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UNIVERSIDAD NACIONAL DANIEL ALCIDES CARRION FILIAL LA MERCED FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS E. F. P.

EN INGENIERIA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

RECONOCIMIENTO DE LA ACTIVIDAD BIOCATALITICA DE ENZIMAS

22CATEDRATICO

: ING ANTONIO OTAROLA

ALUMNO

VARGAS CORONEL YOEL

SEMESTRE

VIII

LA MERCED CHANCHAMAYO

I.

INTRODUCCION En la actualidad los alimentos juegan un papel muy importante en nuestra vida cotidiana, es por eso que el ingeniero alimentario debe de conocer la importancia y la forma de cmo actan las enzimas en los alimentos. Las enzimas son sustancias protenicas que producen las clulas vivas y que acta como catalizador de los procesos metablicos. Los enzimas, a diferencia de los catalizadores inorgnicos catalizan reacciones especficas. Sin embargo hay distintos grados de especificidad. El enzima sacarasa es muy especfico: rompe el enlace b-glucosdico de la sacarosa o de compuestos muy similares. As, para el enzima sacarasa, la sacarosa es su sustrato natural, mientras que la maltosa y la isomaltosa son sustratos anlogos. El enzima acta con mxima eficacia sobre el sustrato natural y con menor eficacia sobre los sustratos anlogos. Entre los enzimas poco especficos estn las proteasas digestivas como la quimotripsina Las enzimas que actan en estas reacciones se encuentran concentrados en cantidades muy pequeas y no resultan modificados por ellas. Dichas reacciones son activadas por las enzimas gracias a su estructura que les permite fijarse a un sustrato. Dentro de los que estudiaremos estn las: La alfa-amilasa, la biopectinasa, la papana.

II.

OBJETIVOS Evaluar la actividad biocataltica de las enzimas de inters en los procesos agroindustriales Reconocer la especificidad amiloltica, pectinoltica y proteoltica de enzimas comerciales

III.

REVISION DE LITERATURA 1.1.Enzimas Las enzimas son protenas que catalizan reacciones bioqumicas. Su importancia como catalizadores biolgicos. Un catalizador es una sustancia que disminuye la energa de activacin de una reaccin qumica. Al disminuir la energa de activacin, se incrementa la velocidad de la reaccin. Las enzimas se consumen en gran cantidad a travs de todos los alimentos frescos como frutas, ensaladas frescas, leche, mantequilla, queso, carne, pescado y huevo. 1.2.Cintica Enzimtica La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cintica y de la dinmica qumica de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo cataltico, su papel en el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede ser inhibida su actividad por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de molculas.

Mecanismo para una reaccin catalizada por una enzima con un nico sustrato. La enzima (E) une un sustrato (S) y genera un producto (P).La cintica enzimtica es el estudio de cmo las enzimas se unen a sus sustratos y los transforman en productos. Los datos de equilibrios utilizados en los estudios cinticos son obtenidos mediante ensayos enzimticos.

1.3. Clasificacin de las enzimas xido-reductasas (Reacciones de oxido-reduccion) Transferasas (Transferencia de grupos funcionales) Hidrolasas (Reacciones de hidrlisis) Liasas (Adicin a los dobles enlaces) Isomerasas (Reacciones de isomerizacion) Ligasas (Formacin de enlaces, con aporte de ATP)

1.4. Funcin de las enzimas En su estructura globular, se entrelazan y se pliegan una o ms cadenas polipeptdicas, que aportan un pequeo grupo de aminocidos para formar el sitio activo, o lugar donde se adhiere el sustrato, y donde se realiza la reaccin. Una enzima y un sustrato no llegan a adherirse si sus formas no encajan con exactitud. Este hecho asegura que la enzima no participa en reacciones equivocadas. La enzima misma no se ve afectada por la reaccin. Cuando los productos se liberan, la enzima vuelve a unirse con un nuevo sustrato. 1.5. Fuente de enzimas Las fuentes de enzimas pueden ser de tipo vegetal, animal y microbiana. Las enzimas de tipo vegetal, se encuentran las porteasas, carbohidrasas ( las cuales descomponen residuos de azcares de carbohidratos superiores, a-amilasas y b-amilasa Entre las enzimas de tipo animal estn las esterasa ( Lipasa se produce en la mucosa gstrica, el pncreas y las semillas de ricino, fosfotasas: Se obtiene de tejidos animales seo, muscular, tripsina y quimotripsina se produce en el pncreas y , pectasas ) Las enzimas del tipo microbiano provienen de. Bacterias, hongos. 1.6. Algunas enzimas La alfa-amilasa: cataliza la hidrlisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidn, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinognica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca produccin de maltosa. Por su accin, la alfa-amilasa provee de fragmentos menores que pueden ser utilizados por la enzima beta-amilasa. La enzima es resistente al calor, pues a 70C conserva un 70% de su actividad. Acta sobre almidones crudos y gelatinizados. La biopectinasa: es una enzima de origen fungico, producidas por Aspergillus oryzae transformada con el gen de A. aculeatus. Esta enzima permite la clarificacin de jugos concentrados al degradar las pectinas provenientes de restos de semillas. La papana: La papana se consigue por la extraccin del ltex, que es un lquido blanco obtenido mediante cortes en los frutos inmaduros. Luego, en laboratorio, se separa la enzima y se purifica hasta alcanzar un nivel ptimo de calidad para la comercializacin y uso. La enzima se usa en estado lquido y tiene una duracin mnima de seis meses estando refrigerada. La cualidad principal es el uso como mejorador de las carnes, y el aclaramiento y evitacin de sedimentacin en las cervezas por su accin en los enlaces de las protenas.

