TEMA2-BiotecMed

La clula como herramienta para producir frmacos. Protenas teraputicas recombinantes. Anticuerpos monoclonales.

Clonacin de un fragmento de ADN

Produccin de protenas recombinantes

Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae/ Pichia pastoris Clulas de mamferos (CHO, de ovario de hmster chino)
- Factores de coagulacin VII y VIII - Eritropoietina (EPO) - Hormona de crecimiento (GH) - Hormona estimulante del folculo (FSH)

Plantas o animales transgnicos

- lactoglobulina en la leche de vaca - Antitrombina III humana en leche de cabra

Produccin de protenas recombinantes: Escherichia coli - Es el organismo ms utilizado - Es muy simple - Fcil de manipular - Fcil de cultivar - Pero carece de la capacidad de realizar modicaciones post-traduccionales

Generalidades de los vectores de clonacin de tipo plsmido para expresar genes eucariotas en bacterias - Molculas de ADN de doble cadena circulares - Se autorreplican - Se mantienen como entidades extracromosmicas - Tienen un marcador seleccionable en la bacteria - Tienen sitios de restriccin para clonar - Tienen un promotor que se expresa en la bacteria tras el cual se clona - Otros elementos (vector o inserto): terminador, sitio de unin a ribosomas.. La bacteria tambin debera tener algunas caractersticas: RecA-, restriccin-, etc.

Y el gen eucariota - No debe tener intrones (ADNc) - Contener un ATG inicial y un triplete de stop nal - Necesita las secuencias de control de la transcripcin y traducccin de procariotas si el vector no las tiene Los sistemas ms sosticados controlan tambin.. -La estabilidad de la protena -La solubilidad -La secrecin -El nmero de copias del plsmidos

Promotor y terminador Promotor fuerte y regulable: ej. Promotor lac de E. coli

Efecto de la temperatura

Control de la traduccin

Seal de inicio de la traduccin (ribosome-binding site)

- 6-8 nucletidos del ARNm complementario de una zona del ARNr de la subunidad pequea del ribosoma - A 8 nucletidos aprox. del inicio de la traduccin - No debe poder formar una estructura secuandaria:

Si la protena exgena presenta muchos codones raros para el hospedador tendr pocos ARNt para ellos:
-Sintetizar una secuencia con codones ms frecuentes -Emplear estirpes bacterianas que sobreexpresen ciertos ARNt

Estabilidad

Para evitar la degradacin de la protena: protenas de fusin

-Clonacin en la misma fase de lectura -Puede incluirse tambin en fase la secuencia para un pptido diana de una proteasa no bacteriana:

La estabilidad de la protena depende de:

- La formacin de puentes disulfuros - La presencia de ciertos aa en el extremo N-terminal:

- La presencia de secuencias PEST disminuye la estabilidad

Solubilidad

Solubilidad de la protena: son frecuentes las

acumulaciones de protenas en forma de cuerpos de inclusin insolubles e inactivos. En muchos casos se debe a plegamientos incorrectos de la protena. Soluciones: -Protenas de fusin con tiorredoxina: las protenas se acumulan en las zonas de adhesin de la bacteria -Si la protena tiene 3 ms puentes disulfuro no suele plegarse apropiadamente: coexpresar protenas que intervienen en el plegamiento (periplsmicas: DsbA y DsbC, unidas a membrana: DsbB y DsbD):

Secrecin Aumento de la secrecin: pptido leader

Secrecin de la IL-2

Ms consideraciones sobre la secrecin

-Si en lugar de E. coli se usara una Gram+ o un eucariota, tras pasar la membrana las protenas estaran en el exterior -El exceso de produccin de una protena puede sobrecargar e inhibir la secrecin -Usar la protena que libera a las bacteriocinas -Usar las formas L (aunque resisten a la mayora de los antibiticos, son inestables, crecen muy lentamente y requieren medios complejos)

Otros parmetros

-El ADN exgeno puede cambiar el metabolismo de la bacteria (impide el desarrollo celular, requiere mucha energa, limitan los ARNt-aa, etc...) -Evitar la insuciencia de oxgeno en los cultivos -Utilizar cepas de E. coli decientes en proteasas -Integrar los plsmidos en el cromosoma cuando sea til (para evitar su prdida)

