Introduccin Si los genes son los patrones absolutos e irreemplazables de la vida, las enzimas son los obreros especializados

que hacen posible que la vida celular tenga lugar. Las enzimas son protenas que facilitan las reacciones entre molculas que pueden reaccionar naturalmente entre s, pero en presencia de una enzima, la velocidad de la reaccin se incrementa de tal modo que ocurre en tiempo de segundos o menos. Las enzimas son catalizadores, es decir, son sustancias que, sin consumirse en una reaccin, aumentan notablemente su velocidad. No es que hagan factibles reacciones imposibles, sino que aceleran las que podran producirse espontneamente. Ello hace posible que, en condiciones fisiolgicas, tengan lugar reacciones que sin catalizador requeriran condiciones extremas de presin, temperatura o pH. La funcin de las enzimas como partcipe fundamental en una reaccin bioqumica fue conocida en los albores de la bioqumica clsica. En resumen, las enzimas son obreros calificados que unen, cortan, transfieren y/o modifican los grupos qumicos participantes de las reacciones bioqumicas vitales para la vida. En los captulos 13, 14 y 15 de este curso nos referimos a las enzimas que intervienen en los procesos de sntesis de ADN y otros relacionados, pero no nos detuvimos a explicar con detalle qu son las enzimas. En este captulo daremos un panorama general de su constitucin y funciones y luego nos detendremos en el anlisis de cmo si se engaa a una enzima se puede atacar una enfermedad. Qu son las enzimas? Su nombre proviene del griego nsymo (dentro de la levadura). Las enzimas son catalizadores (aumentan la rapidez) muy potentes y eficaces, qumicamente son protenas. Al igual que los catalizadores metlicos, slo se requiere una masa pequea para funcionar, la que se recupera indefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean energticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios qumicos, sino que aceleran su consecucin. Las enzimas son grandes protenas que aceleran las reacciones qumicas. En su estructura globular, se entrelazan y se pliegan mediante una o ms cadenas polipeptdicas, que as aportan un pequeo grupo de aminocidos para formar el sitio activo, o lugar donde se reconoce el sustrato, y donde se realiza la reaccin. Una enzima y un sustrato no llegan a interaccionar si sus formas no encajan con exactitud. Algunos fragmentos de ARN tambin tienen capacidad de catalizar reacciones relacionadas con la replicacin y maduracin de los cidos nucleicos, dichos fragmentos se denominan ribozimas. (1) La figura 18.1 esquematiza los pasos de un reaccin enzimtica en trminos generales.

Figura 18.1: Esquematizacin de una reaccin enzimtica (tomada de la figura 7 del captulo 13 de este curso) muestra una reaccin enzimtica. En el primer dibujo vemos un corte de una enzima que parecera tener forma globular que muestra su sitio activo (sealado con una flecha fina) cuya forma permite la interaccin con el sustrato que debe ajustarse a la misma geometra. Es como como si calzramos dos bolas en dos hoyos que las contengan. En este caso las dos bolas seran el sustrato que ser modificado por la enzima, por ejemplo: fosforilado, hidrolizado es decir separado como en el ejemplo, etc. Como resultado final la enzima queda inalterada y sin consumir mientras que el sustrato original desapareci y se convirti en un producto diferente. Cmo funcionan? Las enzimas son esenciales para todos los procesos biolgicos ya que son las responsables de las reacciones que mantienen la vida. Cualquier mutacin o disfuncin en un gen responsable de la codificacin de una enzima puede causar un enfermedad severa y hasta la muerte. La accin de las enzimas se caracteriza por la formacin de un complejo que representa el estado de transicin. El sustrato se une a la enzima a travs de numerosas interacciones dbiles como ser: puentes de

hidrgeno, electrostticas, hidrfobas, etc, en un lugar especfico llamado el centro activo. Este centro es una pequea porcin de la enzima, constituido por una serie de aminocidos que interaccionan con el sustrato. Para ejercer su actividad las enzimas requieren, a menudo, de molculas auxiliares, que se ubican en el centro activo de la enzima; en el caso de ser molculas orgnicas reciben el nombre de coenzimas, mientras que si son iones metlicos (generalmente oligoelementos) se llaman cofactores entre los que se encuentran el hierro, cobre, yodo, manganeso, selenio, zinc, cromo, cobalto, flor, litio y silicio. El conjunto enzima + cofactor o coenzima se denomina holoenzima, mientras que la parte proteica propiamente dicha se conoce como apoenzima. Usualmente las llamadas coenzimas no son simples molculas auxiliares de las enzimas sino verdaderos sustratos de las reacciones pero que a diferencia del sustrato principal se regeneran fcilmente mediante reacciones simples. Las enzimas tienen una estructura tridimensional sin la que no pueden desarrollar su actividad. En esa estructura poseen el centro activo al que se unen los sustratos y en el que se produce la reaccin cataltica. Cuando el sustrato accede al centro activo, se produce un cambio en la estructura del conjunto enzima-sustrato pero una vez finalizada la catalizacin (catlisis: transformacin qumica motivada por sustancias que no se alteran en el curso de la reaccin) la enzima es recuperada sin ningn cambio en su estructura. Las enzimas son esenciales para la vida ya que, de otra forma, las reacciones en las clulas ocurriran lentamente. Factores que influyen en la velocidad de las reacciones enzimticas Temperatura: Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reaccin hasta cierta temperatura ptima, ya que despus de aproximadamente 450 C se comienza a producir la desnaturalizacin trmica. Las enzimas de muchos mamferos tienen una temperatura ptima de 370 C, por encima de esa temperatura comienzan a inactivarse y se destruyen. Sin embargo, existen especies de bacterias y algas que habitan en fuentes de aguas termales y, en el otro extremo, ciertas bacterias rticas tienen temperaturas ptimas cercanas a 00 C. Un ejemplo interesante lo constituyen las ADN polimerasas aisladas de las bacterias que crecen en aguas termales. Cuando explicamos en el captulo 15 la reaccin de la polimerasa en cadena (PCR) comentamos que constaba de ciclos de calentamiento y enfriamento, durante el calentamiento se separaban las hebras de ADN y durante el enfriamiento se volva a restaurar el dplex. Lo que hizo posible esta reaccin fue el descubrimiento de ADN polimerasas que funcionan a temperaturas altas.

Thermus aquaticus, denominado tambin Thermophilus aquaticus, es una bacteria termfila que vive en la proximidad de las fuentes de agua caliente (de 50 a 80 C) fue descrito por Thomas Brock en 1969 en una fuente del parque de Yellowstone en Estados Unidos. Es una bacteria gram-negativa ( Gram es una tincin que permite diferenciar las bacterias segn el tipo de membrana que las rodea; las gram- positivas se tien de violeta y las gramnegativas de rosa), aerobia (requiere oxgeno) y hetertrofa ( se alimenta de sustancias orgnicas fabricadas por otros organismos). Esta bacteria vive a temperaturas comprendidas entre 50 y 80 C, debido a que su cctel enzimtico resiste tales condiciones. Normalmente a esas temperaturas, las protenas constitutivas de la mayora de los seres vivos se desnaturalizan y no vuelven a ser funcionales. Es por ello por lo que, una de sus enzimas, la ADN polimerasa de Thermus aquaticus, la llamada Taq polimerasa, es ampliamente utilizada por sus propiedades de termorresistencia en las reacciones de PCR. En efecto, esta enzima tiene una temperatura ptima de funcionamiento alrededor de los 75 C.

Figura 18.2. Microfotografa electrnica de Thermus aquaticus (tomada de la Wikipedia en la pgina dedicada a esta bacteria).

pH (grado de acidez de la solucin) El pH no afecta la actividad enzimtica directamente sino que modifica la concentracin de protones (H+). Los protones adems de alterar la estructura de la enzima y el sustrato, pueden participar tambin en la reaccin como sustrato o producto. En esos casos, la concentracin de protones afecta directamente la velocidad de la reaccin. Sabiendo que las enzimas son protenas, cualquier cambio brusco de pH, puede alterar el carcter inico de los grupos amino (NH2-) y carboxilo (-COOH) en la superficie proteica, afectando as las propiedades catalticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su inactivacin . El pH ptimo de algunas enzimas se muestra a continuacin:

Pepsina (1,5) ; Tripsina (7,7); Catalasa (7,6); Arginasa (9,7); Ribonucleasa (7,8) Clasificacin El Comit de Enzimas (EC) de la Unin Internacional de Bioqumica y Biologa Molecular clasifica a las enzimas en 6 clases, de acuerdo con del tipo de reaccin que catalizan, se muestra en el cuadro 18.1. Se conocen al presente ms de 5000 enzimas, algunas trabajan solas y otras necesitan un cofactor. Para medir la velocidad de reaccin de una enzima lo que se hace es determinar la velocidad de formacin del producto y la cantidad que se obtiene, la actividad se expresa como la cantidad de enzima que produce un mol de producto por minuto de reaccin. Cuadro 18.1 Clasificacin de las enzimas segn su funcin
Nm ero 1 Clasific acin Oxidorr eductas as Transfe rasas Propiedades bioqumicas Actan sobre muchos grupos qumicos para agregar o remover tomos de hidrgeno Transfieren grupos funcionales entre molculas donantes y aceptoras. Las quinasas son transferasas especializadas que regulan el metabolismo transfiriendo fosfatos desde el ATP a otras molculas Agregan agua a una ligadura hidrolizndola Agregan agua, amonaco o dixido de carbono actuando sobre las dobles ligaduras o los remueven para producir enlaces dobles. Transforman ciertas sustancias en sus ismerass Permiten la unin de dos molculas con la degradacin del ATP que provee la energa necesaria para que la reaccin tenga lugar.

