Artigo

Biodegradao Bacteriana de Petrleo e seus Derivados

Wetler-Tonini, R. M. C.;* Rezende, C. E.; Grativol, A. D.
Rev. Virtual Quim., 2011, 3 (2), 78-87. Data de publicao na Web: 30 de junho de 2011 http://www.uff.br/rvq

Bacterial Biodegradation of Petroleum and Oil Compounds

Abstract: Petroleum compounds can be degraded by several bacterial species. Thus, these microorganisms are of great interest to the industry and to the recovery of contaminated environments. Methods to isolate, cultivate and identify bacteria able to degrade these pollutants have been developed in the field of chemistry, biochemistry, microbiology and molecular biology, allowing for a better understanding of bacterial communities ecology and dynamics in the environmental context and in the laboratory. Finally, there is a growing need for multidisciplinary research in order to meet the greatest possible number of species, their metabolic properties and their respective roles in the degradation process of oil compounds and, with this information, develop strategies for decontamination of environments polluted with these substances. Keywords: microbial ecology; petroleum biodegradation; bacterial identification methods.

Resumo
Componentes do petrleo podem ser degradados por diversas espcies de bactrias. Estes microrganismos so de grande interesse para a indstria e na recuperao de ambientes contaminados. Mtodos de isolamento, cultivo e de identificao de bactrias degradadoras de poluentes foram desenvolvidos nos domnios da qumica, bioqumica, microbiologia e biologia molecular, possibilitando conhecer melhor a ecologia e dinmica das comunidades bacterianas no ambiente e em laboratrio. H a necessidade crescente de pesquisas multidisciplinares para conhecer o maior nmero possvel de espcies, das suas caractersticas metablicas e das suas respectivas funes para a biodegradao de petrleo e de seus derivados para a descontaminao de ambientes poludos por estes compostos. Palavras-chave: ecologia microbiana; biodegradao de petrleo; mtodos de identificao de bactrias.

* Laboratrio de Cincias Ambientais, P5, sala 211. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Av. Alberto Lamego, 2000, Parque Califrnia, CEP: 28013-602, Campos dos Goytacazes-RJ, Brasil. micro_rita@yahoo.com.br Rev. Virtual Quim. |Vol 3| |No. 2| |78-87| 78

Volume 3, Nmero 2 Revista Virtual de Qumica ISSN 1984-6835

Abril-Junho 2011

Biodegradao Bacteriana de Petrleo e seus Derivados

Rita Maria C. Wetler Tonini,* Carlos E. de Rezende, Adriana D. Grativol
Laboratrio de Cincias Ambientais, P5, sala 211. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Av. Alberto Lamego, 2000, Parque Califrnia, CEP: 28013-602, Campos dos Goytacazes-RJ, Brasil. * micro_rita@yahoo.com.br Recebido em 30 de junho de 2011. Aceito para publicao em 30 de junho de 2011

1. Biodegradao de petrleo 2. Deteco de microrganismos degradadores de poluentes do petrleo 2.1. Indicadores fsico-qumicos de poluio no solo 3. Identificao de microrganismos degradadores 3.1. Mtodos dependentes de cultura 3.2. Mtodos independentes de cultura 4. Consideraes Finais

1. Biodegradao de petrleo
O petrleo pode ser utilizado por diversos microrganismos como fonte de carbono e energia. Uma grande quantidade de substratos e metablitos presentes em solos impactados por hidrocarbonetos fornece condies para o desenvolvimento de uma complexa comunidade microbiana. 1-7 As populaes de bactrias que degradam hidrocarbonetos em sedimentos marinhos contaminados com petrleo so maiores do que nos sedimentos no contaminados por estas substncias8. Normalmente, as populaes destes microrganismos representam menos de 1% do total das comunidades microbianas em ambientes naturais. Entretanto, quando poluentes derivados do petrleo esto presentes, as populaes de bactrias degradadoras destes compostos aumentam para 10% da comunidade.9 Derrames sucessivos de petrleo no mesmo ambiente aceleram o aumento da biomassa bacteriana. Desta forma, uma alta concentrao dessas bactrias pode ser utilizada como um indicador de ambiente impactado cronicamente por petrleo.10 Portanto, o estudo da diversidade 79