Produccin de protenas recombinantes

Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae/ Pichia pastoris Clulas de mamferos (CHO, de ovario de hmster chino)
- Factores de coagulacin VII y VIII - Eritropoietina (EPO) - Hormona de crecimiento (GH) - Hormona estimulante del folculo (FSH)

Plantas o animales transgnicos

- lactoglobulina en la leche de vaca - Antitrombina III humana en leche de cabra

Vector de expresin en eucariotas

(al margen de un origen de replicacin de E. coli y de un marcador para E. coli)

- Origen de replicacin de eucariota - Marcador seleccionable en eucariota - Promotor eucariota - Sitio de clonacin - ATG y seales de stop transcripcionales y traduccionales - Regin Kozak - Secuencia que permita la poliadenilacin del mensajero

Si esta diseado para integrarse

-No tiene origen de replicacin eucariota -Tiene una secuencia del hospedador que permite su integracin

Ventajas de Saccharamyces cerevisiae

-Es unicelular, se conoce muy bien gentica y siolgicamente y crece en cultivos pequeos y en biorreactores. -Se han aislado varios promotores fuertes de esta levadura y un plsmido natural (plsmido de 2 m) que se puede usar como parte de un vector endgeno de expresin. -Lleva a cabo muchas modicaciones post-transduccionales. -Secreta tan pocas protenas que cuando nos las ingeniamos para que secrete una protena exgena, sta es prcticamente pura. -Se ha utilizado tanto que su uso para la produccin de agentes teraputicos para humanos no requiere el mismo intenso estudio que requiere las clulas de hospedadores no aprobados. Es un organismo GRAS (generally recognized as safe).

Vectores de levaduras
-YEps (plsmidos de levadura episomales): basados en el plsmido de 2m. Son los ms utilizados para producir protenas. -YIps (plsmidos de levadura que se integran) -YACs (cromosomas de levadura articiales)

Caractersticas adicionales

-Se usan estirpes de levadura auxtrofas para algn aa o nucletido. Los vectores llevan el gen silvestre que complementa esa auxotrofa y as se seleccionan. -Hay toda una serie de promotores fuertes descritos, aunque se preeren los regulables (concretamente los inducibles). -La mayor ecacia se tiene con un buen terminador, que suele ser del mismo gen que el promotor. -A muchas protenas exgenas se les clona un pptido seal para que se secreten. -Tambin se hacen protenas de fusin para obtener mejor las protenas. -Frecuentemente los cultivos de ms de 10 litros pierden los plsmidos aunque se seleccionen. As que a veces se recurre a la integracin en el cromosoma (preferiblemente linearizando y por 2 hechos de recombinacin). Para aumentar el nmero de copias se utilizan como dianas secuencias repetidas que estn en 200 o ms copias.

Problemas con Saccharomyces cerevisiae

-A veces la expresin es baja y la produccin modesta. -A veces ciertas protenas heterlogas son hiperglucosiladas con ms de 100 manosas, alterando la funcin de la protena y aportndole propiedades antignicas. -A veces las protenas deben secretarse pero no lo hacen. -A altas concentraciones celulares producen etanol, que es txico para las propias clulas.

Ventajas de Pichia pastoris

- Hay descrito un promotor muy eciente y regulado (el del alcohol oxidasa, la primera enzima de la utilizacin del metanol). En presencia de metanol, el 30% de las protenas de la clula son el alcohol oxidasa. En su ausencia no se produce la protena. Y se regula muy rpidamente. - Como esta levadura no produce etanol, se puede cultivar a altas concentraciones. - Tambin secreta muy pocas protenas propias.

Produccin de protenas recombinantes en clulas de insecto mediante baculovirus Baculovirus

-Nucleocpsida individual: puede infectar a la clula de al lado. -Polihedrn: grupo de nucleocpsidas atrapadas en una matriz de protena (polihedrina). Muchos de los polihedrones (al conjunto se le llama polihedra) salen al ambiente cuando muere el animal. Tras la ingestin por un hospedador susceptible, la polihedrina se solubiliza y los viriones entran en las clulas del intestino. Durante las ltimas etapas de la infeccin, la poliedrina se sintetiza en cantidades masivas (se inicia 36-48h post-infeccin y continua hasta 4-5 das) hasta la ruptura de las clulas y la muerte del animal.

Produccin de un baculovirus recombinante

- Cotransfectar clulas de insecto con el ADN del baculovirus silvestre cortado y el vector con al ADN de inters. -Los recombinantes se distinguen por hibridacin, PCR, etc..

