; MARQUES, M. C. A. Efeitos do tratamento crnico com o Extrato Aquoso Bruto da Pffafia glomerata (Spreng) Pedersen em ulceras induzidas com acido actico. In: XVI REUNIAO ANUAL DA FEDERACAO DE SOCIEDADES DE BIOLOGIA EXPERIMENTAL, 2001, Curitiba. FESBE 2001.

FREITAS, C.S.; PAULA, M.F.R.; RIECK, L.; MARQUES, M.C.A. Actions of crude hydroalcoholic extract of Pfaffia sp. on gastrointestinal tract. Brazilian Archives of Biology and Technology, v. 46, n.3, p. 355-360, 2003.

FREITAS, C.S.; BAGGIO, C.H.; SILVA-SANTOS, J.E.; RIECK, L..; SANTOS, C.A.M.; JNIOR, C.C.; MING, L.C.; CORTEZ, D.A.G.; MARQUES, M.C.A. Involvement of nitric oxide in the gastroprotective effects of an aqueous extract of Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen, Amaranthaceae, in rats. Life Sciences, v. 74, p. 1167-1179, 2004.

GLAVIN, G. B.; SZABO, S. Experimental gastric mucosal injury: laboratory models reveal mechanisms of pathogenesis and new therapeutic strategies. Faseb. Journal, v. 6, p. 825-831, 1992.

GOEL, R.K.; BHATTACHARYA, S.K. Gastroduodenal mucosal defense and mucosal protective agents. Indian J. Exp. Biol., v. 29, p. 701-14, 1991.

GOMEZ, G.; ENGLANDER, E.W.; GREELEY, G.H. Nutrient inhibition of ghrelin secretion in the fasted rat. Regul. Pept., v. 117, p. 3336, 2004.

GOSMANN, G.; GATTUSO, S.; GATTUSO, M.; FENNER, R.; PACHECO, E.F.; FERRAZ, A.; SAVI, L.A.; BARARDI, C.R.M.; SIMES, C.M.O.; SORTINO, M.; ZACCHINO, S.; GNERRE, C.; TESTA, B.; RATES, S.M.K. Botanical

(morphological, micrographic), chemical and pharmacological characteristics of Pfaffia glomerata species (Amaranthaceae) native to South Brazil. Journal of Pharmaceutical Sciences, v.39, n.2, p.141-47, 2003.

GRANGER, D. L.; HIBBS, J. B.; PERFECT, J. R.; DURACK, D. T. Metabolic fate of L-arginine in relation to microbiostatic capability of murine macrophages. Journal of Clinical Investigation, v. 85, p. 264-273, 1990.

GUIMARES, M.M.; RIECK, L.; SILVA-SANTOS, J.E.; MESIA-VELA, S.; MARQUES, M.C.A. Pesquisas Realizadas com Plantas Medicinais no Estado do Paran no perodo de 1992 a 2002. In: CORREIA JR, C.; GRAA, L.R.; SCHEFFER, M.C. Complexo Agroindustrial das Plantas Medicinais, Aromticas e Codimentares no Estado do Paran Diagntico e Perspectiva. 1. ed. Curitiba: EMATER, 2004, p. 167-69.

HABIG, W.H.; PABST, M.J.; JAKOBY, N.B. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. J. Biol. Chem., v. 249, p. 7130-7139, 1974.

HAGNER, S.; STAHL, U.; KNOBLAUCH, B. Calcitonin receptor-like receptor: identification and distribution in human peripheral tissues. Cell. Tissue Res., v. 310, p.4150, 2004.

HASEBE, K.; HORIE, S.; YANO, S.; WATANABE, K. Inhibitory effect of N(omega)nitro-L-arginine on gastric secretion induced by secretagogues and vagal stimulation in the isolated stomach. European Journal of Pharmacology, v. 350, p. 229-36, 1998.

HASEBE, K.; HORIE, S.; YANO, S.; WATANABE, K. Stimulatory effects of nitric oxide donors on gastric acid secretion in isolated mouse stomach., Eur. J. Pharmacol., v. 420, p. 159-64, 2001.

HASEBE, K.; HORIE, S.; YANO, S.; WATANABE, K. Stimulatory Effects of Nitric Oxide Donors on Histamine Realease in Isolated Rat Gastric Mucosal Cells. Biol. Pharm. Bull., v. 26, p. 950-53, 2003.

HIRSCH, A.B.; MCCUEN, R.W.; ARIMURA, A. Adrenomedullin stimulates somatostatina and thus inhibits histamine and acid secretion in the fundus of the stomach. Regul. Pept., v. 110, p. 18995, 2003.

HIRSCH, D.P.; TIEL-VAN BUUL, M.M.; TYTGAT, G.N; BOECKXSTAENS, G.E. Effect of L-NMMA on postprandial transient lower esophageal sphincter relaxations in healthy volunteers. Dig. Dis. Sci., v. 45, p. 2069-75, 2000.

HIRSCHOWITZ, B.I.; MOLINA, E.. Effects of four H2 histamine antagonists on bethanechol-stimulated acid and pepsin secretion in the dog. J. Pharmacol. Exp. Ther., v. 2, p. 341-5, 1983.

HOGBEN, C.A.M.; KENT, T.H. WOODWARD, P.A.; SILL, A.J. Quantitative histology of gastric mucosa: Man, dog cat, guinea pig, and frog. Gastroenterology, v. 67, p. 1143-54, 1974.

HOLM, M.; JOHANSSON, B.; PETTERSSON, A.; FANDRIKS, L. Acid-induced duodenal mucosal nitric oxide output parallels bicarbonate secretion in the anaesthetized pig. Acta Physiologica Scandinavica, v. 162, p. 461-8, 1998.