microbiana autctone torna-se fundamental para a compreenso das funes exercidas pelos microrganismos diante da contaminao dos habitats por petrleo e seus derivados.11 Ecologicamente, microrganismos degradadores de hidrocarbonetos so amplamente distribudos. As dificuldades encontradas para caracterizar comunidades microbianas de ambientes impactados por hidrocarbonetos do petrleo so agravadas pela grande quantidade de substratos especficos e interaes metablicas possveis. Apesar da complexidade destas comunidades, ferramentas esto sendo desenvolvidas com o objetivo de caracterizar a abundncia e distribuio microbiana em ambientes naturais, a fim de associar estruturas comunitrias com as funes do ecossistema. Mtodos baseados em cultura e independentes de cultura tm sido desenvolvidos e aplicados para fornecer uma compreenso destas comunidades microbianas, e a evoluo destas pesquisas tem gerado e disponibilizado listas-referncia de microrganismos degradadores de hidrocarbonetos para consulta, uma vez que tcnicas para isolar e identificar microrganismos responsveis pelo metabolismo destes compostos so fundamentais Rev. Virtual Quim. |Vol 3| |No. 2| |78-87|

Wetler-Tonini, R. M. C. et al. para a biorremediao de ambientes poludos.5 comunidade podem ser divididas em mtodos dependentes de cultura e independentes de cultura.5

2. Deteco de microrganismos degradadores de poluentes do petrleo

2.1. Indicadores fsico-qumicos de poluio no solo

3.1. Mtodos dependentes de cultura

As taxas de infiltrao de gua esto sujeitas as caractersticas fsicas (ex.: granulometria) e qumicas (ex.: contedo da matria orgnica) dos solos e, consequentemente, controlam a distribuio de poluentes e microrganismos.12,7 Os intervalos de densidade do solo, em geral, variam de <1,0 (em solos orgnicos) a 1,7 g cm-3 e so dependentes das rochas formadoras dos sedimentos e das caractersticas das partculas (areia, silte, argila e matria orgnica). Camadas de solo compactado tm densidades elevadas, e inibem o movimento do ar e da gua, dificultando a ao de microrganismos aerbios. Neste caso, deve-se direcionar a prospeco para microrganismos anaerbios. Os solos com texturas mais finas tendem a agregar partculas de matria orgnica e a ter maior quantidade de bactrias aerbias.12,7 Caractersticas qumicas como o pH, a condutividade eltrica e a presena de hidrocarbonetos aromticos policclicos (HPAs) devem ser levados em considerao, pois o pH pode ser alterado pela presena de poluentes e influencia diretamente a solubilidade de minerais e de matria orgnica do solo, na disponibilidade de nutrientes e na atividade de microrganismos.12,7 A condutividade eltrica uma indicao da quantidade de ons (sais dissolvidos) presentes no solo, e o excesso de sais afeta diretamente a atividade microbiana.12 A deteco de HPAs de origem petrognica, pirognica ou biognica pode ser utilizada como indicadora da presena de microrganismos biodegradadores de petrleo, uma vez que estes possuem vias metablicas para a degradao de compostos orgnicos aromticos.13,14,6,7

Os mtodos tradicionais, dependentes de cultura, so os mais conhecidos e baseiam-se na diferenciao morfolgica, metablica e fisiolgica dos microrganismos. As tcnicas incluem o isolamento e cultivo em meios slidos contendo compostos do petrleo como nica fonte de carbono, tcnica de nmero mais provvel (NMP) e, mais recentemente, Biolog que emprega placas de utilizao do substrato.1,5 Tcnicas de cultura tradicionais produziram informaes essenciais sobre interaes microbianas com hidrocarbonetos no ambiente. Isto pode ser demonstrado em estudos, onde catlogos de microrganismos foram compilados com base no isolamento convencional e tcnicas de plaqueamento. Estas pesquisas documentaram que h uma coleo diversa, amplamente distribuda de bactrias, leveduras e fungos, capazes de utilizar hidrocarbonetos.1,5 Outras investigaes contemporneas continuam registrando comunidades microbianas em ambientes impactados por hidrocarbonetos em todo o mundo.1,5 Embora possibilitem isolar e identificar microrganismos presentes em ambientes impactados por hidrocarbonetos, as descries de comunidades microbianas por mtodos dependentes de cultivo so baseadas apenas nas caractersticas morfolgicas e funcionais.5 Aps o isolamento, so feitas anlises morfolgicas e testes bioqumicos para a identificao das bactrias ao nvel de gnero. O primeiro passo consiste na caracterizao morfolgica da colnia, colorao de Gram, e na visualizao e descrio ao microscpio das bactrias coradas. A seguir, so feitos testes bioqumicos primrios, a saber: catalase e oxidase, oxidao-fermentao e motilidade. Testes secundrios consistem na avaliao do crescimento em meios especficos (MacConkey, DNAse e Marine Agar), susceptibilidade a penicilina, utilizao de hidrocarbonetos como nica fonte de carbono e energia, hidrlise do amido, requerimento de ons de sdio, teste de utilizao de citrato, fermentao e produo de gs a partir da glicose e fermentao de 15 D-manitol. Para estudos em que no h necessidade de obteno de isolados, para os hidrocarbonetos novolteis com base na formao das emulses, pode-se 80