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Hidrola sas Liasas

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Isomera sas Ligasas

Estructura tridimensional de las enzimas. El avance en el conocimiento de la estructura tridimensional de las protenas surgi mediante la tecnologa que comprende primero: la cristalizacin de las molculas y luego la determinacin del patrn de distribucin de sus tomos. Esto se logra cuando un haz de rayos X se hace atravesar el cristal, los rayos son desviados (difractados) al chocar contra

los tomos de la red cristalina y se forma sobre una pantalla una figura caracterstica. Por supuesto que slo los expertos pueden reconstruir la forma de una molcula compleja pero lo hacen con la ayuda de programas de computacin que generan estructuras en tres dimensiones. De esta forma se puede establecer cuntos polipptidos forman la molcula, cules son sus plegamientos y localizar adems el sitio activo si es que la molcula en cuestin es una enzima. Consideraremos un solo ejemplo por la belleza de su estructura y su importancia vital en la duplicacin y transcripcin del ADN. La enzima ADN girasa o helicasa. Como ustedes recordarn de captulos anteriores (captulo 13) ambas hebras de un ADN se encuentran enlazadas formando una hlice. En los momentos en que se necesita copiar una de ellas, el ADN se va desenrollando por sectores, este trabajo que requiere de una mquina muy especial es la enzima ADN girasa o helicasa. La estructura de la helicasa se describi recin en 1999 y result ser una molcula compleja formada por seis polipptidos individuales acomodados formando un anillo tal como se ve en la figura 18.2.

Figura 18.2 Estructura de la helicasa, se trata de una molcula compleja formada por seis helicasas individuales ensambladas de tal modo que conforman un motor en forma de anillo que desenrrolla el ADN. El motor se desplaza por el agujero central de una de las hebras y fuerza su paso a travs de los pares de bases de la molcula de ADN doble. Las esferas rojas que anidan entre dos lbulos representan las molculas de dTTP (deoxitimidina trifosfato) que es la molcula que le provee de energa a la enzima para actuar. Los rulos rosados representan la parte de la molcula que se aferra al ADN. (2) No todas las helicasas son hexamricas, hay toda una familia de

helicasas de estructuras ms simples. A medida que la helicasa avanza a lo largo de la cadena a razn de 300 nucletidos por segundo va quitndole, mediante hidrlisis, los fosfatos a la molcula de dTTP que es su moneda energtica, ya que sabemos que tanto de este nucletido como del ATP la clula toma energa que le permite llevar a cabo sus reacciones. En la figura 18.3 se muestra la frmula del dTTP que al hidrolizarse y perder pirofosfato (molcula formada por dos fosfatos) cede energa.

Figura 18.3. Frmula qumica del dTTP. Cmo engaar a una enzima: la base de muchos medicamentos En una reaccin tpica catalizada por una enzima tanto la concentracin del producto como la del reactivo son cientos de veces o miles de veces ms grandes que la concentracin de la enzima. La serie de eventos complejos que ocurren en esta reaccin son: E+S ES ES* EP E+ P Donde ES* es un estado de transicin. La cintica o velocidad de esta reaccin bioqumica fue descrita por Michaelis-Menten que la formularon como ecuacin y que tiene gran aplicabilidad en todas las reacciones enzimticas bioqumicas y que permite la graficacin y obtencin de curvas caractersticas. La presencia en la reaccin de inhibidores permite determinar en muchos casos el uso de estas sustancias como medicamentos. Para todos los interesados les recomiendo consultar la

pgina: http://web.indstate.edu/mwking/home.html muy completa y actualizada. Nosotros, en cambio, siguiendo la tnica de nuestro curso y completando los conocimientos impartidos en los captulo 13,14 y 15 vamos a ver ejemplos de cmo engaar a una enzima que interviene en la sntesis de ADN virales y de ese modo conseguir molculas antivirales eficaces. En primer lugar, vamos a analizar la accin de los anlogos de nuclesidos sobre las enzimas ADN polimerasa y retrotranscriptasa. ADN polimerasas. La ADN polimerasa es la enzima principal involucrada en la sntesis de cadenas nuevas de ADN, esencialmente lo que hace es ir enganchando nucletidos de adenina (A), guanina (G), citosina (C) o timina (T) unos a continuacin de los otros formando una hebra larga y siguiendo el patrn de apareamiento posible que le dicta la secuencia de la cadena molde. Pero el procedimiento no es tan sencillo como lo mostramos en el captulo 13 sino que, en realidad, para que se duplique la cadena funcionan al unsono varias enzimas debido a algunas restricciones de la propia polimerasa. Todas las ADN polimerasas conocidas (hay varias) sintetizan el ADN en la direccin 5 3 de modo que no puede comenzar a sintetizar desde el extremo, porque slo puede enganchar en un grupo 3-OH y por lo tanto necesita de un cebador o primer al que pueda enganchar el primer nucletido. Los cebadores son bases de ARN o ADN que son sintetizados por otra enzima llamada primasa. Recordemos tambin que, como vimos antes, se necesita una helicasa para que desenrrolle las cadenas y ofrezca a la polimerasa una cadena simple para copiar. Las ADN polimerasas son estructuras altamente conservadas lo que significa que sus subunidades catalticas estn altamente conservadas y varan poco de una especie a otra. La ADN polimerasa es una holoenzima ya que requiere in magnesio como cofactor para funcionar adecuadamente. Algunas polimerasas tienen una funcin correctora esto significa que si se coloca por error un nucletido que no corresponde al par, entonces la misma enzima lo remueve. Para ello vuelve hacia atrs un par de bases y con su actividad de exonucleasa 35 corta (separa el par errneo) y vuelve a colocar el par correcto y continuando la replicacin. Esta actividad se conoce con el de proofreading y es equivalente a corregir un texto en la prueba de galera. Cmo se engaa a una enzima. Las enzimas no son infalibles, pueden ser engaadas ofrecindoles sustratos parecidos a su sustrato natural pero que posean algn cambio qumico que pueda paralizar la reaccin natural. Este es el principio de la obtencin de muchos medicamentos contra virus que se conocen con el nombre genrico de antivirales. As por ejemplo, si queremos combatir la

infeccin con virus Herpes que es un ADN virus que produce esas vesculas molestas en la boca pero tambin que puede matar por una encefalitis, nosotros podemos evitar que se duplique su ADN dentro de la clula administrando al paciente anlogos de nuclesidos. En la figura 18.4 encontramos la frmula correspondiente a la guanosina (base normal del ADN) y en la figura 18.5 de la acicloguanosina, ms conocida como aciclovir- droga efectiva contra el herpes- y del ganciclovir, droga efectiva contra el citomegalovirus (CMV).

Figura 18.4 Frmula estructural de la guanosina, resulta de la unin de la base guanina a una ribosa.

Figura 18.5. Frmulas estructurales del aciclovir y ganciclovir. Ntese que el anillo de la ribosa est abierto y carece del OH necesario para que se enganche el prximo nucletido. Cuando la ADN polimerasa enganche una guanidina en la cadena que se est sintetizando porque tiene que aparearse a una citosina lo har pero la

cadena quedar cortada ya que el prximo nucletido no tendr dnde hacerlo, de este modo, la cadena viral no podr ser sintetizada y no se formarn las partculas virales. Enzima transcriptasa reversa Se denomina as a la ADN polimerasa dependiente de ARN, que utiliza al ARN como molde en lugar del ADN. Esta enzima forma parte de los llamados retrovirus entre los que se encuentra el virus causante de SIDA, el virus HIV. Normalmente transcribe la informacin del ARN y la convierte en un ADN complementario formndose un hbrido ARN-ADN. Luego se digiere el ARN y se duplica la cadena de ADN dando origen a un ADN doble. Como mencionamos en otros captulos el uso de la palabra reversa se debe a que normalmente en la clulas el flujo de informacin es ADN ARN protena, en este caso ocurre el proceso reverso ARN ADN. As como se engaa a la ADN polimerasa del virus herpes se puede engaar a la transcriptasa reversa del HIV. Como se puede observar en la figura 18.6 hay molculas anlogas a la timidina, como el conocido AZT y 3 TC que al tener bloqueado el OH de la ribosa al que debe unirse el prximo nucletido, cortan la cadena creciente de esto modo impiden la replicacin viral.