HOLST, B.; SCHWARTZ, T.W. Constitutive ghrelin receptor activity as a signaling set-point in appetite regulation. Trends Pharmacol. Sci., v. 25, p. 11317, 2004.

HOLZER, P.; LIVINGSTONE, E.H.; GUTH, P.H. Neural, metabolic, physical, and endothelial factors in the regulation of the gastric crirculation. In: JOHNSON, L.R. Physiology of the gastrointestinal tract. 3 ed. New York: Raven Press, v. 2, 1994, p. 1311-29.

JAFFREY, S.; ERDJUMENT-BROMAGE, H.; FERRIS, C.; TEMPST, P.; SNYDER, S. Protein S-nitrosylation: a physiological signal for neuronal nitric oxide. Nat. Cell. Biol., v 3, p. 193-97, 2001.

JAISWAL, A.K.; McBRIDE, O.W.; ADESNIK, M.; NEBERT, D.W. Human dioxininducible cytosolic NAD(P)H:menadione oxidoreductase. CDNA sequence and localization of gene to chromosome 16. J. Biol. Chem.,v. 263, p.13572-13578, 1988.

KATO, S.; KITAMURA, M.; KOROLKIEWIC, R. P.; TAKEUCHI, K. Role of nitric oxide in regulation of gastric acid secretion in rats: effects of NO donors and NO synthase inhibitor. Br. J. Pharmacol..v.123, p.839-46, 1998.

KAWASHIMA, K.; ISHIHARA, S.; RUMI, M.A.K. Localization of calcitonin generelated peptide receptors in rat gastric mucosa. Peptides, v. 23, p. 95566, 2002.

KAZUMORI, H.; ISHIHARA, S.; RUMI, M.A.K. Transforming growth factor-_ directly augments histidine decarboxylase and vesicular monoamine transporter 2 production in rat enterochromaffin-like cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., v. 286, p. G508G514, 2004.

KIM, H.; KIM, K.H. Effects of a nitric oxide donor and nitric oxide synthase inhibitors on acid secretion of isolated rabbit gastric glands. Pharmacology, v. 53, p. 331-9, 1996.

KIVILUOTO, T.; AHONEN, M.; BCK, N.; HPPL, O.; MUSTONEN, H.; PAIMELA, H.; KIVILAAKSO, E. The pre-ephitelial mucus-HCO-3 layer protects

against intracellular acidosis in acid-exposed gastric mucosa. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., v. 264, p. G57-G63, 1993.

KONTUREK,

S.J.;

CIESZKOWSKI,

M.;

JAWOREK,

J.;

KONTUREK,

J.;

BRZOZOWSKI, T.; GREGORY, H. Effects of epidermal growth factor on gastrointestinal secretions. Am. J. Physiol., v. 246, p. G580-6, 1984.

KONTUREK, J.W.; THOR, P.; DOMSCHKE, W. Effects of nitric oxide on antral motility and gastric emptying in humans. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., v. 7, p. 97102, 1995.

KONTUREK, J.W.; FISCHER, H.; GROMOTKA, P.M.; KONTUREK, S.J.; DOMSCHKE, W. Endogenous nitric oxide in the regulation of gastric secretory and motor activity in humans. Alimentary Pharmacology &Therapeutics, v. 13, p. 1683-91, 1999.

KUBO, K.; UEHARA, H.; KUBOTA, T.; NOZU, T.; MORUYA, M.; WATANABE, Y.; SHOJI E.; SANTOS S.B.; HARADA, K.; KONGO, Y. Effects of ranitidine on gastric vesicles containing H+, K+ - ATP adenosine triphosphatase in rats. Scand. J. Gastroenterol., v. 30, p. 944-951, 1995.

KUSAYAMA, T.; YAMAZAKI, J.; NAGAO, T. Flow dependence of nitric oxidemediated pressure change in rat mesenteric beds with different tonus. Eur. J. Pharmacol., v. 312, p. 30107, 1996.

KWIECIE, S.; BRZOZOWSKI, T.; KONTUREK, S.J. Effects of reactive oxygen species action on gastric mucosa in various models of mucosal injury. Journal of Physiology and Pharmacology, v. 53, n. 1, p. 39-50, 2002.

LEVENSTEIN, S. Stress and peptic ulcer: life beyond Helicobacter. BMJ., v. 316, n. 7130, p. 538-41, 1998.

LEWIN, J. M.; BADO, A. Receptores regulanting acid secretion. Scandinavian Journal of Gastroenterology, v.26, suplemento 180, p. 53-57, 1991.

LEWIS, D.; HANSON, P.J. Anti-ulcer drugs of plant origin. Progress in Medicinal Chemistry, v. 28, p. 201-31, 1991.

LONGHURST, J. C.; STTEBINS, C. L.; ORDWAY, G. A.

Chemically induced

cardiovascular reflexes arising from the stomach of the cat. American Journal Physiology - Heart Circulatory Physiology, v.247, n. 16, p. 459-466, 1984 (a).

LONGHURST, J. C.; KAUFMANN, M. P.; ORDWAY, G. A.; MUSCH, T. L. Effects of bradykinin and capsaicin on endings of aferent fibers from abdominal visceral organs. American Journal Physiology - Regulatory Integrative Comparativa Physiology, v. 247, n. 16, p. R 552-R 559, 1984 (b).

LOPEZ-BELMONTE, J.; WHITTLE, B.J.; MONCADA, S. The actions of nitric oxide donors in the prevention or induction of injury to the rat gastric mucosa. Br. J. Pharmacol., v. 108, p. 73-8, 1993.

LUCEY, M.R.; YAMADA, T. Biochemistry and physiology of gastrointestinal somatostatin. Dig. Dis. Sci, v.34, p. 5S-13S, 1989.