3. Identificao de microrganismos degradadores

Abordagens para a deteco da diversidade microbiana e as funes de cada microrganismo na Rev. Virtual Quim. |Vol 3| |No. 2| |78-87|

Wetler-Tonini, R. M. C. et al. aplicar a tcnica de NMP (nmero mais provvel) em placas de 96 poos, utilizando-se um programa de computador para estimar o nmero de microrganismos degradadores no meio de cultivo. Ensaios de NMP dividem comunidades em tipos fisiolgicos, podendo apresentar maior eficincia com o uso de vrios meios seletivos em associao com uma detalhada caracterizao do local de estudo. Esta tcnica tem se mostrado particularmente til para estudar sistemas anaerbios, pois se mostra sensvel, mesmo quando anaerbios de crescimento lento esto sendo analisados. A tcnica de NMP tambm se mostra bastante til para a caracterizao de comunidades microbianas de ambientes impactados por petrleo, e utilizada para avaliar o papel de grupos microbianos especficos durante o processo de remediao.5,15,16 A tcnica de Biolog pode ser aplicada para verificar padres de substrato para avaliar a diversidade funcional de comunidades microbianas. Neste teste, a amostra incubada com at 95 diferentes fontes de carbono em placas de 96 poos, e o corante azul de tetrazlio usado para indicar a atividade microbiana. O resultado do ensaio um perfil qualitativo fisiolgico das potenciais funes metablicas exercidas pela poro cultivvel da comunidade microbiana. As diferenas nos perfis podem ento ser analisadas por mtodos de estatstica multivariada. 12 No entanto, algumas identificaes incorretas e a constatao de que o tempo de incubao pode causar modificaes prejudica a confiabilidade do ensaio. Parte das falhas encontradas na identificao de organismos pode ser minimizada complementando o Biolog com testes bioqumicos quando a microplaca inoculada.18 Com base em estudos de cultivo de bactrias utilizando hidrocarbonetos como nica fonte de carbono, observou-se que os isolados obtidos apresentaram especificidade quanto ao uso de substratos e, foram identificadas vrias vias metablicas de degradao de HPAs para diferentes microrganismos.5,19,20 Para utilizar estes compostos, o microrganismo deve ter a capacidade de quebrar pelo menos parte da molcula de hidrocarboneto, transformando-o em outro composto intermedirio da via degradativa.5,19,20 Em laboratrio, utilizando-se culturas puras, as condies de crescimento podem ser controladas para otimizar a capacidade de biodegradao, uma vez que possvel controlar fatores fsicos e qumicos intervenientes na atividade microbiana, como pH, temperatura, umidade e concentrao de nutrientes.7 A presena de co-metabolismo essencial para a degradao de alguns hidrocarbonetos em condies 81 de laboratrio, uma vez que estes podem apresentar toxicidade para certos microrganismos e, em contrapartida, servir de fonte de carbono para outros. Assim, o metabolismo de compostos txicos por alguns microrganismos resistentes gera subprodutos que sero utilizados por outras espcies como substrato de crescimento. A biodegradao do petrleo em ambientes naturais ou em laboratrio, no pode ser realizada por uma nica espcie de bactria, uma vez que este poluente constitudo por vrios tipos de hidrocarbonetos. Nenhum microrganismo capaz de degradar sozinho todos os compostos ali presentes, exigindo a formao de consrcios de vrias espcies microbianas, os quais, tm demonstrado maior eficincia na degradao, podendo chegar mineralizao completa do poluente em funo da complementaridade metablica entre seus membros.2,5,10,21 Diversas pesquisas tm tentado descrever as interaes entre microrganismos e entre os hidrocarbonetos e microrganismos, por extrapolao de estudos detalhados em laboratrio com isolados de ambientes contaminados por hidrocarbonetos. Por exemplo, as avaliaes funcionais e fisiolgicas de grupos de isolados, com o objetivo de quantificar a capacidade de emulsificao do leo e a forma utilizada por isolados ambientais para assimilar hidrocarbonetos.5 Os pesquisadores tambm tm elaborado consrcios microbianos, contendo vrias linhagens j estudadas com a finalidade de descrever processos ecolgicos especficos de vrios ambientes naturais.5 Nos ltimos anos, os mtodos dependentes apenas de cultivo microbiano tm demonstrado que a contagem utilizando estas tcnicas apresenta discrepncias quando comparadas comunidade de microrganismos no ambiente , uma vez que, as clulas bacterianas se mostraram sensveis ao cultivo. Devese considerar que apenas uma pequena frao dos microrganismos pode ser cultivada a partir de amostras ambientais, e mesmo que um microrganismo seja cultivado, o seu papel e funo na comunidade e sua contribuio para o ecossistema no so, necessariamente, identificados.5,22 Outro aspecto a ser ressaltado que a contagem microscpica direta excede as contagens de clulas viveis em meio de cultura em vrias ordens de grandeza.23 Algumas explicaes podem incluir i) a presena de um grande nmero de clulas muito pequenas e, provavelmente, inativas, que no so capazes de crescer em condies de laboratrio; ii) normalmente, o cultivo em laboratrio apresenta seletividade, permitindo o crescimento de algumas espcies e reprimindo o crescimento de outras; iii) a Rev. Virtual Quim. |Vol 3| |No. 2| |78-87|