Produccin de protenas recombinantes

Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae/ Pichia pastoris Clulas de mamferos (CHO, de ovario de hmster chino)
- Factores de coagulacin VII y VIII - Eritropoietina (EPO) - Hormona de crecimiento (GH) - Hormona estimulante del folculo (FSH)

Plantas o animales transgnicos

- lactoglobulina en la leche de vaca - Antitrombina III humana en leche de cabra

Produccin de protenas recombinantes: clulas de mamfero

Lnea celular CHO, de ovario de hmster chino, se usa para obtener una expresin estable (a largo plazo) de la protena: - Factores de coagulacin VII y VIII - Eritropoietina (EPO) - Hormona de crecimiento (GH) - Hormona estimulante del folculo (FSH) Las lneas celulares COS (derivadas de clulas de rin de mono verde africano), BHK (derivadas de clulas de rin de hmster) y HEK-239 (derivadas de clulas embrionarias de rin humano) se usan para obtener una expresin transitoria (a corto plazo) de la protena y para comprobar que nuestra construccin est bien realizada.

Vector de expresin en clulas de mamfero

-Origen de replicacin eucaritico (SV40) -Marcador seleccionable en clulas -Promotor eucaritico (constitutivo o inducible) -MCS -Seal de poliadenilacin -Secuencia de terminacin de la transcripcin (promotor y terminador del mismo gen: CMV, SV40, actina..) -La expresin de nuestro gen se incrementa si situamos un intrn entre el promotor y nuestro gen de inters. Suele funcionar un intrn hbrido con las seales donadoras y aceptoras de splicing de dos genes diferentes. - (Un origen de replicacin de E. coli y un marcador seleccionable en esa bacteria)

Secuencias de control de la traduccin

-Secuencia de Kozak (K), que es una secuencia de nucletidos alrededor del AUG que facilita la iniciacin de la traduccin: CC(A/G)CCAUGG -Una secuencia para el pptido seal (S), para la secrecin -La secuencia de un tag (T), para la puricacin -Una secuencia codicante para la seal de una proteasa (P) -Gen de inters -Codn de stop para asegurar la parada -Regiones 3 y 5 UTR (untranslated regions), para la eciente traduccin y estabilidad del mesajero. Se pueden usar regiones sintticas o las de la globina humana -El uso de codones del gen de inters tambin puede requerir modicaciones dependiendo del hospedador

Si se trata de un heterodmero
-Montaje in vitro -Cotransfeccin -Vectores de expresin bicistrnicos:
(IRES: internal ribosomal entry site)

Produccin de protenas recombinantes

Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae/ Pichia pastoris Clulas de mamferos (CHO, de ovario de hmster chino)
- Factores de coagulacin VII y VIII - Eritropoietina (EPO) - Hormona de crecimiento (GH) - Hormona estimulante del folculo (FSH)

Plantas o animales transgnicos

- lactoglobulina en la leche de vaca - Antitrombina III humana en leche de cabra

Produccin de protenas recombinantes: plantas o animales transgnicos

- Un animal transgnico contiene un fragmento de ADN exgeno integrado establemente en su genoma. Este transgn codica para la protena de inters, tiene un promotor especco que dene dnde y cuando se expresar el gen y elementos reguladores que aseguran la correcta expresin de la protena recombinante - Generalmente la investigacin se hace en ratones transgnicos y despus se repite en los animales de granja. - Como obtener una vaca transgnica tiene un elevado costo (500.000 ), muchos laboratorios emplean animales ms pequeos que tambin den leche, como cabras u ovejas, que adems tienen un tiempo de generacin ms corto - Se utilizan generalmente las glndulas mamarias como factora de protenas porque es muy fcil obtener y puricar las protenas que se encuentran en la leche - -lactoglobulina ovina en la leche de ratona: primera protena sintetizada por un animal transgnico (1987) - Antitrombina III humana en leche de cabra: actualmente se comercializa

Obtencin de animales transgnicos

- Inyeccin pronuclear: microinyeccin de varias copias del transgn en uno de los pronucleos del vulo recien fecundado. Pero solo si se incorpora al genoma en estado de zigoto se produce un animal transgnico. Si se incorpora en fases posteriores, se producir una quimera que con una probabilidad elevada no transmitir el transgn a la descendencia. Adems, como la integracin del transgn es al azar, nunca se puede garantizar que el animal fundador, o su descendencia, exprese la protena deseada en el momento y la cantidad deseados.