Figura 18.6. Frmulas estructurales de timidina y anlogos de timidina. En el AZT el OH est reemplazado por nitrgeno y en el 3TC por azufre. Proteasas Las proteasas (proteinasas, peptidasas, o enzimas proteolticas) son enzimas que rompen las uniones peptdicas entre los aminocidos que forman las protenas. Recordemos que las protenas son largos polmeros de aminocidos con muchas funciones dentro de una clula de vital

importancia como la digestin, la apoptosis, la coagulacin de la sangre y otros. En la figura 18.7 se muestra la sntesis de un pptido (unin de dos aminocidos) destacndose la unin peptdica.

Figura 18.7 Reaccin entre dos aminocidos para dar un pptido. Como resultado de la unin se pierde una molcula de agua.

La accin de estas enzimas consiste en un proceso de ruptura proteoltica en la que usan una molcula de agua de ah que de acuerdo a la clasificacin general se las considere hidrolasas. Las proteasas pueden tambin servir de blancos para el ataque de microorganismos. Hay numerosas proteasas que cortan las protenas en determinados aminocidos, por ejemplo la familia de las caspasas de gran importancia en la apoptosis o muerte celular programada, hidrolizan la unin cuando encuentran en la cadena el aminocido aspartato. Como esta actividad la realizan por medio de la cistena se dice que pertenecen al grupo de las cisten-proteasas. Otras proteasas hacen otro tipo de cortes. Referencias Michael W. King, Ph.D / IU School of Medicine / miking at iupui.edu Biositesis de las enzimas

RESUMEN La tecnologa enzimtica tiene como objetivo la superacin de todos aquellos inconvenientes que parecen retrasar la aplicacin de las enzimas en estos procesos a escala industrial, las enzimas son protenas cuya funcin biolgica es catalizar las reacciones que suceden en las clulas. Esta rea tiene aplicaciones desde tiempos remotos como la fermentacin, actualmente en diferentes industrias a diferentes niveles, ya que implica la utilizacin de sistemas enzimticos diversos que optimizan el procesamiento en la obtencin de detergente, aditivos alimenticios, productos qumicos y farmacuticos. La tecnologa enzimtica se presenta como alternativa biotecnolgica basada en que las industrias desarrollen productos de calidad homognea, aprovechen ptimamente sus materias primas, aceleres sus procesos de produccin, minimicen desperdicios y disminuyan el deterioro del medio ambiente. DESCRIPTORES: Enzimas/ Catalizadores/ Manipulacin gentica/ Produccin de enzimas. Industrias/ Biosntesis/

TECNOLOGIA ENZIMATICA 9.1 LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES Las enzimas son catalizadores de origen biolgico que parecen cumplir muchos de los requisitos necesarios para impulsar esta nueva industria qumica. Son catalizadores muy activos en medios acuosos y en condiciones muy suaves de temperatura, presin, pH, etc. Son catalizadores muy especficos: pueden modificar un nico substrato en una mezcla de substratos muy similares e incluso pueden discernir entre dos ismeros de una mezcla racmica de un compuesto quiral, Son catalizadores muy selectivos: pueden modificar un nico enlace o un nico grupo funcional en una molculas que tenga varias posiciones modificables. A pesar de esas excelentes propiedades catalticas, las enzimas han ido evolucionando a travs de los siglos para cumplir mejor las necesidades fisiolgicas de los seres vivos y no para ser utilizadas en sistemas qumicos industriales. As, las enzimas son catalizadores solubles, generalmente muy inestables y que sufren inhibiciones por substratos y productos. Adems, las enzimas muchas veces no poseen todas las propiedades ideales (actividad, selectividad, etc) cuando queremos que catalicen procesos distintos de los naturales (por sntesis en lugar de hidrlisis), sobre substratos no naturales,

en condiciones experimentales no convencionales (en disolventes orgnicos no-txicos). 9.2 TECNOLOGIA ENZIMATICA MODERNA A mediados de los aos 50, la tecnologa de las enzimas vivi su poca de gran esplendor, creciendo a un ritmo desenfrenado. El progreso de la bioqumica ha derivado en una mejor comprensin de la gran variedad de enzimas presentes en las clulas vivas, as como un mejor conocimiento acerca de su modo de accin. Por ejemplo, su eficacia se puede aumentar extrayndolas de los microorganismos y mantenindolas aisladas. Las enzimas purificadas a travs de este sistema no pierden sus propiedades; al contrario, estas preparaciones "sin clulas" devienen incluso ms eficaces. "A comienzos de 1970 la tecnologa enzimtico comenzaba a entrar en periodo de desarrollo industrial, dirigido a la produccin de aminocidos y azcares a partir de glucosa isomerizada. En aquel momento, los mercados Europeos y Americanos se encontraban dominados por la comercializacin de las enzimas proteolticas utilizadas en la industria de los detergentes, pero existian grandes expectativas sobre el mercado de enzimas aplicadas a la industria alimentara, al cual se le auguraba un crecimiento importante (Dunnill, 1980; Lewis y Kristiansen, 1985). En 1981 el mercado mundial del azcar se valor en 200 millones de dlares y en 1985 la oficina de Valores Tecnolgicos de USA lo cifraban en 250 millones. La interpretacin mas clara es el mercado para las enzimas utilizadas en la industria ha crecido espectacularmente a lo largo de los aos 1970, y que este crecimiento ha sido paralelo al desarrollo de un gran nmero de aplicaciones a la industria alimentara. Se puede esperar en el futuro que el mercado experimente un aumento cuando las enzimas comiencen a utilizarse en procesos de produccin de la industria qumica."(1) En poca ms reciente se ha visto que puede utilizarse diversos tejidos vegetales y homogenados tisulares, obtenidos de distintas fuentes, como alternativas a las clulas microbianas y a las enzimas purificadas. Por consiguiente, la conclusin evidente es que existen una serie de preparaciones biocatalticas para resolver una situacin concreta, entre las cuales debe realizarse una eleccin. Por tanto, es conveniente considerar los criterios que debe manejarse en la eleccin del biocatalizador.

9.3 INDUSTRIAS TRADICONALES Y ENZIMAS ASOCIADAS Las aplicaciones industriales tradicionales se refieren a la produccin de una transformacin til por alguna enzima, bien sea natural o aadida intencionalmente. Entre las que podemos citar: Fermentacin.- "La fermentacin alcohlica es un ejemplo conocido de los procedimientos en que se efectan alteraciones enzimticas, tanto cuando se agrega alguna enzima como cuando se aade algn microbio vivo (levadura). Primero se calienta el grano amilceo para gelatinizar el almidn, y luego se aade malta ( que contienen enzimas diastsicas) para convertir el almidn en azcar fermentable (maltosa). Si el producto que se desea obtener es alcohol, se agrega entonces levadura. El empleo de amilasa en forma de malta es indudablemente la mayor aplicacin industrial que tiene las enzimas, pero no es del todo conocida la accin de estas amilasas. La elaboracin de vinagre con alcoholes es un proceso enzmico producido por un microbio vivo (Acetobacter aceti). Como el alcohol es oxidado y convertido en cido actico con oxgeno de la atmsfera. Aislada de las bacterias, la enzima cataliza igualmente la oxidacin, pero es mucho ms econmico valerse de la clula viva intacta."(2) Curticin.-" Primero se quitan a las pieles el pelo y el exceso de carne y luego se ponen en remojo para que se hinchen y se vuelvan ms o menos porosas y permeables a las sustancias curtientes. El primer remojo se ha efectuado siempre mediante la accin enzimtica. Cuando se observ que la hinchazn era producida parcial o totalmente por enzimas protealtina impura. La cantidad de material enzimtico que se usa en la industria de curtidura representa probablemente la mayor aplicacin industrial de las enzimas despus de la industria de fermentacin."(3) Fabricacin de queso.- "La operacin ms importante en la fabricacin de queso es la coagulacin de la casena de la leche, que luego se trata para convertirla en queso. Se puede coagular la casena mediante la adicin de cido o de enzimas quesos se fabrica coagulada la casena con rennina, esta probablemente tiene una accin proteoltica muy dbil que continua en el queso. La rennina produce un cogulo elstico del que se exprime fcilmente el suero. No es la nica portenasa que se usa en la elaboracin del queso, pues tambin se emplea mezclas de rennina con pepsina. Asimismo se ha usado la papana, y en este caso al parecer se asegura la protelisis durante el aejamiento del queso. En los pases balcnicos se emplea jugo de higos ( que contiene gran proporcin de enzimas