Wetler-Tonini, R. M. C. et al. composio da frao cultivvel da comunidade pode ser distorcida pelo mtodo de cultura, uma vez que o tempo de replicao varia de acordo com a espcie microbiana, e, com o crescimento rpido de algumas espcies, outras de replicao mais lenta so excludas por competio; iv) os meios de cultura so extremamente ricos em fontes de carbono quando comparados aos substratos encontrados em ambientes naturais, podendo falsear a composio da comunidade original. Assim, devido s limitaes dos meios de cultura em reproduzir as condies adequadas, a diversidade e equitabilidade obtidas por cultivo no podem representar com preciso a comunidade real encontrada in situ.22-24 De acordo com Felske e colaboradores (1999)22, apesar das limitaes supracitadas, possvel cultivar vrios tipos de bactrias em laboratrio com o uso de nutrientes e condies adequadas. Membros de vrios grupos microbianos onipresentes e de difcil cultivo j foram isolados por ajustes das condies de cultura, at mesmo por modificaes simples, tais como o uso de formulaes slidas em lugar de lquidas, reduo das concentraes de nutrientes e minerais, ou aumento do tempo de incubao.25 A diversidade de microrganismos muito ampla, no entanto, ainda pouco conhecida. Estima-se que um grama de solo contenha de 10 a 20 bilhes de microrganismos, representando milhares de espcies de fungos, bactrias e leveduras. Com os avanos nas pesquisas, o nmero de espcies microbianas identificadas cresce a cada ano, indicando que foram descobertas e nomeadas, talvez, menos de 0,1% e no mximo 10% das espcies microbianas existentes, dependendo do habitat estudado. Acredita-se que menos de 1% de todas as clulas bacterianas do solo podem ser cultivadas pelos mtodos tradicionais.5,17,22 A extrao direta de cidos nucleicos de amostras ambientais tm comprovado que uma grande proporo de microrganismos (90-99,9%) no facilmente cultivada em laboratrio, mas que pode ser responsvel pela maior parte da atividade biodegradativa de interesse biotecnolgico.24 Microrganismos no cultivveis compem a maior parte da comunidade microbiana. No entanto, at pouco tempo, o cultivo era indispensvel para sua identificao. Alm disso, a frequncia de ocorrncia das populaes, a sazonalidade, e em muitos casos, a dependncia de hospedeiros e/ou substratos especficos para sua sobrevivncia e replicao tambm consistiam em importantes limitaes identificao.17,22 O uso de tcnicas de cultivo indispensvel aos estudos de microrganismos ambientais, auxiliando no Rev. Virtual Quim. |Vol 3| |No. 2| |78-87| isolamento e proporcionando a compreenso detalhada das caractersticas e do metabolismo dos organismos separadamente. Entretanto, na anlise de comunidades, so limitados em reproduzir a alta diversidade existente, os nichos ecolgicos e as relaes simbiticas encontradas em ambientes naturais complexos. A identificao direta de bactrias do solo por meio de tcnicas que independem de cultura prvia, com o uso do gene 16S rDNA, indicou a presena de muitas espcies bacterianas no cultivveis.22-24 No entanto, existe a hiptese de que as bactrias cultivveis representem as clulas viveis, enquanto as sequncias de 16S rDNA podem ser obtidas a partir de clulas mortas presentes na amostra. Esta possibilidade, indicaria que a anlise de sequencias clonadas do 16S rDNA fornece informaes, principalmente de interesse taxonmico, podendo no indicar as principais bactrias vivas agindo nos processos biogeoqumicos dos solos e sedimentos.22 Os mtodos microbiolgicos clssicos combinados s tcnicas de anlise molecular podem proporcionar uma caracterizao mais abrangente da comunidade microbiana presente no ambiente e sua resposta biorremediao induzida e aos processos naturais de atenuao.24