IV.

MATERIALES Y METODOS 4.1 MATERIALES Enzimas comercia de origen microbiano: alfa-amilasa de bacillus subtilis. Enzimas de origen fngico: pectinasa de aspergillus Nger. Enzima de origen vegetal : papana de carica papaya ( extracto de ltex fresco) Fcula de yuca , papa o camote Gluten de trigo Pectina comercial Termmetro Olla mediana Cocinilla Gradilla Fiolas de 50ml Hidrxido de sodio Glucosa anhidra Bao mara Tubos de ensayo Agua destilada Acido 3.5- dinitrosalisilico Tartrato de sodio y potasio

V.

RESULTADOS Y DISCUSIONES 5.1 METODOLOGIA EXPERIMENTAL a) Preparacin de las enzimas Preparar una solucin de alfa amilasa al 1 % en volumen de 50 ml Preparar una solucin de biopeptinasa al 1 % en volumen de 50 ml Preparar una solucin de papana al 5 % en volumen de 50 ml

b) Preparacin de los sustratos A partir de 500 gr de harina de trigo, extraer el gluten mediante lavados sucesivos del almidn, anotar sus rendimientos Preparar una solucin de fcula al 10% en un volumen de 100 ml Preparar una solucin de pectina comercial al 11 % en volumen de 100 ml

c) Despolimerizacin del almidn Colocar en tubos de ensayo 5 ml 6 (tubos) de solucin de fcula o almidon y colocar en una gradilla Introducir la gradilla en bao Maria a 70 C Llegado a dicha temperatura adicionar 1 ml de solucin de enzima alfaamilaza, y mantener durante 0, 2, 4, 8, 15 y 20 minutos Cumplido el tiempo de reaccin, inactivar cada muestra de los tubos a ebullicin durante 5 min Enfriar los tubos y registrar los grados brix A continuacin adicionar 2 ml de agua destilada y 2 ml de la solucin coloreada de cido 3,5-dinitrosalisilico y hacer reaccionar durante 5 min Realizar la comparacin de la variacin del color entre las muestras.

d) Despolimerizacin del gluten de trigo Pesar cantidades iguales de gluten y colocar en placas petri Adicionar 10 ml de la solucin de papana, incluyendo un testigo sin la enzima Registrar los cambios fsicos realizados (textura, ablandamiento, etc) para comprobar si existe o no actividad proteoltica e) Despolimerizacin de la pectina Colocar 10 gr de la solucin de pectina (gelificada) en vasos de 50 ml Adicionar la enzima biopectinasa en las concentraciones de 2, 4, 8, 10 ml y hacer reaccionar durante 5 min Llevar a bao Mara a la temperatura de 40 C con agitacin constante y lenta Comprobar el grado de despolimerizacin (viscosidad, textura, apariencia) comprobando con el testigo sin enzima.

5.2

RESULTADOS
En esta prctica se hizo la preparacin de gluten y almidn debindose observar la despolimerizacin o la accin de las enzimas sobre los sustratos.