proteolticas ficina). Para preparar el cogulo. La diferentes enzimas coagulantes hacen variar notablemente la naturaleza del queso."(4) Elaboracin de pan.- An se discute el papel que desempean en la fabricacin del pan las enzimas que se hallan en la harina. La harina cruda contiene cantidad relativamente pequea de muchas enzimas, incluso una protena del tipo de la papana, que segn creen algunos reblandece la masa. Al igual que todas las enzimas del tipo de la papana, la proteinasa de la harina es inactivada por la oxidacin. La harina de trigo contiene tambin pequeas cantidad de -amilasa y gran proporcin de -amilasa -amilasa a la harina, generalmente en forma de harina de trigo malteado, ocasiona aumento de volumen de la hogaza. La amilasa agregada hidroliza parte del almidn y lo convierte en maltosa, con lo cual suministra mas azcar para que fermente la levadura y origina la -amilasa que ya existe en la harina coopera probablemente en el proceso amilasa. "Proteinasas.- Son sustratos de las poteinasa todas las protenas excepto las queratinaass. La hidrlisis es ordinariamente muy lenta. Las proteinasas desintegran tambin pptidos sencillos, pero de ordinario con mucha lentitud. Los productos superiores de degradacin de las protenas son descompuestos rpidamente. Los aminocidos pueden ser liberados por accin proteoltica. Renina.- Se halla en el cuarto estmago de las terneras. Su accin proteoltica, si la tiene, es muy dbil. Es un poderoso agente coagulador de la leche ( pH ptimo aproximadamente 5.4) Papana.- Se halla en el ltex del fruto verde de la papaya. Es tpica de muchas enzimas vegetales como la ficina de la leche de higuern, la asclepana del vencetsigo y la bromelina del anans. Una de sus caractersticas es su contenido de grupos SH, de que parece depender la actividad de la enzima. Por oxidacin ligera se vuelve inactiva, pero es reactivada por agentes reductores, como la cistena, HCN y otros, incluso los grupos SH en las protenas que estn siendo digeridas por las enzimas parcialmente activas. La papana es relativamente resistentee con el calor, y empleada a temperaturas de 50 a 60C, es muy rpida la protelisis. La enzima coagula fcilmente la leche. Los microorganismos vivos son atacados rara vez por las proteinasas, pero la papana ataca ciertos parsitos intestinales (scaris) vivos. Descompone la hipurilamida con desprendimiento de amoniaco. Carbohidrasas.- Descomponen residuos de azcares de carbohidratos superiores. -Amilasa.- Se hallan en las glndulas salivales, el pncreas, hongos,

bacterias y la malta, que las contienen en abundancia. Descomponen los almidones y el glucgeno en dextrinas y disocian lentamente las dextrinas en maltosa y cantidad mnima de glucosa. Destruyen la estructura en cadenas ramificada del almidn (amilo pectina) y el glucgeno. Con el tempo pueden efectuar la destruccin casi total del -amilasa de malta requiere calcio y puede ser una -amilasa animal necesita cloruro. -amilasa.- Se halla en las plantas superiores, los granos la producen en abundancia. La enzima de los granos descomponen totalmente la amilasa y la convierte directamente en maltosa, tambin descompone la amilo pectina ( la porcin de cadena ramificada del almidn) y el glucgeno, pero su accin se detiene donde se ramifica la cadena de hidratos de carbono. Cuando se rompe las cadenas ramificadas de -amilasa), la -amilasa ataca los fragmentos de cadena recta as formados. De esta manera, las dos enzimas juntas hidrolizan ms rpidamente el almidn que cualquiera de ellas por separado."(5)

9.4 APLICACIONES INDUSTRIALES En relacin con las enzimas, la tecnologa moderna contribuye al ahorro. Por ejemplo, permite la utilizacin del excedente de suero derivado de la fabricacin del queso. La lactosa transforma el azcar del suero en una mezcla de glucosa y galactosa con un sabor ms dulce. As, se refina el producto y se concentra en una especie de jarabe cuyo sabor recuerda el de la miel, con lo que las aplicaciones en el sector de la confitera industrial se hacen innumerables. Se usan tambin muchos otros tratamientos de las enzimas en la produccin de edulcorantes modernos. Por ejemplo, EE.UU. se puede constatar que el jarabe del almidn de maz tiene un alto contenido en fructosa, razn por la cual ha llegado a eclipsado a la sacarosa. Las enzimas presentan muchsimas aplicaciones. Con los procedimientos modernos de fabricacin de alimentos, benefician tanto a los sectores industriales como a los consumidores. Sus caractersticas especficas permiten a los industriales ejercer un control de calidad ms estricto. Con un menor consumo de energa y unas condiciones de tratamiento ms ligeras, su eficacia favorece el entorno. Pueden utilizarse para tratar los desechos biolgicos resultantes de la fabricacin de alimentos, puesto que las propias enzimas son biodegradables. Mediante una rpida absorcin natural, las enzimas son el tpico ejemplo de "tecnologa verde".

9.4.1 Alimentos La utilizacin emprica de preparaciones enzimticas en la elaboracin de alimentos es muy antigua. El cuajo, por ejemplo, se utiliza en la elaboracin de quesos desde la prehistoria, mientras que las civilizaciones precolombinas ya utilizaban el zumo de la papaya. Sin embargo, hasta 1897 no qued totalmente demostrado que los efectos asociados a ciertos materiales biolgicos, como el cuajo o las levaduras pudieran individualizarse en una estructura qumica definida, llamada enzima, aislable en principio del organismo vivo global. Desde hace unas dcadas se dispone de enzimas relativamente puros y con una gran variedad de actividades susceptibles de utilizarse en la elaboracin de alimentos. Los progresos que estn realizando actualmente la ingeniera gentica y la biotecnologa permiten augurar un desarrollo cada vez mayor del uso de los enzimas, al disponer de un suministro continuo de materiales con la actividad deseada aprecios razonables. Los enzimas son piezas esenciales en el funcionamiento de todos los organismos vivos, actuando como catalizadores de las reacciones de sntesis y degradacin que tienen lugar en ellos. La utilizacin de enzimas en los alimentos presenta una serie de ventajas, adems de las de ndole econmica o tecnolgica. La gran especificidad de accin que tienen los enzimas hace que no se produzcan reacciones laterales imprevistas. Asimismo se puede trabajar en condiciones moderadas, especialmente de temperatura, lo que evita alteraciones de los componentes ms lbiles del alimento. Desde el punto de vista de la salud, puede considerarse que las acciones enzimticas son, en ltimo extremo, naturales. Adems los enzimas pueden inactivarse fcilmente cuando se considere que ya han realizado su misin, quedando entonces asimilados al resto de las protenas presentes en el alimento. Para garantizar la seguridad de su uso deben tenerse en cuenta no obstante algunas consideraciones: en aquellos enzimas que sean producidos por microorganismos, estos no deben ser patgenos ni sintetizar a la vez toxinas, antibiticos, etc. Los microorganismos ideales son aquellos que tienen ya una larga tradicin de uso en los alimentos (levaduras de la industria cervecera, fermentos lcticos, etc.). Adems, tanto los materiales de partida como el procesado y conservacin del producto final deben ser acordes con las prcticas habituales de la industria alimentara por lo que respecta a pureza, ausencia de contaminantes, higiene, etc. Los enzimas utilizados dependen de la industria y del tipo de accin que se desee obtener, siendo ste un campo en franca expansin. A

continuacin se mencionan solamente algunos ejemplos. Industrias lcteas "Como se ha indicado, el cuajo del estmago de los rumiantes es un producto clsico en la elaboracin de quesos, y su empleo est ya citado en la Iliada y en la Odisea. Sin embargo, el cuajo se obtuvo como preparacin enzimtica relativamente pura solo en 1879. Est formado por la mezcla de dos enzimas digestivos (quimosina y pepsina) y se obtiene del cuajar de las terneras jvenes. Estos enzimas rompen la casena de la leche y producen su coagulacin. Desde los aos sesenta se utilizan tambin otros enzimas con una accin semejante obtenidos a partir de microorganismos o de vegetales. Actualmente empieza a ser importante tambin la lactasa, un enzima que rompe la lactosa, que es el azcar de la leche. Muchas personas no pueden digerir este azcar, por lo que la leche les causa trastornos intestinales. Ya se comercializa leche a la que se le ha aadido el enzima para eliminar la lactosa. "(6) Panadera En panadera se utiliza la lipoxidasa, simultneamente como blanqueante de la harina y para mejorar su comportamiento en el amasado. La forma en la que se aade es usualmente como harina de soja o de otras leguminosas, que la contienen en abundancia. Para facilitar la accin de la levadura, se aade amilasa, normalmente en forma de harina de malta, aunque en algunos pases se utilizan enzimas procedentes de mohos ya que la adicin de malta altera algo el color del pan. La utilizacin de agentes qumicos para el blanqueado de la harina est prohibida en Espaa. A veces se utilizan tambin proteasas para romper la estructura del gluten y mejorar la plasticidad de la masa. Este tratamiento es importante en la fabricacin de bizcochos. Cervecera A principios de este siglo (1911) se patent la utilizacin de la papana para fragmentar las protenas presentes en la cerveza y evitar que sta se enturbie durante el almacenamiento o la refrigeracin, y este mtodo todava se sigue utilizando. Este enzima se obtiene de la papaya. Un enzima semejante, la bromelana, se obtiene de la pia tropical. Un proceso fundamental de la fabricacin de la cerveza, la rotura del almidn para formar azcares sencillos que luego sern fermentados por las levaduras, lo realizan las amilasas presentes en la malta, que pueden aadirse procedentes de fuentes externas, aunque lo usual es lo contrario, que la actividad propia de la malta permita transformar aun ms almidn del