3.2. Mtodos independentes de cultura

A disparidade entre a diversidade microbiana no ambiente e a cultivada em laboratrio aumentou a importncia das abordagens moleculares independentes de cultura, mas recentemente, a anlise do DNA tornou-se o alvo dominante de estudo. Mtodos baseados na assinatura do DNA bacteriano por meio do gene 16S rDNA demonstram as relaes filogenticas nas comunidades microbianas e tm aumentado substancialmente o conhecimento sobre a diversidade de microrganismos em ambientes naturais. A caracterizao de um organismo em termos de filotipo requer apenas uma sequncia de genes, e no uma clula metabolicamente ativa. Estes genes podem ser obtidos por clonagem de DNA, isolado diretamente da amostra ambiental por vrias tcnicas j padronizadas. Estes mtodos tornaram-se ferramentas indispensveis no somente na ecologia microbiana clssica, mas tambm em outras reas de pesquisa, uma vez que muitas caractersticas de algumas espcies s podem ser explicadas em um contexto de comunidade.23,24,26,27 82

Wetler-Tonini, R. M. C. et al. As sondas de DNA podem detectar genes ou sequncias de genes no DNA total isolado e purificado a partir de amostras ambientais. De acordo com Widada e colaboradores,24 tcnicas de hibridizao de DNA, usando DNA marcado como uma sonda especfica foram utilizadas em diversas pesquisas para identificao de microrganismos especficos em amostras ambientais. Um dos primeiros estudos para a utilizao de tcnicas de hibridizao direta de monitoramento para degradadores de xenobiticos consistiu no uso de plasmdeos em microcosmos no solo. Bactrias foram hibridizadas com plasmdeos como sondas para quantificar as clulas que continham a sequncia responsvel pela utilizao do poluente. Uma correlao positiva foi observada entre as concentraes de plasmdeo e as taxas de mineralizao. A exposio aos substratos aromticos causou um aumento na quantidade de plasmdeos encontrados nas amostras.24 Microrganismos podem ser usados para determinar a biodisponibilidade de um determinado composto qumico no solo e sedimento. Para tal, indicada a medio de plasmdeos em bactrias, uma vez que o gene que codifica a resistncia aos xenobiticos so, geralmente, codificados nestes plasmdeos; estes servem como indicadores de contaminantes no ambiente. possvel usar abordagem endgena ou exgena. Na abordagem endgena, plasmdeos so extrados das bactrias e isolados em placas de gar. Na abordagem exgena, uma amostra de solo ou sedimento misturada com bactrias sem plasmdeo, que, por conjugao, posteriormente, os adquirem naturalmente das bactrias que contm plasmdeos. Se o nmero de plasmdeos encontrado apresentar aumento em um determinado local, uma investigao dos fatores de estresse pode ser iniciada.12 A ecologia microbiana sofreu uma mudana profunda nas duas ltimas dcadas quanto aos mtodos empregados para a anlise das comunidades naturais. As tcnicas de investigao da diversidade microbiana estrutural mudaram de cultivo para mtodos que se baseiam na investigao de parte da sequncia do DNA, com maior nfase para o gene 16S rDNA, em bactrias, e 18S rDNA, para fungos. A caracterizao pode ser feita atravs da clonagem e sequenciamento direto, por hibridizao do DNA da amostra com sondas ou, alternativamente, pelo uso da tcnica de PCR (polymerase chain reaction, em ingls), com o uso de iniciadores universais que amplificam as sequncias-alvo de diversos organismos e, posteriormente, os fragmentos amplificados podem ser analisados atravs de outras 83 tcnicas.1,17,23,27 De acordo com Felske e colaboradores22 estudos moleculares podem fornecer informaes sobre a maioria dos membros metabolicamente ativos da comunidade bacteriana no solo e tambm so aplicveis em sedimentos, porm algumas adaptaes se fazem necessrias devido as caractersticas de cada tipo de matriz ambiental. Com a rpida expanso da gentica, a ecologia e a biogeoqumica molecular tm apresentado uma srie de abordagens baseadas na tcnica de PCR. Desta forma, os estudos de microrganismos atravs dos fragmentos de DNA amplificados usando clonagem ou sequenciamento ou submetidos a uma srie de mtodos de caracterizao gentica so empregados para avaliar perfis de comunidades.5,17,22-24,28 A evoluo da utilizao de DNA microarrays tem atrado a ateno dos microbiologistas ambientais, uma vez que esta tcnica permite o acompanhamento de milhares de genes ao mesmo tempo.5 Diante da evoluo das tcnicas de ecologia microbiana, possvel afirmar que a identificao filogentica e a caracterizao da dinmica das comunidades dos microrganismos, em breve, sero pr-requisitos essenciais para a realizao de estudos de qualidade nesta rea, tornando possvel a obteno de dados taxonmicos e quantitativos to confiveis quanto os da ecologia de macro-organismos.26 A seguir, sero apresentadas algumas tcnicas baseadas em PCR, comumente usadas com a finalidade de estudar a diversidade e identificar microrganismos ambientais. ARDRA (amplified ribosomal DNA restriction analysis) uma ferramenta comumente empregada para estudar a diversidade microbiana, que se baseia no polimorfismo do DNA. Assim, clones contendo fragmentos do gene 16S rDNA, obtidos atravs do uso de iniciadores universais ou especficos, so amplificados por PCR e digeridos por enzimas de restrio. A seguir procede-se a separao dos fragmentos em gel de agarose de alta densidade ou gel de acrilamida. Os perfis resultantes so, ento, utilizados para classificar a comunidade em grupos genotpicos especficos ou para a tipagem de linhagens.29 RISA (ribossomal intergenic space analysis) um mtodo de anlise da comunidade microbiana, que fornece estimativas de diversidade e composio da comunidade. Foi usado originalmente para a comparao da diversidade em solos e mais recentemente para analisar a diversidade microbiana na rizosfera e em ambientes marinhos. O mtodo envolve a PCR do DNA total da comunidade Rev. Virtual Quim. |Vol 3| |No. 2| |78-87|