MARQUES, L.C.; GALVAO, S.M.; ESPINOLA, E.; DIAS, R.F.; MATTEI, R.; OLIVEIRA, M.G.; DE ARAUJO CARLINI, E.L. Psychopharmacological assessment of Pfaffia glomerata roots (extract BNT-08) in rodents. Phytother Res., v. 7, p. 56672, 2004.

MARTIN, M.J.; JIMENEZ, M.D.; MOTILVA, V. New issues about nitric oxide and its effects on the gastrointestinal tract. Curr Pharm Des. v. 7, n. 10, p. 881-908, 2001.

MASHIMO, H.; GOYAL, R.K. Lessons from genetically engineered animal models. IV. Nitric oxide synthase gene knockout mice. Am. J. Physiol., v. 277, p. G745-50, 1999.

MATES, J.M. Effects of antioxidant enzymes in the molecular control of reactive oxygen species toxicology. Toxicology, v. 153, p. 83-104, 2000. Erratum in: Toxicology , v. 163, p. 219, 2001.

McLAUGHLIN, J.T.; AI, W.D.; SINCLAIR, N.F. PACAP and gastrin regulate the histidine decarboxylase promoter via distinct mechanisms. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., v. 286, p. G51G59, 2004.

MESIA, S. V. Mecanismos das aes anti-secretora cida e antilcera gstrica de princpios isolados do gervo-roxo ( Starchytarpheta cayennensis Vahl). So Paulo, 1998. Tese (Doutorado em Farmacologia) Instituto Nacional de Farmacologia (INFAR), Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de So Paulo.

MICHIELS, C.; RAES, M.; TOUSSAINT, O.; REMACLE, J. Importance of Seglutathione peroxidase, catalase, and Cu/Zn-SOD for cell survival against oxidative stress. Free Radic. Biol. Med., v.3, p. 235-48, 1994.

MILANI, S.; CALABR, A. Role of growth factors and their receptors in gastric ulcer healing. Microscopy Research and Technique, v. 53, p. 360-71, 2001.

MINOWA, S.; TSUCHIYA, S.; SOMEYA, A. Role of neuropeptide receptor systems in vanilloid VRI receptor-mediated gastric acid secretion in rat brain. Eur. J. Pharmacol., v. 486, p. 31724, 2004.

MOJZIS,

J.;

HEGEDUSOVA,

R.;

MIROSSAY,

L.

Role

of

muus

in

ischemia/reperfusion-induced gastric mucosa injury in rats. Physiol. Res., v. 49, p. 441-46, 2000.

MONDAL, M.S.; DATE, Y.; MURAKAMI, N. Neuromedin U acts in the central nervous system to inhibit gastric acid secretion via CRH system. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., v. 284, p.G963G969, 2003.

MURAKAMI, S.; ARAI, L.; MURAMATSU, M.; OTOMO, S.; BABA, K.; KIDO, T.; KOZAWA, M. Inhibition of gastric H+ , K+ - ATPase and acid secretion by cassigarol A, a polyphenol from Cassia garrettiana Craib. Biochem. Pharmacol, v. 44, p. 3337, 1992.

MURRAY, K.; BLOOM, E. Ghrelin for the gastroenterologist: history and potential. Gastroenterology, v. 125, p. 14921502, 2003.

NAGY, L.; MOZSIK, G.Y.; TRNOK, F.; SZALAI, M.; PTH, I.; JVOR, T. Interrelationships between the gastric secretory responses, prostaglandin E2 inhibitor by catechins. J. Pharm. Pharmacol., v.44, p. 926-28, 1991.

NAKAI, S.; TAKAGI, N.; MIICHI, H.; HAYASHI, S.; NISHIMOTO, N.; TAKEMOTO, T.; KIZU, H. Pfaffosides, nortriterpenoid saponins, from Pfaffia paniculata. Phytochemystry, v. 23, p. 1703-1705, 1984.

NAVARRETE, A.; TREJO-MIRANDA, J.L; REYES-TREJO, L.J. Principles of root bark of Hippocratea excelsa (Hippocrataceae) with gastroprotective activity. Journal of Ethnopharmacology, v. 79, p. 383-8, 2002.

NETO, A.G.; COSTA, J.M.L.C.; BELATI, C.; VINHOLISC, A.H.C; POSSEBOM, L.S.; DA SILVA FILHO, A.A.; CUNHA, W.R.; CARVALHO, J.C.T.; BASTOS, J.K.; SILVA, M.L.A.E. Analgesic and anti-inflammatory activity of a crude root extract of Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen. Journal of Ethnopharmacology. v. 96, p. 87-91, 2005.

NETO, A.G.; DA SILVA FILHO, A.A.; COSTA, J.M.L.C.; VINHOLISC, A.H.C; SOUZA, G.H.B. CUNHA, W.R.; SILVA, M.L.A.E.; ALBUQUERQUE, S.; BASTOS, J.K. Evaluation of the trypanocidal and leishmanicidal in vitro activity of the crude

hydroalcoholic extract of Pfaffia glomerata (Amarathanceae) roots. Phytomedicine. v. 11, p. 662665, 2004.

NEWMAN, D.J.; CRAGG, G.M.; SNADER, K.M. Natural Products as Sources of New Drugs over the Period 1981-2002. Journal of Natural Products, v. 66, p. 1022-1037, 2003.

NISHIMOTO, N.; NAKAI, S.; TAKAGI, N.; HAYASHI, S.; TAKEMOTO, T.; ODASHIMA, S.; KIZU, H.; WADA, Y. Pfaffosides and Nortriterpenoid Saponins from Pfaffia paniculata. Phytochemistry, v. 23, p. 139-142, 1984.