que contiene. Cuando esto es as, las industrias cerveceras aaden almidn de patata o de arroz para aprovechar al mximo la actividad enzimtica. - Fabricacin de zumos A veces la pulpa de las frutas hace que los zumos sean turbios y demasiado viscosos, producindose tambin ocasionalmente problemas en la extraccin y en su eventual concentracin. Esto es debido a la presencia de pectinas (Vase pgina...), que pueden destruirse por la accin de enzimas presentes en el propio zumo o bien por enzimas aadidas obtenidas de fuentes externas. Esta destruccin requiere la actuacin de varios enzimas distintos, uno de los cuales produce metanol, que es txico, aunque la cantidad producida no llegue a ser preocupante para la salud. Fabricacin de glucosa y fructosa a partir del maz Una industria en franca expansin es la obtencin de jarabes de glucosa o fructosa a partir de almidn de maz. Estos jarabes se utilizan en la elaboracin de bebidas refrescantes, conservas de frutas, repostera, etc. en lugar del azcar de caa o de remolacha. La forma antigua de obtener estos jarabes, por hidrlisis del almidn con un cido, ha sido prcticamente desplazada en los ltimos 15 aos por la hidrlisis enizmtica, que permite obtener un jarabe de glucosa de mucha mayor calidad y a un costo muy competitivo. De hecho, la CE ha limitado severamente la produccin de estos jarabes para evitar el hundimiento de la industria azucarera clsica. Los enzimas utilizados son las alfa-amilasas y las amiloglucosidasas. La glucosa formada puede transformarse luego en fructosa, otro azcar ms dulce, utilizando el enzima glucosa-someraza, usualmente inmovilizado en un soporte slido. Refinado de azcar "La extraccin de la sacarosa, a partir de la melaza de la remolacha azucarera puede complicarse por la presencia de rafinosa, un trisacrido que previene la cristalizacin. Para incrementar la recuperacin del azcar y mejorar el proceso, la rafinosa puede degradarse enzimticamente. El resultado de esta degradacin es doble; por un lado favorece la cristalizacin y, adems, produce sacarosa como uno de los productos de la -galactosida es producida por el hongo Morteirella vinaceae raffinosutilizer y puede ser empleada convenientemente para inmovilizar los residuos micelares que producen este organismo. La reaccin hidroltica se efecta a pH superior a 5 para evitar la inversin de la sacarosa catalizada por el medio cido. Algunas veces, se requiere un tratamiento similar en el proceso de obtencin a partir de la caa de azcar, donde el almidn es hidrolizado antes de la cristalizacin mediante el uso de -amilasa."(7)

 Otras aplicaciones Los enzimas se utilizan en la industria alimentara de muchas otras formas, en aplicaciones menos importantes que las citadas anteriormente. Por ejemplo, en la fabricacin de productos derivados de huevos, las trazas de glucosa presentes, que podran oscurecerlos, se eliminan con la accin combinada de dos enzimas, la glucosa-oxidasa y la catalasa. Por otra parte, la papana y bromelana, enzimas que rompen las protenas, se pueden utilizar, fundamentalmente durante el cocinado domstico, para ablandar la carne. Algunas enzimas, como la lactoperoxidasa, podran utilizarse en la conservacin de productos lcteos. 9.4.2 Detergentes Entre otros aditivos importantes que se encuentran en los detergentes estn las enzimas, los cuales por lo general son sustancias de naturaleza protenica, que se encargan de catalizar las reacciones en los seres vivos. La tecnologa de enzimas en los detergentes se desarroll a partir de la dcada de los aos 60, como una herramienta ms de stos para atacar ciertos sustratos (generalmente proticos) especficos. Las ms comunes son las llamadas proteasas, las cuales degradan restos de protenas; y las lipasas que pueden atacar restos de sustratos lpidos que son los que comnmente se adhieren a la ropa y a ellas se les adhieren el resto de la suciedad como polvo, restos de otros compuestos orgnicos etctera. Los detergentes que contienen enzimas se les llama detergentes biolgicos. Efectos de enzimas activas Como se mencion anteriormente, algunos detergentes contienen enzimas, las cuales atacan sustratos orgnicos especficos. El problema se presenta al usar exceso de estos detergentes, con lo cual se desechan enzimas activas al drenaje, las cuales al llegar a los cuerpos de agua provocarn daos en los seres vivos presentes en stos, por accin directa sobre ellos o sobre los nutrientes que componen su dieta alimenticia. Otros efectos. Entre otros efectos secundarios producidos por los detergentes es que afectan procesos de tratamiento de las aguas residuales, por ejemplo: cambios en la demanda bioqumica de oxgeno y en los slidos suspendidos, efectos corrosivos en algunas partes mecnicas de las

plantas, interferencias en el proceso de cloracin y en la determinacin de oxgeno disuelto y algunos aditivos en los detergentes pueden intervenir en la formacin de flculos (agrupaciones de partculas suspendidas). 9.4.3 Energa Otra actividad que llama a las aplicaciones biotecnolgicas es la produccin de energa, siendo la ventaja de las fuentes orgnicas con respecto a los combustibles fsiles el que las primeras sean renovables. Cada ao crecen unas 200 mil millones de toneladas de biomasa (madera, cereales, etc), de las cuales los humanos usamos slo un 3%. Por lo tanto, este rubro ofrece un enorme potencial que puede ser aprovechado. Un ejemplo clsico de biocombustible es el alcohol obtenido por fermentacin de material rico en azcares y almidn, o de residuos orgnicos varios, incluyendo los forestales. El principal obstculo para la viabilidad de esta propuesta es el costo, puesto que el petrleo sigue siendo ms barato. Sin embargo, los avances tecnolgicos estn permitiendo acortar la brecha. Hay tambin diversos sectores de la industria en los que la adaptacin o sustitucin de procesos qumicos o fsico-qumicos por otros de base biolgica puede contribuir al desarrollo sustentable. Beneficios concretos a escala industrial ya se observan con la introduccin de enzimas en la produccin de celulosa, de textiles y del cuero, entre otros. " 9.4.4 Tratamiento de desechos "Pero es el tratamiento de desechos donde la biotecnologa puede tener un mayor impacto a nivel mundial. Los Estados Unidos gastan US$ 40 mil millones al ao para combatir la polucin que generan los 600 millones de toneladas de desechos industriales. Bacterias, microalgas, levaduras, hongos y plantas han mostrado una notable eficiencia para metabolizar residuos orgnicos, xenobiticos y metales pesados (biorremediacin y fitorremediacin), reduciendo hasta 20 veces el costo involucrado en la incineracin de dichos residuos. Por otra parte, se han hecho grandes avances en el tratamiento de derrames de petrleo con microorganismos. En fin, hay muchas otras reas suceptibles de ser abordadas exitosamente mediante el empleo de diversas biotecnologas. Sin embargo, a pesar de los promisorios resultados obtenidos hasta el momento, persisten an varias limitaciones tcnicas y econmicas que requieren ser resueltas. Por ello, la biotecnologa no debe ser vista como una panacea y en cada caso habr que ponderar sus ventajas con respecto a las tecnologas tradicionales. Al considerar las aplicaciones enzimticas en el tratamiento de los residuos,

se debe hacer hincapi entre las situaciones donde el residuo de un proceso es el material crudo y los siguientes, por ejemplo, conversin de almidones, y procesos que ayudan a reducir los costos asociados del tratamiento. Existen un amplio nmero de industrias de procesamiento de alimentos que producen residuos que necesariamente deben ser posteriormente tratados. La aplicaciones de grupos de enzimas depende de la necesidaddd de hidrolizar polmeros complejos para incrementar su posterior degradacin microbiolgica. Entre los diversos ejemplos se puede incluir el empleo de las lipasas asociadas con cultivos bacterianos para eliminar los depsitos de grasa procedentes de las paredes de las tuberas que transportan el efluente. Otra enzima degradante de polmeros utilizados de forma similar son las celulosas, proteinasas y amilasas. Una aplicacin particular que puede describirse como tratamiento de residuos, es el emplio de proteinasas en las preparaciones comerciales de detergentes, denominadas como polvo de lavado biolgico. Adems de estas hidrlisis de materiales polimricos, existen tambin aplicaciones de enzimas capaces de degradar compuestos altamente txicos que podran inhibir procesos de tratamiento basado en el empleo microbigico. Un ejemplo especfico es el uso de la peroxidasa de la cola de caballo para iniciar la degradacin de fenoles y aminas aromticas que se presentan en muchas industrias con aguas residuales. "(8) En trminos ms amplio es posible anticipar que los procesos basados en el empleo de organismos construidos genticamente para degradar los compuestos indicados anteriormente, podra representa un proceso mucho ms econmico. 9.4.5 Productos mdicos y farmacuticos Aunque las posibilidades de utilizacin de las enzimas en la medicina y campos relacionados sea potencialmente inmersa, en la actualidad el nmero concreto de aplicaciones es relativamente pequeo. No obstante, los resultados obtenidos con este pequeo nmero de ideas afortunadamente son realmente excitantes y demuestran claramente la capacidad potencial existente en las tcnicas empleadas. Puesto que las aplicaciones mdicas y farmacuticas de las enzimas abarcan un amplio espectro de materias, es conveniente dividirlas en tres reas importantes de inters: terapia enzimtica, uso analtico y productos de compuestos farmaceticos. Cada una de estas reas, auque cubre un gran nmero de