Wetler-Tonini, R. M. C. et al. bacteriana, amplificando a regio intergnica entre a subunidade pequena (16S) e a subunidade grande (23S) do gene rRNA, com iniciadores especficos para regies conservadas dos genes ribossomais 16S e 23S. Nesta tcnica, as diferenas no comprimento do espaador intergnico so exploradas. A regio intergnica 16S-23S, que pode codificar tRNAs dependendo da espcie bacteriana, apresenta significativa heterogeneidade no comprimento e na sequncia de nucleotdeos, que podem ser utilizadas para distinguir cepas bacterianas e espcies estreitamente relacionadas. O produto da PCR passa por uma eletroforese em gel de poliacrilamida, e o DNA corado e visualizado. O resultado um padro complexo de bandas que fornece um perfil da comunidade especfica, onde cada banda de DNA correspondente a, pelo menos, um organismo da comunidade original. Embora esta tcnica fornea estimativas relativamente rpidas da composio de comunidades microbianas, a eletroforese em gel de poliacrilamida tende a ser demorada e 20,30 complicada. Diante das limitaes existentes, a tcnica foi aprimorada com o uso da automatizao, sendo, assim, criada a tcnica de ARISA (automated ribosomal intergenic spacer analysis), que pode ser utilizada para investigar a dinmica espacial e temporal das assembleias bacterianas, para anlises de estruturas das comunidades microbianas ambientais, obtendo-se uma estimativa do nmero de txons de bactrias. Esta tcnica difere da RISA pela anlise dos produtos da PCR em um sistema de eletroforese capilar automatizado. Assim, produzido um eletroferograma, cujos picos correspondem a fragmentos distintos de DNA, que so diferenciados por um sistema de deteco de fluorescncia a laser. A sensibilidade deste mtodo muito elevada (detecta diferenas de um nico nucleotdeo), e a reprodutibilidade garantida pela automatizao instrumental. A tcnica de ARISA tem sido utilizada para analisar a estrutura gentica de vrias comunidades de bactrias e/ou de fungos em amostras de gua doce, bacterioplncton, e diferentes solos, permitindo uma estimativa bastante confivel da complexidade da comunidade.31,32 A utilizao de uma tcnica automatizada e a fcil anlise dos dados gerados tem demonstrado que ARISA uma tcnica apropriada para analisar e comparar um grande nmero de amostras e os resultados obtidos so confiveis e reprodutveis.31,32 A tcnica de T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism) necessita de iniciadores marcados com fluorescncia, produzindo fragmentos de DNA amplificados (amplicons) de mesmo tamanho com marcadores terminais atravs da reao de PCR. Rev. Virtual Quim. |Vol 3| |No. 2| |78-87| Aps a purificao, os produtos amplificados so digeridos por enzimas de restrio selecionadas, produzindo fragmentos de tamanhos diferentes. A ltima etapa realizada em um sequenciador automtico, no qual os fragmentos marcados so identificados por densitometria e desenhado um perfil de picos com base no comprimento dos fragmentos. Esta tcnica permite obter estimativas semi-quantitativas da importncia relativa de cada filotipo detectado e, em certos casos, permite atravs da comparao com banco de dados internacionais a identificao do gnero ou mesmo espcie correspondente ao comprimento do fragmento de cada eletroferograma.12,24,27,31,33 O DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) um mtodo que pode ser utilizado para amostras de solo, sedimento ou gua. Consiste na amplificao de fragmentos do gene 16S rRNA e posterior corrida dos produtos da PCR em um gel com gradiente de desnaturao 30-60% ureia/formamida. Com base no grau de desnaturao, os fragmentos de DNA correm pelo gel, produzindo bandas em locais diferentes, possibilitando distinguir populaes ao nvel de gnero, estimar a diversidade bacteriana e comparar com outros locais, contaminados ou no com hidrocarbonetos, alm da observao dos efeitos destes poluentes na diversidade bacteriana. Ainda possvel retirar e sequenciar as bandas obtidas no gel a fim de identificar as espcies presentes na comunidade. Esta tcnica pode ser utilizada para identificar populaes responsveis pela descontaminao durante a biorremediao em associao com mtodos de avaliao da taxa de degradao a fim de definir melhores estratgias para a remoo do poluente.5,20,24,25 TGGE (temperature gradient gel electrophoresis) um mtodo pelo qual fragmentos de DNA de mesmo tamanho, mas apresentando diferentes sequncias so obtidos por PCR e podem ser diferenciados por eletroforese. A separao baseada na diminuio da mobilidade eletrofortica do fragmento de DNA parcialmente desnaturado em um gel de poliacrilamida contendo um gradiente linear de temperatura. Assim, esta tcnica segue a mesma lgica do DGGE, porm ao invs da desnaturao, utiliza-se um gradiente de temperatura para a separao dos fragmentos de DNA.24 SSCP (single strand conformation polymorphism) nesta tcnica, a sequncia de interesse do DNA amplificada pela PCR usando iniciadores marcados. Os produtos resultantes da PCR so desnaturados e visualizados por eletroforese em gel de poliacrilamida, detectando-se mutaes quando h alteraes na motilidade das fitas simples. Assim, a 84