NISHIMOTO, N.; SHIOBARA, Y.; FUJINO, M.; INOUE, S-S.; TAKEMOTO, T.; OLIVEIRA, F. de; AKISUE, G.; AKISUE, M.K. Ecdysteroids from Pfaffia iresinoides and reassignment of some 2505-2507, 1987.
13

C NMR chemical shifts. Phytochemistry, v. 26 p.

NISHIMOTO, N.; SHIOBARA, Y.; INOUE, S-S.; FUJINO, M.; TAKEMOTO, T.; YEOH, C.L.; OLIVEIRA, F. de; AKISUE, G.; AKISUE, M.K.; HASHIMOTO, G. Three ecdysteroid glycosides from Pfaffia iresinoides. Phytochemistry, v. 27 p. 16651668, 1988.

NWOKOLO, C.U.; FRESHWATER, D.A.; OHARE, P. Plasma ghrelin following cure of Helicobacter pylori. Gut, v. 52, p. 63740, 2003.

OATES, P. J.; HAKKINEN, J. P., Studies on the mechanism of ethanol-induced gastric damage in rats, Gastroenterology, v. 1, n. 1, p. 1-117, 1988.

OGATA, T.; YAMASAKI, Y., Morphological studies on the translocation of tubulovesicular system toward the intracellular canaliculus during stimulation of the gastric parietal cell, Microscopy Research Technique, v. 48, n. 5, p. 282-292, 2000.

OLIVEIRA, F. Pfaffia paniculata (Martius) Kuntze O ginseng-brasileiro. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.1, n. 1, p. 1-117, 1986.

ORSINI, B.; CALABRO, A.; MILANI, S.; GRAPPONE, C.; HERBST, H.; SURRENTI, C. Localization of epidermal growth factor/transforming growth factor-alpha receptor in the human gastric mucosa. An immunohistochemical and in situ hybridization study. Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histopathol., v. 423, n. 1, p.57-63, 1993.

OTOFUJI, G.M.; GARCIA, T.L.C.; BAGGIO, C. H.; CALIXTO, C.P.; FREITAS, C.S.; RIECK, L.; MARQUES, M.C.A. Efeito do Extrato Hidroalcolico Percolado das Razes de Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen sobre a secreo acida gstrica. In: Congresso Brasileiro de Farmacologia, 35., 2003 (b), guas de Lindia, So Paulo. Anais da XXXV CONGRESSO BRASILEIRO DE

FARMACOLOGIA, 2003, guas de Lindia, So Paulo: p.213.

OTOFUJI, G.M.; GARCIA, T.L.C.; FREITAS, C.S.; BAGGIO, C. H.; MARQUES, M.C.A. Efeito Gastroprotetor do Extrato Hidroalcolico Percolado das Razes de Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen Amaranthaceae. In: REUNIO ANUAL DA FEDERAO DE SOCIEDADES DE BIOLOGIA EXPERIMENTAL (FeSBE), 18., 2003, Curitiba, Paran. Anais da XVIII REUNIO ANUAL DA FEDERAO DE SOCIEDADES DE BIOLOGIA EXPERIMENTAL (FeSBE), 2003 (a), Curitiba, Paran: p.123.

PALMER, R.M.; FERRIGE, A.G.; MONCADA, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature, v. 327, p. 524 26, 1987.

PATTERSON, L.M.; ZHENG, H.Y.; WARDM S,M. Vanilloid receptor (VR1) expression in vagal afferent neurons innervating the gastrointestinal tract. Cell Tissue Res., v. 311, p. 27787, 2003.

PAULA, M.F.R.; FREITAS, C.S.; NOWACKI, L.C.; STRAPASSON, F.; VELA, S.M.; MARQUES, M.C.A. Avaliao preliminar dos efeitos do extrato hidroalcolico

da Pfaffia sp sobre o trato gastrointestinal. Anais da XII Reunio Anual da Federao de Sociedades de Biologia Experimental (FeSBE), p. 357, 1997

PERINI, R.F.; MA, L.; WALLACE, J.L. Mucosal Repair and COX-2 Inhibition. Current Pharmaceutical Design, v. 9, p. 2207-11, 2003.

PRINZ, C.; KAJIMURA, M.; SCOTT, D.; HELANDER, H.; SHIN, J.; BESACON, M.; BAMBERG, K.; HERSEY, S.; SACHS, G. Acid secretion and H+/K+ -ATPase of stomach. Yale. J. Biol. Med., v. 6, p. 577-96, 1992.

PRINZ, C.; ZANNER, R.; GRATZL, M. Physiology of gastric enterochromaffin-like cells. Ann. Rev. Physiol., v. 65, p. 37182, 2003.

PUSHPAKIRAN, G.; MAHALAKSHMI, K.; ANURADHA, C.V. Protective effects of taurine on glutathione and glutathione-dependent enzymes in ethanol-fed rats. Pharmazie. v. 11, p. 869-72, 2004.

RAIHA, I.; KEMPPAINEN, H.; KAPRIO, J.; KOSKENVUO, M.; SOURANDER, L. Lifestyle, stress, and genes in peptic ulcer disease: a nationwide twin cohort study. Arch. Intern. Med., v. 158, n. 7, p. 698-704, 1998.

ROBERT, A.; NEZAMIS, J. E.; LANCASTER, C.; HAUCHAR, A. J. Cytoprotection by prostaglandins in rats. Prevention of gastric necrosis produced by alcohol, HCl, NaOH, hypertonic NaCl and thermal injury. Gastroenterology, v. 77, p. 433-443, 1979.