aplicaciones, presenta una serie de principios predominantes que son esencialmente para que la utilizacin de las enzimas se realice con xito. A diferencia de otros usos industriales para las enzimas, las aplicaciones mdicas y farmacuticas de las mismas requieren generalmente pequeas cantidades de enzimas muy purificadas. En parte, esto refleja el hecho de que para una enzima sea efectiva slo debe modificarse helelos compuestos de inters contenido en un fluido o tejidos fisiolgicos complejo. Esto contrasta con muchos procesos industriales en los que el medio de cultivo est relativamente bien definido y por, consiguiente, puede utilizarse un extracto enzimtico sin purificar. Adems, si el destino de una enzima o de un producto obtenido por mtodos enzimticos es su administracin a un paciente, resuelta evidente que el preparado debe contener las menores cantidades posibles de material extrao para evitar probables efectos secundarios. Produccin de aminocidos enzimticamente La produccin de aminocidos mediante tecnologa con enzimas est adaptada convenientemente. Aunque se pueden sintetizar empleando un proceso qumico, se debe sealar que en este caso se obtiene una mezcla de D y L ismeros. Puesto que solamente el L-ismero es biolgicamente activo, la mezcla debe ser separada en sus dos componentes. Este proceso puede llevarse a cabo mediante el empleo de la enzima aminoacilasa. Una vez sintetizado, la mezcla del DL aminocidos se acetila. En la produccin de otros aminocidos se han incluido tambin una etapa mediada por enzimas, incluyendo a la D-feniglicina, utilizada en la sntesis de penicilina semisinttica, y en el caso del L-triptfano, un aminocido esencial que puede sintetizarse a partir del indol. Estas son dos reas importantes en el desarrollo de esta tecnologa. En trminos de aplicacin a gran escala, la produccin de aminocidos esenciales como suplementos dietticos presenta una importancia particular. Si unas protena celular sencilla queda establecida en los mercados de alimentacin animal y humana, se puede esperar que la demanda para aminocidos esenciales incrementara, ya que muchas protenas microbianas son deficitarias en algunos de estos residuos cruciales. Tratamientos teraputicos con enzimas.-" El fundamento de esta forma de terapia es simplemente la administracin de una enzima concreta a un paciente, esperando con optimismo que produzca una progresiva mejora en el mismo. El problema principal relacionado con este mtodo es que las respuestas defensivas del organismo inactive o eliminen los compuestos extraos incorporados. En consecuencia cualquier tratamiento que utilice la administracin de una enzima, bien

por va sangunea o por cualquier otra, debe tener en cuenta este posible inconveniente."(9) Organos artificiale.- "Para sustituir algunas funciones del rin y el hgado se han desarrollado rganos artificiales que contienen enzimas. Una lesin renal crnica se trata con hemodilisis peridica, a menos que sea posible el transplante del rgano. El hgado es un rgano multifuncional y sera imposible conseguir un sustituto artificial con la tecnologa disponible actualmente. Sin embargo, s puede reproducirse una funcin importante del hgado: la desintoxicacin. A partir de clulas hepticas se pueden obtener varias enzimas microsomales capaces de llevar a cabo la desintoxicacin de una gran variedad de compuestos."(10) Aplicaciones Analticas.- "En la medicina moderna, el anlisis de las distintas muestras fisiolgicas tiene un papel clave y, dentro del mismo el uso de las enzimas(tanto en forma libre como inmovilizadas) constituyen un aspecto muy destacado. Los tipos de aplicacin de las encimas al anlisis se pueden dividir en dos granes grupos. El primero de ellos recije aquellos mtodos que miden directamente un compuesto, mientras que el segundo lo hace con aquellos que utilizan una enzima para amplificar otra respuesta (por ejemplo inmunoencarios con enzimas acopladas)."(11) Antibiticos semi-sintticos.- Las penicilinas semisintticas son los principales productos farmacuticos obtenidos por tecnologa enzimtico. El mtodo de fermentacin tradicional permite producir la bencil-penisilna (penisilina g) como la fenoximetil- penisilina (penisilina b) y en el pasado estos dos antibiticos con gran xito. Sin embargo, estos compuestos presentan limitaciones en su eficacia contra ciertas bacterias patgenas Esteroides.-" Los esteroides se utilizan en un gran nmero de preparados farmacuticos (por ejemplo la pldora contraceptiva y los antinflamatorios), por lo que los procesos empleados en la produccin de estas sustancias presentan una considerable importancia econmica."(12) 9.5. FUENTES DE ENZIMAS Las fuentes de enzimas pueden ser de tipo vegetal, animal y microbiana. Las enzimas de tipo vegetal, se encuentran las porteasas, carbohidrasas ( las cuales descomponen residuos de azcares de carbohidratos superiores, a-amilasas y b-amilasa Entre las enzimas de tipo animal estn las esterasa ( Lipasa se produce en la mucosa gstrica, el pncreas y las semillas de ricino, fosfotasas: Se obtiene de tejidos animales seo, muscular, tripsina y

quimotripsina se produce en el pncreas y , pectasas ) Las enzimas del tipo microbiano provienen de. Bacterias, hongos. 9.6. MECANISMO DE BIOSISTESIS DE ENZIMAS La degradacin de compuestos requiere enzimas. Los agentes que afectan a la presencia o actividad de las enzimas afectan tambin al crecimiento de los organismos. Las enzimas constitutivas se producen estn presentes o no los substratos (ej. glicolisis). Las enzimas inducibles slo se producen cuando los substratos estn presentes. El control de enzimas es por medio de actividad o sntesis. Generalmente, el control de actividad de las enzimas es por encendido o apagado de las enzimas y est asociado con enzimas alostricas durante la inhibicin de feedback:V Cuando los productos en una va aumentan, ellos mismos producen feedback a la primera enzima de la va y cierran la sntesis de los productos finales e intermedios.

Vas ramificadas Feedback acumulativo: ni F ni H pueden reducir separadamente por completo la actividad de e1, posiblemente cada uno puede lograr una reduccin parcial pero juntos pueden pararla totalmente.

Feedback secuencial: F y H provocan feedback en e4 y e6 respectivameante provocando la acumulacin de D. D entonces produce feedback sobre e1.

Feedback multivalente: ni F ni H por separadoproducen efecto alguno en e1 pero juntos tienen actividad inhibitoria.

Pero tambin puede darse un control de la sntesis de enzimas a nivel gentico (opern). Induccin El gen regulador sintetiza un represor activo. En ausencia de substrato (inductor), el represor activo se une al operador e impide a la ARN polimerasa unirse al promotor para la transcripcin del mRNA. Si el substrato est presente se une al represor activo que se inactiva y permite la transcripcin del mRNA. Represin del producto final El gen regulador sintetiza un represor inactivo. Si hay poca cantidad de producto final el represor inactivo no se une al operador y permite la transcripcin del mRNA. Si el producto final es abundante se une al represor inactivo que se activa y ahora el represor activo se une al operador y previene la transcripcin del mRNA. 9.7 MANEJO DE LA BIOSINTESIS DE ENZIMAS El criterio de viabilidad econmica de un proceso esta estrechamente reacionado con las normas legislativas que rigen tanto par las operaciones que los componen como para la pureza del producto final. Muchas restricciones legales se refieren a materias de seguridad que afectan, por un lado, a la maquinaria utilizada en el proceso y, por otro, a los planes posteriores con el producto. Eientemente a la hora de calcular los costos de un proceso, deben tenerse en cuenta los destinados a cubrir los requisitos legales correspondientes. En el caso de materiales biolgicos existen varias reas que presentan u riesgo potencial de efectos nocivos. Microbiologia Toxicidad qumica Toxicidad relacionada con la actividad de las encimas Reacciones alrgicas