Wetler-Tonini, R. M. C. et al. mutao pode ser posteriormente caracterizada por eluio do alelo mutado, que usado para uma nova amplificao e sequenciamento. Uma importante aplicao deste mtodo avaliar se duas sequncias de DNA so iguais, reduzindo a necessidade de sequenciamento. Apesar de haver algumas descries do uso do SSCP na biologia de populaes, esta tcnica ainda pouco usada a identificao de variaes genticas em ecologia molecular.24,34,35 A anlise de RAPD (random amplified polymorphic DNA) conceitualmente simples; pequenas quantidades de DNA genmico total so submetidas PCR utilizando iniciadores com sequncia aleatria. O protocolo de amplificao difere das condies normais de PCR, em que apenas um nico iniciador aleatrio empregado e desnecessrio o conhecimento prvio do genoma submetido anlise. O protocolo de anlise por RAPD realizado de acordo com mtodos originais utilizando iniciadores curtos de sequncia aleatria que so comercialmente disponveis. S molculas de alto peso molecular, ou seja, DNA no degradado, devem ser submetidos a anlises de RAPD. Os produtos de amplificao podem ser detectados por eletroforese em gel de agarose. A tcnica possui vrias aplicaes potenciais em ecologia molecular, incluindo a determinao de identidades taxonmicas, deteco de fluxo gnico interespecficos, anlise de amostras misturadas, e produo de sondas especficas. Algumas limitaes devem ser consideradas, por exemplo, o tamanho do iniciador ir determinar o grau de especificidade na digitalizao do genoma; sua sensibilidade s condies de reao, em que pequenas mudanas nas condies podem afetar a reprodutibilidade dos produtos de amplificao. A tcnica sensvel a temperatura, ao tipo de polimerase utilizado, ou a concentrao de DNA. Apenas as condies de reao estritamente padronizadas iro garantir produtos de amplificao reprodutveis. Alm disso, a concentrao ideal de DNA por reao pode variar substancialmente em condies especficas, dependendo do iniciador e do programa utilizado no termociclador.36 importante ressaltar que todas as tcnicas dependentes da PCR possuem uma limitao no que se refere comparao de resultados, uma vez que os pesquisadores da rea de biologia molecular utilizam diferentes conjuntos de iniciadores, explorando assim diferentes regies do genoma. Alm disso, o uso de iniciadores diferentes pode influenciar na eficincia de amplificao, dependendo da sensibilidade do iniciador para detectar DNA de populaes menos representativas na mistura, bem como da especificidade do iniciador.31,32 85 A anlise de cidos graxos fosfolipdicos, componentes essenciais da membrana presentes em organismos vivos, pode ser utilizada para fornecer informaes sobre a estrutura trfica (ao nvel fenotpico) de comunidades microbianas. O uso de padres de cidos graxos fosfolipdicos, em geral, consiste em um mtodo rpido e confivel para a deteco de mudanas na estrutura das comunidades microbianas dos solos e sedimentos e as variaes detectadas podem estar relacionadas a mudanas no uso do solo, manejo e poluio, assim como nos sedimentos dos ecossistemas aquticos continentais e marinhos.12