A. Preparacin de las enzimas: Se prepar solucin de alfa amilasa al 1% (0.5 gr. de alfa-amilasa en ml. de agua) y la otra de papana gotitas (2.5 ml. de papana en ml. de agua). B. Preparacin de los sustratos: Se prepar los sustratos, de 100 gr. de gluten se le adiciono agua hasta formar una masa elstica con la adicin de ml. de agua.Se prepar la solucin de papaina

C. Despolimerizacin del gluten de trigo: A cantidad determinada de gluten y se coloc en placa petri, luego se adiciono solucin de papana a una placa petri y se registr los cambios producidos (textura, ablandamiento) por la actividad proteoltica de la enzima papana En esta reaccin acta la enzima proteasa pasado los minutos el gluten no se desintegra; dejndolo ms min. el gluten empieza a desintegrarse levementente. Cuanto ms tiempo permanece pierde elasticidad

5.3 DISCUSIN

Segn Primo 1997 afirma que: El almidn est formado por la fraccin amilosa de cadena recta de molculas de glucosa unidas por enlaces glucosdicos alfa-1,4; en tanto que la fraccin amilopectina, adems de la cadena recta, presenta ramificaciones con enlaces glucosdicos 1,6. La alfa-amilasa cataliza la hidrlisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidn, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinognica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca produccin de maltosa. La enzima alfa-amilasa requiere de un activador como, por ej., cloruro de sodio. Es sensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a ph 3,3 o a ph menor a 0 C por 15 minutos. El ph ptimo de accin est dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la alfa-amilasa bacteriana y pancretica. La enzima es resistente al calor, pues a 70C conserva un 70% de su actividad. Acta sobre almidones crudos y gelatinizados.

Segn Rolstan 2001 comenta que: La alfa-amilasa de origen bacteriano es ms estable al calor que la de hongos y de cereales, de manera que no se inactiva totalmente en el horno panificador. Por este motivo, su adicin debe ser bastante cuidadosa para evitar una sobreproduccin de dextrina residual y con ello una miga gomosa y pegajosa. Por otra parte, una actividad residual del alfa-amilasa bacteriana en el pan tiene la ventaja de suministrarle una mejor conservacin, al restringir durante el almacenamiento del pan la retrogradacin de su almidn, causante del envejecimiento. Al sustituir la adicin, de la amilasa por extracto, jarabe o harina malteados, debe tenerse presente la relativa termo-resistencia de su alfa-amilana y su considerable actividad proteoltica. En la prctica realizada se observ que el almidon que se encontraba en los tubos pueden transformarse en azucares, por la medicin de grados brix puede aumentar si los tubos se encuentran ms tiempo a las temperaturas requeridas Segn Fennema 1995 afirma que: Las proteasas actan de un modo diferente, dado que hidrolizan enlaces peptdicos de gluten. Esto tambin reduce el grado de contraccin de las piezas de masa y produce unos tamaos ms regulares de productos de panificacin. Sin embargo, la accin de estas proteasas depende del tiempo. Este es el mayor factor limitador del uso de proteasas en las masas, dado que los fabricantes de bollos necesitan cierto grado de libertad con respecto al tiempo de reposo de las masas. Esto es posible con el rpido efecto de los agentes reductores como los sulfitos, pero no es fcil de conseguir con la accin continua de las proteasas Segn Lorient. 1989 comenta que: Mediante el uso de una proteasa que slo puede estar activa al comienzo de la preparacin de la masa, se puede reducir la contraccin de la masa y se pueden obtener productos horneados, con tamaos ms regulares. La accin de la proteasa se puede reducir sustancialmente cuando la concentracin del agente oxidante o los agentes oxidantes alcanza un nivel particular (de inactivacin). Por consiguiente, la cantidad requerida de enzima necesaria para la produccin de suficiente agente oxidante puede depender de la estabilidad de oxidacin de la proteasa, la cantidad de proteasa presente, la eficacia del agente oxidante y el tiempo deseado despus del cual la actividad de proteasa se deba reducir a un nivel deseado

Cuando se realiz la prctica con harina este fue sometido en dos placas petrix, uno contena papana y el otro no. Se observ de inmediato que el gluten que contena papana se fue desasindose rpidamente en transcurso de minutos. En cuanto a despolimerizacin se puede o no comprobar siempre en cuando el poder activo de la enzima. En cuanto a despolimerizacin en los tubos se pudo observar precipitaciones de almidn color blanco liquido flotante de color amarillo. As tambin se pudo observar separacin de fases en otro tubo como blanco; en fin hay separacin de fases en solucin flotante.

VI.

CONCLUSIONES

En la prctica realizada se logr evaluar las actividades biocataliticas de las enzimas alfa amilasa que tuvo la funcin de transformar el almidon de la harina en sacarosa, teniendo como prueba a 6 tubos con sus respectivos grados brix , tambin de la enzima , la papana que reaccion

rpidamente ante el gluten incluso llegando a reducir su tamao y ruptura de su estructura

VII.