9.7.1 Manipulacin gentica El inters de los explotadores agrcolas y los empresarios del sector alimentario por las cosechas modificadas genticamente se explica debido a todo el potencial econmico y ecolgico que se ha demostrado. Sin duda

alguna, la biotecnologa desempea una funcin muy importante en una produccin y preparacin de vveres duradera de cara al futuro. Sin embargo, aunque los especialistas han admitido que la modificacin gentica de las plantas es un mecanismo econmico y ecolgico para la produccin de alimentos, el gran pblico no deja de darle vueltas al tema de la seguridad de los productos. La industria de la biotecnologa es consciente de esta reticencia. Es la razn por la cual favorece hoy el dilogo con las diferentes partes interesadas, en particular sobre las cuestiones siguientes: Son seguros los alimentos que contienen organismos modificados genticamente? Los genes introducidos en las plantas pueden trasmitirse al medio ambiente? Es posible que la transferencia de genes de un organismo a otro provoque alergias en el ser humano? La manipulacin gentica es "la introduccin de genes extraos en una clula"; siendo esta clula generalmente un embrin; o sea el producto del huevo fecundado. Recurdese que se llama "huevo" o "cigoto"; cuando la clula sexual femenina, el vulo, es fecundado por la clula sexual masculina, el espermatozoide. La fecundacin se realiza en el aparato genital femenino, ms especficamente, en las trompas uterinas (en el ser humano, se produce en la parte superior de las trompas). Este nuevo huevo o cigoto no tiene al principio, un solo ncleo, sino dos, uno es el proncleo del espermatozoide, y otro, es el proncleo del vulo que lo conformaron (luego stos se unirn para formar el ncleo del huevo). Dicho huevo se extrae del aparato genital, y fuera del mismo, se le introduce material gentico, que son fragmentos de A.D.N. contenidos en los genes. El lugar especfico donde se realiza esta inoculacin es, en el proncleo masculino del huevo. Al introducir material gentico extrao, se pretende producir nuevos caracteres hereditarios que no estaban en el material gentico original. La ingeniera gentica consiste en la manipulacin del cido desoxirribonucleico, o ADN. En este proceso son muy importantes las llamadas enzimas de restriccin producidas por varias especies bacterianas. Las enzimas de restriccin son capaces de reconocer una secuencia determinada de la cadena de unidades qumicas (bases de nucletidos) que forman la molcula de ADN, y romperla en dicha localizacin. Los fragmentos de ADN as obtenidos se pueden unir utilizando otras enzimas llamadas ligasas. Por lo tanto, las enzimas de restriccin y las ligasas permiten romper y reunir de nuevo los fragmentos

de ADN. Tambin son importantes en la manipulacin del ADN los llamados vectores, partes de ADN que se pueden autorreplicar (generar copias de ellos mismos) con independencia del ADN de la clula husped donde crecen. Estos vectores permiten obtener mltiples copias de un fragmento especfico de ADN, lo que hace de ellos un recurso til para producir cantidades suficientes de material con el que trabajar. El proceso de transformacin de un fragmento de ADN en un vector se denomina clonacin, ya que se producen copias mltiples de un fragmento especfico de ADN. Otra forma de obtener muchas copias idnticas de una parte determinada de ADN es la reaccin de la polimerasa en cadena, de reciente descubrimiento. Este mtodo es rpido y evita la clonacin de ADN en un vector. La terapia gnica consiste en la aportacin de un gen funcionante a las clulas que carecen de esta funcin, con el fin de corregir una alteracin gentica o enfermedad adquirida. La terapia gnica se divide en dos categoras. La primera es la alteracin de las clulas germinales, es decir espermatozoides u vulos, lo que origina un cambio permanente de todo el organismo y generaciones posteriores. Esta terapia gnica de la lnea germinal no se considera en los seres humanos por razones ticas. El segundo tipo de terapia gnica, terapia somtica celular, es anloga a un trasplante de rgano. En este caso, uno o ms tejidos especficos son objeto, mediante tratamiento directo o extirpacin del tejido, de la adicin de un gen o genes teraputicos en el laboratorio, junto a la reposicin de las clulas tratadas en el paciente. Se han iniciado diversos ensayos clnicos de terapia gentica somtica celular destinados al tratamiento de cnceres o enfermedades sanguneas, hepticas, o pulmonares. La ingeniera gentica tiene un gran potencial. Por ejemplo, el gen para la insulina, que por lo general slo se encuentra en los animales superiores, se puede ahora introducir en clulas bacterianas mediante un plsmido o vector. Despus la bacteria puede reproducirse en grandes cantidades constituyendo una fuente abundante de la llamada insulina recombinante a un precio relativamente bajo. La produccin de insulina recombinante no depende del, en ocasiones, variable suministro de tejido pancretico animal. Otra aplicacin importante de la ingeniera gentica es la fabricacin de factor VIII recombinante, el factor de la coagulacin ausente en pacientes con hemofilia. Casi todos los hemoflicos que recibieron factor VIII antes de la mitad de la dcada de 1980 han contrado el sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) o hepatitis por la contaminacin viral de la sangre utilizada para fabricar el producto. Desde entonces se realiza la deteccin selectiva de la presencia de VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) y virus de la hepatitis C en los donantes de sangre, y el proceso de

fabricacin incluye pasos que inactivan estos virus si estuviesen presentes. La posibilidad de la contaminacin viral se elimina por completo con el uso de factor VIII recombinante. Otros usos de la ingeniera gentica son el aumento de la resistencia de los cultivos a enfermedades, la produccin de compuestos farmacuticos en la leche de los animales, la elaboracin de vacunas, y la alteracin de las caractersticas del ganado. Riesgos Mientras que los beneficios potenciales de la ingeniera gentica son considerables, tambin lo son sus riesgos. Por ejemplo, la introduccin de genes que producen cncer en un microorganismo infeccioso comn, como el virus influenza, puede ser muy peligrosa. Por consiguiente, en la mayora de las naciones, los experimentos con ADN recombinante estn bajo control estricto, y los que implican el uso de agentes infecciosos slo se permiten en condiciones muy restringidas. Otro problema es que, a pesar de los rigurosos controles, es posible que se produzca algn efecto imprevisto como resultado de la manipulacin gentica.En ingeniera gentica, los cientficos utilizan enzimas de restriccin para aislar un segmento de ADN que contiene un gen de inters por ejemplo, el gen que regula la produccin de insulina. 2. Un plsmido extrado de su bacteria y tratado con la misma enzima de restriccin puede formar un hbrido con estos extremos 'pegajosos' de ADN complementario.3. El plsmido hbrido se reincorpora a la clula bacteriana, donde se replica como parte del ADN celular.4. Se pueden cultivar un gran nmero de clulas hijas y obtener sus productos genticos para el uso humano.

9.8 CINETICA DE LA BIOSISNTESIS DE ENZIMAS "Aunque las leyes generales de la catlisis debieran ser vlidas para las enzimas, el hecho de que stas sean sustancias complejas, de alto peso molecular, de tamao coloidal y de composicin difcil de precisar, impide la aplicacin de dichas leyes de una manera estricta; por ejemplo, su tamao coloidal puede causar fenmenos de adsorcin o diversas reacciones debidas a sus numerosas cargas elctricas. No obstante, los factores que afectan la velocidad de la reaccin enzimtica son los ya sealados a propsito de las reacciones qumicas en general, como la temperatura y las concentraciones de las sustancias reaccionantes que, en este caso particular, son la enzima el sustrato. Adems intervienen el PH medio donde se realiza la reaccin, la presencia de los productos de la reaccin, y otros factores secundarios como las radiaciones y los efectos xido reductores."(14) 9.9 PRODUCCION DE ENZIMAS A GRAN ESCALA "La produccin de encimas para empleo industrial y como alimento se ha desarrollado en forma independiente en diversas industrias. La fuente original de enzimas de cereales, principalmente de las distintas clases de malta, es la industria de la malta de cebada. Las proteasas de las plantas, como la papaina, bromalaeina y ficina, que se emplean en los estados unidos son de omportancin, y generalmente los importadores tienen poco control sobre las condiciones del proceso de produccin."(15) La industria empacadora de carnes es la fuente principal de las enzimas derivada del pncreas, estmago e hgado de los animales. Finalmente, las enzimas de fuentes microbiolgicas: Bacterias, Hongos y levaduras, se producen en la industria de la fermentacin. Los procesos microbianos en los que el hombre controla las condiciones del desarrollo microbiolgico, se llaman fermentaciones."(15) 9.9.1 Medios de fermentacin Las fermentaciones con clulas libres constituyen todava el mtodo mas utilizado. Su manipulacin es relativamente fcil, y, en algunos casos no requiere un medio de cultivo estril. Ya que las clulas se producen con la misma rapidez con la que son eliminadas del reactor, existe una sntesis