4. Consideraes Finais
Nas ltimas dcadas a contaminao ambiental por petrleo e derivados tem causado mobilizao de empresas privadas e do poder pblico em todo o mundo e, com isso, tem aumentado a demanda de estudos de caracterizao de microrganismos para a sua aplicao na biorremediao de compostos do petrleo. Para tal, faz-se necessrio conhecer detalhadamente a diversidade e a dinmica das comunidades microbianas presentes em diferentes ecossistemas; a ao de cada microrganismo no metabolismo de compostos especficos, gerados em diferentes fases da degradao do petrleo; bem como das vias metablicas e consrcios microbianos utilizados para degradar os poluentes em cada ambiente ou em laboratrio. As tcnicas de biologia molecular tm contribudo de maneira significativa para os estudos de comunidades microbianas, pois oferecem mtodos rpidos, sensveis, e precisos para analisar as bactrias e seus genes catablicos no ambiente. Seu uso tem contribudo para o rpido crescimento dos bancos de dados, cada vez que os pesquisadores obtm alta confiabilidade ao afirmar que uma espcie est presente na comunidade estudada. Elas tm permitido uma melhor caracterizao das comunidades de microrganismos degradadores de hidrocarbonetos e das adaptaes celulares e fisiolgicas das bactrias presena dos poluentes, alm dos mecanismos de acesso e captao das substncias pelas clulas microbianas. Alm disso, permitem comparaes entre diferentes comunidades, o monitoramento das mudanas temporais resultantes de alteraes nos parmetros ambientais, a avaliao dos impactos de biorremediao e a modelagem ecolgica. As informaes obtidas a partir de estudos nesta rea Rev. Virtual Quim. |Vol 3| |No. 2| |78-87|

Wetler-Tonini, R. M. C. et al. proporcionam uma viso em longo prazo dos efeitos ecolgicos causados pela contaminao com petrleo ou outros poluentes, como metais pesados e pesticidas.5,23,24 A associao entre os mtodos dependentes de cultura e os mtodos independentes permitiu o isolamento e a identificao de diversos microrganismos degradadores de compostos do petrleo; elaborao in vitro de consrcios microbianos com reconhecida capacidade degradativa e a produo em larga escala de tensoativos, como os biossurfactantes, que so utilizados na solubilizao do petrleo, facilitando sua degradao. Alm disso, estes estudos forneceram dados importantes sobre a diversidade de comunidades microbianas em ambientes naturais e o conhecimento da participao de cada organismo em processos biogeoqumicos em diversos ecossistemas. As tcnicas descritas no presente artigo fornecem informaes teis para melhorar as estratgias de biorremediao, proporcionando maior segurana na escolha da tcnica mais adequada para cada tipo de ecossistema.
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Agradecimentos
Os autores agradecem ao Laboratrio de Cincias Ambientais do Centro de Biocincias e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense pela infraestrutura. Este trabalho faz parte do Instituto Nacional de Cincia e Tecnologia sobre a Transferncia de Material na Interface Continente Oceano (CNPq Proc. 573.601/2008-9) e CER recebe apoio financeiro da FAPERJ (E- 26/102.697/2008; E26/112.037-2008); CNPq (Proc. 573.601/2008-9). ADG recebe apoio da CAPES (AUX-PE-PNPD2303/2008) e RMCWT recebe apoio FAPERJ (E26/101.829/2008).

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