ESTUDO CINTICO DA ENZIMA INVERTASE Estudo laboratorial da actividade enzimtica

A caracterizao cintica de um enzima em laboratrio pode ser feita de vrias maneiras. Podemos, no entanto, comear por referir alguns aspectos importantes para a maioria das estratgias. Em primeiro lugar, preciso que a mistura de reaco contenha todos os ingredientes necessrios, ou seja, um tampo que mantenha o pH pretendido, o substrato e os cofactores necessrios para a catlise. tambm indispensvel o controlo da temperatura, recorrendo-se em geral a um banho termostatizado. Quanto a cada ensaio de actividade propriamente dito, distinguem-se: (i) ensaios contnuos: segue-se a reaco em contnuo, medida que ela ocorre , (ii) ensaios descontnuos: deixa-se decorrer a reaco, e vo-se retirando amostras a intervalos de tempo conhecidos; produto formado ou substrato gasto. A Fig. 1 representa um exemplo de um ensaio enzimtico contnuo: posteriormente determina-se a concentrao do

1. Preparar a mistura de reaco (menos um componente)

2. colocar no espectrofotmetro a estabilizar a temperatura

3.adicionar o componente que falta e registar a variao de absorvncia durante um intervalo de tempo.

Fig. 1. Ensaio enzimtico contnuo, seguido no espectrofotmetro. A reaco s iniciada no ponto 3, com a adio do substrato ou do enzima.

Um ensaio enzimtico contnuo s possvel quando o mtodo de medio no interfere com a reaco. Nalguns casos, como nos chamados mtodos colorimtricos, o mtodo

de medio destri o enzima , e portanto necessrio utilizar um mtodo descontnuo (Fig. 2).

Fig. 2. Ensaio enzimtico descontnuo para a invertase. A reaco s iniciada no ponto 3, com a adio do substrato ou do enzima. A reaco terminada em 4, ao fim de 10 minutos de reaco, quantificando-se em seguida o produto formado (neste caso, a glucose e a frutose, que so acares redutores).

Aco enzimtica da invertase

A enzima sacarase ou invertase (-fructofuranosidase) uma enzima que catalisa a hidrlise da sacarose (acar no redutor) em glucose e frutose (dois acares redutores, capazes de reduzir os ies frrico ou cprico, presente no reagente de Fehling):

Sacarose + H2O

Glucose + Frutose

Por definio, 1 unidade (U) de invertase hidrolisa 1 mol de sacarose a glucose e frutose por minuto, a pH 4,6 (25C).

A reaco pode seguir-se facilmente determinando a quantidade de acares redutores libertados por aco do enzima, utilizando, por exemplo, a reaco do cido 3,5dinitrosaliclico (DNS). A invertase existe no fermento do po, sendo possvel obter um extracto no purificado desta enzima destruindo as clulas por autlise e removendo os detritos celulares por centrifugao, aps a qual a invertase ficar no lquido sobrenadante. Nesta aula utilizar-se- a invertase comercial.

Neste trabalho efectua-se o estudo cintico da actividade do enzima sacarase em funo da concentrao de substrato, de forma a determinar os valores de Vmax e Km.