constante de nuevo catalizado. De esta forma, y suministrando al reactor condiciones apropiadas para el crecimiento, la fermentacin puede transcurrir en un estado estacionario en el que la eficiencia cataltica no cambia. Adems, a partir de la degradacin catablica de los nutrientes, la clula que crece activamente es capaz de suministrar la energa necesaria para la sntesis. Sin embargo, el mayor nmero de reacciones requeridas para el metabolismo significa tambin aumento de probabilidades para la formacin de productos secundarios no deseados. Este hecho, junto con la produccin de un exceso de biomasa, limita el rendimiento del medio del cultivo y, por consiguiente la economa del proceso. La clulas inmovilizadas pueden considerarse como un estado intermedio entre la fermentacin, la clulas libres y las enzimas inmovilizadas. En algunos casos las clulas se destruyen antes de inmovilizarlas y se utiliza un solo componente enzimtico, por lo que, en ellos, la distincin entre clulas y encimas inmovilizadas constituye una cuestin puramente semntica. 9.10 RECUPERACION DE LAS ENZIMAS La presencia de sustancias ppticas en las frutas origina importantes problemas en su procesado industrial para la obtencin de zumo, debido a que retienen parte del zumo durante el prensado de la fruta, aumentando considerablemente su viscosidad y disminuyendo as el rendimiento de la extraccin. El desarrollo de la tecnologa enzimtica ha permitido la preparacin de enzimas pectinolticas inmovilizadas que pueden utilizarse repetidamente en operaciones simultneas o de manera continuada, capaces de degradar estas sustancias pcticas. Con estas perspectivas, el objetivo principal en este trabajo fue la preparacin de enzimas pectinolticas estables, mediante tcnicas de inmovilizacin por adsorcin en geles de alginato de calcio, estudiando las caractersticas de los biocatalizadores inmovilizados en comparacin con sus contrapartidas solubles, con objeto de mejorar y facilitar el uso de estas enzimas en los procesos de clarificacin de zumos de pltano y de kiwi, estudiando adems la posibilidad de reutilizacin de las enzimas. En relacin a los principales resultados obtenidos al determinar las actividades enzimticas de poliglacturonasa (PG), pectina liasa (PL) y endopectinasa (endoP), obtenidas de preparados comerciales (Rapidase C80, Biopectinase CCM, Pectinex 3 XL y Grindamyl 3PA, se puede concluir que :(i) cuando se inmovilizaban las pectinasas sobre geles de alginato, la PL y endoP de Rapidase C80 presentaban los niveles ms elevados de

actividad en los inmovilizados (7,2 % y 12,5% de inmovilizacin, respectivamente), mientras que el mayor nivel de inmovilizacin de PG (25%) se obtuvo con Pextinex 3XL . (ii) La aplicacin de las enzimas a un biorreactor, que contena una solucin de pectina, confirmaba su idoneidad para reducir la viscosidad de la solucin. Como tendencia general la eficacia de las enzimas inmovilizadas segua el siguiente orden descendente: Rapidase>Biopectinase>Grindamyl>Pectinex. (iii) La regeneracin de las perlas de alginato con Cl2 Ca y su reactivacin con una nueva solucin de enzima, permita reciclar el mismo inmovilizado cinco veces consecutivas. Al aumentar la concentracin enzimtica, se reducan los tiempos de tratamiento y, con ello, la inestabilidad de las enzimas inmovilizadas, lo que aumentaba la operatividad del reciclado hasta ocho reutilizaciones. (iv) La posibilidad de reutilizacin de las enzimas inmovilizadas en los zumos de pltano y kiwi se vea limitada a tres, como consecuencia directa de la desestabilizacin del soporte de inmovilizacin por efecto de los componentes del zumo, lo cual poda reducirse o anularse modificando el soporte de inmovilizacin aplicado. (v) Por ltimo, con vistas a la aplicacin biotecnolgica de ese estudio, podra concluirse que la inmovilizacin de enzimas pectinolticas sobre geles de alginato de calcio optimiza la estabilidad operacional de las enzimas y permite su reutilizacin. Reduciendo los costes finales del proceso sin prdida apreciable de la calidad y cualidades organolpticas de los zumos tratados. La presencia de sustancias pcticas en las frutas origina importantes problemas en su procesado industrial para la obtencin de zumo, debido a que retienen parte del zumo durante el prensado de la fruta, aumentando considerablemente su viscosidad y disminuyendo as el rendimiento de la extraccin. El desarrollo de la tecnologa enzimtica ha permitido la preparacin de enzimas pectinolticas inmovilizadas que pueden utilizarse repetidamente en operaciones simultneas o de manera continuada, capaces de degradar estas sustancias pcticas. Con estas perspectivas, el objetivo principal en este trabajo fue la preparacin de enzimas pectinolticas estables, mediante tcnicas de inmovilizacin por adsorcin en geles de alginato de calcio, estudiando las caractersticas de los biocatalizadores inmovilizados en comparacin con sus contrapartidas solubles, con objeto de mejorar y facilitar el uso de estas enzimas en los procesos de clarificacin de zumos de pltano y de kiwi, estudiando adems la posibilidad de reutilizacin de las enzimas. En relacin a los principales resultados obtenidos al determinar las actividades enzimticas de poliglacturonasa (PG), pectina liasa (PL) y endopectinasa (endoP), obtenidas de preparados comerciales (Rapidase C80, Biopectinase CCM, Pectinex 3 XL y Grindamyl 3PA, se puede concluir

que :(i) cuando se inmovilizaban las pectinasas sobre geles de alginato, la PL y endoP de Rapidase C80 presentaban los niveles ms elevados de actividad en los inmovilizados (7,2 % y 12,5% de inmovilizacin, respectivamente), mientras que el mayor nivel de inmovilizacin de PG (25%) se obtuvo con Pextinex 3XL . (ii) La aplicacin de las enzimas a un biorreactor, que contena una solucin de pectina, confirmaba su idoneidad para reducir la viscosidad de la solucin. Como tendencia general la eficacia de las enzimasinmovilizadas segua el siguiente orden descendente: Rapidase>Biopectinase>Grindamyl>Pectinex. (iii) La regeneracin de las perlas de alginato con Cl2 Ca y su reactivacin con una nueva solucin de enzima, permita reciclar el mismo inmovilizado cinco veces consecutivas. Al aumentar la concentracin enzimtica, se reducan los tiempos de tratamiento y, con ello, la inestabilidad de las enzimas inmovilizadas, lo que aumentaba la operatividad del reciclado hasta ocho reutilizaciones. (iv) La posibilidad de reutilizacin de las enzimas inmovilizadas en los zumos de pltano y kiwi se vea limitada a tres, como consecuencia directa de la desestabilizacin del soporte de inmovilizacin por efecto de los componentes del zumo, lo cual poda reducirse o anularse modificando el soporte de inmovilizacin aplicado. (v) Por ltimo, con vistas a la aplicacin biotecnolgica de ese estudio, podra concluirse que la inmovilizacin de enzimas pectinolticas sobre geles de alginato de calcio optimiza la estabilidad operacional de las enzimas y permite su reutilizacin. Reduciendo los costes finales del proceso sin prdida apreciable de la calidad y cualidades organolpticas de los zumos tratados. CONCLUSIONES 1.Las enzimas son catalizadores de origen biolgico que cumplen muchos requicitos para impulsar nuevas industrias qumicas. 2.La tecnologa enzimtica tiene mltiples aplicaciones, como fabricacin de alimentos, los progresos que estn realizando actualmente la ingeniera gentica y la biotecnologa permiten augurar el desarrollo cada vez mayor del uso de las enzimas. 3.La utilizacin de enzimas en los alimentos presentan una serie de ventajas, adems de las de ndole econmico y tecnolgico. 4.Las enzimas utilizadas dependen de la industria y del tipo de accin que se desee obtener. 5.Las fuentes de enzimas pueden ser de origen vegetal, animal o microbiano. 6.se puede manipular genticamente, la biosntesis de enzimas para optimizar los procesos, pero se debe tener en cuenta, las respectivas normas.

7.La produccin de enzimas a gran escala tiene su principal aplicacin en la industria de la fermentacin. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Citas bibliogrficas 1. P Gaseosa y J. Hube, tecnologa de las enzimas, Editorial acribas. S.A., Segunda Edicin, Zaragoza Espaa, 1990., Pas 3. 2. Kira, Raymond, Enciclopedia de Tecnologa Qumica, Tomo VI, primera Edicin, Editorial Uteha, Espaa 1962., paj. 1006. 3. IBID (2), Paj. 1007 4. IBID (2) Paj. 1007 5. IBID (2). Paj. 1008, 1009, 1010. 6. IBID (1), Paj. 104 7. IBID (1) Paj 106 8. IBID (1) Paj 108, 109. 9. IBID (1), Paj. 74 10. IBID (1) paj. 76 11. IBID (1) paj 81 12. IBID (1) paj 86 13. IBID (2) paj. 1111 14. Perry, Manual del Ingeniero Qumico, sexta Edicin,Tomo VI, Editorial McGraw-Hill, 1992., paj 27-2015. IBID (2) paj. 1014. Bibliografa P Gasesa y J. Hubble, tecnologa de las enzimas, Editorial acribis. S.A., Segunda Edicin, Zaragoza Espaa, 1990. Perry, Manual del Ingeniero Qumico, sexta Edicin,Tomo VI, Editorial McGraw-Hill, 1992. Kirk, Raymond, Enciclopedia de Tecnologa Qumica, Tomo VI, primera Edicin, Editorial Uteha, Espaa 1962. Ocano, Enciclopedia de la Ciencia y La tecnologa Tomo V, ediciones Ocano, Barcelona 1980. Url http:://www.icp.csis.es/biocatlisis/web3lineas.html http:www.mty.itesm.mx/data/cd/html http//www.unav.es/memoria/8-99/ingenieria.html