ROSS, D.; KEPA, J.K.; WINSKI, S.L.; BEALL, H.D.; ANWAR, A.; SIEGEL, D. NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1): chemoprotection, bioactivation, gene regulation and genetic polymorphisms. Chem. Biol. Interact., v. 129, p. 77-97, 2000.

SABABI, M.; NILSSON, E.; HOLM, L. Mucus and alkali secretion in the rat duodenum: effects of indomethacin, N omega-nitro-Larginine, and luminal acid. Gastroenterology, v. 109, p. 1526-34, 1995.

SACHS, G. Prtons pump inhibitors and acid-related diseases. Pharmacotherapy. v. 17, p. 22-37, 1997.

SALIM, A.S. Sulfhydryls protect patients against complications of erosive gastritis. Dig. Dis. Sci., v. 11, p. 1436-7, 1990.

SALVEMINI, D.; MISKO, T.P.; MASFERRER, J.L.; SEIBERT, K.; CURRIE, M.G; NEEDLEMAN, P. Nitric oxide activates cyclooxygenase enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 15, p. 7240-4, 1993.

SAMUELSON, L.C.; HINKLE, K.L. Insights into the regulation of gastric acid secretion through analysis of genetically engineered mice. Annu. Rev. Physiol., v. 65, p.383400, 2003.

SANCHEZ, R.I.; MESIA-VELA, S.; KAUFFMAN, F.C. Induction of NAD(P)H quinone oxidoreductase and glutathione S-transferase activities in livers of female AugustCopenhagen Irish rats treated chronically with estradiol: comparison with the Sprague-Dawley rat. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol., v. v. 2-3, p. 199-206, 2003.

SCARPIGNATO, S.; CAPOVILLA, T; BERTACCINI, G.

Action of caerilein on

gastric emptying of conscius rat. Arch. Int. Pharmacodyn., v. 246, p. 286-294, 1980.

SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; PETROVICK, P. R. Produtos de origem vegetal e o desenvolvimento de medicamentos. In: Simes, C. M. O.; Schenkel, E. P.; Gosmann, G. Mello, J. C. P.; Mentz, L. A.;. Petrovick, P.R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 3.ed. Porto Alegre/Florianpolis: Editora da Universidade UFRGS / Editora da UFSC. Captulo 15. p. 301-332, 2001.

SCHICHO, R.; SCHEMANN, M.; PABST, M.A. Capsaicin-sensitive extrinsic afferents are involved in acid-induced activation of distinct myenteric neurons in the rat stomach. Neurogastroenterol Motil., v. 15, p. 3344, 2003.

SCHMASSMANN, A. Mechanism of ulcer healing and effects of nonesteroidal antiinflammatory drugs. Am. J. Med., v. 30, n. 104, p. 43S-51S, 1998.

SCHUBERT,

M.

L.;

SHAMBUREK,

R.

D.

Control

of

acid

secretion.

Gastroenterology Clinics of America, v. 19, p. 1-25, 1990.

SCHUBERT, M.L. Gastric Secretion. Curr. Opin. Gastroenterol., v. 19, p. 519-25, 2003.

SCHUBERT, M.L. Gastric Secretion. Curr. Opin. Gastroenterol., v. 20, p. 519-20, 2004.

SEDLAK, J.; LINDSAY, R. H. Estimation of total protein bound and nonprotein sulfhydril groups in tissues with Ellmans reagent. Analytical Biochemistry, v. 25, p. 192-205, 1988.

SENAY, S. E.; LEVINE, R. J. Synergism between cold and restraint for rapid production of stress ulcer in rats. Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., v.124, p. 12211223, 1967.

SESSA, W.C.; HARRISON, J.K.; BARBER, C.M.; ZENG, D.; DURIEUX, M.E.; DANGELO, D.D.; LYNCH, K.R.; PEACH, M.J. Molecular cloning and expression of a cDNA encoding endothelial cell nitric oxide synthase. J. Biol. Chem., v. 267, p. 1527415276. 1992

SHAH, V.; KAMATH, P.; DE GROEN, P. Physiology of the splanchnic circulation. In: Topol E, Lanzer F, eds. Theory and practice of vascular diseases. Germany: Springer Verlag, 2002, p.1688-94.

SHAH, V.; LYFORD, G.; GORES, G.; FARRUGIA, G.. Nitric Oxide in Gastrointestinal Health and Disease. Gastroenterology, v. 126, p. 90313, 2004.

SHAMBUREK, R.D.; SCHUBERT, M.L. Pharmacology of gastric acid inhibition. Baillieres Clin. Gastroenterol,, v. 7, n.1, 23-4, 1993.

SHAY, H.; KOMAROV, S. A.; FELS, S. E.; MERAZE, D.; GRUENSTEIN, M.; SIPLET, H. A simple method for the uniform production of gastric ulceration in rat. Gastroenterology, v. 5, p. 43-61, 1945.

SHIMADA, M.; DATE, Y.; MONDAL, M.S. Somatostatin suppresses ghrelin secretion from the rat stomach. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 302, p. 52025, 2003.

SHIOBARA, Y.; INOUE, S.; NISHIGUCHI, Y.; KATO, K.; TAKEMOTO, T.; NISHIMOTO, N.; OLIVEIRA, F.; AKISUE, M.K; HASHIMOTO, G. Pfaffane-type nortriterpenoids from Pfaffia pulverulenta. Phytochemistry, v. 31, p. 1737-1740, 1992.

SHIOBARA, Y.; INOUE, S.; KATO, K.; NISHIGUCHI, Y.; OISHI, Y; NISHIMOTO, N.; OLIVEIRA, F.; AKISUE, G.; AKISUE, M.K; HASHIMOTO, G. A nortriterpenide, triterpenoids and ecdysteroids from Pfaffia glomerata. Phytochemistry, v. 32, n. 6, p. 1527-1530, 1993a.