- Transferencia nuclear: transferencia del ncleo de una clula somtica, elegida entre aquellas clulas transformadas correctamente (con el transgn ya integrado en el sitio deseado y expresndose como es esperado), en un ovocito cuyo ADN ha sido eliminado (realmente es una fusin celular). Se obtiene un embrin transgnico que, una vez transferido a una hembra receptora, producir un animal transgnico.

Primeras protenas recombinantes

- Interfern: , , - Interleuquina: IL-1, IL-2, IL-4 - Hormona de crecimiento - Insulina

Primeras reas de aplicacin

- Enfermedades cardiovasculares - Oncologa - Diabetes-endocrinologa - Anti-infecciosos - Artritis - Inamacin - Enfermedades autoinmunes

 Principales reas de aplicacin actualmente

-Hematologa -Diabetes-endocrinologa -Sistema Nervioso Central -Oncologa -Anti-infecciosos (incluyendo HIV)

Protenas recombinantes de aplicacin en salud humana aprobadas hasta agosto de 2005

Protenas recombinantes (continuacin)

Principales estrategias teraputicas en la utilizacin de los biofrmacos

-Terapias de remplazamiento de protenas decientes: eritropoietina, insulina, hormona de crecimiento, factores de coagulacin... -Terapias de bloqueo de factores de crecimiento: receptor soluble de TNF o antagonista del receptor de IL-1, en artritis reumatoide -Inmunoestimuladores: interleuquinas, interferones, factores estimulantes de colonias...

ANTICUERPOS

- Los anticuerpos (las inmunoglobulinas) son molculas producidas por los linfocitos B en repuesta a la exposicin a una sustancia o molcula reconocida como extraa (antgeno). - Cada anticuerpo reconoce y se une especcamente a una sola regin del antgeno, denominada epitopo o determinante antignico. - De forma natural, una sustancia extraa puede contener diferentes epitopos, por lo que puede estimular la produccin de diferentes anticuerpos por distintos clones de linfocitos B originando una mezcla heterognea de inmunoglobulinas, con diferente capacidad de reconocer y unirse al antgeno. Esto es lo que se denomina un anticuerpo policlonal.

Anticuerpos monoclonales
En 1975, George Khler y Csar Milstein desarrollaron la tcnica de obtencin de anticuerpos monoclonales fusionando linfocitos B de ratones inmunizados con un determinado antgeno con clulas inmortales de mieloma obteniendo una clula productora de un anticuerpo monoclonal llamada hibridoma.

Estructuralmente -2 cadenas pesadas (H) -2 cadenas ligeras (L) Funcionalmente -Regin constante: Fc -2 regiones variables: Fab Sitios precisos de reconocimiento 3 CDRs por cadena (2 regiones hipervariables: Fv)

Respuesta inmunolgica mediada por el dominio Fc tras la unin antgeno/anticuerpo

Se activa la cascada del complemento. Los componentes de este sistema acaban con las membranas celulares, activan los fagocitos y generan seales para movilizar otros componentes de la respuesta inmunolgica. Se produce la unin del Fc a un receptor de una clula efectora de ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytoxicity) producindose citotoxicidad. La clula efectora libera sustancia que lisan la clula a la que est unidad el anticuerpo. Tras la unin del Fab a un antgeno soluble, el Fc puede unirse a los receptores Fc de los fagocitos, los cuales engullen y destruyen el complejo antgeno-anticuerpo.

Efecto teraputico de los anticuerpos

- Por sus propiedades naturales como efectores de la respuesta inmune Activacin de clulas del sistema inmune que expresan receptores para la regin Fc (inducen fagocitosis, liberacin de mediadores inamatorios, muerte celular, etc..) Activacin del sistema de lisis celular inducido por las protenas del complemento presentes en el plasma de la sangre (lisan una clula recubierta de anticuerpos) - Por su capacidad de reconocimiento de dianas especcas Bloqueo de las funciones en las que est implicada la molcula diana reconocida Emisin de seales al interior de la clula, que pueden activar mecanismos de apoptosis.

