INTRODUO

Eletroforese o movimento de molculas carregadas em um campo eltrico. um mtodo importante para separao de molculas biolgicas porque normalmente, no afeta a estrutura nativa de biopolmeros, e devido ser altamente sensvel a pequenas diferenas em ambas as cargas e massa.

CONSIDERAES GERAIS Gel de eletroforese

O meio ideal de apoio para eletroforese quimicamente inerte, de fcil manuseio e tem porosidade controlvel. Embora papel seja o suporte escolhido para algumas aplicaes como aminocidos e pequenos peptdeos, h limitaes porque a porosidade no pode ser controlada. Gis com porosidade controlvel ou varivel so ideais para separao de componentes de alto peso molecular (protenas e cidos nuclicos), porque eles permitem fcil movimentao de macromolculas enquanto previne conveco e minimiza difuso. Gis tambm adicionam a possibilidade de combinao de separao eletrofortica com efeito de peneiramento molecular permeao do gel. Gis com efeitos peneira podem ser preparados com tamanhos de poros aproximadamente do mesmo tamanho de molculas a serem separadas pelo controle da concentrao do gel. Trs tipos de gis so comumente usados amido, poliacrilamida e agarose e as propriedades, usos, e preparao do de poliacrilamida sero discutidos agora. Poliacrilamida Acrilamida e bisacrilamida podem ser polimerizados na presena de radicais livres para gerarem gis de variados, mas controlados tamanhos de poros. Isto permite ao meio eletrofortico ter um efeito direto na separao eletrofortica. Se o tamanho dos poros forem aproximadamente iguais aos das molculas, molculas pequenas mover-se-o livremente num campo eltrico e molculas maiores sero restringidas na migrao delas. Gel de poliacrilamida formado pela polimerizao de acrilamida, com um agente de ligao cruzada N,N-metileno bisacrilamida. A polimerizao

catalisada por agentes que geram radicais livres, como persulfato de amnio. A formao de radicais livres do persulfato de amnio catalisada por N,N,N,Ntetrametiletilenodiamina (TEMED). Oxignio ir inibir a polimerizao de radical livre, ento retirada de ar de solues usadas na polimerizao recomendada. O tamanho do poro no gel de poliacrilamida influenciado pela concentrao total de acrilamida, onde as propriedades rigidez e expansibilidade e em menor grau o tamanho do poro so mais afetados pela quantidade do agente de ligaes cruzadas. Gis de poliacrilamida podem ser formados em cilindros ou em placas planas. Placas de gel permite correr vrias amostras e padres num simples gel sob condies uniformes. Calor mais facilmente dissipado de uma placa fina que de um cilindro. Entretanto, o manuseio da placa, usualmente entre 0,7 e 1,5 mm de espessura, pode ser mais difcil que o manuseio com gis cilndricos. Separaes em gis podem ser alcanadas com variveis contnuas (uma densidade de gel, um tampo, e um pH) ou com condies descontnuas (diferentes densidade do gel, tampes, e/ou pHs dentro do mesmo gel). Descontinuidade produz zonas de material altamente concentrada e faz possvel a separao de misturas de grande nmero de espcies moleculares diferentes, ou a separao de misturas de substncias altamente similares. A acumulao aumentada a cada descontinuidade em pH, composio do tampo, ou densidade do gel. No gel de separao, as bandas separam-se em reas baseadas no tamanho forma moleculares ou na relao carga/massa.

OBJETIVO
Realizar uma eletroforese em gel de poliacrilamida a fim de separar protenas, extradas de folhas de seringueira (Hevea brasiliensis), de diferentes pesos moleculares.

MATERIAL E MTODOS Extrao da protena

Folhas de seringueira do jardim clonal do Setor de Fisiologia Vegetal do Departamento de Biologia da UFLA foram maceradas em almofariz com nitrognio lquido, em presena de PVPP (polivinilpolipirrolidona).

Ao macerado, foi adicionado tampo fosfato 0,1M pH 7,5 com 1% de cido ascrbico na relao de 1 grama para 3mL. O extrato foi centrifugado a 10.000G, por 15 minutos a 4oC. O precipitado foi descartado e o sobrenadante foi quantificado por Bradford.

Preparo da eletroforese
a) Preparo do gel separador -

6,6mL de gua destilada. 5,0mL de Tris HCl 1,5M pH 8,8. 200L de SDS 10%. 8,3mL de Bis/acrilamida 30%. 100L de persulfato de amnio. 22L de TEMED.

Este gel foi colocado na cuba de eletroforese, acrescentando-se, depois, gua destilada por cima, para definir a faixa de separao. b) Preparo do gel de empilhamento -

3,9mL de gua destilada. 1,7mL de Tris HCl 0,5M pH 6,8. 20L de persulfato de amnio 10%. 15L de TEMED. 1,4mL de acrilamida soluo 6%.

Este gel foi sobreposto ao gel de separao. c) Tampo de corrida 30,30g Tris HCl. 144,13g de glicina. 1,6 mL de SDS 10% Diluir para 1 litro. Na hora de uso diluir 10 vezes.

d) Tampo da amostra 3,0mL de gua destilada. 1,0mL de Tris HCl pH 6,8. 0,8mL de glicerol. 0,4mL de 2-mercaptoetanol. 0,4mL de azul de bromofenol 1%.

e) Soluo corante 200mL de metanol. 50mL de cido actico. 250mL de gua destilada. 0,5g de Comassie Blue.

f) Soluo descorante 40mL de metanol. 10mL de cido actico. 50mL de gua.

Preparo das amostras

Foram misturados 16L da amostra em 4L de tampo da amostra em tubos eppendorff e levados ebulio por 4 minutos. Posteriormente, com a cuba eletrofortica pronta, as amostras foram aplicadas no gel com uma seringa Hamington.

Condies de corrida
As amostras foram submetidas, temperatura ambiente, a uma corrente de 110V, 20mA e 5W aproximadamente, at atingirem, visualmente, a extremidade inferior do gel. A seguir, o gel foi retirado e transferido para uma cuba, onde foi adicionada soluo corante, overnight. No dia seguinte, o gel foi descorado na soluo descorante.

RESULTADOS E CONCLUSES
Apesar do resultado de quantificao de protenas totais por Bradford, ter indicado uma alta concentrao (0.97 g/ L), corrida eletrofortica no apresentou nenhuma banda de protenas.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
DEUTSCHER, M.P. Guide to protein purification Methods in enzymology. Academic Press, San Diego, 1990. 893p. LEHNINGER, A . L. Bioqumica. Volume 1 (Traduo). So Paulo: Edgard Blucher Ltda., 2a ed., 1989. 262 p. ROBYT, J.F.; WHITE, B.J. Biochemical Techniques Theory and practice Waveland Press. Prospect Heights., Illinois. 1990. 403p. SANTOS, C.D.; ABREU, C.M.P.; CORRA, A.D.; PAIVA, L.V. Curso de Qumica Bioqumica. UFLA/FAEPE, Lavras, 1999. 237p. VOET, D.; VOET, J.G.; PRATT, C.W. Fundamentos de bioqumica. Ed. Artmed, Porto Alegre. 2000. 931p.