RECOMENDACIONES

Es necesario acelerar las reacciones que ocurren, donde intervienen las enzimas que juegan un papel muy importante, por lo tanto debemos de conocer sus caractersticas que esta presentan. Utilizar la amilasa que degrada el almidn a azcares ms sencillos que pueden ser utilizados por las levadura en la fabricacin del pan. Tambin se emplean proteasas para romper la estructura del gluten y mejorar la plasticidad de la masa, principalmente en la fabricacin de bizcochos Las enzimas se encuentran en todos los seres vivos y son piezas esenciales en su funcionamiento. Desde el punto de vista bioqumico son protenas que actan como aceleradores de las reacciones qumicas, de sntesis y degradacin de compuestos. Una de las caractersticas ms sobresalientes de las enzimas es su elevada especificidad. Esto quiere decir que cada tipo de enzima se une a un nico tipo de sustancia, el sustrato, sobre el que acta Las enzimas tienen muchas aplicaciones en diversos tipos de industrias, entre las que se destaca la alimenticia. En algunos casos, como la obtencin de yogur, o la produccin de cerveza o de vino, el proceso de fermentacin se debe a las enzimas presentes en los microorganismos que intervienen en el proceso de produccin. Sin embargo, otros procesos de produccin de alimentos, pueden realizarse mediante la accin de las enzimas aisladas, sin incluir a los microorganismos que las producen El metodo de hidrolisis de almidon con una enzima de alfa-amilasa consiste en el tratamiento del almidon, a un ph entre 3,5 y 7,0 y temperatura comprendida entre 50c y 100c, con la enzima alfa-amilasa, durante un tiempo suficiente para producir una disolucion de hidrolizado de almidon

VIII. CUESTIONARIO

1. Cul es el principio del modo de accin del cido 3,5-dinitrosalisilico?

Los grupos reductores liberados del almidn se miden por su propiedad de reducir el cido 3,5-dinitrosalicilico. 2. Como se explica las fases de la cinetica enzimtica durante su accin biocatalitica Cinetica enzimatica El proceso enzimtico sigue las siguientes etapas:

En primer lugar el sustrato (S) y la enzima (E) se unen y forman un complejo enzima-sustrato (ES). Una vez formado el complejo ES, este o bien se disocia en enzima ms el sustrato o se transforma el sustrato en producto formado el complejo enzima-producto (EP), que se disocia para dar enzima (E) ms producto (P). El proceso fue modelizado por Michaelis y Menten y le permitio obtener una ecuacin, ecuacin de Michaelis-Mente en donde la velocidad de la accin de un enzima es funcin de la cantidad de sustrato presente, la cantidad de enzima y las caractersticas del enzima, la afinidad del enzima por el sustrato y el poder cataltico del enzima: 4. Explicar el mecanismo de accin biocatalitica de las enzimas en sus respectivos polimeros Mecanismo de Accin: Como hemos visto las propiedades qumicas de una enzima dependen casi enteramente de las cadenas laterales. La actividad cataltica de una enzima resulta de la unin de la molcula de sustrato al sitio activo de la enzima por medio de interacciones generalmente dbiles. Al parecer, las ms significativas

son las interacciones puente hidrgeno. Tambin debemos recordar que esta unin es sumamente especfica.

Ciclo cataltico de una enzima Una vez que la enzima reconoce al sustrato y se ajusta a l, se forma un complejo que recibe el nombre de complejo enzima-sustrato. La ruptura y la formacin de los enlaces se llevan a cabo por las interacciones entre las cadenas laterales de la enzima y los enlaces dentro del sustrato. Una vez que se han formado los productos obtenemos un complejo que recibe el nombre de complejo enzimaproducto, finalmente los productos se separarn de la enzima recuperndose esta para reaccionar con otra molcula de sustrato, es decir que en el transcurso de la reaccin la enzima no se modifica.

IX.

BIBLIOGRAFIA

PRIMO, Y. E 1997. Qumica de alimentos. Editorial. Acribia. Zaragoza. 1095p. FENNEMA, O. 1995. Qumica de los alimentos.Editorial

Acribia.Zaragoza JC CHEEFRELJL.CUQ-D LORIENT. 1989 Protenas Alimentaras. Editorial Acribia Primera Edicin Espaa Zaragoza Rolstan Lawrie 2001Avances de la ciencia de la leche Edit. Acribia, Zaragoza Espaa.

X.

ANEXOS

Fig.01 Adicin de agua a la harina y amasado para obtencin de gluten

Fig.04 Obtencin de la enzima proteoltica papana

Fig.05 cambios que ocurren en la muestra dos con papana

Fig.07 tubos de ensayo para medir los grados brix

Fig.08 gluten con pectinasa en bao maria para luego ver los cambios

Fig.10 tubos en bao Mara donde ocurren las reacciones Fig.12 adicin de agua + 2 ml de acido 3.5dinitrosalisilico

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