Usos de los anticuerpos -Prevenir el rechazo inmunolgico frente a rganos trasplantados -Tratamiento de tumores cerebrales

Para reducir la respuesta anti-Ig de ratn

Anticuerpo monoclonal quimrico

Se construyen cadenas quimricas. Se clonan en un vector de expresin y se transfectan en linfocitos B cultivados

Anticuerpo monoclonal humanizado

Cmo se obtienen?

- Se aislan los ADNc de las cadenas L y H de un hibridoma de inters. - Las regiones variable son amplicadas por PCR. Para ello se emplean oligos de la regin variable donde hay un alto grado de conservacin. Se secuencian las regiones. Es posible delimitar las CDRs porque son altamente variables. - Se disean 6 pares de oligos para amplicar las 6 CDRs. - Esos oligos llevan 12 nucletidos complementarios de la regin que anquea en humanos la zona donde queremos clonar los CDRs. - Se remplazan uno a uno los 6 CDRs. - Se clona en un vector de expresin y se transfectan clulas para producir los anticuerpos.

Problemas para obtener anticuerpos completamente humanos

Los cromosomas humanos de una fusin linfocito humanomieloma de ratn son inestables. No se ha descubierto un mieloma humano que pueda remplazar al mieloma de ratn. Aunque fuera posible obtener el hidridoma, las normas de investigacin mdica impiden la inyeccin de un antgeno para propsitos no teraputicos y realizar una esplenectoma parcial para obtener las clulas productores de anticuerpos.

Alternativas
Aislar linfocitos B humanos productores de anticuerpos mediante un antgeno uorescente. Usar FACS para enriquecer la muestra. Inmortalizar con el virus Epstein-Barr. Algunas de las clulas transformadas secretaban el anticuerpo humano que interacciona con el antgeno. Introducir clulas del sistema inmune humano en un mutante de ratn que no tenga la mayor parte de su propio repertorio de clulas inmunolgicas. Tras el trasplante, el ratn scid (con una severa inmunodeciencia combinada) adquiere el sistema inmune humano y responde a los antgenos produciendo anticuerpos. Introducir genes de inmunoglobulinas humanas en lneas germinales de ratn para producir un transgnico que produzca inmunoglobulinas humanas tras la inmunizacin con un antgeno. El ratn tiene deletados los genes que producan sus inmunoglobulinas.

Nuevas estrategias de utilizacin teraputica de los mAb

inactivas

Anticuerpos biespecficos

Inmunocitoquinas
- Diferentes citoquinas e interleuquinas poseen efecto antitumoral, pero las dosis teraputicas suelen causar graves efectos secundarios. -Se han diseado protenas de fusin formadas por un AcMo, dirigido frente a un antgeno tumoral, y el gen de una citoquina inmunoestimuladora. -Estas quimeras son capaces de inducir la activacin de la respuesta inmune antitumoral a nivel local. -Estas protenas de fusin se han probado en modelos tumorales, tanto en estrategias de vacunacin previas a la inoculacin tumoral como en el tratamiento de tumores ya establecidos, mostrando un efecto antitumoral ms potente que el de la citoquina sola o el de la combinacin de la citoquina libre y el Ac.

AcMo conjugados a agentes txicos

-Radioistopos: partculas (emite ) (ms alcance) partculas (menos) -Toxinas: ricina, diftrica, exotoxina A, enterotoxina A -Agentes citotxicos

AcMo conjugados a enzimas o agentes fotosensibilizadores

Un ejemplo muy importante: Degradacin de cogulos sanguneos

(proteasa)

Estrategia para eliminar directamente los trombos

mAb aprobados para uso teraputico

mAb aprobados para uso teraputico (cont)

Principales indicaciones teraputicas para los AcMo

-Inmunotoxinas contra cncer -Inmunosupresores en el rechazo de trasplantes -Enfermedades autoinmunes (artritis reumatoide y esclerosis mltiple) -Inhibidores de la respuesta inamatoria bloqueando factores como IL-1 y TNF- en la inamacin crnica

Protenas articiales de reconocimiento no de tipo anticuerpo

Ej: Los pptidos con anidad conocida respecto a una diana pueden ser fusionados o insertados en una protena carrier (transportadora) para combinar sus propiedades de unin con las caractersticas favorables del transportador (efectiva penetracin en tejidos para el tratamiento de tumores slidos, actividad intracelular para bloquear determinadas rutas, estabilidad....)