SHIOBARA, Y.; INOUE, S.; KATO, K.; NISHIGUCHI, Y.; NISHIMOTO, N.; OLIVEIRA, F.; AKISUE, G.; AKISUE, M.K; HASHIMOTO, G. Pfaffane-type nortriterpenoids from Pfaffia pulverulenta. Phytochemistry, v. 33, p. 897-899, 1993b.

SHIRIN, H.; PINTO, J.T.; LIU, L.U.; MERZIANU, M.; SORDILLO, E.M.; MOSS, S.F. Helicobacter pylori decreases gastric mucosal glutathione. Cancer Lett., v. 26, n. 2, p. 127-33, 2001.

SMITH, L. B.; DOWNS, R. J. Amarantceas. Flora Ilustrada Catarinense, Parte I, Fascculo: As plantas amara, 40-42, 1972.

SOUZA, M.C.; CISLINSKI, J.; ROMAGNOLO, M.B.. Levantamento florstico. In: VAZZOLER, A.E.A. de M., AGOSTINHO, A.A.; HAHN, N.S. (Eds.). A plancie de Inundao do Alto rio Paran: aspectos fsicos, biolgicos e socioeconmicos. Maring: EDUEM, 1997. p. 343-68.

STADTMAN, E.R.; BERLETT, B.S. Free-radical-mediated modification of proteins. In: Wallace, K.B. (Ed.). Free Radical Toxicology. p. 71_87, 1997.

STAMLER, J.S. S-nitrosothiols and the bioregulatory actions of nitrogen oxides through reactions with thiol groups. Curr. Top. Microbiol. Immunol., v. 196, p. 1936, 1995.

STAMLER, J.; LAMAS, S.; FANG, F. Nitrosylation: the prototypic redoxbased signaling mechanism. Cell, v. 106, p. 67583, 2001.

STICKNEY, J. C.; NORTHUP, D. W. Effect of gastric emptying upon propulsive motility of small intestine in rat. Exp. Biol. Med., vol. 101, p. 582, 1959.

SUNDLER, F.; EKBLAD, E.; HAKANSON, R. The neuroendocrine system of the gut an update. Acta Onco., v.30, p.419-27, 1991.

SUZUKI, H.; MASAOKA, T.; HOSODA, H. Helicobacter pylori infection modifies gastric and plasma ghrelin dynamics in Mongolian gerbils. Gut., v. 53, p. 18794, 2004.

SZABO, S.; SZELENYI, I., Cytoprotection in gastrointestinal pharmacology, Trends in Pharmacologycal Sciences, v. 8, p. 149-154, 1987.

SZABO, S.; BYNUM, T.E. Alternatives to the acid-oriented approach to ulcer disease: does 'cytoprotection' exist in man? A new classification of antiulcer agents. Scand. J. Gastroenterol., v. 1, p. 1-6, 1988.

SZABO, S., Mechanisms of gastric mucosal injury and protection. Journal of Clinical Gastroenterology. v. 13, p. 21S-34S, 1991.

SZABO, S.; NAGY, L., Pathways, mediators and mechanism of gastroduodenal mucosal injury, Acta Physiologica Hungarica, v. 80, p. 9-21, 1992.

TACK, J.; DEMEDT, S.; MEULEMANS, A.; SCHUURKES, J.; JANSSENS, J. Role of nitric oxide in the gastric accommodation reflex and in meal induced satiety in humans. Gut, v. 51, p.21924, 2002.

TAKAHASHI, M.; OTA, S.; HATA, Y. Hepatocyte growth factor as a key to modulate anti-ulcer action of prostaglandins in stomach. J. Clin. Invest., v. 98, p. 260411, 1996.

TAKEMOTO, T.; NISHIMOTO, N.; TAKAGI, N.; HAYASHI, S.; ODASHIMA, S.; WADA, Y. Pfaffic acid, a novel nortriterpene from Pfaffia paniculata Kuntze. Tetrahedron Letters, v. 24, p. 1057-1060, 1983

TAKEUCHI, K.; OHUCHI, T.; MIYAKE, H.; NIKI, S.; OKABE, S. Effects of nitric oxide synthase inhibitors on duodenal alkaline secretion in anesthetized rats. European Journal of Pharmacology, v. 231, p. 135-8, 1993.

TEBBE, J.J.; MRONGA, S.; SCHFER, M.K.H. Stimulation of neurons in rat ARC inhibits gastric acid secretion via hypothalamic CRF1/2- and NPY-Y1 receptors. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., v. 285, p. G1075G1083, 2003.

TERANO, A.; SAKATA-HORIE, K.; SHIMADA, T.; HIRAISHI, H.; YOSHIURA, K.; YONEDA, M.; TAKAHASHI, M.; FUJIMORI, T. The role of cellular migration in the repair process of gastric epithelial cells.Life Sci., v. 25-26, p. 3083-9, 2001.

TESKE, M.; TRENTINI, A. M. M. M. Herbarium. Compndio de Fitoterapia, Curitiba, Paran, 1995.

THANGARAJAH, H.; WONG, A.; CHOW, D.C. Gastric H-K-ATPase and acidresistant surface proteins. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., v. 282, p. G953G961, 2002.

UEDA, S.; OKADA, Y. Acid secretagogues induce Ca++ mobilization coupled to K+ conductance activation in rat parietal cells in tissue culture. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1012, p. 254-260, 1989.

VANE, J.R.; MITCHELL, J.A.; APPLETON, I.; TOMLINSON, A.; BISHOP-BAILEY, D.; CROXTALL, J.; WILLOUGHBY, D.A. Inducible isoforms of cyclooxygenase and nitric-oxide synthase in inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 6, p. 2046-50, 1994.

VASCONCELOS, J.M. de O. Amaranthaceae do Rio Grande do Sul Brasil, V: gneros Pfaffia Mart. e Gomphrena Mart. Roeslria. 1986. p.75-127.

VIGO, C.L.S.; NARITA, E.; MARQUES, L.C. Validao da metodologia de quantificao espectrofotomtrica das saponinas de Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen Amaranthaceae. Revista Brasileira de Farmacognosia. v. 14, p. 4649, 2003.

WALLACE, J. L.; GRANGER, D. N. The cellular and molecular basis of gastric mucosal defense. Faseb. Journal, v. 10, p. 731 - 740, 1996.

WALLACE, J. L. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs and gastroenteropathy: the second hundred years.Gastroenterology. v. 3, p. 1000-16, 1997.

WALLACE, J. L. Mechanisms of protection and healing: current knowledge and future research. American Journal of Medicine, v. 110, n. 1A, p. 19S-23S, 2001.

WILKES, J. M.; KAJIMURA, M.; SCOTT, D. R.; HERSEY, S. J.; SACHS, G. Muscarinic responses on gastric parietal cells . Journal of Membrane Biology, v. 122, p. 97-110, 1991.

WINTERBOURN, C.O. Superoxide as an intracellular radical sirk. Free Radic. Biol. Med., v. 14, p. 85-90, 1993.

XIE, Q.W.; CHO, H.J.; CALAYCAY, J.; MUMFORD, R.A,; SWIDEREK, K.M.; LEE, T.D.; DING, A.; TROSO, T.; NATHAN, C.. Cloning and characterization of inducible nitric oxide synthase from mouse macrophages. Science, v. 256, p. 22528, 1992.

WISEMAN, H.; HALLIWELL, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochem. J., v. 313, p. 17-29, 1996.

YUNES, R. A.; PEDROSA, R. C.; FILHO, V. C. Frmacos e Fitoterpicos: A necessidade do desenvolvimento da Indstria de Fitoterpicos e Fitofrmacos no Brasil. Qumica Nova, v. 24, n. 1, p. 147-152, 2001.

ZAKI, M.; KODURU, S.; MCCUEN, R.; Amylin, released from the gastric fundus, stimulates somatostatin and thus inhibits histamine and acid secretion in mice. Gastroenterology, v. 123, p. 24755, 2002.

ZHAO, C.M.; CHEN, D.; DE LA COUR, C.D. Histamine and histidine decarboxylase are hallmark features of ECL cells but not G cells in rat stomach. Regul. Pept., v. 118, p 6166, 2004.

ZHAO, C.M.; CHEN, D.; YAMADA, H. Rat stomach ECL cells: mode of activation of histidine decarboxylase. Regul. Pept., v. 114, p. 2127, 2003.

8 ANEXO

8.1 ANLISES QUMICAS DA FBUT(50) E DA FE(70)

As fraes FBut(50) e FE(70) quando analisadas por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) e espectroscopia de ressonncia nuclear magntica de hidrognio (1H-RNM), obteve-se os seguintes resultados:

8.1.1 FBut(50)

O cromatograma obtido da FBut(50), analisada por CLAE em sistema Varian, mostra que esta frao uma mistura de compostos com diferentes tempos de reteno (Tr = min). Dentre estes compostos, 3 esto em maior concentrao: 1.17min (32%); 1.54min (11,12%); 3.68min (28.43%) (figura 8.2). O sistema Varian permite analisar a amostra em apenas um comprimento de onda ( ), que foi de 210nm. Este sistema de eluio no permitiu uma boa eluio como observado em relao ao cromatograma da mesma amostra em sistema DIONEX, usando como fase mvel a mistura de H2O/ACN 1:1 em meio cido (0,1%TFA). A anlise em sistema Dionex, (Cromeleon) permitiu analisar a FBut(50) com deteco em diode array (DAD).. O perfil cromatogrfico de FBut(50) mostra que esta frao apresenta-se como uma mistura de compostos de diferentes tempos de reteno. Dentre estes compostos, 3 esto em maior concentrao: 1.84 min (38.24%), 2.48 min (22.92%) e 16.60 min (26.54%) (figura 8.3). Com base em dados da literatura, as razes da P. glomerata apresentam como constituintes qumicos o cido glomrico (triterpenide), o cido pfamrico (nortriterpenide), a ecdisterona, a rubrosterona, o cido oleanlico e o oleanolato de -glucopiranosil (SHIOBARA et al., 1993). Analisamos as amostras por 1 H-RNM

para comparar com os compostos j descritos na literatura. O espectro de Ressonncia Nuclear Magntica de 1 H em D2O da FBut50 (figura 8.4) apresentou os seguintes deslocamentos qumicos: sinais simples entre 0.74 1.24, caractersticos de hidrognios de dois singletos em 1.22 atribudos as duas metilas (CH3) ligadas a metilas(CH3) ligada a carbonos sp3;

carbono oximetnico [-COH(CH3)2], da poro terminal da cadeia da ecdisterona (figura 8.1);

sinais mltiplos na regio de 1.2 a 2.2, caractersticos de

hidrognios dos CH2 dos anis esteroidais, presentes tanto na rubrosterona quanto na ecdisterona (figura 8.1); um sinal triplo em 1.77, caracterstico de hidrognio do CH2 vizinho ao

grupo C=O, atribudo ao CH2 (C-16) do anel de cinco carbonos semelhante ao observado para o anel da rubrosterona; sinais em 3,2 a 4,2, caracterstico de hidrognio oximetnico dois sinais largos com 7,51 e 7,52 dos hidrognios

(CHOH), de hidrognios ligados aos C-2 e C-3 da rubrosterona e da ecdisterona; ligados ao carbonos sp2 do anel B do esteride (H-C-7). Os dados de CLAE e 1HRMN obtidos com a FBut(50) sugerem que a mesma uma mistura contendo trs compostos majoritrios, que podem ser esterides do tipo ecdisterona e rubrosterona (observados pela
1

H-RNM), j

relatados anteriormente para a espcie P. glomerata (SHIOBARA et al., 1993). No entanto, estes resultados precisam ser confirmados com a obteno dos compostos puros e com novas anlises.

Ecdisterona

Rubrosterona

Figura 8.1: Estrutura qumica da ecdisterona e da rubrosterona.

Figura 8.2: Perfil cromatogrfico da FBut(50), obtido com um sistema de cromatografia lquida de alta eficincia em sistema Varian, coluna RP-C18 90A (150 x 4,60mm) eluda com metanol:gua 50:50 em fluxo contnuo de 1,0ml/min (Seo de Fisiologia e Bioqumica da Secretaria do Meio Ambiente de So Paulo). Os dados foram obtidos e analisados pela Dra. Luce Maria Brando Torres.

Injecao UV_VIS_1 120 Sequencia milfolhas #1 4 mAU WVL:210 nm

1 - 1,840

100

80

60 2 - 2,067 43,565 3 - 2,479 - 3,297 6 -54,460 7 - 4,857 9 8 6,910 - - 6,040 10 -11 - 9,624 8,838 12 -- 11,145 13 11,909 14 - 12,575 15 - 14,756

40

16 - 16,597

20

0 MinAr = 0,100

min -20 0,0 4,0 8,0 0,0 14,0 18,0 22,0 26,0 30,0 2,0 6,0 1 12,0 16,0 20,0 24,0 28,0
Figura 8.3: Perfil cromatogrfico da FBut(50), obtido com um sistema de cromatografia lquida de alta eficincia em sistema Dionex, coluna RP-C-18 90A (150 x 4,60mm) eluda com H O 0,1% de TFA:ACN0 e 1% de TFA (50:50) em fluxo contnuo de 2 1,0ml/min (Seo de Fisiologia e Bioqumica da Secretaria do Meio Ambiente de So Paulo). Os dados foram obtidos e analisados pela Dra. Luce Maria Brando Torres.

17 - 26,968 18 - 27,880

Figura 8.4: Espectro de Ressonncia Nuclear Magntica de 1H em D O (com supresso do solvente gua) da frao 2 FBut50 em Espectrofotmetro Brucker (DRX-500) (Central Analtica da Universidade de So Paulo).

4.1.4.2 FE(70)

O cromatograma da FE(70) foi obtido por CLAE em sistema Dionex com deteco em diode array (DAD).. Os dados mostram que esta frao apresenta-se como uma mistura de compostos de diferentes tempos de reteno. Dentre estes compostos, 2 esto em maior concentrao: 1.89 min (58.23%) e 2.69 min (12.30%) (figura 8.5). Analisamos a FE(70) por 1H-RNM em D2O (figura 8.6). O espectro obtido apresentou os seguintes deslocamentos qumicos: sinais simples entre 0.73 1.17, caractersticos de metilas ligadas a sinais mltiplos na regio entre 1.2 a 2.2, caractersticos de sinais na regio de 3.28 a 4.56, caractersticos de hidrognios sinais entre 5.10 a 5.45, caracterstico de hidrognios ligados a um sinal duplo com 4.57, com constante de acoplamento (J) de 8Hz, um sinal duplo com 4.60, com constante de acoplamento (J) de 8Hz do acar ligado, na carbonos sp3 ; em um total de 7 metilas;

hidrognios de CH2 dos anis alifticos;

ligados a carbono oximetnico (CHOH); carbono sp2 (C=C);

do hidrognio anomrico do acar na forma piranosdica;

do hidrognio anomrico, oximetnicos em posio axial

forma piranosdica. Este sinal aproximadamente a metade da altura do sinal em 4.57, sugerindo uma mistura de dois compostos de natureza terpnica ligados a acar e em concentraes diferentes. Os dados de CLAE e 1HRMN obtidos com a FE(70) sugerem que a mesma uma mistura contendo trs compostos majoritrios. Os dados espectrais e os testes fitoqumicos realizados com as razes da P. glomerata (FREITAS, 2000) indicam que a FE(70) constituda de triterpenos ligados acar.

Injecao 120 Sequencia milfolhas4#2UV_VIS_1 mAU WVL:210 nm 4 -- 2,364 2,688 2,149 1 - 1,889 6- 4,384 5 - 2 7- --3 2,270 8 3,328 9 3,751 10 3,568 4,674 11 - 6,092 12 13 - 9,702 - 8,965 14 - 10,825 15 - 12,150 16 - 14,918

50

17 - 20,623 min

-20 0,0 4,0 8,0 14,0 20,0 26,0 2,0 6,0 12,0 18,0 24,0 30,0 10,0 16,0 22,0 28,0
Figura 8.5: Perfil cromatogrfico da FE(70), obtido com um sistema de cromatografia lquida de alta eficincia em sistema Dionex, coluna RP-C-18 90A (150 x 4,60mm) eluda com H2O 0,1% de TFA:ACN0 e 1% de TFA (50:50) em fluxo contnuo de 0,8ml/min (Seo de Fisiologia e Bioqumica da Secretaria do Meio Ambiente de So Paulo). Os dados foram obtidos e analisados pela Dra. Luce Maria Brando Torres.

Figura 8.6: Espectro de Ressonncia Nuclear Magntica 1H em D O (com supresso de solvente) da frao Fe 70 em 2 Espectrofotmetro Brucker (DRX-500) (Central Analtica da Universidade de So Paulo).